專利名稱：T細(xì)胞受體和編碼該受體的核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及構(gòu)成MAGE-A4143.15i肽特異性的、HLA-A2402限制性 T細(xì)胞受體(TCR)a鏈的多肽、編碼該多肽的核酸、構(gòu)成上述TCR的卩 鏈的多肽、編碼該多肽的核酸、由上述構(gòu)成a鏈的多肽與構(gòu)成p鏈的 多肽構(gòu)成的T細(xì)胞受體、含有上述核酸的重組核酸、含有該重組核酸 的栽體、導(dǎo)入了上述核酸或栽體的細(xì)胞、以及含有上述栽體或細(xì)胞作 為有效成分的抗癌藥。
背景技術(shù)：
細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)中有可通過特異性的T細(xì)胞受體(T cell receptor,以下簡稱為TCR)識別由主要組織相容性抗原基因復(fù)合體 (Major histocompatibility gene compler，以下簡稱為MHC)編碼的主要 組織相容性抗原分子(MHC分子，為人時，稱為人白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen )，以下簡稱為HLA)與抗原肽的結(jié)合物——復(fù)合體， 殺傷在細(xì)胞表面呈遞該復(fù)合體的細(xì)胞的細(xì)胞。因此，該細(xì)胞毒反應(yīng)成 立必須是l)有CTL存在，該CTL具有對靶細(xì)胞的HLAI類類型特異 性的TCR, 2)有抗原肽存在，該抗原肽與HLA分子結(jié)合形成的復(fù)合 體可被TCR識別。
上述抗原肽例如是在哺乳類細(xì)胞內(nèi)合成的抗原等在細(xì)胞質(zhì)中加 工，分解成小的肽而產(chǎn)生，并且與HLA分子締合，呈遞于細(xì)胞表面。 即，在由很多亞單元構(gòu)成的蛋白酶體復(fù)合體中，蛋白質(zhì)被分解為含有 8-15個氨基酸的肽，其中的幾個通過TAP轉(zhuǎn)運蛋白從細(xì)胞質(zhì)中運輸 到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。這些肽如果在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與I類/p2微球蛋白的雜二聚體結(jié) 合，則形成三分子復(fù)合體，較穩(wěn)定，通過高爾基體轉(zhuǎn)運到細(xì)胞表面。 表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原蛋白的腫瘤細(xì)胞應(yīng)該可以將被T 細(xì)胞識別的HLA限制性抗原肽呈遞于細(xì)胞表面。
已知HLAI類分子主要有HLA-A、 -B、 -C,與它們結(jié)合并呈遞的 抗原肽含有8-10個氨基酸，并且根據(jù)各個HLA分子的不同而具有不 同的一定的結(jié)構(gòu)上的特征。例如，與世界上頻率最高的HLA-A2.1分子結(jié)合的肽最為已知的是自N末端第2號為Leu、且C末端具有Leu 或Val的含9-10個氨基酸的肽。與以日本人為代表的亞洲人種中較多 的HLA-A24分子結(jié)合的肽最為已知的是自N末端第2號為Tyr、Phe、 Met、 Trp其中之一，且C末端具有Leu、 Ile、 Trp、 Phe其中之一的 含有9-10個氨基酸的肽。
目前，抗原肽已經(jīng)得到鑒別的胂瘤抗原有與HLA-A1結(jié)合的 MAGE-A1、 MAGE-A3、 MAGE-A4，與HLA-A2.1結(jié)合的MAGE-A3、 MART1、酪氨酸酶、gp100、 HER2/neu、 CEA等，與HLA-Cwl結(jié)合 的MAGE-A3，與HLA-B44結(jié)合的MAGE-A3,與HLA-B37結(jié)合的 MAGE-A4，與HLA-A24結(jié)合的MAGE-A1、 MAGE-A2、 MAGE-A3、 MAGE-A4、 NY-ESO-l、 CEA、 HER2/neu、酪氨酸酶、|3-連環(huán)蛋白 (Catenin )等。其中的大部分是首先將識別腫瘤細(xì)胞的I類限制性CTL 進行林化，鑒定該CTL所識別的腫瘤抗原，接著通過遺傳工程學(xué)方法 發(fā)現(xiàn)腫瘤抗原蛋白中的最小單位，再以與HLAI類分子結(jié)合的基序相 關(guān)的信息為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)最小單位中的肽。或者首先以與上述HLAI類 分子結(jié)合的肽中共通的基序結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)腫瘤抗原蛋白中的HLA I類分子結(jié)合肽，接著利用抗原呈遞細(xì)胞選擇可誘導(dǎo)CTL的抗原肽， 最后通過確認(rèn)對腫瘤細(xì)胞具有毒性的CTL是否被誘導(dǎo)來確定抗原肽。 HLA I類分子被分成幾個亞型，其保守亞型的種類在人種之間有 很大差異，世界上HLA-A2最多，白色人種的45。/。是HLA-A2陽性。 該HLA-A2限制性抗原肽的鑒定發(fā)展最快。在日本人中，HLA-A2陽 性占40%，觀察其亞型則與白色人種相同，HLA-A'0201陽性為20%, 其余的大多是A'0206陽性。與這些亞型結(jié)合的肽不同，主要研究的 HLA-A2是HLA-A*0201。在日本人中，HLA-A24陽性占60%以上， 亞洲人種與其它人種相比，HLA-A24陽性率高。因此，HLA-A24限 制性抗原肽的發(fā)現(xiàn)對于亞洲人種、特別是日本人，在通過誘導(dǎo)特異性 地作用于腫瘤細(xì)胞的CTL、提供對肺瘤治療有用的CTL方面顯示重 要作用。
即使是相同的抗原，HLA不同則其抗原肽也不同，因此，利用 抗原肽誘導(dǎo)CTL較為繁雜。為解決該問題曾進行了各種研究，但尚未 得到另人滿意的成果。研究的一個方面是將抗原基因?qū)雭碜曰颊弑?身的抗原呈遞細(xì)胞，利用其進行T細(xì)胞誘導(dǎo)的方法。對于抗原呈遞細(xì)胞，研究了B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹狀細(xì)胞，以作為專門的抗原呈遞細(xì) 胞而已知的樹狀細(xì)胞為中心，實施了將其以疫苗的佐劑等的形式進行 應(yīng)用的臨床實驗。但問題是準(zhǔn)備免疫誘導(dǎo)必需量的這些抗原呈遞細(xì)胞 要花費很多人力。B細(xì)胞可以通過EB病毒的活化來大量制備，但是 由于是使用病毒，在安全性上有問題。
作為腫瘤抗原特異性TCR基因，例如克隆了 HLA-A2限制性的 MART1特異性TCR [非專利文獻l]、 MAGE-A3特異性TCR [非專利 文獻2]、 CAMEL (CTL-黑素瘤識別抗原(CTL-recognized antigen on melanoma))特異性TCR [非專利文獻3]、 gpl00特異性TCR [非專利 文獻4]、 NY-ESO-1特異性TCR [非專利文獻5]、 HLA-24限制性的 WT1 (腎母細(xì)胞瘤l)特異性TCR [非專利文獻6]、 HLA-Cwl6限制性 的MAGE-A1特異性TCR[非專利文獻7]等的基因。
通過將TCR基因?qū)氲饺我獾腃TL中，有望使其具有目標(biāo)抗原 特異性細(xì)胞毒活性。椐此，人們嘗試了以MARTI [非專利文獻8]、 gpl00 [非專利文獻4]和mHAG HA-2抗原[非專利文獻9]為耙的TCR 基因治療。
MAGE-A4是屬于癌-睪丸抗原家族的MAGE亞家族的抗原，在各 種癌中表達(dá)，并且具有高抗原性(在60%的食道癌、50%的頭頸部癌、 24%的非小細(xì)胞肺癌、33%的胃癌和21%的何杰金病中顯示陽性)，因 此有望作為癌癥疫苗療法的靶抗原。并取得了 HLA-A24限制性的、 MAGE-A4n3-m肽特異性CTL克隆[非專利文獻10〗。
非專利文獻l: CancerRes，第54巻，第5265-5268頁(1994) 非專利文獻2: Anticancer Res,第20巻，第1793-1799頁(2000) 非專利文獻3: Int. J. Cancer，第99巻，第7-13頁(2002) 非專利文獻4: J. Immunol,第170巻，第2186-2194頁(2003) 非專利文獻5: J. Immunol,第174巻，第4415-4423頁(2005) 非專利文獻6: Blood，第106巻，第470-476頁(2005) 非專利文獻7: Int. Immunol,第8巻，第1463-1466頁(1996) 非專利文獻8: J. Immunol,第163巻，第507-513頁(1999) 非專利文獻9: Blood，第103巻，第3530-3540頁(2003) 非專利文獻10: Clin， CancerRes,第11巻，第5581-5589頁(2005)

發(fā)明內(nèi)容
作為識別腫瘤相關(guān)抗原的HLA-A24限制性TCR基因，已知有識 別WT1的TCR基因，與HLA-A2.1相比，對其分析研究進展較緩慢， 無法對亞洲人種、特別是日本人的腫瘤治療提供有用的TCR基因。 因此，人們希望發(fā)現(xiàn)識別各種腫瘤抗原的HLA-A24限制性的新型TCR基因。
在生物體內(nèi)，經(jīng)由TCR擔(dān)負(fù)細(xì)胞毒活性的是具有抗原特異性TCR 的CTL,將其在體外繁殖并應(yīng)用于癌等疾病的治療時，這些細(xì)胞的使 用、例如采集或放大培養(yǎng)尚存在問題。因此，人們迫切希望能夠提供 可用于大量且容易地制備具有所需抗原特異性的CTL的對腫瘤抗原 等具有特異性的TCR基因。
本發(fā)明人對于識別腫瘤抗原的CTL進行了深入的研究，結(jié)果成功 地從識別腫瘤抗原MAGE-A4的HLA-A24限制性CTL中克隆了編碼 TCRa鏈和P鏈的cDNA。并且發(fā)現(xiàn)，通過向表達(dá)HLA-A24分子的 CTL等的細(xì)胞中導(dǎo)入由這些cDNA制備的RNA，這些細(xì)胞顯示 HLA-A24限制性的、MAGE-A4來源肽特異性細(xì)胞毒性，從而完成了 本發(fā)明。
本發(fā)明的第1方案涉及構(gòu)成HLA-A24限制性的、MAGE-A4143-151 特異性的T細(xì)胞受體的多肽、以及具有上述受體的可變區(qū)多肽的多肽。
本發(fā)明的第2方案涉及HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.151特異 性TCR,其特征在于該TCR由本發(fā)明第1方案的多肽構(gòu)成。
本發(fā)明的第3方案涉及編碼HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.151 特異性TCR的核酸，以及編碼具有上述受體可變區(qū)多肽的多肽的核 酸。
本發(fā)明的第4方案涉及重組核酸，該重組核酸含有本發(fā)明第3方
案的核酸。
本發(fā)明的第5方案涉及栽體，該載體插入了本發(fā)明第4方案的重
組核酸。
本發(fā)明的第6方案涉及表達(dá)HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.m 特異性TCR的細(xì)胞，其特征在于該細(xì)胞導(dǎo)入了本發(fā)明第3方案的 核酸，或者用第5方案的栽體轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的第7方案涉及抗癌藥，其特征在于該抗癌藥含有本發(fā)明第6方案的細(xì)胞或第5方案的栽體作為有效成分。
本發(fā)明的第8方案涉及癌的治療方法，該治療方法包含施與本發(fā) 明第7方案的抗癌藥的步驟。
本發(fā)明提供編碼HLA-A24限制性的、MAGE-A4,43.囚特異性TCR 的a鏈和p鏈的核酸。還提供將不具HLA-A24限制性、或者不具有 MAGE-A4143.151特異性的T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞使用的腫瘤細(xì)胞毒化方 法。上述效應(yīng)細(xì)胞例如在癌的治療中有用。


圖1是表示#2-28細(xì)胞、導(dǎo)入RNA的ms69細(xì)胞和ms69細(xì)胞的四 聚體測定的結(jié)果的圖。
圖2是表示#2-28細(xì)胞、導(dǎo)入RNA的CD8陽性細(xì)胞和CD8陽性 細(xì)胞的四聚體測定的結(jié)果的圖。
圖3是表示#2-28細(xì)胞、導(dǎo)入RNA的ms69細(xì)胞和ms69細(xì)胞的 ELISPOT測定的結(jié)果的圖。
圖4是表示導(dǎo)入RNA的CD8陽性細(xì)胞和CD8陽性細(xì)胞的 ELISPOT測定的結(jié)果的圖。
圖5是表示#2-28細(xì)胞、導(dǎo)入RNA的ms69細(xì)胞和ms69細(xì)胞的細(xì) 胞毒性的圖。
圖6是表示#2-28細(xì)胞、導(dǎo)入RNA的CD8陽性細(xì)胞和CD8陽性 細(xì)胞的細(xì)胞毒性的圖。
具體實施例方式
本發(fā)明的第1方案涉及構(gòu)成HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.m 特異性T細(xì)胞受體的多肽，該多肽具有上述受體的可變區(qū)的多肽。上 述多肽有TCRa鏈和TCR卩鏈兩種，兩種鏈組合，構(gòu)成HLA-A24限制 性的、MAGE-A4143_151特異性TCR。
上述a鏈多肽是可與P鏈一起形成HLA-A24限制性的、 MAGE-A4M3-m特異性TCR的多肽，作為a鏈可變區(qū)的多肽，指具有 選自序列表SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的多肽；序列表SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列中有一至多個氨基酸殘基缺失、附加、插入 或置換的多肽中的多肽的多肽。本發(fā)明中，來自TCR的a鏈的多肽含有上述Ct鏈可變區(qū)的氨基酸序列或與其類似的序列作為必須構(gòu)成成
分。包含含有恒定區(qū)的a鏈全部氨基酸序列(SEQIDNO,l)或與其類似 的序列、即具有一至數(shù)個氨基酸殘基缺失、附加、插入或置換的氨基 酸序列的多肽是本發(fā)明的優(yōu)選方案之一。
另外，上述卩鏈多肽是可與a鏈一起形成HLA-A24限制性的、 MAGE-A4l43.l51特異性TCR的多肽，p鏈可變區(qū)的多肽指具有選自序 列表SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列的多肽；序列表SEQ ID N0.7所 示的氨基酸序列中有至少一個氨基酸殘基缺失、不可、插入或置換的 多肽中的多肽的多肽。本發(fā)明中，來自TCR的p鏈的多肽含有上述卩 鏈可變區(qū)的氨基酸序列或與其類似的序列作為必須構(gòu)成成分。包含含 有恒定區(qū)的卩鏈全部氨基酸序列(SEQ IDNO,2)或與其類似的序列、即 具有一至數(shù)個氨基酸殘基缺失、附加、插入或置換的氨基酸序列的多 肽是本發(fā)明的優(yōu)選方案之一。
這里，"HLA-A24限制性的、MAGE-A4"3.^特異性TCR"是指特 異性識別具有序列表SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列的肽 (MAGE-A4143.151，以下簡稱為P143)與HLA-A24分子的復(fù)合體、且在 T細(xì)胞表面存在該TCR時，使該T細(xì)胞具有針對靶細(xì)胞的、HLA-A24 限制性的P143特異性細(xì)胞毒活性。特異性識別上述復(fù)合體可通過公 知的方法確認(rèn)，優(yōu)選的方法例如有使用HLA-A24分子和P143進行 的四聚體分析以及ELISPOT測定。通過進行ELISPOT測定，可以確 認(rèn)在細(xì)胞表面表達(dá)該TCR的T細(xì)胞通過TCR識別靶細(xì)胞，該信號傳 遞至細(xì)胞內(nèi)。上述復(fù)合體存在于T細(xì)胞表面時，可使該T細(xì)胞具有細(xì) 胞毒活性，其確認(rèn)方法也可采用公知方法，優(yōu)選的方法有例如鉻釋 放測定等對HLA-A24陽性靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的測定。
本發(fā)明的多肽可以使用后述的本發(fā)明的核酸，通過遺傳工程方法 生產(chǎn)。例如，將上述編碼a鏈多肽的核酸、編碼p鏈多肽的核酸兩者 導(dǎo)入細(xì)胞，通過表達(dá)a鏈、卩鏈多肽，可以使該細(xì)胞表達(dá)HLA-A24 限制性的、MAGE-A4143.151特異性TCR,
本發(fā)明的第2方案涉及HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.15i特異 性TCR，其特征在于該TCR由本發(fā)明的多肽構(gòu)成。上述TCR例如 可使用后述的本發(fā)明的核酸，使上述核酸所編碼的多肽人為地表達(dá)， 由此能夠以與天然伴隨的生物體成分分離的形態(tài)制備，但這并不受本發(fā)明特別限定。
本發(fā)明的第3方案涉及編碼HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.151 特異性TCR、或其可變區(qū)的核酸。
本發(fā)明的核酸是編碼具有TCRa鏈可變區(qū)多肽的多肽的核酸、或 者編碼具有TCR卩鏈可變區(qū)多肽的多肽的核酸，編碼TCR卩鏈多肽的 核酸或者編碼TCR a鏈多肽的核酸均導(dǎo)入到細(xì)胞中時，與 HL A-A24/M AGE-A4143.151復(fù)合體特異性結(jié)合的分子在上述細(xì)胞中表 達(dá)。編碼具有TCR a鏈可變區(qū)多肽的多肽的核酸包含編碼TCR a鏈多 肽的核酸、編碼TCRa鏈可變區(qū)多肽的核酸，而編碼具有TCR卩鏈可 變區(qū)多肽的多肽的核酸包含編碼TCR |3鏈多肽的核酸、編碼TCR卩 鏈可變區(qū)多肽的核酸。將編碼TCRa鏈多肽的核酸和編碼TCR(3鏈多 肽的核酸、編碼TCRa鏈可變區(qū)多肽的核酸和編碼TCRp鏈可變區(qū)多 肽的核酸、它們的任意組合導(dǎo)入細(xì)胞時，HLA-A24限制性的、 MAGE-A4143.151特異性TCR也在上述細(xì)胞中表達(dá)。
上述編碼a鏈多肽的核酸可列舉含有序列表SEQ ID NO.3所示堿 基序列的核酸、以及在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可以與上述堿基序列的核酸或其互 補鏈雜交的核酸，但這并不限定本發(fā)明。編碼a鏈多肽的可變區(qū)的核 酸可列舉含有序列表SEQ ID N0.6所示的堿基序列的核酸、以及在嚴(yán) 謹(jǐn)條件下可與上述堿基序列的核酸或其互補鏈雜交的核酸。上述編碼 卩鏈多肽的核酸可列舉含有序列表的SEQ IDN0.4所示的堿基序列的 核酸、以及在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與上述堿基序列的核酸或其互補鏈雜交的 核酸。編碼卩鏈多肽的可變區(qū)的核酸可列舉含有序列表的SEQ ID N0.8所示的堿基序列的核酸，以及在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與上述堿基序列 的核酸或其互補鏈雜交的核酸。
這里，嚴(yán)謹(jǐn)條件可列舉1989年、Cold Spring Harbor Laboratory 發(fā)行，J, Sambrook等人編輯，Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第二版等中記栽的條件。具體來說例如有在0.5%SDS、 5xdenhardt 溶液、含有0.01%改性鮭魚精子DNA的6xSSC中，與探針一起在65 。C溫育12-20小時的條件。與探針雜交的核酸例如在含有0,5%SDS的 O.lxSSC中、在37'C清洗，除去非特異性結(jié)合的探針，然后即可進行 檢測。
本說明書中的核酸是指單鏈或雙鏈的DNA、 RNA或DNA-RNA嵌合體、或DNA-RNA雜合雙鏈。核酸的全部或一部分為RNA時， RNA部分的序列可以是將本說明書序列表中的T更換為U。本發(fā)明的 優(yōu)選方案是本發(fā)明的編碼TCRa鏈多肽的核酸或者編碼TCRa鏈可
肽的核酸的兩種核酸的組合。上述核酸的組合用于在細(xì)胞中表達(dá) HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.151特異性TCR。
本發(fā)明的核酸例如可如下獲得。按照常規(guī)方法，由HLA-A24限 制性的、MAGE-A4,43-m特異性CTL、例如非專利文獻10的克隆#2-28 制備RNA，合成cDNA。以此為模板，使用與編碼TCRa鏈和卩鏈恒 定區(qū)的核酸互補的反義引物進行5'-cDNA末端快速擴增(RACE)。 5，-RACE可按照公知的方法進行，例如可以使用 CapFishing Full-Length cDNA Premix試劑盒(少一 ，-一》公司制)等市售的試劑盒 進行。通過上述方法擴增的DNA整合到質(zhì)粒栽體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。 由轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒，確定插入的DNA的堿基序列。
通過將所得堿基序列與已知的TCR a鏈和(3鏈的基因序列比較， 可以排除通過5'-RACE擴增的與TCR基因無關(guān)的DNA。 PCR時，在 堿基序列中產(chǎn)生突變的DNA可能被擴增，因此本發(fā)明中優(yōu)選使用由 多種大腸桿菌克隆確定序列、由其共有序列推定的、上述CTL原本所 具有的TCRa鏈和P鏈基因的序列。
具有序列表的SEQIDN0.3所示的堿基序列、編碼SEQIDNO.l 的氨基酸序列的TCRa鏈的核酸，以及具有序列表的SEQIDN0.4所 示的堿基序列、編碼SEQ IDN0.2的氨基酸序列的TCRp鏈的核酸通 過上述方法獲得。
本發(fā)明中，可以使用由上述方法得到的DNA,也可以化學(xué)合成具 有相同序列的核酸使用。
本發(fā)明的核酸中，編碼與構(gòu)成TCR的各鏈可變區(qū)相當(dāng)?shù)牟糠值暮?酸可以與編碼其它功能性分子例如編碼抗體或受體的核酸中編碼恒 定區(qū)或胞內(nèi)區(qū)的區(qū)域連接。這樣構(gòu)建的新型核酸具有HLA-A24限制 性的、MAGE-A4143_151特異性結(jié)合活性，可用于嵌合功能性分子的制 備。
本發(fā)明的第4方案是重組核酸，該重組核酸含有本發(fā)明的核酸。 上述重組核酸可列舉以下核酸附加了在將本發(fā)明的核酸導(dǎo)入細(xì)胞時，使上述核酸所編碼的多肽的翻譯成為可能的各種要素的核酸，但 這并不是限定本發(fā)明。
含有DNA的本發(fā)明的重組核酸可列舉具有啟動子(例如磷酸甘油 酸激酶啟動子、Xist啟動子、P-肌動蛋白啟動子、RNA聚合酶II啟動 子等來自哺乳類的啟動子，SV40早期啟動子、巨細(xì)胞病毒啟動子、 單純皰滲病毒的胸苷激酶啟動子、各種反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR啟動子等來 自病毒的啟動子)、終止子、增強子或其它的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域的重組核酸。 并且還可以編碼有助于第1發(fā)明的多肽翻譯的序列(Kozak序列等)。 上述各要素當(dāng)然是配置在上述功能性協(xié)作的位置，以適合由本發(fā)明的 核酸進行RNA的轉(zhuǎn)錄、多肽的翻譯。重組核酸為RNA時，則不需要 這些與控制轉(zhuǎn)錄相關(guān)的要素。
如后所述，本發(fā)明的重組核酸整合到栽體中使用，除此之外還可 以將作為RNA的本發(fā)明的核酸直接導(dǎo)入細(xì)胞，以此用于TCR表達(dá)。 RNA的導(dǎo)入方法可以采用公知的方法，例如可優(yōu)選使用電穿孔法。
本發(fā)明的第5方案涉及插入至少一個本發(fā)明的重組核酸的栽體。 上述栽體在使HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.151特異性TCR在所 需細(xì)胞中表達(dá)方面有用。特別優(yōu)選的方案是(l)插入兩種重組核酸的載 體，所述重組核酸是含有編碼本發(fā)明的TCRa鏈多肽或具有其可變區(qū) 多肽的多肽的核酸的重組核酸，以及含有編碼本發(fā)明的TCRP鏈多肽 或具有其可變區(qū)多肽的多肽的核酸的重組核酸；以及(2)插入了含有編 碼本發(fā)明的TCR a鏈多肽或具有其可變區(qū)多肽的多肽的核酸的重組 核酸的載體、與插入了含有編碼本發(fā)明的TCRp鏈多肽或具有其可變 區(qū)多肽的多肽的核酸的重組核酸的栽體的組合。上述(l)的方案中，編 碼TCRa鏈多肽的核酸與編碼TCRI3鏈多肽的核酸可通過各自的啟動 子進行轉(zhuǎn)錄、翻譯，也可使用內(nèi)部核糖體進入位點(IRES),用一個啟 動子進行轉(zhuǎn)錄、翻譯。
本發(fā)明使用的載體沒有特別限定，可根據(jù)目的從質(zhì)粒栽體、病毒 栽體等公知的栽體中選擇適當(dāng)?shù)脑泽w使用。例如，將上述重組核酸整 合到質(zhì)粒載體中時，向細(xì)胞中的導(dǎo)入可使用磷酸鈣法、陽離子脂質(zhì)體 法(cationic lipid method )、脂質(zhì)體法、電穿孔法等基因?qū)敕椒ā?br> 具有感染細(xì)胞、導(dǎo)入外來DNA的能力的病毒栽體適合本發(fā)明。 本發(fā)明中，可以使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括慢病毒栽體或假型栽體)、腺病毒栽體、腺病毒伴隨病毒栽體、皰療病毒栽體等公知的病毒栽體。 插入了本發(fā)明的重組核酸的病毒栽體可以在適合各病毒的條件下感 染目標(biāo)細(xì)胞，導(dǎo)入本發(fā)明的核酸。具有將插入的外來核酸整合到染色 體上的能力的反轉(zhuǎn)錄病毒栽體是本發(fā)明的優(yōu)選。
本發(fā)明的第6方案涉及表達(dá)HLA-A24限制性的、MAGE-A4143.151 特異性TCR的細(xì)胞，其特征在于該細(xì)胞中導(dǎo)入了本發(fā)明的核酸。 這里，本發(fā)明的核酸可以以上述本發(fā)明的重組核酸或本發(fā)明的載體的 形式導(dǎo)入到所希望的細(xì)胞中，本發(fā)明的細(xì)胞的優(yōu)選方案可列舉導(dǎo)入了 編碼TCRa鏈多肽或具有其可變區(qū)多肽的多肽的核酸以及編碼TCR卩 鏈多肽或具有其可變區(qū)多肽的多肽的核酸二者的細(xì)胞、用本發(fā)明的栽 體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。上述核酸整合到染色體DNA上的細(xì)胞也包含在本發(fā) 明中。
TCR在T細(xì)胞的抗原識別方面顯示重要作用，因此優(yōu)選的本發(fā)明 的方案是導(dǎo)入了本發(fā)明的核酸的T細(xì)胞。通過上述方法，將本發(fā)明的 核酸導(dǎo)入到由生物體采集的T細(xì)胞，則可以獲得表達(dá)HLA-A24限制 性的、MAGE-A4,43.m特異性TCR的T細(xì)胞。并且，作為本發(fā)明的優(yōu) 選方案，還可以是將上述核酸導(dǎo)入可分化為T細(xì)胞的細(xì)胞，然后使細(xì) 胞分化為T細(xì)胞。可分化為T細(xì)胞的細(xì)胞例如有造血干細(xì)胞、淋巴祖 細(xì)胞和T細(xì)胞前體細(xì)胞。導(dǎo)入了核酸的導(dǎo)入對象細(xì)胞無需分成單一的 細(xì)胞種類，可以是將含有上述導(dǎo)入對象細(xì)胞的細(xì)胞集團作為核酸導(dǎo)入 的對象。
上述的含有導(dǎo)入對象細(xì)胞的細(xì)胞集團可以由人或非人哺乳動物 的例如末梢血、骨髓和臍帶血采集，還可根據(jù)需要，將T細(xì)胞和/或可 分化為T細(xì)胞的細(xì)胞進行分級并富集，用于本發(fā)明。將本發(fā)明的導(dǎo)入 了 TCR基因的細(xì)胞用于癌等的治療時，優(yōu)選該細(xì)胞集團由作為治療 對象的患者本人、或者與患者的HLA型一致的供體采集。
將本發(fā)明的核酸導(dǎo)入細(xì)胞的方法沒有特別限定，可以采用公知的 方法。導(dǎo)入本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的重組核酸時，例如可以采用電穿 孔法、磷酸4丐法、陽離子脂質(zhì)體法、脂質(zhì)體法。通過使用市售的轉(zhuǎn)染 試劑[例如Transl T系列(Mirus公司制)、GeneJuice (Novagene公司制)、 RiboJuice(Novagene z〉司制)、Lipofectamine (Invitrogene公司制),可 以簡便且高效率地導(dǎo)入核酸。使用本發(fā)明的栽體時，如果栽體是質(zhì)粒栽體，則可以按照與上述核酸同樣的方法導(dǎo)入到細(xì)胞中。栽體如果是 病毒栽體，則可以選擇與各種病毒栽體相適應(yīng)的感染方法。特別是使
用反轉(zhuǎn)錄病毒栽體時，通過使用重組纖連蛋白片段CH-296 (TAKARA BIO公司制)，可以對各種細(xì)胞、特別是反轉(zhuǎn)錄病毒栽體的感染效率低 的造血干細(xì)胞進行高效率的基因?qū)搿?br> 本發(fā)明的第7方案涉及抗癌藥，其特征在于該抗癌藥含有本發(fā) 明第5方案的栽體或第6方案的細(xì)胞作為有效成分。由本發(fā)明第6方 案得到的、導(dǎo)入本發(fā)明的核酸的T細(xì)胞對于呈遞HLA-A24分子和 MAGE-A4143_151肽的細(xì)胞顯示細(xì)胞毒活性。因此，上述本發(fā)明的載體 和細(xì)胞可用作對于表達(dá)MAGE-A4的癌的抗癌藥。
上述本發(fā)明的抗癌藥的特征在于含有本發(fā)明的載體或細(xì)胞作為 有效成分。該抗癌藥可以以將上述栽體或細(xì)胞懸浮于藥物可接受的稀 釋劑的形式提供。這里所述的稀釋劑例如是適合該栽體或細(xì)胞保存的 培養(yǎng)基、生理食鹽水、或磷酸緩沖生理食鹽水。培養(yǎng)基沒有特別限定， 通常有RPMI、 AIM-V、 X-VIVO10等培養(yǎng)基。另外，為了穩(wěn)定化的目 的，該抗癌藥還可以添加藥物可接受的栽體、保存劑等。這里所述的 栽體有人血清白蛋白等。含有本發(fā)明的細(xì)胞作為有效成分的抗癌藥優(yōu) 選以1xl0tlxl()8個/ml、更優(yōu)選5xl05 5xl()7個/ml含有上述細(xì)胞。
將含有本發(fā)明的細(xì)胞作為有效成分的抗癌藥施與人時，例如可通
過注射器施與，成人每人的施與量通常是優(yōu)選使上述細(xì)胞數(shù)為 1xlO、lxlO"個。上述值是一個大概值，并不限于此。另外，含有本 發(fā)明的載體作為有效成分的抗癌藥根椐施與途徑或栽體的種類等，抗 癌藥中的栽體濃度和施與量有很大不同。
如上所迷，本發(fā)明提供癌的治療方法。在使用本發(fā)明的第5方案 的栽體作為有效成分時，上述治療方法是體內(nèi)(in vivo)基因治療。 而在使用本發(fā)明的細(xì)胞作為有效成分時，可以為將編碼HLA-A24限 制性的、MAGE-A4,43-m特異性TCR的核酸導(dǎo)入到摘除到體外的細(xì)胞 中，然后將其施與患者的先體外后體內(nèi)治療。本發(fā)明的治療方法可以 將核酸導(dǎo)入到來自施與個體(例如人)的細(xì)胞、或者來自HLA的類型相 同的個體的細(xì)胞中使用，因此并未見有特別的毒性。
實施例以下通過實施例進一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實 施例的限定。
實施例1 MAGE-A4特異性CTL克隆#2-28的TCR a鏈和卩鏈 基因的克隆及序列確定
(1) 由^2-28制備RNA， 5'-RACE、克隆
培養(yǎng)非專利文獻10記栽的CTL克隆#2-28細(xì)胞，使用RNeasy Mini 試劑盒(軒7y》公司制)，從2xl()S個細(xì)胞中提取RNA。上述的CTL 克隆#2-28細(xì)胞對脈沖導(dǎo)入了 MAGE-A4143.151肽(序列表的SEQ ID N0.9，以下簡稱為P143)的靶細(xì)胞顯示HLA-A2402限制性細(xì)胞毒活性。 以該RNA的200 ng為才莫板，^吏用CapFishing Full-length cDNA Premix 試劑盒0 — ^一》公司制)，按照試劑盒的使用說明書合成cDNA。 使用序列表SEQ ID NO.10所示的低聚dT銜接頭(oligo dT adaptor )、 反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (不含RNaseH) ( TAKALA BIO公司制)和上述酶 所附的反應(yīng)緩沖液進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
以上述得到的單鏈cDNA為模板，使用上述試劑盒進行PCR。 5， 一側(cè)的引物是使用試劑盒所附的5'-RACE引物(SEQIDNO.ll)， 3' — 側(cè)的引物是使用對TCR a鏈C區(qū)特異性的3-TRa-C引物(SEQ ID N0.12)、對TCR(3鏈C1區(qū)域特異性的3-TRj3畫Cl引物(SEQ ID NO,13) 或?qū)CR卩鏈C2區(qū)特異性的3-TRj3-C2引物(SEQ IDN0.14)。將這些 反應(yīng)依次稱為PCR-a、 PCR-(31和PCR-|32。將各反應(yīng)液在94'C保持3 分鐘，然后將94。C40秒、58'C40秒、72'C 1分鐘的循環(huán)進行30個循 環(huán)，在72。C保持5分鐘。將各反應(yīng)產(chǎn)物的一部分通過瓊脂糖凝膠電泳 進行分析，發(fā)現(xiàn)在PCR-a和PCR-卩2中有約1 kb的DNA擴增。
通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR-a和PCR-p2的殘余的反應(yīng)產(chǎn)物， 從凝膠中回收約1 kb的DNA。將它們與pT7blue T-栽體(Novagene公 司制)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。
(2) 序列的確定、群集(夕，義夕yy,)、克隆的選擇
從來自上述得到的PCR-a和PCR-(32的轉(zhuǎn)化體中分別選擇96個， 由它們分別制備質(zhì)粒，使用自動測序儀確定DNA堿基序列。由序列 數(shù)據(jù)中除去pT7blue序列，然后進行群集，發(fā)現(xiàn)最大的毗連群() 共同序列中所含的最長的可讀框的序列如序列表的SEQ ID N0.3和 SEQ ID N0.4所示。這些序列依次為#2-28細(xì)胞的TCR a鏈基因和p鏈基因的cDNA序列。由cDNA堿基序列推定的TCRa鏈和|3鏈的氨 基酸序列如序列表的SEQ IDNO.l和SEQ IDN0.2所示。從上述質(zhì)粒 中選擇具有與pT7blue的T7啟動子同方向的TCR a鏈基因和卩鏈基 因cDNA的共同序列的質(zhì)粒，分別命名為pBS MAGE TCR a和pBS MAGE TCR|3。
實施例2 通過mRNA轉(zhuǎn)染進行MAGE-A4特異性TCR的表達(dá)
(1) mRNA的制備
通過用限制酶EcoRI進行消化，使pBS MAGE TCR a和pBS MAGE TCR p形成直鏈。以它們?yōu)槟０?，使用mMESSAGE mMACHINE T7試劑盒(7*》匕'才》公司制)，按照試劑盒的使用說明 書進行體外轉(zhuǎn)錄。然后用Poly(A)Tailing試劑盒(7》匕'才7公司制)， 按照試劑盒的使用說明書，在上述轉(zhuǎn)錄的RNA上附加Poly(A)鏈。這 樣，得到MAGE-A4 TCRa mRNA和MAGE-A4 TCR卩mRNA。將它們 溶解于磷酸緩沖生理食鹽水(PBS),在使用之前一直在-80'C保存。
(2) mRNA轉(zhuǎn)染
ms69細(xì)胞是對脈沖導(dǎo)入了 SAGE715-723肽(序列表的SEQ ID NO.15，以下簡稱為P715)的靶細(xì)胞HLA-A2402限制性地顯示細(xì)胞毒 活性的CTL克隆，是通過與非專利文獻10記栽的#22細(xì)胞同樣方法 得到但與#22不同的克隆。將lxl0 個ms69細(xì)胞用X-VIVO20培養(yǎng)基 y y歹k 7夕義公司制)清洗兩次。將各80 |ig實施例2-(l)中制備 的MAGE-A4 TCRa mRNA和MAGE-A4 TCR卩mRNA和上述細(xì)胞在 X-VIVO20培養(yǎng)基中混合使達(dá)到150 ^U，用ECM830基因?qū)胙b置 (BTX公司制造)，通過電穿孔法向細(xì)胞導(dǎo)入RNA。導(dǎo)入mRNA后的 細(xì)胞在X-VIVO20培養(yǎng)基中、在5%(:02存在下、在37。C培養(yǎng)一天。 以下將這樣得到的細(xì)胞記載為導(dǎo)入RNA的ms69細(xì)胞。
通過Ficoll離心法從人末梢血中分離末梢血單核細(xì)胞(PBMC)，用 添加了 0.5%AB型血清的PBS清洗兩次。向其中添加固定有抗CD8 抗體的磁珠MACS CD8微珠(;、f - 一公司制)，在4。C反應(yīng)15分鐘， 然后將珠子用添加了 0.5%AB型血清的PBS清洗一次。用安裝了磁鐵 的柱捕獲磁珠，從其中回收CD8陽性細(xì)胞，將其懸浮于添加有10%AB血清和100U/ml干擾素2 (IL-2)的RPMI1640培養(yǎng)基中，使達(dá)到lx106 個/ml。向24孔板的各孔中分別添加300 pl用PBS稀釋為1 ng/ml的 抗CD3抗體(才夕乂夕口一》0KT3， ^》七》7 7"—t公司制)，在 4匸靜置過夜，然后舍去上清，向各孔中分別分注1 ili1上述CD8陽性 細(xì)胞懸浮液。培養(yǎng)開始4天后、7天后和IO天后將培養(yǎng)基分別更換一 半，在5%(:02的存在下、在37。C培養(yǎng)。培養(yǎng)開始12天后，將lx107 個CD8陽性細(xì)胞用X-VIVO20培養(yǎng)基(^弋》7'l^少夕只公司制)清洗 兩次。按照與ms69細(xì)胞同樣的方法向該細(xì)胞中導(dǎo)入MAGE-A4TCRa mRNA和MAGE-A4 TCR卩mRNA。導(dǎo)入mRNA后的細(xì)胞在X-VIVO20 培養(yǎng)基中、在5%(:02的存在下、在37'C培養(yǎng)一天。將這樣得到的細(xì) 胞記為導(dǎo)入RNA的CD8陽性細(xì)胞。
(3) 四聚體測定
使在HLA-A2402重鏈的C末端附加作為生物素蛋白連接酶BirA 的底物的序列的多肽和|32-微球蛋白以不溶性包封體的形式在大腸桿 菌中表達(dá)。將上述包封體在P143肽存在下進行體外重折疊，形成 HLA-A2402/卩2/微球蛋白/P143復(fù)合體。使生物素蛋白連接酶(7* ^f 4 r 4一公司制)與所得復(fù)合體作用，用藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉抗生物素 (Streptavidin-PE, 4》匕'卜口 ,-工:x乂^司制)制備四聚體。
將上述導(dǎo)入RNA的ms69細(xì)胞和導(dǎo)入RNA的CD8陽性細(xì)胞與20 )ig/ml四聚物在37。C反應(yīng)30分鐘，然后與Tricolor標(biāo)記小鼠抗人CD8 抗體(力/k夕夕'公司制)在冰上反應(yīng)15分鐘。清洗細(xì)胞后用FACS Calibur (BD公司制)進行流式細(xì)胞分析。使用ms69細(xì)胞和CD8陽性 細(xì)胞作為陰性對象，使用弁2-28細(xì)胞作為陽性對象。
結(jié)果，四聚體陽性率在陰性對照的ms69細(xì)胞中為0.60%,而在 導(dǎo)入RNA的ms69細(xì)胞中為66.65%，在陰性對照的CD8陽性細(xì)胞中 為23.1%,而在導(dǎo)入RNA的CD8陽性細(xì)胞中為34.4%。導(dǎo)入了 RNA 的ms69細(xì)胞和CD8陽性細(xì)胞的四聚體測定結(jié)果如圖1和圖2所示。 該結(jié)果表明，由#2-28細(xì)胞克隆的TCRa鏈和TCR(3鏈的基因產(chǎn)物識 別P143和HLA-A2402的復(fù)合體。
(4) ELISPOT測定粑細(xì)胞如下制備。將HL A-2402基因轉(zhuǎn)染BxT雜交細(xì)胞抹174CEM. T2 (以下簡稱為T2細(xì)胞)，將制備的T2-A24細(xì)胞(Ikuta. Y等人、Blood、 第99巻、第3717-3724頁、2002年)用含有10。/。胎牛血清(FCS)的 RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，離心后舍去上清。然后懸浮于RPMI1640 培養(yǎng)基中，離心后舍去上清，由此清洗細(xì)胞。將這樣的細(xì)胞清洗共進 行三次，然后懸浮于含1 ml 10 jxM P143或P715或不含肽的RPMI1640 培養(yǎng)基中，在5%<:02存在下、在37。C溫育1小時。通過離心回收細(xì) 胞，懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基后進行離心，清洗細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮于 RPMI1640培養(yǎng)基中,使達(dá)到5xl()4個/100 pl，以此作為ELISPOT測 定的耙細(xì)胞使用。
向7》f義夕， 一》HA96孔過濾和測定板(('J水7*公司制) 的各孔中分別注入100 pl用PBS稀釋為2 pg/ml的抗人千擾素y抗體 (1-D1K， 7丫f少夕公司制)，在4'C放置過夜。舍去孔內(nèi)的液體，然 后向各孔中加入100 jil RPMI1640培養(yǎng)基，放置15分鐘，舍去液 體，洗滌板。將該洗滌再進行一次，然后向各孔中加入含有10%AB 型血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37。C放置1小時，進行封閉。封閉后 吸取上清，然后向各孔中添加100 pi RPMI1640培養(yǎng)基，洗涂板。將 該洗滌操作共進行三次。
將實施例2-(2)制備的(a)導(dǎo)入RNA的ms69細(xì)胞、(b)陰性對照ms69 細(xì)胞和0)陽性對照#2-28細(xì)胞、以及實施例2-(2)中制備的(d)導(dǎo)入RNA 的CD8 P曰性細(xì)胞和(e)陰性對照的CD8陽性細(xì)胞離心回收，用 RPMI1640培養(yǎng)基清洗一次。懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基中，使(a)、 (b) 和(c)為2000個、1000個或500個/100 (d)和(e)為2乂104個/100 pl， 向?qū)嵤├?-(4)中制備的經(jīng)洗滌的板的孔中分注100 ^tl。向其中添加 100pl上述靶細(xì)胞懸浮液，在5%(:02存在下、在37'C培養(yǎng)20小時。
從板的各孔中除去液體，用含有0.05%吐溫20的PBS (PBS-T)清 洗六次。將生物素化抗人干擾素Y抗體(^7'r'夕夕公司制，克隆名 7-B6-l)用PBS稀釋為0.2 pg/ml，向各孔中分注100^1，在4'C放置過 夜。
從板的各孔中除去液體，用PBS-T清洗6次。將用PBS稀釋為1 叫/ml的堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉抗生物素(戶4才，少卜'公司制)向各孔 中分注100 pl，在室溫下反應(yīng)1小時。從板的各孔中除去液體，用PBS-T清洗三次，然后按照AP顯色試劑盒(,4才，少卜'公司制，170-6432) 的使用說明書制備顯色液，在各孔中各分注IO(HU,避光，進行顯色 反應(yīng)。用蒸餾水停止顯色，然后拍攝板的照片。結(jié)果，與ms69細(xì)胞和CD8陽性細(xì)胞相比，導(dǎo)入了 RNA的ms69 細(xì)胞和CD8陽性細(xì)胞在靶細(xì)胞脈沖導(dǎo)入P143時形成了更多的干擾素 y陽性斑點。該結(jié)果如圖3和圖4所示。圖3是使用CTL克隆作為效 應(yīng)細(xì)胞時的ELISPOT測定結(jié)果，ms69細(xì)胞相對于脈沖導(dǎo)入P715的耙 細(xì)月包、#2-28細(xì)胞相對于脈沖導(dǎo)入P143的單巴細(xì)胞、導(dǎo)入RNA的ms69 細(xì)胞相對于任何的把細(xì)胞都形成了較多的干擾素y陽性斑點。圖4是 使用CD8陽性細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞時的ELISPOT測定結(jié)果，導(dǎo)入RNA 的CD8陽性細(xì)胞對脈沖導(dǎo)入P143的靶細(xì)胞特異性地形成干擾素y陽 性j效點。(5)細(xì)胞毒活性將HLA-A0201基因轉(zhuǎn)染T2細(xì)胞、T2-A24細(xì)胞和T2細(xì)胞，制備 T2-A2細(xì)胞，將其用RPMI1640培養(yǎng)基清洗三次，懸浮于RPMI1640 培養(yǎng)基中，使達(dá)到5xl(^個/ml。向這些細(xì)胞懸浮液1 ml中加入終濃 度為10 pM的P143或P715,在室溫下靜置15分鐘，然后添加1 ml 含有10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基，在37'C溫育1小時。將細(xì)胞用不 含F(xiàn)CS的RPMI1640培養(yǎng)基清洗三次，將"106個細(xì)胞懸浮于100 pl 含有10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中。向其中添加50 pi Na25lCr04水 溶液(3.7 MBq)，在37。C標(biāo)記兩小時。將其作為耙細(xì)胞用于細(xì)胞毒活 性的測定。將ms69細(xì)胞、導(dǎo)入RNA的ms69細(xì)胞、#2-28細(xì)胞、CD8陽性 細(xì)胞和導(dǎo)入RNA的CD8細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基清洗兩次，懸浮于 含有10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中(效應(yīng)細(xì)胞)，使達(dá)到2xl()6個/ml、 lxl()6個/ml、 5xl()5個/ml、 2.5xl()5個/ml、 1.25x105個/ml和6.25x104 個/ml,將其100pl加入到96孔V型底板的孔中。將靶細(xì)胞懸浮于含 有10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，使達(dá)到lxl()6個/m1,向加入了效 應(yīng)細(xì)胞的孔中各添加100^1。在37。C反應(yīng)4小時，然后離心回收上清， 使用y計數(shù)儀測定100pl上清中游離的"Cr的量。通過下式，由放射 活性的測定值計算特異性細(xì)胞毒活性。[數(shù)l]特異性細(xì)胞毒活性(％)=[(各孔的測定值-最小釋放值)/(最大釋放值-最小釋放值)]x100上式中，最小釋放值是不加入效應(yīng)細(xì)胞的孔中的51Cr游離量，表 示靶細(xì)胞51Cr的自然游離量。最大釋放值是指將Triton X-100加入靶 細(xì)胞中進行破壞時的51Cr游離量。該結(jié)果如圖5和圖6所示。圖5是表示CTL克隆對脈沖導(dǎo)入P715 的T2-A24細(xì)胞(a)、脈沖導(dǎo)入P143的T2-A24細(xì)胞(b)和脈沖導(dǎo)入P143 的T2-A2細(xì)胞(c)的細(xì)胞毒活性的圖，橫軸表示效應(yīng)細(xì)胞數(shù)/把細(xì)胞數(shù) 比(E/T比)，縱軸表示特異性細(xì)胞毒活性(％) 。 ms69細(xì)胞只對脈沖 導(dǎo)入P715的T2-A24細(xì)胞、#2-28細(xì)胞只對脈沖導(dǎo)入P143的T2-A24 細(xì)胞顯示細(xì)胞毒活性，而導(dǎo)入了 RNA的ms69細(xì)胞對兩者靶細(xì)胞均顯 示細(xì)胞毒活性。任何效應(yīng)細(xì)胞對脈沖導(dǎo)入P143的T2-A2細(xì)胞均未顯 示細(xì)胞毒活性。圖6是表示CD8細(xì)胞對于脈沖導(dǎo)入P143的T2細(xì)胞(a)、 未脈沖導(dǎo)入肽的T2-A24細(xì)胞(b)和脈沖導(dǎo)入P143的T2-A24細(xì)胞(c) 的細(xì)胞毒活性的圖，橫軸表示E/T比，縱軸表示特異性細(xì)胞毒活性 (%)。陰性對照的CD8陽性細(xì)胞對任何細(xì)胞都未顯示細(xì)胞毒活性。 而導(dǎo)入了 RNA的CD8陽性細(xì)胞和作為陰性對照的#2-28細(xì)胞對脈沖 導(dǎo)入P143的T2-A24細(xì)胞顯示了細(xì)胞毒活性。由以上結(jié)果表明，編碼#2-28細(xì)胞的TCRa鏈和(3鏈的基因使CTL 克隆和來自末梢血的CD8細(xì)胞具有P143特異性、HLA-A2402限制性 的細(xì)胞毒活性。產(chǎn)業(yè)實用性通過本發(fā)明，可以提供來自對MAGE-A4為HLA-A24限制性的 CTL的TCRa鏈和卩鏈的多肽、以及編碼該多肽的核酸。上述核酸可 以使T細(xì)胞對呈遞HLA-A24分子和MAGE-A4143.151肽的細(xì)胞具有細(xì) 胞毒活性，因此可用于表達(dá)MAGE-A4的癌的治療。序列表自由文本 SEQIDNO.10:寡聚dT銜接頭SEQIDNO.ll: 5'-RACE引物SEQIDNO.12:用于擴增編碼TCRa鏈的DNA片段的合成引物 3-TRa-CSEQ ID NO.13:用于擴增編碼TCR p鏈的DNA片段的合成引物 3-TR卩-ClSEQ ID NO.14:用于擴增編碼TCR P鏈的DNA片段的合成引物 3-TRP-C權(quán)利要求
1.多肽，該多肽具有含序列表的SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的多肽、或含該序列中有一至多個氨基酸殘基缺失、不可、插入或置換得到的氨基酸序列的多肽，并且可與含有序列表的SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽一起構(gòu)成HLA-A24限制性的、MAGE-A4143-151特異性T細(xì)胞受體。
全文摘要
多肽，該多肽具有含序列表的SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的多肽、或含有該序列中有一至多個氨基酸殘基缺失、不可、插入或置換得到的氨基酸序列的多肽，并且可與含有序列表的SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽一起構(gòu)成HLA-A24限制性的、MAGE-A4_143-151特異性T細(xì)胞受體。
文檔編號A61K48/00GK101287831SQ20068003363
公開日2008年10月15日 申請日期2006年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月13日
發(fā)明者奧村悟司, 宮原慶裕, 日淺厚則, 珠玖洋, 直田浩明 申請人:國立大學(xué)法人三重大學(xué);寶生物工程株式會社