專利名稱：用內(nèi)源c-met配體和抑制劑抑制個(gè)體中的癌發(fā)生和/或轉(zhuǎn)移的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明基于個(gè)體中存在內(nèi)源天然c-met配體和抑制劑，所述c-met 配體和抑制劑抑制由被轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞自分泌產(chǎn)生的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因 子(HGF)變體的相互作用和功能。本發(fā)明涉及抑制個(gè)體中的癌發(fā)生和/ 或轉(zhuǎn)移的方法。該方法包括給個(gè)體施用有效量的內(nèi)源c-met配體或其片段。
本發(fā)明也涉及抑制自分泌產(chǎn)生的內(nèi)源HGF的相互作用的方法、增 強(qiáng)內(nèi)分泌產(chǎn)生的HGF的效果的方法、抑制自分泌產(chǎn)生的HGF的效果的 方法、增強(qiáng)間充質(zhì)細(xì)l包產(chǎn)生的HGF的促運(yùn)動(dòng)(motogenic )作用的方法， 以及影響個(gè)體中的血管發(fā)生、細(xì)胞分裂、遷移和/或形態(tài)發(fā)生的方法。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及調(diào)節(jié)個(gè)體中內(nèi)源c-met配體或其片^:的量的方法以 及區(qū)別HGF的自分泌和內(nèi)分泌變體的方法。
背景技術(shù)：
m^癌基因最初在化學(xué)致癌物(N-曱基-N'-亞硝基胍)處理的人成骨 性肉瘤細(xì)胞系(MNNG-HOS)中鑒定到。從這些細(xì)胞中分離出//^-附"， ^r-wW是可以在體外在形態(tài)學(xué)上轉(zhuǎn)化鼠NIH 3T3成纖維細(xì)胞并且在無(wú) 胸腺棵鼠中誘導(dǎo)它們形成腫瘤的基因。^r-m"基因代表兩種不同基因 座Upr和w^)的融合。盡管0/ r)癌基因產(chǎn)物是一種胞質(zhì)激酶，fmw」 原癌基因產(chǎn)物是一種跨膜受體樣蛋白質(zhì)。C-mW是原癌基因產(chǎn)物，即 一種由通過(guò)二石克4建連4妄的50 kD (ot)和145 kD (p)亞單位組成的受體樣 酪氨酸激酶。在完全加工的c-w"產(chǎn)物中，a亞單位位于細(xì)胞外，并且 是高度糖基化的，而(3亞單位具有細(xì)胞外的、跨膜的和酪氨酸激酶結(jié) 構(gòu)域以及酪氨酸》粦酸化位點(diǎn)。
直到1990年才知道c-mW的配體。HGF誘導(dǎo)完整靶細(xì)胞中的蛋白質(zhì) 發(fā)生快速酪氨酸磷酸化的證據(jù)提示酪氨酸激酶受體可能介導(dǎo)其促有 絲分裂信號(hào)。在完整靶細(xì)胞對(duì)HGF處理的快速應(yīng)答中觀察到145 kDa 酪氨酰(tyrosil)磷酸化，其被鑒定為om^的(3亞單位?？杀豢筩-w^ 抗體識(shí)別的適當(dāng)大小細(xì)胞蛋白質(zhì)的1251-標(biāo)記的配體確定ow^產(chǎn)物為 HGF的細(xì)胞表面受體。細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的存在使HGF受體被 歸類為細(xì)胞表面分子的受體酪氨酸激酶(RTK)家族的一個(gè)成員。c-w^ 受體暴露于底外側(cè)質(zhì)膜中，與極化細(xì)胞中不溶于去污劑的成分結(jié)合。 已經(jīng)對(duì)m^基因作圖，其位于染色體7的q21-31，并且編碼1408個(gè)氨基 酸的糖蛋白一該糖蛋白缺乏與任何其它已知生長(zhǎng)因子受體的顯著同 源性。
c-met受體與其配體HGF的相互作用通過(guò)刺激受體的酪氨酸激酶 活性誘導(dǎo)信號(hào)，隨后磷酸化，并且促進(jìn)與活化的大量胞內(nèi)信號(hào)蛋白的 受體的結(jié)合。HGF促進(jìn)各種細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。在某些癌細(xì)胞系中觀 察到HGF和c-m"受體在同一細(xì)胞中共表達(dá)，這有助于對(duì)細(xì)胞侵襲和致 腫瘤性的自分泌調(diào)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實(shí)施方案涉及抑制個(gè)體中的癌發(fā)生和/或轉(zhuǎn)移的方法。該 方法包括給個(gè)體施用有效量的抗c-met免疫球蛋白。在本發(fā)明的實(shí)施方 案中，內(nèi)源c-met配體或其片段包括天然的和/或重組的內(nèi)源抗c-met免 疫球蛋白、天然的和/或重組的內(nèi)源生物活性肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和 /或其組合。
本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及抑制個(gè)體中自分泌產(chǎn)生的內(nèi)源HGF與 c-m"受體相互作用的方法。該方法包括給個(gè)體施用有效量的內(nèi)源 c-met配體或其片段。
本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及影響個(gè)體中的血管發(fā)生、細(xì)胞分裂、 遷移和/或形態(tài)發(fā)生的方法。該方法包括給個(gè)體施用有效量的內(nèi)源 c-met配體或其片段、抗-HGF或其片段、或其組合。
本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)一步涉及調(diào)節(jié)個(gè)體中內(nèi)源c-met配體或其片 段的量的方法。該方法包括檢測(cè)個(gè)體中的內(nèi)源c-met配體或其片段的水 平并且給個(gè)體施用有效量的內(nèi)源c-met配體或其片段。


以下發(fā)明詳述可以參照附圖更全面地理解，附圖包括
圖l:顯示c-met固定的流動(dòng)池中的信號(hào)強(qiáng)度的柱狀圖，其中比較 了在添加商品抗c-met抗體之前、之后(p<0.00001 )以及在添加商品抗 HGF抗體之后(p〈0.001)的血清(n^10)。添加抗c-met和抗HGF之后的信 號(hào)減弱存在差異；
圖2:來(lái)自3名供血者的血清在通過(guò)c-met固定的親和柱純化之后 的SDS-page。將洗脫的樣品超濾。分離膠中丙烯酰胺的濃度為11%。 高分子量條帶屬于抗c-met;
圖3:血清樣品(供血者)在通過(guò)c-met固定的親和柱純化之后的 SDS-page。分離膠中丙烯酰胺的濃度為11%; A-第一次用c-met柱純 化并超濾的供血者的樣品；B-除去白蛋白和IgG之后的A的樣品；C-第二次用c-met柱純化并超濾的供血者的樣品；D-除去白蛋白和IgG 之后的C的樣 品;
圖4: A:除去白蛋白和IgG之前和之后的人肝炎Hbs免疫球蛋白 (Aunativ)的SDS-page分析。兩條高分子量條帶在除去IgG之后消失。 分離膠中丙烯酰胺的濃度為14.67%; B:用c-met固定的SPR流動(dòng)池的 曲線。信號(hào)l是注射商品重組c-met之后的信號(hào)。信號(hào)2屬于Aunativ， 信號(hào)3屬于除去白蛋白和IgG之后的Aunativ。每個(gè)樣品斥企測(cè)兩次；C: 傳感圖證明信號(hào)強(qiáng)度之間存在差異(1 - 2 - 3);
圖5:血清樣品(供血者)在通過(guò)c-met固定的親和柱純化之后的 SDS-page。分離月交中丙烯酰胺的濃度為11%。去糖基化后抗c-met (乂人 >120 kDa降至lOO kDa)和HGF (從95 kDa降至75 kDa)的分子量降低；
圖6:來(lái)自受過(guò)良好訓(xùn)練的志愿者的血清在c-met固定的SPR流動(dòng) 池中的信號(hào)強(qiáng)度圖。延長(zhǎng)樣品注射時(shí)間(1 -3-5-7-1 O分鐘)增強(qiáng)了信號(hào)
強(qiáng)度；
圖7:顯示來(lái)自8名受過(guò)良好訓(xùn)練的志愿者的血清在c-met固定的表 面等離振子共振(SPR)流動(dòng)池中的平均信號(hào)強(qiáng)度在所有情況下在運(yùn)動(dòng) 期間非顯著性地增強(qiáng)。1=運(yùn)動(dòng)前，2=運(yùn)動(dòng)一半時(shí)；3=最大運(yùn)動(dòng)量時(shí)， 4=運(yùn)動(dòng)后4分鐘，5=運(yùn)動(dòng)后10分鐘；
圖8:顯示來(lái)自8名受過(guò)良好訓(xùn)練的志愿者的平均血漿HGF濃度在 所有情況下在運(yùn)動(dòng)期間非顯著性地增加。1=運(yùn)動(dòng)前，2=運(yùn)動(dòng)一半時(shí)； 3=最大運(yùn)動(dòng)量時(shí)，4=運(yùn)動(dòng)后4分鐘，5=運(yùn)動(dòng)后10分鐘；
圖9:顯示c-met和抗HGF抗體固定的通道中SPR信號(hào)強(qiáng)度百分比 的柱狀圖，分別反映了以下不同組中血液中存在的抗c-met和HGF: IBD (n-48)、感染性胃腸炎(n^9)、健康對(duì)照(n-9)和下肢慢性潰瘍 (n=9)。在下肢慢性潰瘍患者中，對(duì)于抗HGF抗體的親和力存在陰性 SPR信號(hào)；
圖10:顯示在商品c-met和抗c-met固定的流動(dòng)池中，反應(yīng)性關(guān)節(jié) 炎(ReA)患者在疾病急性期(1 )和3-6個(gè)月后(2)的SPR信號(hào)親和力的柱 狀圖。對(duì)c-met流動(dòng)池(c-met通道)的親和力反映了血液中存在抗c-met, 對(duì)抗c-met流動(dòng)池(抗c-met通道)的親和力反映了血液中存在循環(huán) c-met。從急性期到恢復(fù)期，c-met和抗c-met的水平顯著降低(pO.01);
圖11:從損傷的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的培養(yǎng)基的Western印 跡分析。使用人角蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照，牛碳酸脫水酶作為陰性對(duì)照。
圖12:用c-met固定的親和柱純化并超濾和除去白蛋白和IgG后，
對(duì)來(lái)自受損傷患者的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行的基質(zhì)輔 助的激光解吸/電離(MALDI-TOF)分析。位于大約66和33 kDa處的信 號(hào)可能屬于HGF鏈；
圖13: A:對(duì)來(lái)自受損傷患者的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基 進(jìn)行的斑點(diǎn)印跡分析。斑點(diǎn)印跡分析比較了煮沸樣品之前(原始培養(yǎng) 基)和之后(煮沸的)細(xì)胞培養(yǎng)基的結(jié)果；B:對(duì)來(lái)自受損傷患者的 皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行的SDS-Page。分離膠中丙烯酰胺的濃 度為14.67%;
圖14:說(shuō)明了產(chǎn)生HGF的兩個(gè)途徑。間充質(zhì)細(xì)胞響應(yīng)于身體損傷 以內(nèi)分泌方式產(chǎn)生HGF。這種HGF對(duì)上皮細(xì)胞具有作用，可被抗HGF 抗體抑制。天然抗c-met誘導(dǎo)對(duì)上皮細(xì)胞的這種作用。損傷的上皮細(xì)胞 可以自分泌地產(chǎn)生HGF,其對(duì)相同細(xì)胞具有作用，并且誘導(dǎo)細(xì)胞分裂 和遷移。天然抗c-met抗體抑制這種作用；
圖15: A:顯示對(duì)于健康供血者，在c-met和抗HGF抗體固定的流 動(dòng)池中的SPR信號(hào)強(qiáng)度，在c-met通道中具有較低的信號(hào)強(qiáng)度。注射時(shí) 間從1分鐘延長(zhǎng)到10分鐘。延長(zhǎng)注射時(shí)間增強(qiáng)了對(duì)通道的親和力(血 液被抗c-met和HGF完全負(fù)載)，B:顯示對(duì)于重病老年患者，c-met 和抗HGF流動(dòng)池的SPR信號(hào)親和力。對(duì)流動(dòng)池的最大親和力遠(yuǎn)低于健 康對(duì)照。抗HGF親和力(循環(huán)HGF)沒(méi)有緊接c-met親和力；C:顯示49 歲下肢慢性潰瘍患者對(duì)于c-met和抗HGF的SPR信號(hào)親和力，他在 c-met通道中具有與健康供血者相同的信號(hào)強(qiáng)度。對(duì)c-met和抗HGF流 動(dòng)池的親和力在注射后7分鐘均停止增加；和
圖16:說(shuō)明癌性胂瘤含有兩種細(xì)胞；表達(dá)C-met/HGF受體的細(xì)胞 和表達(dá)c-w^受體和HGF mRNA兩者的細(xì)胞。后一種是高侵襲性的癌 細(xì)胞，其產(chǎn)生HGF并且具有HGF的作用(自分泌環(huán)路)。產(chǎn)生自分泌 HGF的細(xì)胞侵入血流中并且引起轉(zhuǎn)移。間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生正常HGF (內(nèi) 分泌環(huán)路)，其對(duì)損傷的正常上皮細(xì)胞具有陽(yáng)性作用。這種HGF可能 誘導(dǎo)表達(dá)HGF受體的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞分裂和遷移，但是這種作用被作 為調(diào)節(jié)機(jī)制的體內(nèi)產(chǎn)生的抗HGF完全抑制。另一方面，抗HGF不能抑 制細(xì)胞自分泌產(chǎn)生的HGF的作用。這些細(xì)胞可能侵入其它器官并引起 轉(zhuǎn)移。在S期添加由間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的HGF (內(nèi)分泌環(huán)路)或抗c-met可 以抑制高侵襲性細(xì)胞的生長(zhǎng)。抗c-met也可以抑制由這些細(xì)胞產(chǎn)生的 HGF的促運(yùn)動(dòng)作用。天然抗c-met不抑制正常HGF的作用(內(nèi)分泌環(huán) 路)。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述
肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是一種在機(jī)體損傷期間產(chǎn)生的多功能的細(xì)
胞因子。本發(fā)明人已經(jīng)確定在血液感染過(guò)程中以及在損傷的器官中
HGF的量增加。 一旦開(kāi)始適當(dāng)?shù)闹委煟琀GF的量就降低。HGF在血液 和體液中非常穩(wěn)定。HGF與其高親和力受體c-met的相互作用通過(guò)刺激 酪氨酸激酶活性誘導(dǎo)信號(hào)，導(dǎo)致HGF的促有絲分裂、促運(yùn)動(dòng)和促形態(tài) 發(fā)生作用，并且啟動(dòng)細(xì)胞中的事件序列，導(dǎo)致細(xì)胞和器官在損傷后的 再生。
本發(fā)明人已經(jīng)研究了血液中HGF的濃度和穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在健康供 血者中HGF濃度的平均值和中值大約為0.7ng/mL。本發(fā)明人進(jìn)一步利 用表面等離振子共振法(SPR)研究了重組HGF和體液中的HGF,證明 生物活性HGF對(duì)由c-met、單克隆/多克隆抗HGF抗體以及葡聚糖固定 化的流動(dòng)池具有恒定的親和力。
SPR技術(shù)適合研究表面上或靠近表面的生物分子的相互作用。 SPR能夠在不對(duì)樣品進(jìn)行任何標(biāo)記的條件下快速、實(shí)時(shí)地檢測(cè)，并且 能夠用于濃度測(cè)定、動(dòng)力學(xué)研究和表位作圖。簡(jiǎn)要地說(shuō)，以特定入射 角入射到金屬表面上的光線可以激發(fā)與表面結(jié)合的電磁波一表面等 離振子，它沿金屬和環(huán)境介質(zhì)之間的界面?zhèn)鞑?。漸逝場(chǎng)與表面等離振 子相結(jié)合，探查例如由于生物分子與表面結(jié)合而誘導(dǎo)的環(huán)境介質(zhì)折射 系數(shù)的局部改變。折射系數(shù)的改變將改變發(fā)生S PR激發(fā)處的入射角。 通過(guò)用Kretschmann裝置隨時(shí)間監(jiān)測(cè)反射光強(qiáng)度最小值的移動(dòng)來(lái)追蹤 這種角度變化，并將結(jié)合事件以傳感圖顯示。SPR裝置的傳感表面由 羧甲基化的葡聚糖基質(zhì)構(gòu)成，這種基質(zhì)是一種水凝膠，提供溶液樣環(huán) 境，在其中發(fā)生生物特異性的相互作用。葡聚糖基質(zhì)中的羧基能夠使 配體(蛋白質(zhì)、受體、DNA等)與表面共價(jià)偶聯(lián)。
利用SPR技術(shù)，本發(fā)明人建立了 一種區(qū)別感染性腹瀉和非感染性 腹渴的方法。本發(fā)明人還表征了在感染性疾病期間發(fā)現(xiàn)的具有生物學(xué) 活性的HGF和在某些慢性疾病如慢性潰瘍期間發(fā)現(xiàn)的HGF的不同特 性。使用表達(dá)HGF受體(c-met)的CCL-53.1細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的小鼠上皮細(xì)胞， 本發(fā)明人已經(jīng)建立了 一種評(píng)價(jià)HGF活性的方法。本發(fā)明人最近報(bào)道了 遭受創(chuàng)傷的人皮膚上皮細(xì)胞自分泌產(chǎn)生HGF。
在建立檢測(cè)血樣中的HGF的SPR方法的同時(shí)，本發(fā)明人還觀察 到高水平的對(duì)c-met固定的流動(dòng)池的親和力，在某些情況下比對(duì)于單 克隆抗HGF抗體或葡聚糖的親和力高數(shù)倍。本發(fā)明人在研究來(lái)自不 同患者組的幾種血樣時(shí)觀察到相同的現(xiàn)象。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)配對(duì)的血 清和血漿樣品之間沒(méi)有差異。當(dāng)重組c-met (R&D Systems)的胞外域 與人IgG的羧基末端6X組氨酸標(biāo)記區(qū)通過(guò)多肽接頭融合時(shí)，懷疑補(bǔ) 體蛋白質(zhì)與IgG的相互作用產(chǎn)生假信號(hào)。EDTA對(duì)補(bǔ)體激活具有抑制 作用。因此，本發(fā)明人向樣品中添加了不同濃度的EDTA，這對(duì)流動(dòng) 池中的信號(hào)強(qiáng)度沒(méi)有任何影響?；诒景l(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，研究了可能 產(chǎn)生信號(hào)的可能的替代途徑。
已認(rèn)為c-met是HGF的細(xì)胞表面受體，同時(shí)不希望被理論所限制， 認(rèn)為沒(méi)有其他蛋白質(zhì)共有c-m"受體。使用c-met固定的親和柱純化血 樣。洗脫下來(lái)的樣品在超濾后的SDS-page顯示高度糖基化的高分子量 條帶，該條帶在去除白蛋白和IgG后消失。同時(shí)，c-met固定的流動(dòng)池 (c-met通道)的SPR信號(hào)減弱。提示血樣中的抗c-met免疫球蛋白產(chǎn)生高 親和力信號(hào)。進(jìn)一 步的研究表明在向樣品中添加抗HGF抗體后SPR信 號(hào)輕微減弱，并且這種信號(hào)減弱與抗HGF抗體固定的流動(dòng)池中的親和 力信號(hào)成比例(數(shù)據(jù)未顯示)。在分析之前向樣品中添加c-met后信號(hào) 嚴(yán)重減弱，在添加抗c-met抗體后增強(qiáng)，這提示對(duì)c-met通道的親和力 信號(hào)是由于血液中HGF和抗c-met兩者的親和力。向血樣中添加人白蛋 白后信號(hào)的輕微減弱可能依賴于健康者血液中天然生物活性HGF對(duì) 白蛋白的親和力和HGF與受體相互作用的抑制。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn) 高度濃縮的人肝炎Hbs免疫球蛋白(Aunativ, Octapharma)和人正常免 疫球蛋白(Gammanorm， Octapharma)(以4交低的程度)在c-met通道中產(chǎn) 生類似的信號(hào)，這種信號(hào)在去除白蛋白和IgG后消失，這與血液中存 在抗c-met的提示相符合。本發(fā)明人進(jìn)一步建立了檢測(cè)血液中內(nèi)源抗 HGF抗體(IgG和IgM)總量的ELISA方法。
為了確定血液中抗c-met的可能的作用，本發(fā)明人研究了健康者以 及不同患者組的樣品。盡管與患者的年齡沒(méi)有顯著相關(guān)性，但是本發(fā)明人觀察到年輕健康者以及定期鍛煉的老年人具有抗c-met的高信號(hào) 水平。四名免疫缺陷患者(總IgG缺陷，數(shù)據(jù)未顯示)和老年重病患 者具有極低的或者沒(méi)有c-met通道信號(hào)(圖15)。分析了來(lái)自8名受過(guò)良 好訓(xùn)練的消防員的血樣，顯示注射時(shí)間從1分鐘延長(zhǎng)到10分鐘使信號(hào) 強(qiáng)度增強(qiáng)。在運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)過(guò)程中，在最大運(yùn)動(dòng)量后4分鐘信號(hào)強(qiáng)度增加 到最大值，但是由于該研究包括的例數(shù)較少，其差異沒(méi)有達(dá)到顯著性。 濃度(ELISA)和對(duì)抗HGF流動(dòng)池的親和力(SPR)以相同的方式增加。不 希望受理論限制，這可能提示在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中HGF的濃度、活性以及抗 c-met增力口。
與急性胃腸炎和健康對(duì)照相比，IBD患者對(duì)c-met通道具有低信號(hào) 親和力。盡管下肢慢性潰瘍和健康對(duì)照的信號(hào)親和力之間的差異沒(méi)有 達(dá)到顯著性(pO.053)，但是本發(fā)明人觀察到運(yùn)動(dòng)較少和/或經(jīng)歷皮質(zhì)類 固醇治療的老年患者具有比年輕人和運(yùn)動(dòng)較多患者更低的抗c-met水 平。顯著地，本發(fā)明人觀察到IBD患者和下肢慢性潰瘍患者在抗HGF 抗體固定的流動(dòng)池中的信號(hào)親和力顯著低于健康對(duì)照。本發(fā)明人以前 曾經(jīng)證明無(wú)生物活性的HGF對(duì)于抗HGF抗體、硫酸類肝素蛋白聚糖 (HSPG)和硫酸葡聚糖的親和力顯著降低。不希望受理論限制，這一發(fā) 現(xiàn)可能提示在IBD和下肢慢性潰瘍患者中，血清和腸潰瘍局部的HGF 的生物學(xué)活性降低。
本發(fā)明人以前曾經(jīng)證明HGF濃度在感染期間增加。該研究中的肺 炎患者具有高水平的HGF (ELISA)，其在有效的抗生素治療后降低， 但是在治療失敗的情況時(shí)繼續(xù)升高。c-met通道中的SPR信號(hào)強(qiáng)度并非 如此?；疾∑陂g信號(hào)顯著減弱，這可能指示感染期間抗c-met的消耗。
在ReA患者中，抗c-met通道的信號(hào)強(qiáng)度在疾病突發(fā)時(shí)較高，這可 能指示急性炎癥期間的細(xì)胞死亡和血液中的細(xì)胞結(jié)合受體c-met(循環(huán) c-met)的釋放。在恢復(fù)期間，血液中的c-met和抗c-met水平顯著降低， 這提示在體內(nèi)炎癥期間抗c-met的調(diào)節(jié)作用。最近已經(jīng)報(bào)道了非小細(xì)胞 肺癌中循環(huán)c-met的存在和循環(huán)c-met的過(guò)量表達(dá)和它與早期復(fù)發(fā)的相 關(guān)性。
自1990年以來(lái)已經(jīng)報(bào)道了癌細(xì)胞中的c-met受體的表達(dá)增強(qiáng)。Met 癌基因編碼的c-met受體控制一種被稱為"侵襲性生長(zhǎng)"的遺傳程序，負(fù) 責(zé)幾個(gè)發(fā)展過(guò)程，并涉及癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移。侵襲性生長(zhǎng)被定義為一種 復(fù)雜的生物程序，它向細(xì)胞發(fā)出分離、遷移、降解周圍的基質(zhì)、增殖 以及存活的指令。該過(guò)程的各個(gè)方面可以由多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子 控制。然而，侵襲性生長(zhǎng)的協(xié)同調(diào)節(jié)在整體上由HGF具體實(shí)現(xiàn)，HGF 通過(guò)c-met受體發(fā)揮作用。最近研究的綜述表明，在數(shù)種惡性腫瘤如脊 索瘤、晚期上皮卵巢癌、膀胱移行細(xì)胞癌、惡性黑素瘤、人結(jié)腸直腸 癌、子宮內(nèi)膜癌、B細(xì)胞淋巴瘤和淋巴結(jié)陽(yáng)性乳腺癌中，證明了c-met 的過(guò)量表達(dá)和它與較低存活率的相關(guān)性。上皮細(xì)胞中HGF和c-met的過(guò) 量表達(dá)介導(dǎo)了自分泌HGF-met信號(hào)發(fā)生。已經(jīng)在SNU-484胃癌細(xì)胞系、 腦脊膜瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、滑 膜肉瘤、骨和軟組織腫瘤、激活的單核細(xì)胞和HGL4膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì) 胞中研究了 HGF的自分泌信號(hào)發(fā)生和它在癌細(xì)胞增殖和遷移中的作 用。在體內(nèi)存在內(nèi)建的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，如Notch功能的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)， 其又通過(guò)c-met的恢復(fù)限制了 HGF活性。
人角質(zhì)形成細(xì)胞是上皮細(xì)胞，推斷其不產(chǎn)生HGF。從損傷的患者 獲得的皮膚細(xì)胞是角質(zhì)形成細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生角蛋白。細(xì)胞以自分 泌方式產(chǎn)生HGF。產(chǎn)生的HGF具有通過(guò)SPR (提交的文章)確定的生物 活性HGF的性質(zhì)，具有兩條如通過(guò)MALDI-TOF確定的代表oc和|3鏈的 帶，并且誘導(dǎo)CCL-53.1細(xì)胞的遷移。已經(jīng)報(bào)道了一個(gè)類似的發(fā)現(xiàn)，即 胃成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基具有與HGF類似的對(duì)上皮增殖和重建的作 用，其活性被抗HGF抗體中和。但是，與健康者產(chǎn)生的HGF或重組HGF 不同，損傷的角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的CCL-53.1細(xì)胞的遷移不被抗HGF抗 體抑制。添加商品抗c-met或在人免疫球蛋白中發(fā)現(xiàn)的天然抗c-met完 全抑制這種遷移。間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的HGF和上皮細(xì)胞以自分泌方式產(chǎn) 生的HGF之間的這種差異的原因尚不清楚。但是，抗c-met不抑制正常 活性HGF (血液、體液中的或重組的)對(duì)CCL-53.1細(xì)胞的作用可能具 有價(jià)值。本發(fā)明人確定添加作為激活物起作用的抗c-met增強(qiáng)了對(duì)
CCL-53.1細(xì)胞的促運(yùn)動(dòng)活性(數(shù)據(jù)未顯示)。
在傳代時(shí)將天然的生物活性HGF和抗c-met加入到正常角質(zhì)形成 細(xì)胞和產(chǎn)生自分泌HGF的角質(zhì)形成細(xì)胞中。HGF和抗c-met對(duì)正常角質(zhì) 形成細(xì)月包都沒(méi)有作用。但是HGF和抗c-met都導(dǎo)致細(xì)胞從孔底脫落以及 產(chǎn)生HGF的上皮細(xì)胞(自分泌)的細(xì)胞死亡。曾才艮道了關(guān)于HGF抑制 自分泌產(chǎn)生HGF的肝細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)的類似的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明人進(jìn)一步 研究了MDA-MB-157 (HTB-24 ATCC)細(xì)胞系， 一種自分泌產(chǎn)生HGF 的人乳腺癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)在傳代時(shí)向細(xì)胞中加入內(nèi)源抗c-met導(dǎo)致HTB 細(xì)胞死亡，這證實(shí)了以前的結(jié)果。向損傷的CCL-53.1細(xì)胞中添加 HTB-24細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基導(dǎo)致細(xì)胞向損傷區(qū)域遷移。加入內(nèi)源c-met 抑制劑抑制了這種效果。
癌性肺瘤含有兩種細(xì)胞表達(dá)c-met/HGF受體的細(xì)胞和表達(dá)c-met 受體和HGF mRNA兩者的細(xì)胞。后一種是高侵襲性的癌細(xì)胞，產(chǎn)生 HGF并且受其影響(自分泌環(huán)路)。產(chǎn)生自分泌HGF的細(xì)胞(被轉(zhuǎn)化 的上皮細(xì)胞)在血流中遷移并且引起轉(zhuǎn)移。間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生正常HGF (內(nèi)分泌環(huán)路)，這種HGF對(duì)于損傷的正常上皮細(xì)胞具有再生作用。這 種HGF可以誘導(dǎo)表達(dá)HGF受體的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞分裂和遷移，但是這
HGF不能抑制被轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞產(chǎn)生的HGF的作用。這些細(xì)胞可能侵 入其它器官并且導(dǎo)致轉(zhuǎn)移。兩種HGF形式(內(nèi)分泌或自分泌產(chǎn)生的) 可能在轉(zhuǎn)錄前或轉(zhuǎn)錄后在結(jié)構(gòu)或糖基化方面不同。在S期添加由間充 質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的HGF (內(nèi)分泌環(huán)路)和/或抗c-met抑制了被轉(zhuǎn)化的上皮 細(xì)胞的生長(zhǎng)?？筩-met也可以抑制由這些細(xì)^>產(chǎn)生的HGF的促運(yùn)動(dòng)作 用。
本發(fā)明人確定了抑制個(gè)體中的癌發(fā)生和/或轉(zhuǎn)移的方法，包括給個(gè) 體施用有效量的內(nèi)源c-met配體或其片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解， 在此可以采用各種給個(gè)體施用有效量的內(nèi)源c-met配體或其片段的方 法。本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)當(dāng)理解，給個(gè)體施用的內(nèi)源c-met配體包括全 長(zhǎng)內(nèi)源c-met配體、內(nèi)源c-met配體片段或其組合。本文使用的"內(nèi)源
c-met配體片段"是指具有與全長(zhǎng)內(nèi)源c-met配體具有相同活性的全長(zhǎng) 內(nèi)源c-met配體的任何片l殳，或者是全長(zhǎng)內(nèi)源c-met配體的化學(xué)或結(jié)構(gòu) 類似物。內(nèi)源c-met配體的例子包括但不限于天然和/或重組抗c-met免 疫球蛋白、天然和/或重組肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)或其組合。
本發(fā)明人還確定了抑制個(gè)體中自分泌產(chǎn)生的內(nèi)源HGF與c-met受 體相互作用的方法。該方法包括給個(gè)體施用有效量的內(nèi)源c-met配體或 其片段。這種對(duì)自分泌產(chǎn)生的內(nèi)源HGF的相互作用的抑制也將增強(qiáng)內(nèi) 分泌產(chǎn)生的內(nèi)源HGF產(chǎn)物與c-met受體的相互作用。
抗c-met不抑制正常HGF (內(nèi)分泌環(huán)^各)的作用(圖16),它的產(chǎn)生可 能因?yàn)殄憻挾黾硬⑶以趪?yán)重炎癥期間被消耗。因此，鍛煉可以引發(fā) 損傷愈合，并且抑制HGF/c-met相互作用介導(dǎo)的癌癥侵襲。血管發(fā)生、 細(xì)胞分裂、遷移和形態(tài)發(fā)生受內(nèi)源c-met配體如HGF、 c-met、天然抗 c-met和抗HGF的影響。因此，本發(fā)明人已經(jīng)確定了影響個(gè)體的血管發(fā) 生、細(xì)胞分裂、遷移和/或形態(tài)發(fā)生的方法。該方法包括給個(gè)體施用有 效量的內(nèi)源c-met配體或其片段、抗HGF或其片段、或其組合。
抗c-met與內(nèi)分泌產(chǎn)生的HGF聯(lián)合對(duì)損傷的上皮細(xì)胞的再生作用 以及對(duì)轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞的凋亡作用可能刺激誘導(dǎo)抗c-met的產(chǎn)生或外 源性施用。鍛煉和疫苗接種是誘導(dǎo)天然抗c-met產(chǎn)生的例子。在手術(shù)之 前、期間、之后和/或在切除腫瘤后外源性施用內(nèi)源c-met配體或其片 段可以消除高侵襲性轉(zhuǎn)化上皮細(xì)胞并且降低了遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。高靈 敏性、高特異性的納米技術(shù)可以辨別并且特異性地消除腫瘤中表達(dá) HGFmRNA的轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞，以降低侵襲的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于其它細(xì)胞因 子來(lái)說(shuō)，在正常和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞上存在具有不同性質(zhì)的不同種類生長(zhǎng)因 子的類似現(xiàn)象可能是事實(shí)。
本發(fā)明人已經(jīng)確定在健康人的血液中發(fā)現(xiàn)了大量的天然抗c-met 抗體。該抗體是高度糖基化的免疫球蛋白，它在急性或慢性炎癥過(guò)程 中被消耗，并且可能隨著體育鍛煉而增多，因此抗體的產(chǎn)生可能因?yàn)?鍛煉而增強(qiáng)并且在炎癥過(guò)程中被消耗。本發(fā)明還涉及確定自身免疫病 患者血液中少量抗c-met配體的存在。
本發(fā)明人進(jìn)一 步確定了調(diào)節(jié)個(gè)體中的內(nèi)源c-met配體或其片,殳的 量的方法。該方法包括檢測(cè)個(gè)體中內(nèi)源c-met配體或其片段的水平，并 且給個(gè)體施用有效量的內(nèi)源c-met配體或其片段。
實(shí)施例
實(shí)^r詳述如下
研究對(duì)象
A-健康志愿者
收集46名健康供血者(22名女性，24名男性；18-57歲，中值為 36歲)的血清。
本研究中也包括8名受過(guò)良好訓(xùn)練的健康志愿者(6名男性，2名 女性；平均年齡36歲，范圍25-49歲)。這8名志愿者在電動(dòng)制動(dòng)的計(jì) 算機(jī)控制的自行車上進(jìn)行運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)。運(yùn)動(dòng)之前(仰臥位)、運(yùn)動(dòng)大約 一半時(shí)間時(shí)、最大運(yùn)動(dòng)量時(shí)、運(yùn)動(dòng)后4分鐘和10分鐘時(shí)(仰臥位)立 即抽取靜脈血樣。在分析前將樣品保存在-70。C。
B-肺炎患者
在抗生素治療之前和18-24小時(shí)后，采集16名經(jīng)X射線^r查證實(shí)為 肺炎的患者(10名男性和6名女性；22-90歲，中值為72歲)的血漿， 在分析之前保存在-70。C。這些患者曾經(jīng)作為以前的研究的一部分(接 受的文章,Chemotherapy)。
C-炎性腸病(IBD)和感染性胃腸炎患者
采集48名已知IBD患者(28名女性和20名男性；范圍為19-85歲， 中值為56歲)的血漿，這些患者在Link印ing大學(xué)醫(yī)院胃腸病科 (Department of Gastroenterology, University Hospital in Linkdping )','臺(tái)療。
也采集了9名收入傳染病科的急性胃腸炎患者(6名女性，3名男 性；范圍為25-86歲，中值為65歲)的血漿。糞便培養(yǎng)物有2例為空腸 彎曲桿菌(Ca附p;;/o6a"er m') P日性，有2例為艱難4炎菌(C7oW〃W/ww #c//e)陽(yáng)性，有2例為沙門(mén)氏菌(Salmonella DO )陽(yáng)性，有3例為陰
性。這些患者曽作為以前的研究的一部分。 D-下肢慢性潰瘍患者
采集12名下肢慢性潰瘍患者(8名女性，4名男性；44-89歲，中值 為76歲)的血液。這些患者曾經(jīng)作為以前的研究的一部分。 E-反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎患者
在疾病急性期和3-6個(gè)月后，采集10名在感染性胃腸炎后發(fā)展的 反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎患者(7名女性，3名男性；范圍為17-78歲，中值為36 歲)的血液，
F-韋格納肉芽腫血管炎患者
采集了 U名未確診的已知韋格納肉芽腫血管炎患者的血液。 方法
用于SPR測(cè)定的配體固定方法
SPR測(cè)定在裝備有4個(gè)流動(dòng)池的全自動(dòng)Biacore 2000儀器(Biacore AB, Uppsala,瑞典)中在760 nm下進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)中的流動(dòng)池溫度為 25。C。使用的樣品表面是羧曱基化的葡聚糖CM5芯片(Biacore AB, Uppsala,瑞典)。配體與葡聚糖水凝膠的羧酸基團(tuán)的偶聯(lián)通過(guò)常規(guī)碳 二亞胺化學(xué)法使用200 mM EDC (N-乙基-N'-(3-二乙基氨基丙基)碳二 亞胺)和50mMNHS(N-羥基琥珀酰亞胺)進(jìn)行?；罨瘯r(shí)間為7分鐘，然 后是2-7分鐘的配體注射。剩余的活性酯的滅活通過(guò)在7分鐘內(nèi)注射pH 8.5的乙醇胺/鹽酸鹽來(lái)進(jìn)行。在固定期間使用5 nl/min的流速。將配體 在10 mM乙酸鹽緩沖液pH 4.5 (即，低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn))中稀釋，從 而提高葡聚糖基質(zhì)和配體之間的靜電相互作用。重組Met原癌基因受 體(IOO ng, R&D Systems)、單克隆抗HGF受體(100 |ug/ml， R&D Systems)和人白蛋白200mg/mL (Octaphanna)以1:5稀釋。接觸時(shí)間為 2-7分鐘。將樣品在HBS緩沖液、PBS (pH 7.4)、 MQ水、生理鹽水+ EDTA中稀釋為不同的濃度和不同的組合，并且分別檢測(cè)。為了獲得 可靠的結(jié)果， 一個(gè)芯片上最多進(jìn)行80個(gè)試驗(yàn)。使用硼酸鹽緩沖液(pH 8.5)和/或5 mM甘氨酸緩沖液pH 2.0和1 M NaCl的組合作為再生li沖 液。
通過(guò)親和層析和SDS-PAGE純化血樣
親和層斥斤4主(Hi國(guó)trap Amersham Biosciences)用重組人HGF受體 (c-MET)/Fc嵌合體(R&D Systems)固定。來(lái)自供血者的血清或血漿樣品 在PBS (pH7.4)中重建并且注射到柱中。^使用含有1 MNaCl的5 mM甘 氨酸緩沖液pH 2.0作為洗脫緩沖液。然后將樣品加至500 pl的離心管 (Amicon Ultra, Millipore, S.A.S. Molsheim，法國(guó))中，以4000 G離心l 小時(shí)。按照說(shuō)明書(shū)使用白蛋白和IgG去除試劑盒(Amersham Biosciences)和天然去糖基化試劑盒(Sigma Alrich)。
用純化、過(guò)濾和除去白蛋白和IgG之前和之后的血才羊進(jìn)行 SDS-PAGE,采用4%積層膠和11-14.6%丙烯酰胺電泳膠。為進(jìn)行大小 估計(jì)，將預(yù)染色的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(Sigma Aldrich)同時(shí)進(jìn)行電泳。
初級(jí)角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物
從一名總體表面積80%燒傷的30歲男性患者的腹股溝區(qū)的皮膚 活檢組織獲得細(xì)胞，接種進(jìn)行組織再生(Karocell AB Stockholm)。將 制備的細(xì)胞在添加有15%馬血清、2.5%胎牛血清(Sigma-Aldrich Stockholm,瑞典)和抗生素(10%，青霉素、鏈霉素、兩性霉素B， Sigma Aldrich)的Kaighn改良的Ham F-12K培養(yǎng)基(ATCC)中在5% (302和95% 空氣的氣氛下于37。C再培養(yǎng)。使圍繞角質(zhì)形成細(xì)胞島含有皮膚成纖維 細(xì)胞的單層生長(zhǎng)。使用無(wú)菌針從角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物中收集細(xì)胞，在 補(bǔ)充的HaniF-12K培養(yǎng)基(如上所述)中再培養(yǎng)。本發(fā)明人在幾次傳 代后成功獲得純角質(zhì)形成細(xì)胞單層(產(chǎn)生角蛋白，正在準(zhǔn)備的文章)。 每到第5天收集培養(yǎng)基，以1000g離心10分鐘，保存在-70。C。同時(shí)用 非酶細(xì)胞分離溶液(lx) (Sigma-Aldrich)分離匯合的細(xì)胞培養(yǎng)物，并將 其懸浮在含15。/o馬血清和2.5Q/。胎牛血清+抗生素的F-12K培養(yǎng)基中。健 康供體的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞作為商品獲得(Karocell AB Stockholm)。
來(lái)源于小鼠皮膚、黑素細(xì)胞、黑素瘤的CCL-53.1粘附上皮細(xì)胞從 美國(guó)組織細(xì)胞保藏中心(ATCC, Manassas, Virginia, USA)獲得，在添加 有15%馬血清、2.5%胎牛血清(Sigma-Aldrich)和10%抗生素的Kaighn
改良的Ham F-12K培養(yǎng)基(ATCC)中在5。/。 (^02和95%空氣的氣氛下于 37。C生長(zhǎng)，接種于24孔培養(yǎng)板(Nunc Brand Products, Roskilde,丹麥) 上，在相同條件下培養(yǎng)24小時(shí)，直到它們達(dá)到匯合。用無(wú)菌鋼具刮下 匯合的單層。脫壁的細(xì)胞用PBS洗滌。用顯微鏡(01ympus)測(cè)量每個(gè)孔 未被細(xì)胞覆蓋的方形面積(mm2)并記錄。然后將收集的培養(yǎng)人角質(zhì)形 成細(xì)胞(l ml)的培養(yǎng)基加入到細(xì)胞中，在含有5% C02的潮濕氣氛中于 37。C孵育。使用收集的前一代CCL-53.1細(xì)胞的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。 使用SPR反應(yīng)性重組人HGF (提交的文章)和利用肝素親和柱從健康供 血者中純化的HGF作為陽(yáng)性對(duì)照。24小時(shí)后，再次測(cè)量并記錄未^皮單 層覆蓋的面積。使用及不使用抗人HGF抗體(R&D Systems)和抗HGF 受體/c-Met抗體(R&D Systems)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行6個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。 統(tǒng)計(jì)學(xué)
數(shù)值為正態(tài)分布，因此在將數(shù)值轉(zhuǎn)化為它們的自然對(duì)數(shù)后使用分 組方差分析(ANOVA， SPSS 13.1)和線性回歸。也利用非參數(shù)4全驗(yàn) Wilcoxen符號(hào)秩檢驗(yàn)驗(yàn)證某些結(jié)果。p<0.05的概率水平被認(rèn)為具有統(tǒng)
計(jì)學(xué)顯著性。 結(jié)果
結(jié)果在重組c-met固定的SPR流動(dòng)池中發(fā)現(xiàn)信號(hào)。在分析前向血 液中添加c-met后信號(hào)顯著減弱(p<0.00001)。添加抗人HGF單克隆/多 克隆抗體或人白蛋白也顯著減弱了信號(hào)(pO.OOl)。然而，添加商品抗 c-met抗體增強(qiáng)了信號(hào)強(qiáng)度(p〈0.01)。在患者的年齡和性別與信號(hào)強(qiáng)度 之間沒(méi)有相關(guān)性。在運(yùn)動(dòng)期間信號(hào)增強(qiáng)，而在患病期間信號(hào)減弱。血 清和血漿樣品之間沒(méi)有顯著差異。通過(guò)SDS-Page證實(shí)，利用c-met固 定的親和柱純化血液產(chǎn)生兩條超過(guò)150 kDa的帶。除去白蛋白和IgG導(dǎo) 致SDS-Page中的條帶和SPR中的信號(hào)消失。去糖基化處理使條帶降至 大約120kDa。對(duì)抗人肝炎HBs免疫球蛋白的分析得到相同的結(jié)果。添 加抗乙型肝炎HBs抗體以及商品抗c-met抑制了上皮細(xì)胞以自分泌方 式產(chǎn)生的HGF的促運(yùn)動(dòng)作用，但是不抑制健康者血液中產(chǎn)生的HGF的 作用。在S期向產(chǎn)生自分泌HGF的皮膚上皮細(xì)胞中添加抗c-met或SPR 反應(yīng)性重組HGF導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但不影響正常皮膚上皮細(xì)胞。 健康供血者和受過(guò)良好訓(xùn)練的志愿者
SPR:在重組人HGF受體/c-met固定的流動(dòng)池(c-met通道)中檢測(cè) 到信號(hào)。在配對(duì)的血清和血漿樣品的SPR信號(hào)之間沒(méi)有顯著性差異 (p=0.56)。當(dāng)樣品在PBS (pH7.4)中稀釋時(shí)獲得最可靠的結(jié)果。樣品在 生理鹽水+ EDTA中稀釋不影響結(jié)果。在添加單克隆/多克隆抗HGF 抗體之后信號(hào)輕微地但是顯著性地減弱(pO.OOl)。在分析之前向樣品 中添加重組人HGF受體/c-met之后信號(hào)嚴(yán)重減弱(p0.0001)(圖1)。添 加人白蛋白輕微地但是顯著地減弱了信號(hào)(pO.Ol)。然而，向樣品中 添加人抗c-met抗體增強(qiáng)了信號(hào)強(qiáng)度(pO.Ol)。通過(guò)除去白蛋白和IgG 處理血樣使信號(hào)顯著減弱(p<0.0001)。對(duì)人肝炎Hbs抗體(Aunative， Octapharma)的分析在c-met通道中得到相同的信號(hào)。向樣品中添加 c-met或除去白蛋白和IgG后信號(hào)消失。在除去白蛋白和IgG后向樣品 中添加白蛋白(Aunativ)未產(chǎn)生任何信號(hào)。
SDS-Page:通過(guò)凝膠電泳分析了利用固定有c met的親和層析柱 純化的血漿。發(fā)現(xiàn)了兩條分子量M20kDa的線， 一條線為大約95 kDa， 第三條線為66 kDa。還發(fā)現(xiàn)了大約35 kDa的另外第四條線(圖2)。
在除去白蛋白和IgG后，>120和66 kD的線消失，而顯示了兩條 不同的大約55和25 kDa的條帶(圖3)。 Avmativ的SDS-Page得到兩條 〉120kDa的條帶，其在除去白蛋白和IgG后消失(圖4)。利用親和柱純 化的血樣的去糖基化使條帶的分子量降至大約100及75kDa(圖5)。
研究對(duì)象研究對(duì)象的年齡和性別與SPR信號(hào)之間沒(méi)有相關(guān)性 (p=0.44)。延長(zhǎng)注射時(shí)間提高了健康供血者中的c-met親和力(圖6)。受 過(guò)良好訓(xùn)練的志愿者的c-met親和力信號(hào)顯示非顯著性的趨勢(shì)，在運(yùn)動(dòng) 之前的平均值(范圍)為726RU (171-1536)，在運(yùn)動(dòng)一半時(shí)為762RU (230-1696)，在最大運(yùn)動(dòng)量時(shí)為733 RU (295-1558)，在運(yùn)動(dòng)后4分鐘為 924 RU (303-2051)， 10分鐘后為851 RU (316-1997)(圖7)。還通過(guò) ELISA測(cè)定了血液中的HGF濃度。為了說(shuō)明血細(xì)胞比容的可能的變化， 將血清HGF對(duì)平均白蛋白濃度進(jìn)行校正。
校正的HGF顯示非顯著性的趨勢(shì)，運(yùn)動(dòng)之前的平均值(范圍) 為0.55 (0.31-0.77),運(yùn)動(dòng)一半時(shí)為0.60 (0.36-0.77)，最大運(yùn)動(dòng)量時(shí)為 0.70 (0.32-1.16)，運(yùn)動(dòng)后4分鐘為0.74 (0.36-1.30)， 10分鐘后為0.60 (0.31-1.03)(圖8)。
肺炎患者
健康對(duì)照和肺炎患者的c-met通道的信號(hào)強(qiáng)度之間沒(méi)有顯著性差 異(11=16， p=0.37)。在所有病例中，治療期間信號(hào)強(qiáng)度顯著減弱 (Wilcoxen符號(hào)秩檢驗(yàn)，p<0.01),無(wú)論它們是否對(duì)治療具有應(yīng)答。
IBD/急性胃腸炎患者
盡管在急性胃腸炎患者(11=9)和健康對(duì)照(11=9，同時(shí)分析)的c-met 通道的信號(hào)強(qiáng)度之間沒(méi)有顯著性差異，但是IBD患者(n=48)的信號(hào)水 平比急性胃腸炎患者和健康對(duì)照顯著降低(pi.005)。 IBD患者的血液 對(duì)于抗HGF通道的親和力比正常對(duì)照顯著降低(pO.Ol),并且對(duì)c-met 通道和抗-H GF通道的親和力之間具有差異。
下肢慢性潰瘍患者
盡管某些下肢慢性潰瘍患者的c-met通道的信號(hào)強(qiáng)度較低，但是這 些患者(n= 12)與健康對(duì)照(n=l9 ，同時(shí)分析)之間的總體差異沒(méi)有達(dá)到 顯著性^=0.053)。慢性潰瘍患者的血液對(duì)于抗HGF通道的親和力顯著 低于正常對(duì)照(pO.OOOl)(圖9),并且這些患者對(duì)c-met通道和抗-HGF 通道的親和力之間具有差異。
反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎(ReA)患者
從ReA患者(n-10)和健康對(duì)照(n=l O)獲得的c-met通道親和力沒(méi)有 顯著性差異。但是，與對(duì)照相比，這些患者在抗c-met固定的流動(dòng)池中 具有高水平的信號(hào)(pO.Ol)。從疾病的急性期到3-6個(gè)月內(nèi)的恢復(fù)期， c-met和抗c-met固定的流動(dòng)池中的信號(hào)強(qiáng)度顯著降低(Wilcoxen符號(hào)秩 檢驗(yàn)，pO.01)(圖10)。
韋格納肉芽肺血管炎患者
盡管對(duì)于抗HGF流動(dòng)池的親和力與正常健康對(duì)照相同，但是本發(fā) 明人》見(jiàn)察到這些患者(n=l 1 ， pO.05)對(duì)c-met流動(dòng)池的親和力與同 一芯
片中檢測(cè)的健康對(duì)照(n=3O)相比顯著性降低。 對(duì)損傷的人角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)活'f生
從嚴(yán)重皮膚損傷者中獲得的人角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生角蛋白(圖ll)和 HGF (圖12-13)。從細(xì)胞獲得的培養(yǎng)基在CCL-53.1細(xì)胞中誘導(dǎo)促運(yùn)動(dòng)活 性。在研究來(lái)自健康皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基時(shí)沒(méi)有觀察到這種效 果。損傷的角質(zhì)形成細(xì)胞自分泌產(chǎn)生的HGF的促運(yùn)動(dòng)作用不能被單克 隆/多克隆抗HGF抗體抑制，而添加多克隆抗c-met抗體以及Aunativ完 全抑制了 CCL-53.1細(xì)胞對(duì)損傷區(qū)域的促運(yùn)動(dòng)活性。但是在用生物活性 重組HGF或利用肝素親和柱從健康供血者中純化的HGF處理的孔(陽(yáng) 性對(duì)照)中，添加抗c-met不能抑制細(xì)胞的促運(yùn)動(dòng)活性，而抗HGF抗體 完全抑制了這種作用(圖14)。
S期的細(xì)胞
CCL-53.1細(xì)胞在傳代時(shí)向細(xì)胞中添加SPR-反應(yīng)性重組HGF、從 供血者中純化的HGF或抗-HGF對(duì)細(xì)胞沒(méi)有顯著影響。在4/6的實(shí)驗(yàn)中， 添加抗c-met導(dǎo)致細(xì)胞脫落。
正常人角質(zhì)形成細(xì)胞在傳代時(shí)添加SPR-反應(yīng)性HGF或抗c-met 對(duì)細(xì)胞沒(méi)有影響。
自分泌產(chǎn)生HGF的上皮細(xì)胞在所有實(shí)驗(yàn)中，在傳代時(shí)添加SPR-反應(yīng)性重組HGF導(dǎo)致細(xì)胞的數(shù)目和與孔底部的附著顯著降低。添加抗 c-met導(dǎo)致細(xì)胞從底部脫落(14小時(shí))，以及細(xì)胞死亡(24小時(shí))，但 是不影響細(xì)胞數(shù)。
此處描述的具體說(shuō)明和實(shí)施方案在性質(zhì)上只是示例性的，不是用 來(lái)限制由權(quán)利要求書(shū)限定的本發(fā)明。基于本說(shuō)明書(shū)，進(jìn)一步的實(shí)施方 案和實(shí)施例對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，并且屬于本發(fā)明 的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抑制個(gè)體中的癌發(fā)生和/或轉(zhuǎn)移的方法，包括給個(gè)體施用有效量的內(nèi)源c-met配體或其片段。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述內(nèi)源c-met配體或其片段包括天然 的和/或重組的內(nèi)源抗c-met免疫球蛋白、天然的和/或重組的內(nèi)源生物 活性肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、和/或其組合。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中所述內(nèi)源c-met配體或其片段抑制產(chǎn)生 自分泌HGF的細(xì)胞的生長(zhǎng)。
4. ;f又利要求l的方法，其中所述內(nèi)源c-met配體或其片革殳在手術(shù)之 前、期間和/或之后施用。
5. 權(quán)利要求l的方法，其中個(gè)體中內(nèi)分泌產(chǎn)生的內(nèi)源HGF的效果 增強(qiáng)。
6. 權(quán)利要求l的方法，其中個(gè)體的鍛煉進(jìn)一步抑制了轉(zhuǎn)移和/或癌 發(fā)生。
7. —種抑制個(gè)體中自分泌產(chǎn)生的內(nèi)源HGF與c-met受體相互作用 的方法，包括給個(gè)體施用有效量的內(nèi)源c-met配體或其片段。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中內(nèi)分泌產(chǎn)生的內(nèi)源HGF產(chǎn)物的效果和 /或生物活性增強(qiáng)。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中自分泌產(chǎn)生的HGF產(chǎn)物的效果和/或生 物活性受到抑制。
10. 權(quán)利要求8的方法，其中再生效果增強(qiáng)。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中受損傷的上皮細(xì)胞再生。
12. 權(quán)利要求8的方法，其中間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的HGF的促運(yùn)動(dòng)效 果增強(qiáng)。
13. —種影響個(gè)體中的血管發(fā)生、細(xì)胞分裂、遷移和/或形態(tài)發(fā)生 的方法，包括給個(gè)體施用有效量的內(nèi)源c-met配體或其片段、抗-HGF 或其片段、或其組合。
14. 一種調(diào)節(jié)個(gè)體中內(nèi)源c-met配體或其片段的量的方法，包括檢測(cè)個(gè)體中的內(nèi)源c-met配體或其片段的水平并且給該個(gè)體施用有效量 的內(nèi)源c-met配體或其片段。
15. —種區(qū)別自分泌和內(nèi)分泌產(chǎn)生的HGF的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了抑制個(gè)體中的癌發(fā)生和/或轉(zhuǎn)移的方法，包括給個(gè)體施用有效量的內(nèi)源c-met配體或其片段，如天然的和/或重組的內(nèi)源抗c-met免疫球蛋白、天然的和/或重組的內(nèi)源生物活性肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、和/或其組合。
文檔編號(hào)A61K39/00GK101360511SQ200680051230
公開(kāi)日2009年2月4日 申請(qǐng)日期2006年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月16日
發(fā)明者塔耶布·內(nèi)耶里, 法里巴·內(nèi)耶里 申請(qǐng)人:法里巴·內(nèi)耶里;塔耶布·內(nèi)耶里