專(zhuān)利名稱(chēng)：環(huán)狀變更的促紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類(lèi)促紅細(xì)胞生成素(EPO)受體激動(dòng)劑。這些EPO受體激動(dòng)劑保留天然EPO的一種或多種活性，還有可能顯示出改善的刺激造血細(xì)胞的活性和/或改善的活性分布型(profile)，包括與天然EPO有關(guān)的不良生物活性的減少，和/或具有改善的物理特性，包括提高了的溶解度、穩(wěn)定性和重折疊效率。
背景技術(shù)：
刺激骨髓細(xì)胞分化和/或增殖的集落刺激因子已經(jīng)引起很大的興趣，因?yàn)樗鼈兙哂杏糜诨謴?fù)降低的造血干細(xì)胞衍生細(xì)胞水平的治療潛力。
促紅細(xì)胞生成素是一種天然存在的糖蛋白激素，其分子量最初報(bào)道是大約39,000道爾頓(T.Miyaki等人，J.Biol.Chem.252:5558-5564(1997))。成熟的激素長(zhǎng)166個(gè)氨基酸，而具有前導(dǎo)肽的激素的“前原”形式長(zhǎng)193個(gè)氨基酸(F.Lin的美國(guó)專(zhuān)利第4,703,008號(hào))。按照氨基酸序列計(jì)算，成熟激素的分子量為18,399道爾頓(K.Jacobs等人，Nature313:806-810(1985)；J.K.Browne等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.5:1693-702(1986))。
通過(guò)氨基酸取代和缺失制備的第一批突變促紅細(xì)胞生成素(即促紅細(xì)胞生成素類(lèi)似物)已顯示減低或未改善活性。如美國(guó)專(zhuān)利4,703,008所述，用苯丙氨酸取代15、40和145位上酪氨酸殘基、用組氨酸取代7位上半胱氨酸殘基、用天冬酰胺取代2位上脯氨酸、缺失殘基2-6、缺失殘基163-166和缺失殘基27-55，并不導(dǎo)致生物活性的明顯提高。Cys到His的突變?nèi)コ松锘钚?。一系列帶有?duì)天冬酰胺殘基28、38或83的單氨基酸取代的突變促紅細(xì)胞生成素，顯示活性嚴(yán)重降低(24位的取代)，或顯示快速的細(xì)胞內(nèi)降解和明顯缺乏分泌(對(duì)殘基38或183的取代)。絲氨酸126上的O-糖基化作用位點(diǎn)的去除，導(dǎo)致促紅細(xì)胞生成素類(lèi)似物的快速降解或缺乏分泌(S.Dube等人，J.Biol.Chem.33:17516-17521(1988))。這些作者得到結(jié)論殘基38、83和126上的糖基化作用位點(diǎn)是正常分泌所必需的，而位于殘基24和38的糖基化作用位點(diǎn)與成熟促紅細(xì)胞生成素的生物活性有關(guān)。
去糖基化的促紅細(xì)胞生成素在體外生物測(cè)定中具有完全的活性(M.S.Dorsal等人，Endocrinology 116:2293-2299(1985)；美國(guó)專(zhuān)利第4,703,008號(hào)；E.Tsuda等人，Eur J.Biochem.266:20434-20439(1991))。然而，普遍認(rèn)為促紅細(xì)胞生成素的糖基化在激素的體內(nèi)活性中具有關(guān)鍵作用(P.H.Lowy等人，Nature 185:102-105(1960)；E.Goldwasser和C.K.H..Kung,Ann.N.Y.Acad.Science 149:49-53(1968)；W.A.Lukowsky和R.H..Paiter,Can.J.Biochem.:909-917(1972)；D.W.Briggs等人，Amer.J.Pys.201:1385-1388(1974)；J.C.Schooley,Exp.Hematol.13:994-998；N.Imai等人，Eur.J.Biochem.194:457-462(1990)；M.S.Dordal等人，Endocrinology 116:2293-2299(1985)；E.Tsuda等人，Eur.J.Biochem.188:405-411(1990)；美國(guó)專(zhuān)利第4,703,008號(hào)；J.K.Brown等人，Cold Spring Harbor Symposia on Quant.Biol.51:693-702(1986)；和K.Yamaguchi等人，J.Biol.Chem.266:20434-20439(1991))。促紅細(xì)胞生成素的去糖基化類(lèi)似物體內(nèi)生物活性的缺乏，被認(rèn)為是去糖基化的激素從受處理動(dòng)物的循環(huán)中快速清除所致。糖基化和去糖基化的促紅細(xì)胞生成素在原生質(zhì)中半衰期的直接比較支持這一觀點(diǎn)(J.C.Spivak和B.B.Hoyans,Blood 73:90-99(1989)，和M.N.Fukuda等人，Blood73:84-89(1989))。
對(duì)促紅細(xì)胞生成素糖基化位點(diǎn)的寡核苷酸定向誘變，已有效地探索了糖基化作用的功能，但卻未能提供深入了解，以了解明顯改善激素特性以用于治療應(yīng)用的有效策略。
已經(jīng)構(gòu)建了一系列單氨基酸取代或缺失的突變體，涉及到氨基酸殘基15、24、49、76、78、83、143、145、160、162、163、164、165和166。在這些突變體中，促紅細(xì)胞生成素的羧基末端、糖基化作用位點(diǎn)和酪氨酸殘基被改變。已經(jīng)將所述突變體給予動(dòng)物，同時(shí)監(jiān)測(cè)血紅蛋白、血細(xì)胞比容和網(wǎng)織紅細(xì)胞的水平(EP No.0409113)。雖然其中的許多突變體保留了體內(nèi)生物活性，但與天然促紅細(xì)胞生成素相比，沒(méi)有一個(gè)顯示其提高血紅蛋白、血細(xì)胞比容和網(wǎng)織紅細(xì)胞(紅細(xì)胞的直接前體)的水平的能力有顯著提高。
已經(jīng)構(gòu)建了另一組突變體以探索殘基99-119(域1)和殘基111-129(域2)的功能(Y.Chem等人，Eur.J.Biochem.202:225-230(1991))。域1突變體在一個(gè)體外生物測(cè)定中快速降解并且無(wú)活性，而域2突變體充其量保留了體外活性。與野生型人類(lèi)促紅細(xì)胞生成素相比，這些突變體也不顯示增強(qiáng)的體內(nèi)生物活性。這些作者得到結(jié)論殘基99-119在促紅細(xì)胞生成素的結(jié)構(gòu)中具有關(guān)鍵作用。
人類(lèi)促紅細(xì)胞生成素分子包含兩個(gè)二硫橋，一個(gè)連接7位和161位的半胱氨酸殘基，第二個(gè)連接29位和33位的半胱氨酸(P.H.Lai等人，J.Biol.Chem.261:3116-3121(1986))。已經(jīng)使用寡核苷酸定向誘變來(lái)探索人類(lèi)促紅細(xì)胞生成素中連接29位和33位半胱氨酸的二硫橋的功能。已將33位上的半胱氨酸轉(zhuǎn)換為一個(gè)脯氨酸殘基，這模擬鼠促紅細(xì)胞生成素在這個(gè)殘基上的結(jié)構(gòu)。得到的突變體具有大大降低的體外活性?；钚缘慕档褪侨绱藝?yán)重，以致作者得出結(jié)論殘基29和33之間的二硫橋?qū)τ诖偌t細(xì)胞生成素的功能來(lái)說(shuō)是不可缺少的(F.K.Lin,Molecularand Cellular Aspects of Erythropoietin and Erythropoiesis，第23-26頁(yè)，I.N.Rich編輯，Springer-Verlag,Berlin(1987))。
Lin,F-K的美國(guó)專(zhuān)利第4,703,008號(hào)(下文稱(chēng)為“008專(zhuān)利”)考慮了EPO的許多種修飾形式，包括EPO的添加、缺失和取代類(lèi)似物。雖然008專(zhuān)利提到糖基化位點(diǎn)的缺失可能會(huì)提高在酵母中產(chǎn)生的EPO的活性(見(jiàn)008專(zhuān)利第37欄(column 37)，第25到28行)，但并未指出任一種建議的修飾形式會(huì)在本質(zhì)上增加生物活性。同時(shí)，008專(zhuān)利推測(cè)，一個(gè)或多個(gè)酪氨酸殘基被苯丙氨酸取代的EPO類(lèi)似物，可能顯示提高或降低的受體結(jié)合親和力。
Fibi,M等人的澳大利亞專(zhuān)利申請(qǐng)第AU-A-59145/90號(hào)也討論了一些修飾的EPO蛋白(EPO突變蛋白)。它一般性地考慮了EPO上10-55、70-85和130-136氨基酸的改變。具體地講，在羧基末端區(qū)添加帶正電荷的堿性氨基酸據(jù)稱(chēng)提高了EPO的生物活性。
Shoemaker,C.B.的美國(guó)專(zhuān)利第4,835,260號(hào)討論了54位的甲硫氨酸和38位的天冬酰胺發(fā)生了氨基酸取代的修飾EPO蛋白。據(jù)認(rèn)為這樣的EPO突變蛋白具有改善的穩(wěn)定性，但與野生型EPO相比，并不顯示生物活性有任何提高。
WO91/05867公布了與人類(lèi)促紅細(xì)胞生成素相比有更多糖類(lèi)附著位點(diǎn)的人類(lèi)促紅細(xì)胞生成素類(lèi)似物，如EPO(Asn69)、EPO(Asn125,Ser127)、EPO(Thr125)和EPO(Pro124,Thr125)。
WO94/24160公開(kāi)了生物活性增強(qiáng)的促紅細(xì)胞生成素突變蛋白，具體的氨基酸取代發(fā)生在20、49、73、140、143、146、147和154位。
WO94/25055公開(kāi)了促紅細(xì)胞生成素類(lèi)似物，包括EPO(X33,Cys139,des-Arg166)和EPO(Cys139,des-Arg166)。蛋白序列的重排在進(jìn)化中，DNA序列的重排在產(chǎn)生蛋白結(jié)構(gòu)和功能的多樣性上具有重要作用。特別是由于堿基突變率低，基因重復(fù)和外顯子移動(dòng)就提供了一種重要的機(jī)制，以快速產(chǎn)生多樣性，并因此提供給生物體一種競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)(Doolittle,Protein Science 1:191-200,1992)。
重組DNA方法的發(fā)展已經(jīng)使得研究序列轉(zhuǎn)座對(duì)蛋白折疊、結(jié)構(gòu)和功能的影響成為可能。用于產(chǎn)生新序列的方法類(lèi)似于通過(guò)氨基酸序列線性重排天然產(chǎn)生成對(duì)相關(guān)蛋白的方法(Cunningham，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:3218-3222,1979；Teather和Erfie,J.Bacteriol.172:3837-3841,1990；Schimming等人，Eur.J.Biochem.204:13-19,1992；Yamiuchi和Minamikawa,FEBS Lett.260:127-130,1991；MacGregor等人，F(xiàn)EBS Lett.378:263-266,1996)。Goldberg和Creighton描述了這種類(lèi)型蛋白重排的第一個(gè)體外應(yīng)用(J.Mol.Biol.165:407-413,1983)。在原始序列選擇一個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)(斷裂點(diǎn))作為新的N端，新序列從斷裂點(diǎn)開(kāi)始具有與原始序列相同的氨基酸順序，直到達(dá)到一個(gè)位于或接近原始C端的氨基酸。在這一點(diǎn)上，新序列或是直接地、或是通過(guò)一部分額外的序列(接頭)，連接到一個(gè)位于或接近原始N端的氨基酸，然后新序列以與原始序列相同的序列延伸下去，直到達(dá)到一個(gè)位于或接近原始序列斷裂點(diǎn)N端的氨基酸，這個(gè)殘基構(gòu)成了鏈的新C端。
這種方法已經(jīng)應(yīng)用到大小范圍從58到462個(gè)氨基酸的蛋白上(Goldenberg和Creighton,J.Mol. Biol.165:407-413,1983；Li和Coffino,Mol.Cell.Biol.13:2377-2383,1993)。檢測(cè)過(guò)的蛋白代表了很大范圍的結(jié)構(gòu)類(lèi)別，包括主要包含α-螺旋(白細(xì)胞介素-4；Keitman等人，Cytokine7:311-318,1995)、β-折疊(白細(xì)胞介素-1；Horlick等人，Protein Eng.5:427-431,1992)或二者的混合物(酵母磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶；Luger等人，Science 243:206-210,1989)的蛋白。在這些序列重排研究中代表了廣泛種類(lèi)的蛋白功能酶T4溶菌酶 Zhang等人，Biochemistry 32:12311-12318(1993)；Zhang等人，Nature Struct.Biol.1:434-438(1995)二氫葉酸還原酶Buchwalder等人，Biochemistry 31:1621-1630(1994)；Protasova等人，Prot Eng.7:
1373-1377(1995)核糖核酸酶T1Mullins等人，J.Am.Chem.Soc.116:5529-5533(1994)；Garrett等人，Protein Science5:204-211(1996)芽孢桿菌屬(Bacillus)Hahn等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.β-葡聚糖酶 91:10417-10421(1994)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶 Yang和Schachman,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.90:11980-11984(1993)磷酸核糖鄰氨基苯甲酸Luger等人，Science 243:206-210(1989)；Luger異構(gòu)酶 等人，Prot.Eng.3:249-258(1990)胃蛋白酶/胃蛋白酶原 Lin等人，Protein Science 4:159-166(1995)3-磷酸甘油醛脫氫酶 Vignais等人，Protein Science 4:994-1000(1995)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶Li和Coffino,Mol.Cell Biol.13:2377-2383(1993)酵母磷酸甘油酸脫氫酶Ritco-Vonsovici等人，Biochemistry 34:
16543-16551(1995)酶抑制劑堿性胰蛋白酶抑制劑 Goldenberg和Creighton,J.Mol.Biol.165:
407-413(1983)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β Horlick等人，Protein Eng.5:427-431(1992)白細(xì)胞介素-4Kreitman等人，Cytokine 7:311-318(1995)酪氨酸激酶識(shí)別域α-血影蛋白SH3域Viguera等人，J.Mol.Biol.247:670-681(1995)跨膜蛋白o(hù)mp A Koebnik和Krmer,J.Mol.Biol.250:617-626(1995)嵌合蛋白白細(xì)胞介素-4-假 Kreitman等人，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.單胞菌屬外毒素 91:6889-6893(1994)融合分子這些研究的結(jié)果具有高度的可變性。許多情況下觀察到了切實(shí)降低的活性、溶解度或熱力學(xué)穩(wěn)定性(大腸桿菌(E.coli)二氫葉酸還原酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、omp A、酵母磷酸甘油酸脫氫酶)。在其它情況下，序列重排的蛋白表現(xiàn)出許多與其天然對(duì)應(yīng)物近乎相同的特性(堿性胰蛋白酶抑制劑、T4溶菌酶、核糖核酸酶T1、芽孢桿菌屬β-葡聚糖酶、白細(xì)胞介素-1β、α-血影蛋白SH3域、胃蛋白酶原、白細(xì)胞介素-4)。在例外的情況下，觀察到了相對(duì)于天然序列的幾個(gè)特性的預(yù)料之外的改善，如重排的α-血影蛋白SH3域序列的溶解度和重折疊率、轉(zhuǎn)座的白細(xì)胞介素-4-假單胞菌屬外毒素融合分子的受體親和力和抗腫瘤活性(Kreitman等人，Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.91:6889-6893,1994；Kreitman等人，Cancer Res.55:3357-3363,1995)。
這些類(lèi)型研究的最初動(dòng)機(jī)是研究蛋白折疊和穩(wěn)定性中的近程和遠(yuǎn)程相互作用。這種類(lèi)型的序列重排將原始序列中的一部分遠(yuǎn)程相互作用轉(zhuǎn)換為新序列中的近程相互作用，反之亦然。許多這些序列重排能獲得至少有某些活性的構(gòu)象，該事實(shí)是說(shuō)明蛋白折疊以多種折疊途徑發(fā)生的有力證據(jù)(Viguera，等人，J.Mol.Biol.247:670-681,1995)。對(duì)于α-血影蛋白的SH3域來(lái)說(shuō)，在對(duì)應(yīng)于β-發(fā)夾轉(zhuǎn)角的位置選擇新末端，導(dǎo)致蛋白的穩(wěn)定性稍稍降低，但蛋白仍然能夠折疊。
此處引用的研究中使用的內(nèi)部斷裂點(diǎn)的位置僅僅在蛋白的表面發(fā)現(xiàn)，并且分布在整個(gè)線性序列上，而沒(méi)有任何明顯地集中于末端或中部的傾向(從原始N端到斷裂點(diǎn)的相對(duì)長(zhǎng)度的變異度是整個(gè)序列長(zhǎng)度的大約10到80％)。在這些研究中，連接原始N端和C端的接頭含有0到9個(gè)殘基。在一種情況下(Yang和Schachman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:11980-11984,1993)，在原始C端區(qū)段刪除了部分序列，就在截短的C端和原始N端之間制造連接。如Gly和Ser的柔性親水性殘基常常用在這種接頭中。Viguera等人(J.Mol.Biol.247:670-681,1995)比較了用3殘基或4殘基接頭連接原始N和C端；3殘基接頭在熱力學(xué)上較不穩(wěn)定。Drotasova等人(Protein Eng.7:1373-1377,1994)用3殘基或5殘基接頭連接大腸桿菌二氫葉酸還原酶的原始N端；只有3殘基接頭以好的產(chǎn)量產(chǎn)生蛋白。
發(fā)明摘要本發(fā)明的修飾人類(lèi)EPO受體激動(dòng)劑可由下面的結(jié)構(gòu)式表示X1-(L)a-X2其中a是0或1；
X1是一個(gè)肽，包含對(duì)應(yīng)于從殘基n+1到J的序列的氨基酸序列；X2是一個(gè)肽，包含對(duì)應(yīng)于從殘基1到n的序列的氨基酸序列；n是一個(gè)整數(shù)，取值范圍為從1到J+1；而L是一個(gè)接頭。
在上面的結(jié)構(gòu)式中，人類(lèi)EPO的組成氨基酸殘基從氨基端到羧基端被順序編號(hào)為1到J。這個(gè)蛋白中一對(duì)相鄰的氨基酸被分別編號(hào)為n和n+1，其中n是一個(gè)整數(shù)，取值范圍為從1到J-1。殘基n+1成為新EPO受體激動(dòng)劑的新N端，而殘基n成為新EPO受體激動(dòng)劑的新C端。
本發(fā)明涉及新型EPO受體激動(dòng)劑多肽，其包含修飾過(guò)的下面結(jié)構(gòu)式所示EPO氨基酸序列AlaProProArgLeuIleCysAspSerArgValLeuGluArgTyrLeuLeuGluAlaLys1020GluAlaGluAsnIleThrThrGlyCysAlaGluHisCysSerLeuAsnGluAsnIleThr3040ValProAspThrLysValAsnPheTyrAlaTrpLysArgMetGluValGlyGlnGlnAla5060ValGluValTrpGlnGlyLeuAlaLeuLeuSerGluAlaValLeuArgGlyGlnAlaLeu7080LeuValAsnSerSerGlnProTrpGluProLeuGlnLeuHisValAspLysAlaValSer90100GlyLeuArgSerLeuThrThrLeuLeuArgAlaLeuGlyAlaGlnLysGluAlaIleSer110 120ProProAspAlaAlaSerAlaAlaProLeuArgThrIleThrAlaAspThrPheArgLys130 140LeuPheArgValTyrSerAsnPheLeuArgGlyLysLeuLysLeuTyrThrGlyGluAla140 160CysArgThrGlyAspArg166其中N端的1-6個(gè)氨基酸和C端的1-5個(gè)氨基酸可以可任選地從所述EPO受體激動(dòng)劑多肽上缺失。
其中N端與C端或是直接地，或是通過(guò)一個(gè)能連接N端和C端的接頭相連接，并分別在下列氨基酸上有新的C和N端23-2448-49111-11224-2550-51112-11325-2651-52113-11426-2752-53114-11527-2853-54115-11628-2954-55116-11729-3055-56117-11830-3156-57118-11931-3257-58119-12032-3377-78120-12133-3478-79121-12234-3579-80122-12335-3680-81123-12436-3781-82124-12537-3882-83125-12638-3984-85126-12740-4185-86127-12841-4286-87128-12943-4487-88129-13044-4588-89131-13245-46 108-10946-47 109-11047-48 110-111并且所述EPO受體激動(dòng)劑多肽可以可選地緊跟著(甲硫氨酸-1)、(丙氨酸-1)或(甲硫氨酸-2，丙氨酸-1)。
可以制造新C端和N端的更優(yōu)選的斷裂點(diǎn)是23-24、24-25、25-26、27-28、28-29、29-30、30-31、31-32、32-33、33-34、34-35、35-36、36-37、37-38、38-39、40-41、41-42、42-43、52-53、53-54、54-55、55-56、77-78、78-79、79-80、80-81、81-82、82-83、83-84、84-85、85-86、86-87、87-88、88-89、109-110、110-111、111-112、112-113、113-114、114-115、115-116、116-117、117-118、118-119、119-120、120-121、121-122、122-123、123-124、124-125、125-126、126-127、127-128、128-129、129-130、130-131和131-132。
可以制造新C端和N端的最優(yōu)選的斷裂點(diǎn)是23-24、24-25、31-32、32-33、37-38、38-39、82-83、83-84、85-86、86-87、87-88、125-126、126-127和131-132。
最優(yōu)選的斷裂點(diǎn)包括糖基化位點(diǎn)、非中和抗體、蛋白水解切割位點(diǎn)。
本發(fā)明的EPO受體激動(dòng)劑可以包含氨基酸取代、缺失和/或插入，其中氨基酸取代的例子如WO94/24160所公開(kāi)的、或者Asn24、Asn83和Asn126上的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)被改變?yōu)槠渌被幔绲幌抻贏sp或Gly。本發(fā)明的EPO受體激動(dòng)劑也可以還在原始蛋白的N和C端或其中一端具有氨基酸缺失，和/或在上文所示結(jié)構(gòu)式中序列重排蛋白的新N和/或C端具有缺失。
在本發(fā)明的一個(gè)最佳實(shí)施方案中，連接N端和C端的接頭(L)是一段選自以下的多肽GlyGlyGlySerSEQ ID NO:123GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerSEQ ID NO:124GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerSEQ ID NO:125SerGlyGlySerGlyGlySerSEQ ID NO:126GluPheGlyAsnMetSEQ ID NO:127GluPheGlyGlyAsnMetSEQ ID NO:128GluPheGlyGlyAsnGlyGlyAsnMetSEQ ID NO:129和GlyGlySerAspMetAlaGlySEQ ID NO:130。
本發(fā)明還包括將重組人類(lèi)EPO受體激動(dòng)劑與一種或多種其它集落刺激因子(CSF)共同或順序給予。這些集落刺激因子包括細(xì)胞因子、淋巴因子、白細(xì)胞介素、造血生長(zhǎng)因子，其中包括但不限于GM-CSF、G-CSF、c-mpl配體(又名TPO或MGDF)、M-CSF、IL-1、IL-4、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、LIF、人類(lèi)生長(zhǎng)激素、B細(xì)胞生長(zhǎng)因子、B細(xì)胞分化因子、嗜酸性粒細(xì)胞分化因子和又名青灰因子或c-kit配體的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)(這里統(tǒng)稱(chēng)為“因子”)。這些共同給予的混合物的特征在于同時(shí)具有兩種肽的一般活性，或者該混合物進(jìn)一步的特征在于，具有比EPO受體激動(dòng)劑或第二種集落刺激因子單獨(dú)存在時(shí)的加性效應(yīng)更高的生物或生理活性。共同給予也可能提供一種增強(qiáng)活性的效應(yīng)，或提供一種不同于根據(jù)EPO或第二種集落刺激因子的存在所預(yù)期的活性。共同給予也可能具有改善的活性分布型，可以包括與天然人類(lèi)EPO相關(guān)的不良生物活性的降低。除上面的名單外，可以與本發(fā)明的多肽共同給予的還有WO94/12639和WO94/12638所述的IL-3變異體、WO95/21197和WO95/21254所述的融合蛋白、WO97/12977公開(kāi)的G-CSF受體激動(dòng)劑、WO97/12978公開(kāi)的c-mpl受體激動(dòng)劑、WO97/12979公開(kāi)的IL-3受體激動(dòng)劑和WO97/12985所述的多功能受體激動(dòng)劑。這里所使用的“IL-3變異體”指的是WO94/12639和WO94/12638所述的IL-3變異體，這里所使用的“融合蛋白”指的是WO95/21197和WO95/21254所述的融合蛋白，這里所使用的“G-CSF受體激動(dòng)劑”指的是WO97/12978公開(kāi)的G-CSF受體激動(dòng)劑，這里所使用的“c-mpl受體激動(dòng)劑”指的是WO97/12978公開(kāi)的c-mpl受體激動(dòng)劑，這里所使用的“IL-3受體激動(dòng)劑”指的是WO97/12979公開(kāi)的IL-3受體激動(dòng)劑，這里所使用的“多功能受體激動(dòng)劑”指的是WO97/12985所述的多功能受體激動(dòng)劑。
此外，設(shè)想體外應(yīng)用將包括在將擴(kuò)大培養(yǎng)的骨髓和血細(xì)胞輸入患者體內(nèi)以前、刺激骨髓和血細(xì)胞活化和生長(zhǎng)的能力。
還設(shè)想，本發(fā)明的EPO受體激動(dòng)劑的應(yīng)用將包括血庫(kù)應(yīng)用，這里，在某個(gè)醫(yī)療程序前，將所述EPO受體激動(dòng)劑給予患者，以增加從該患者體內(nèi)取出的紅細(xì)胞和血液產(chǎn)品的數(shù)量，然后將所述血液產(chǎn)品儲(chǔ)藏起來(lái)并在醫(yī)療程序后輸回給患者。此外，設(shè)想EPO受體激動(dòng)劑的應(yīng)用將包括將EPO受體激動(dòng)劑在獻(xiàn)血之前給予獻(xiàn)血者，以增加血紅細(xì)胞的數(shù)量，因此使得獻(xiàn)血者能安全地提供更多血液。
附圖簡(jiǎn)述

圖1用示意圖說(shuō)明了一個(gè)蛋白的序列重排。天然蛋白的N端(N)和C端(C)通過(guò)一個(gè)接頭連接或直接地相連接。蛋白在一個(gè)斷裂點(diǎn)被打開(kāi)，形成一個(gè)新的N端(新N)和一個(gè)新的C端(新C)，形成具有新的線性氨基酸序列的蛋白。一個(gè)重排分子可以從頭作為線性分子來(lái)合成，而不必經(jīng)過(guò)連接原始N端和C端并在斷裂點(diǎn)打開(kāi)蛋白的步驟。
圖2是用于產(chǎn)生新蛋白的方法I的簡(jiǎn)圖，其中天然蛋白的N端和C端通過(guò)一個(gè)接頭連接起來(lái)，并產(chǎn)生了不同的蛋白N端和C端。在所展示的實(shí)施例中，序列重排產(chǎn)生了一個(gè)新的基因，這個(gè)基因編碼一種蛋白，所述蛋白在原始蛋白的氨基酸97形成新的N端，原始C端(氨基酸174)通過(guò)一個(gè)接頭區(qū)與氨基酸11(氨基酸1-10被刪除)連接起來(lái)，并在原始序列的氨基酸96形成新的C端。
圖3是用于產(chǎn)生新蛋白的方法Ⅱ的簡(jiǎn)圖，其中天然蛋白的N端和C端不通過(guò)接頭而連接起來(lái)，并產(chǎn)生了不同的蛋白N端和C端。在所展示的實(shí)施例中，序列重排產(chǎn)生了一個(gè)新的基因，這個(gè)基因編碼一種蛋白，所述蛋白在原始蛋白的氨基酸97形成新的N端，原始C端(氨基酸174)連接到原始N端，并在原始序列的氨基酸96形成新的C端。
圖4是用于產(chǎn)生新蛋白的方法Ⅲ的簡(jiǎn)圖，其中天然蛋白的N端和C端通過(guò)一個(gè)接頭連接起來(lái)，并產(chǎn)生了不同的蛋白N端和C端。在所展示的實(shí)施例中，序列重排產(chǎn)生了一個(gè)新的基因，這個(gè)基因編碼一種蛋白，所述蛋白在原始蛋白的氨基酸97形成新的N端，原始C端(氨基酸174)通過(guò)一個(gè)接頭區(qū)與氨基酸1連接起來(lái)，并在原始序列的氨基酸96形成新的C端。
圖5顯示了一個(gè)基于Lin等人所述序列(PNAS 82:7580-7584,1985)的編碼人類(lèi)成熟EPO的DNA序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明的受體激動(dòng)劑可用于治療特征為造血系統(tǒng)中紅細(xì)胞水平降低的疾病。
EPO受體激動(dòng)劑可用于貧血的治療或預(yù)防。許多藥物會(huì)導(dǎo)致骨髓抑制或造血缺陷。這些藥物的例子有AZT、DDI、化療中使用的烷化劑和抗代謝藥、抗生素如氯霉素、青霉素、丙氧烏苷、道諾霉素和磺胺類(lèi)藥物、吩噻嗪酮(phenothiazone)、安定藥如氨甲丙二酯、鎮(zhèn)痛藥如氨基比林和安乃近、抗驚厥藥如苯妥英或痛驚寧、抗甲狀腺藥物如丙硫氧嘧啶和甲巰咪唑和利尿劑。EPO受體激動(dòng)劑可用于治療或預(yù)防使用這些藥物治療的患者身上常出現(xiàn)的骨髓抑制或造血缺陷。
造血缺陷的出現(xiàn)也可能是病毒、微生物或寄生蟲(chóng)感染的結(jié)果，也可能是腎病或腎衰竭治療、如透析的結(jié)果。本發(fā)明的多肽可用于治療這樣的造血缺陷。
本發(fā)明的另一方面提供了用于表達(dá)這些新型EPO受體激動(dòng)劑的方法中的質(zhì)粒DNA載體。這些載體包含上述編碼本發(fā)明新型多肽的新型DNA序列。能轉(zhuǎn)化可以表達(dá)EPO受體激動(dòng)劑的宿主細(xì)胞的合適載體，包括這樣的表達(dá)載體，所述載體包含連接了按使用的宿主細(xì)胞選擇的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列、編碼EPO受體激動(dòng)劑的核苷酸序列。插入了如上所述的修飾序列的載體包括在本發(fā)明中，并可用于產(chǎn)生修飾的EPO受體激動(dòng)劑多肽。本方法中所使用的多肽還包含選定的調(diào)控序列，這些調(diào)控序列與本發(fā)明的DNA編碼序列操縱性地連接，并因此能在選擇的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)其復(fù)制和表達(dá)。
本發(fā)明的另一方面提供了一種用于產(chǎn)生人類(lèi)EPO受體激動(dòng)劑新家族的方法。本發(fā)明的方法涉及培養(yǎng)合適的已被一種載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或細(xì)胞系，其中所述載體包含用于編碼新型EPO受體激動(dòng)劑多肽表達(dá)的DNA序列。合適的細(xì)胞或細(xì)胞系可以包括細(xì)菌如大腸桿菌、酵母、哺乳細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞的各種菌株或細(xì)胞株，它們可以在本發(fā)明的方法中用作宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的其它方面是用于治療上面提到的病癥的方法和治療組合物。這樣的組合物包括混合了一種藥學(xué)上可接受的載體的、治療有效量的一種或多種本發(fā)明的EPO受體激動(dòng)劑。這種組合物可以胃腸外、靜脈內(nèi)或皮下給予。在給予時(shí)，本發(fā)明中使用的治療組合物優(yōu)選采用無(wú)熱原、胃腸外可接受的水溶液形式。制備具有合適的pH、等滲性、穩(wěn)定性等等的這樣的胃腸外可接受的蛋白溶液屬于本領(lǐng)域的技術(shù)。
給予將按照一個(gè)劑量給予制度進(jìn)行，進(jìn)行根據(jù)類(lèi)似物與人類(lèi)EPO相比的體內(nèi)比活，并根據(jù)本領(lǐng)域的現(xiàn)有知識(shí)，包括給予人類(lèi)EPO以誘導(dǎo)促紅細(xì)胞生成作用和治療人類(lèi)各種病癥，如貧血，包括腎衰竭患者的貧血，可以很容易地由熟練技術(shù)人員確定該給予制度。本發(fā)明類(lèi)似物的劑量在某種程度上會(huì)因人而異，這取決于具體的類(lèi)似物及其體內(nèi)比活、給藥途徑、患者的醫(yī)療狀況、年齡、體重及性別、患者對(duì)該類(lèi)似物或載體成份的敏感性以及主治醫(yī)師能容易地加以考慮的其它因素。關(guān)于本發(fā)明類(lèi)似物的治療用途，可參閱美國(guó)專(zhuān)利第4,703,008號(hào)和第4,835,260號(hào)；還可參見(jiàn)Physicians’Desk第591-595頁(yè)關(guān)于重組[des-Arg166]人類(lèi)EPO一章。市售的重組[des-Arg166]人類(lèi)EPO的制劑是在每毫升不含防腐劑的水溶液中含2,000、3,000、4,000或10,000單位糖激素(glycohormone)，并含2.5mg/ml人血清蛋白、5.8mg/ml檸檬酸鈉、5.8mg/ml NaCl和0.06mg/ml檸檬酸，pH6.9(+/-0.3)。
已經(jīng)證明重組產(chǎn)生的EPO在對(duì)患有血紅細(xì)胞產(chǎn)生削弱的患者的治療中特別有用(Physicians Desk Reference(PDR).1993年版，第602-605頁(yè))。已經(jīng)證明重組EPO有效地治療與慢性腎衰竭有關(guān)的貧血和遭受與疊氮胸苷、(AZT)治療有關(guān)的內(nèi)源性EPO降低所困擾的HIV感染者(見(jiàn)PDR,1993年版，第6002頁(yè))。
對(duì)EPO蛋白進(jìn)行修飾以改善其作為診斷或治療血液疾病的工具的應(yīng)用性肯定是需要的。具體地說(shuō)，當(dāng)需要給予患者EPO時(shí)，由于顯示增強(qiáng)生物活性的EPO的修飾形式在治療環(huán)境中比天然EPO更有療效并更有效率，使得給予的頻率更低和/或劑量更低。給予減少劑量的EPO，推測(cè)有可能降低與EPO治療有關(guān)的不利效應(yīng)出現(xiàn)的危險(xiǎn)，如高血壓、發(fā)病(seizure)、頭痛等等(見(jiàn)PDR,1993年版，第603-604頁(yè))。本發(fā)明的EPO受體激動(dòng)劑也可以具有改善的穩(wěn)定性，并因此延長(zhǎng)了半衰期，這就使得能在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中以更低的費(fèi)用合成非糖基化形式的EPO。由于半衰期延長(zhǎng)，這種非糖基化形式的EPO與去糖基化的EPO相比，將在體內(nèi)活性上有所提高。
治療方法和組合物也可以包括與其它造血因子共同給予。能與本發(fā)明多肽同時(shí)或順序給予的其它合適的造血因子、集落刺激因子(CSF)和白細(xì)胞介素的非排他性名單，包括GM-CSF、G-CSF、c-mpl配體(又名TPO或MGDF)、M-CSF、IL-1、IL-4、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、LIF、人類(lèi)生長(zhǎng)激素、B細(xì)胞生長(zhǎng)因子、B細(xì)胞分化因子、嗜酸性粒細(xì)胞分化因子和又名青灰因子或c-kit配體的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)(這里統(tǒng)稱(chēng)為“因子”)或它們的組合物。除上面的名單外，能與本發(fā)明的多肽共同給予的還有WO94/12639和WO94/12638所述的IL-3變異體、WO95/21197和WO95/21254所述的融合蛋白、WO97/12977公開(kāi)的G-CSF受體激動(dòng)劑、WO97/12978公開(kāi)的c-mpl受體激動(dòng)劑、WO97/12979公開(kāi)的IL-3受體激動(dòng)劑和WO97/12985所述的多功能受體激動(dòng)劑。
本發(fā)明的EPO受體激動(dòng)劑能用于使外周血中的造血祖細(xì)胞(progenitor)和干細(xì)胞活動(dòng)化(mobilization)。已經(jīng)表明外周血衍生祖細(xì)胞在自體骨髓移植的環(huán)境中能有效地使患者重建。
本發(fā)明的EPO受體激動(dòng)劑也能用于造血祖細(xì)胞的體外擴(kuò)大培養(yǎng)。如G-CSF之類(lèi)的集落刺激因子(CSF)已經(jīng)或是單獨(dú)給予、或是與其它CSF共同給予、或是與骨髓移植物聯(lián)合給予，以治療在高劑量化療后常常出現(xiàn)的貧血、中性粒細(xì)胞減少和血小板減少。
本發(fā)明的另一方面提供了維持和擴(kuò)大培養(yǎng)造血前體細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞接種到盛有一種培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，這種培養(yǎng)基補(bǔ)充了本發(fā)明的EPO受體激動(dòng)劑，并通過(guò)暴露于基質(zhì)細(xì)胞系如HS-5(WO96/02662,Roecklein和Torok-Strob,Blood 85:997-1105,1995)加以調(diào)整。接頭的確定接頭氨基酸序列的長(zhǎng)度的選擇可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或根據(jù)結(jié)構(gòu)信息的指導(dǎo)，或綜合使用兩種方法。
當(dāng)?shù)貌坏饺魏谓Y(jié)構(gòu)信息時(shí)，采用一種設(shè)計(jì)可以制備一個(gè)小系列的接頭進(jìn)行測(cè)試，所述接頭的長(zhǎng)度有所變化以涵蓋0-50的范圍，其序列經(jīng)過(guò)選擇與表面暴露(親水性，Hopp和Woods,Mol.Immunol.20:483-489,1983；Kyte和Doolittle,J.Mol.Biol.157:105-132,1982；暴露于溶劑的表面區(qū)域，Lee和Richards,，Mol.Biol.55:379-400,1971)和采用必需構(gòu)象的能力相一致，而不擾亂EPO受體激動(dòng)劑的構(gòu)型(構(gòu)象可變的；Karplus和Schulz,Naturwissenschaften 72:212-213,(1985))。假定每個(gè)殘基的平均平移是2.0到3.8，這就意味著測(cè)試的長(zhǎng)度為0到30個(gè)殘基之間，其中0-15個(gè)殘基是優(yōu)選的范圍。這樣一個(gè)經(jīng)驗(yàn)系列的例子是使用一個(gè)盒式序列，如Gly-Gly-Gly-Ser重復(fù)n次以構(gòu)建接頭，其中n是1、2、3或4。那些熟悉本行的人會(huì)認(rèn)識(shí)到有許多這樣的不同長(zhǎng)度和組成的序列能用作接頭，主要的考慮是它們既不過(guò)長(zhǎng)，也不過(guò)短(參閱Sandhu,Critical Rev.Biotech.12:437-462,1992)；如果它們過(guò)長(zhǎng)，熵效應(yīng)將有可能使三維折疊不穩(wěn)定，也可能使折疊在動(dòng)力學(xué)上不可能，而如果它們過(guò)短，由于扭應(yīng)變和立體應(yīng)變，它們有可能使該分子不穩(wěn)定。
那些對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)信息分析有經(jīng)驗(yàn)的人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，鏈兩端的距離，即定義為在兩個(gè)c-α碳原子之間的距離，能用于確定所要使用的序列的長(zhǎng)度，或至少限定在對(duì)接頭的經(jīng)驗(yàn)選擇中所必須測(cè)定的可能的數(shù)目。他們也會(huì)認(rèn)識(shí)到，有時(shí)侯會(huì)出現(xiàn)這樣的情況從x-射線衍射或核磁共振波譜數(shù)據(jù)得到的結(jié)構(gòu)模型中，肽鏈末端的位置被錯(cuò)誤地確定，如果這是真的，那么為了正確地估計(jì)所需接頭的長(zhǎng)度，要將這種情況考慮在內(nèi)。從那些位置被很好地確定的殘基中選擇兩個(gè)在序列上靠近鏈末端的殘基，它們的c-α碳原子之間的距離就用于計(jì)算它們之間的接頭的近似長(zhǎng)度。以計(jì)算得到的長(zhǎng)度作為指導(dǎo)，選擇具有一定范圍數(shù)目殘基(用每殘基2到3.8進(jìn)行計(jì)算)的接頭。這些接頭根據(jù)需要，可以由截短或延長(zhǎng)了的原始序列組成，而當(dāng)序列延長(zhǎng)時(shí)，可以選擇出如上所述柔性親水性的額外殘基；或者可以可任選地使用一系列接頭取代原始序列，一個(gè)例子是上面提到的“Gly-Gly-Gly-Ser”盒式方法；或者可以可任選地使用具有合適總長(zhǎng)度的原始序列和新序列的組合。EPO受體激動(dòng)劑氨基端和羧基端的確定可以通過(guò)從原始多肽鏈內(nèi)適當(dāng)選擇起始位置(氨基端)和終止位置(羧基端)，并如上所述使用接頭序列，制備能折疊成生物活性狀態(tài)的EPO受體激動(dòng)劑序列。使用下面所述的指導(dǎo)，從稱(chēng)為斷裂點(diǎn)區(qū)的一段共同序列中選擇氨基端和羧基端。在同一斷裂點(diǎn)區(qū)內(nèi)選擇氨基端和羧基端，就產(chǎn)生了一種新型蛋白序列。在許多情況下，新末端的選擇會(huì)使得羧基端的原始位置緊挨在氨基端的原始位置之前。然而，那些熟悉本行的人會(huì)認(rèn)識(shí)到，在該區(qū)任一處選擇末端都可能會(huì)起作用，并且這會(huì)有效地導(dǎo)致新序列氨基或羧基部分的缺失或添加。
分子生物學(xué)的一個(gè)中心原則是，蛋白的一級(jí)氨基酸序列指導(dǎo)折疊為表達(dá)其生物功能所必需的三維結(jié)構(gòu)。那些熟悉本行的人都知道方法，以采用蛋白單晶體的x-射線衍射或蛋白溶液的核磁共振波譜，獲得并解釋三維結(jié)構(gòu)信息。與斷裂點(diǎn)區(qū)的鑒定有關(guān)的結(jié)構(gòu)信息的例子，包括蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的位置和類(lèi)型(α和3-10螺旋、平行和反平行β折疊、鏈回折(chain reversal)和轉(zhuǎn)角、以及環(huán)；Kabsch和Sander,Biopolymers 22:2577-2637,1983)；氨基酸殘基溶劑暴露的程度，殘基間相互作用的程度和類(lèi)型(Chothia,Ann.Rev.Biochem.53:537-572；1984)和沿著多肽鏈的構(gòu)象靜態(tài)和動(dòng)態(tài)分布(Alber和Mathews,MethodsEnzymol.154:511-533,1987)。在一些情況下知道殘基溶劑暴露的額外信息；一個(gè)例子是在蛋白表面上有一個(gè)必需的轉(zhuǎn)錄后糖附著位點(diǎn)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)性的結(jié)構(gòu)信息得不到、或不可能得到時(shí)，還可采用的方法是，分析一級(jí)氨基酸序列以預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)、溶劑可及性和轉(zhuǎn)角以及環(huán)的出現(xiàn)。當(dāng)直接的結(jié)構(gòu)性方法不可行的時(shí)候，有時(shí)也可應(yīng)用生物化學(xué)的方法來(lái)經(jīng)驗(yàn)性地確定表面暴露；例如，采用限制性蛋白水解后鑒定鏈斷裂的位點(diǎn)，來(lái)推斷表面暴露(Gentile和Salvatore,Eur.J.Biochem.218:603-621,1993)。
這樣或是使用實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)構(gòu)信息，或是使用預(yù)測(cè)性的方法(例如，Srinivisan和Rose Proteins:Struct.,Funct.& Genetics,22:81-99,1995)，檢查親代氨基酸序列，根據(jù)是否對(duì)維持二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)不可缺少來(lái)分類(lèi)各個(gè)區(qū)。內(nèi)部出現(xiàn)已知涉及到周期性二級(jí)結(jié)構(gòu)(α和3-10螺旋、平行和反平行β折疊)的序列的區(qū)域是要避免的區(qū)域。相似的，經(jīng)觀察或預(yù)測(cè)具有低水平溶劑暴露的氨基酸序列區(qū)很可能是蛋白的所謂疏水核的一部分，這也是選擇氨基和羧基端時(shí)應(yīng)避免的區(qū)域。相比之下，那些已知或預(yù)測(cè)位于表面的回折或環(huán)的區(qū)域，特別是那些已知是生物活性非必需的區(qū)域，是定位多肽鏈末端的優(yōu)選位點(diǎn)。根據(jù)上面標(biāo)準(zhǔn)所優(yōu)選的連續(xù)氨基酸序列被認(rèn)為是一個(gè)斷裂點(diǎn)區(qū)。
材料與方法重組DNA方法除另外注明外，所有具體的化學(xué)藥品都得自Sigma公司(St.Louis,MO)。限制性?xún)?nèi)切核酸酶和T4 DNA連接酶得自New England Biolabs(Beverly,MA)或Boehringer Mannheim(Indianapolis,IN)。大腸桿菌(E.coli)菌株的轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，如DH5αTM(Life Technologies,Gaithersburg,MD)和TGl(Amersham Corp.,Arlington Heights,IL)用于連接反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，并且為用于轉(zhuǎn)染哺乳類(lèi)細(xì)胞的質(zhì)粒DNA的來(lái)源。大腸桿菌菌株，如MON105和JM101，可以用于在胞質(zhì)或周質(zhì)空間中表達(dá)本發(fā)明的EPO受體激動(dòng)劑。
MON105 ATCC#55204:F-,λ-,IN(rrnD,rrE)1,rpoD+,rpoH358DH5αTM:F-,phi80dlacZdeltaM15,δ(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17(rk-,mk+),phoA,supE44λ-,thi-1,gyrA96,relA1TG1:δ(lac-pro),supE,thi-1,hsdD5/F’(traD36,proA+B+,lacIq,lacZδM15)DH5αTM亞克隆效率細(xì)胞(Subcloing efficiency cell)做為感受態(tài)細(xì)胞被購(gòu)買(mǎi)來(lái)，并用廠家的方法準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)化，用CaCl2法使大腸桿菌菌株TG1和MON105處于感受態(tài)，以攝入DNA。通常，將20到50ml細(xì)胞在LB培養(yǎng)基(1％ Bacto-蛋白胨，0.5％ Bacto-酵母提取物，150mM NaCl)中培養(yǎng)，直到其密度用Baush & Lomb Spectronic分光光度計(jì)(Rochester,NY)在600納米(OD600)處測(cè)定光密度時(shí)達(dá)到約1.0。離心收集細(xì)胞，重懸浮于1/5培養(yǎng)體積的CaCl2溶液(50mM CaCl2,10mMTris-Cl,pH7.4)，并于4℃保持30分鐘。離心重新收集細(xì)胞，并重懸浮于1/10培養(yǎng)體積的CaCl2溶液中，將連接好的DNA加入0.2ml這些細(xì)胞中，并將樣品在4℃保持1小時(shí)。將樣品轉(zhuǎn)移到42℃2分鐘，加入1ml LB，然后將樣品于37℃振蕩1小時(shí)。將這些樣品的細(xì)胞鋪展在平板上(加了1.5％ Bacto-瓊脂的LB培養(yǎng)基)，平板在用于選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體時(shí)包含氨芐青霉素(100毫克/ml,μg/ml)，或在用于選擇壯觀霉素抗性轉(zhuǎn)化體時(shí)包含壯觀霉素(75μg/ml)。將平板置于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單個(gè)菌落，在添加了合適抗生素的LB上37℃振蕩培養(yǎng)6-16小時(shí)。挑取菌落，并接種在添加了合適抗生素(100μg/ml氨芐青霉素或75μg/ml壯觀霉素)的LB上37℃振蕩培養(yǎng)。在收獲培養(yǎng)物以前，用PCR分析1μl細(xì)胞以檢測(cè)EPO受體激動(dòng)劑基因的存在。使用退火時(shí)結(jié)合EPO受體激動(dòng)劑基因和/或載體的引物的組合進(jìn)行PCR。在PCR完成后，將上樣染料加入樣品，然后如前面所述進(jìn)行電泳。當(dāng)觀察到預(yù)期長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物時(shí)，基因就已經(jīng)連接到載體上。產(chǎn)生具有新N端/C端的基因的方法方法Ⅰ．產(chǎn)生包含一個(gè)接頭區(qū)的具有新N端/C端的基因包含一個(gè)將原始C端和N端分開(kāi)的接頭區(qū)、具有新N端和C端的基因，可以基本根據(jù)如L.S.Mullins等人J.Am.Chem.Soc.116,5529-5533(1994)介紹的方法制備。使用多步驟的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，來(lái)重排編碼該蛋白一級(jí)氨基酸序列的DNA序列。步驟顯示于圖2。
在第一步，用引物組(“新起始”和“接頭起始”)從原始基因序列產(chǎn)生和擴(kuò)增一個(gè)DNA片段(“片段起始”)，這個(gè)DNA片段包含編碼新蛋白的新N端部分的序列，這個(gè)序列之后是連接原始蛋白的C端和N端的接頭。在第二步，用引物組(“新終止”和“接頭終止”)從原始基因序列產(chǎn)生和擴(kuò)增一個(gè)DNA片段(“片段終止”)，這個(gè)DNA片段編碼上面所使用的同一個(gè)接頭，接頭之后是新蛋白的新C端部分?！靶缕鹗肌焙汀靶陆K止”引物經(jīng)設(shè)計(jì)包含合適的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，使得能將新基因克隆進(jìn)表達(dá)質(zhì)粒。一般的PCR條件是一個(gè)循環(huán)的95℃解鏈2分鐘；25個(gè)循環(huán)的94℃變性1分鐘、50℃退火1分鐘并72℃延伸1分鐘；加上一個(gè)循環(huán)的72℃延伸7分鐘。使用了Perkin Elmer GeneAmp PCRCore Reagent試劑盒。一個(gè)100μl的反應(yīng)包括每種引物各100皮摩爾和1μg模板DNA；1×PCR緩沖液，200μM dGTP,200μM dATP,200μM dTTP,200μM dCTP,2.5單位AmpliTaq DNA聚合酶和2mMMgCl2。在480型的DNA熱循環(huán)器(Perkin Elmer Corporation,Norwalk,CT)內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
“片段起始”和“片段終止”在接頭區(qū)內(nèi)有互補(bǔ)序列，并有接頭兩端的二個(gè)氨基酸的編碼序列，它們?cè)诘谌齻€(gè)PCR步驟中被連接起來(lái)，形成全長(zhǎng)的編碼新蛋白的基因。將DNA片段“片段起始”和“片段終止”用1％ TAE凝膠分離，用溴化乙錠染色并用Qiaex凝膠提取試劑盒(Qiagen)分離。將這些片段以等摩爾量混合，于70℃加熱10分鐘，緩慢冷卻以使它們通過(guò)“接頭起始”和“接頭終止”之間的共有序列退火。在第三個(gè)PCR步驟，將引物“新起始”和“新終止”加入退火的片段，以產(chǎn)生和擴(kuò)增全長(zhǎng)的有新N端/C端的基因。一般的PCR條件是一個(gè)循環(huán)的95℃解鏈2分鐘；25個(gè)循環(huán)的94℃變性1分鐘、60℃退火1分鐘并72℃延伸1分鐘；加上一個(gè)循環(huán)的72℃延伸7分鐘。使用了PerkinElmer GeneAmp PCR Core Reagent試劑盒。一個(gè)100μl的反應(yīng)包括每種引物各100皮摩爾和約0.5μg DNA；1×PCR緩沖液，200μM dGTP,200μM dATP,200μM dTTP,200μM dCTP,2.5單位AmpliTaq DNA聚合酶和2mM MgCl2。使用Wizard PCR Preps試劑盒(Promega)純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物。方法Ⅱ．產(chǎn)生不含接頭區(qū)的具有新N端/C端的基因不含連接原始C端和N端的接頭、具有新N端和C端的基因可以通過(guò)兩步PCR擴(kuò)增和一次平端連接制備。所述步驟示于圖3中。在第一步中，用引物組(“新起始”和“P-b1起始”)從原始基因序列產(chǎn)生和擴(kuò)增一個(gè)DNA片段(“片段起始”)，這個(gè)DNA片段包含編碼新蛋白的新N端部分的序列。在第二步中，用引物組(“新終止”和“P-b1終止”)從原始序列產(chǎn)生和擴(kuò)增一個(gè)DNA片段(“片段終止”)，這個(gè)DNA片段編碼新蛋白的新C端部分的序列?！靶缕鹗肌焙汀靶陆K止”引物經(jīng)設(shè)計(jì)包含合適的限制性位點(diǎn)，使得能將新基因克隆進(jìn)表達(dá)質(zhì)粒。一般的PCR條件是一個(gè)循環(huán)的95℃解鏈2分鐘；25個(gè)循環(huán)的94℃變性1分鐘、50℃退火45秒并72℃延伸45秒。使用Deep Vent聚合酶(New EnglandBiolabs)來(lái)減少?gòu)S家所介紹的條件中突出端的出現(xiàn)。“P-b1起始”和“P-b1終止”引物在5＇末端磷酸化，以協(xié)助隨后“片段起始”和“片段終止”之間的平端連接。一個(gè)100μl的反應(yīng)包括每種引物150皮摩爾和1μg模板DNA；1×Vent緩沖液(New England Biolabs),300μM dGTP,300μM dATP,300μM dTTP,300μM dCTP和1單位Deep Vent聚合酶。在480型的DNA熱循環(huán)器(Perkin Elmer Corporation,Norwalk,CT)內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用Wizard PCR Preps試劑盒(Promega)純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
所述引物經(jīng)設(shè)計(jì)包含合適的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，以使得能將新基因克隆進(jìn)表達(dá)載體。一般地，“片段起始”經(jīng)設(shè)計(jì)產(chǎn)生一個(gè)NcoⅠ限制性位點(diǎn)，“片段終止”經(jīng)設(shè)計(jì)產(chǎn)生一個(gè)HindⅢ限制性位點(diǎn)。用MagicDNA Clean-up System試劑盒(Promega)純化限制性消化的反應(yīng)產(chǎn)物。片段起始和片段終止用1％ TAE凝膠分離，用溴化乙錠染色并用Qiaex凝膠提取試劑盒(Qiagen)分離。將這些片段與pMON3934的約3800堿基對(duì)的NcoⅠ/HindⅢ載體片段混合，于50℃加熱10分鐘后緩慢冷卻，使它們能退火到該載體片段的末端。用T4 DNA連接酶(BoehringerMannheim)將3個(gè)片段連接起來(lái)。結(jié)果是產(chǎn)生了包含全長(zhǎng)的具有新N端/C端的基因的質(zhì)粒。一部分連接反應(yīng)的產(chǎn)物用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α細(xì)胞(Life Technologies,Gaithersburg,MD)。如下所述純化質(zhì)粒DNA并進(jìn)行序列證實(shí)。方法Ⅲ．通過(guò)串聯(lián)重復(fù)的方法產(chǎn)生具有新N端/C端的基因可以根據(jù)如R.A.Horlick等人Protein Eng.5:427-431(1992)描述的方法制備具有新N端/C端的基因。使用一個(gè)串聯(lián)重復(fù)的模板DNA，進(jìn)行具有新N端/C端的基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。這些步驟如圖4所示。
串聯(lián)重復(fù)的模板DNA用克隆的方法產(chǎn)生，并包含兩個(gè)拷貝的基因，它們被一個(gè)DNA序列分開(kāi)，這個(gè)DNA序列編碼連接兩個(gè)拷貝基因的原始C端和N端的接頭。使用特定的引物組從串聯(lián)重復(fù)的模板DNA上產(chǎn)生和擴(kuò)增全長(zhǎng)的具有新N端/C端的基因。這些引物經(jīng)設(shè)計(jì)包含合適的限制性位點(diǎn)，以使得能將新基因克隆進(jìn)表達(dá)載體。一般的PCR條件是一個(gè)循環(huán)的95℃解鏈2分鐘；25個(gè)循環(huán)的94℃變性1分鐘、50℃退火1分鐘并72℃延伸1分鐘；加上一個(gè)循環(huán)的72℃延伸7分鐘。使用Perkin Elmer GeneAmp PCR Core Reagent試劑盒(Perkin ElmerCorporation,Norwalk,CT)。一個(gè)100μl的反應(yīng)包括每種引物各100皮摩爾和1μg模板DNA；1×PCR緩沖液，200μM dGTP,200μM dATP,200μM dTTP,200μM dCTP,2.5單位AmpliTaq DNA聚合酶和2mMMgCl2。在480型的DNA熱循環(huán)器(Perkin Elmer Corporation,Norwalk,CT)內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用Wizard PCR Preps試劑盒(Promega)純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物。DNA分離及確定特征可以采用多種不同的方法并使用那些熟悉本行的人所知道的市售試劑盒分離質(zhì)粒DNA。這里展示了幾個(gè)這樣的方法。使用PromegaWizardTM Miniprep試劑盒(Madison,WT)、Qiagen QIAwell Plasmid分離試劑盒(Chatsworth,CA)或Qiagen Plasmid Midi試劑盒分離質(zhì)粒DNA。這些試劑盒遵從同樣的分離質(zhì)粒DNA的一般程序。簡(jiǎn)要地說(shuō)，離心(5000×g)沉淀細(xì)胞，用順序的NaOH/酸處理釋放質(zhì)粒DNA并離心(10000×g)去除細(xì)胞碎片。將上清液(包含質(zhì)粒DNA)上樣到包含DNA結(jié)合樹(shù)脂的柱中，洗柱，質(zhì)粒DNA用TE洗脫出來(lái)。篩選出帶有所需質(zhì)粒的菌落后，將大腸桿菌細(xì)胞接種到添加了合適抗生素的50-100ml LB中，使其在一個(gè)空氣培養(yǎng)箱中37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。純化的質(zhì)粒DNA用于DNA測(cè)序、進(jìn)一步的限制性酶消化、DNA片段進(jìn)一步亞克隆及對(duì)哺乳類(lèi)、大腸桿菌或其它細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。序列確認(rèn)將純化的質(zhì)粒DNA重懸浮于dH2O中，并使用Bausch and LombSpectronic 601 UV分光光度計(jì)在260/280nm處測(cè)定吸收率以進(jìn)行定量測(cè)定。DNA樣品的測(cè)序是使用ABI PRISMTMDyeDeoxyTM終止劑(terminator)測(cè)序化學(xué)(Applied Biosystems Division of Perkin ElmerCorporation,Lincoln City,CA)試劑盒(Part Number 401388或402078)按廠家介紹的方法進(jìn)行，并且通常還通過(guò)測(cè)序混合物加入5％ DMSO以修改該方法。測(cè)序反應(yīng)是在480型的DNA熱循環(huán)器(Perkin ElmerCorporation,Norwalk,CT)內(nèi)根據(jù)推薦的擴(kuò)增條件進(jìn)行。純化樣品以用Centri-SepTM離心柱(Princeton Separations,Adelphia,NJ)去除多余的染料終止劑，并冷凍干燥樣品。將熒光染料標(biāo)記的測(cè)序反應(yīng)物重懸浮于去離子化的甲酰胺中，并使用ABI 373A型自動(dòng)DNA測(cè)序儀在4.75％多聚丙烯酰胺-8M尿素變性凝膠上測(cè)序。使用Sequencher v2.1 DNA分析軟件(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)分析重疊的DNA片段并組合成總的DNA重疊群。在哺乳類(lèi)細(xì)胞中EPO受體激動(dòng)劑的表達(dá)哺乳類(lèi)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染/條件培養(yǎng)基的產(chǎn)生可以從ATCC(Rockcille,MD)獲得BHK-21細(xì)胞系。在補(bǔ)充至2mML-谷氨酰胺和10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM/高葡萄糖)上培養(yǎng)細(xì)胞。這個(gè)配方被命名為BHK生長(zhǎng)培養(yǎng)基。選擇性培養(yǎng)基是補(bǔ)充了453單位/ml潮霉素B(Calbiochem,San Diego,CA)的BHK生長(zhǎng)培養(yǎng)基。BHK-21細(xì)胞系在此之前用HSV反式激活蛋白V16穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染，這種蛋白會(huì)反式激活質(zhì)粒pMON3359上發(fā)現(xiàn)的IE 110啟動(dòng)子(見(jiàn)Hippenmeyer等人，Bio/Technology，第1037-1041頁(yè)，1993)。VP16蛋白驅(qū)動(dòng)插入在IE110啟動(dòng)子之后的基因的表達(dá)。表達(dá)反式激活蛋白VP16的BHK-21細(xì)胞被命名為BHK-VP16。質(zhì)粒pMON1118(見(jiàn)Highkin等人，Poultry Sci.,70:970-981,1991)由SV40啟動(dòng)子表達(dá)潮霉素抗性基因。可以從ATCC得到一個(gè)相似的質(zhì)粒pSV2-hph。
轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將BHK-VP16細(xì)胞以每皿3×105細(xì)胞的濃度接種到60毫米(mm)組織培養(yǎng)皿中。每個(gè)皿的細(xì)胞用3ml“OPTIMEN”TM(Gibco-BRL,Gaitherburg,MD)轉(zhuǎn)染16小時(shí)，所述“OPTIMEN”TM中包含10μg帶有所需基因的質(zhì)粒DNA、3μg潮霉素抗性質(zhì)粒、pMON1118和80μg Gibco-BRL“LIPOFECTAMINE”TM。接著將培養(yǎng)基吸出，并用3ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，從每個(gè)皿收集培養(yǎng)基并分析活性(瞬時(shí)條件培養(yǎng)基)。將細(xì)胞從皿中用胰蛋白酶-EDTA取出，然后1∶10稀釋并轉(zhuǎn)移到有10ml選擇性培養(yǎng)基的100mm組織培養(yǎng)皿中。在選擇性培養(yǎng)基中約7天后，抗性細(xì)胞生長(zhǎng)成直徑幾毫米的集落。用濾紙(剪成與集落大約同樣大小并浸泡在胰蛋白酶/EDTA中)將克隆從皿中移出，并轉(zhuǎn)移到24孔板的單個(gè)孔中，每個(gè)孔含1ml選擇性培養(yǎng)基。當(dāng)克隆生長(zhǎng)匯合后，再次分析條件培養(yǎng)基，將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。大腸桿菌中EPO受體激動(dòng)劑的表達(dá)在New Brunswick Scientific(Edison,New Jersey)的G25型空氣培養(yǎng)箱中，將帶有所需質(zhì)粒的大腸桿菌菌株MON105或JM101在M9加酪蛋白氨基酸培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)。在OD600處監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)直到OD600達(dá)到值1，這時(shí)加入溶于0.1N NaOH中的萘啶酮酸(10毫克/ml)直到達(dá)到50μg/ml的最終濃度。培養(yǎng)物在37℃下再振蕩3到4小時(shí)。在整個(gè)培養(yǎng)期間保持高度通風(fēng)，以獲得所需基因產(chǎn)物的最大產(chǎn)量。在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞，檢測(cè)包涵體(IB)的存在。取出每一毫升等份的培養(yǎng)物以分析蛋白含量煮沸沉淀的細(xì)胞，用還原緩沖液處理并進(jìn)行SDS-PAGE電泳(見(jiàn)Maniatis等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1982)。離心(5000×g)培養(yǎng)物以沉淀細(xì)胞。
其它的達(dá)到基因在大腸桿菌中高水平表達(dá)的策略可參見(jiàn)Savvas,C.M.(Microbiological Reviews 60:512-538,1996)。包涵體的制備、提取、重折疊、透析、DEAE色譜分析以及以包涵體形式在大腸桿菌中積累的EPO受體激動(dòng)劑的特征包涵體的分離將從330ml大腸桿菌培養(yǎng)物得到的細(xì)胞沉淀物重懸浮于15ml超聲處理緩沖液(10mM 2-氨基-2-(羥甲基)1,3-丙二醇鹽酸(Tris-HCl),pH8.0+1mM乙二胺四乙酸(EDTA))中。用超聲細(xì)胞破碎儀(SonicatorCell Disruptor)(W-375型，Heat Systems-Ultrasonics,Inc.,Farmingdale,New York)的微型尖端探頭超聲處理這些懸浮的細(xì)胞。在超聲處理緩沖液中進(jìn)行三輪超聲處理并離心，從而破碎細(xì)胞并沖洗包涵體(IB)。第一輪超聲處理是在破碎3分鐘后破碎1分鐘，最后兩輪超聲處理是每輪破碎1分鐘。從包涵體沉淀物中提取和重折疊蛋白在最后的離心步驟之后，將IB沉淀物重懸浮于10ml的50mMTris-HCl,pH9.5、8M尿素和5mM二硫蘇糖醇(DTT)，并于室溫下攪拌約45分鐘以使表達(dá)的蛋白變性。
將提取溶液轉(zhuǎn)移到含70ml 5mM Tris-HCl,pH9.5和2.3M尿素的燒杯中，暴露于空氣中4℃下溫和地?cái)嚢?8到48小時(shí)，使得蛋白重折疊。根據(jù)用Vydac(Hesperia,Ca.)C18反相高壓液相色譜(RP-HPLC)柱(0.46×25cm)進(jìn)行的分析監(jiān)測(cè)重折疊。用含0.1％三氟乙酸(TFA)、濃度為40％到65％的乙腈線性梯度洗脫液監(jiān)測(cè)重折疊。該梯度以每分鐘1.5ml的流速進(jìn)行30分鐘。在洗脫液中變性蛋白一般要比重折疊的蛋白更晚洗脫出來(lái)。純化在重折疊之后，用酸沉淀法去除大腸桿菌雜蛋白。用15％(體積比)乙酸(HOAc)將重折疊緩沖液的pH滴定到pH5.0和pH5.2之間。此溶液在4℃攪拌2小時(shí)并以12,000×g離心20分鐘以沉淀任何不可溶的蛋白。
用一張截留分子量(MWCO)為3,500道爾頓的Spectra/Por 3膜透析處理酸沉淀步驟的上清液。對(duì)4升(50倍過(guò)量)10mM Tris-HCl,pH8.0透析，其中更換2次溶液，進(jìn)行總共18小時(shí)。透析在DEAE色譜分析前降低了樣品的電導(dǎo)率并去除了尿素。在透析后離心(12,000×g 20分鐘)樣品以沉淀任何不可溶的蛋白。
使用Bio-Rad Bio-Scale DEAE2柱(7×52mm)進(jìn)行離子交換層析。在含10mM Tris-HCl,pH8.0的緩沖液中平衡柱子。使用多于45倍柱體積的含0到500mM氯化鈉(NaCl)梯度的平衡緩沖液洗脫蛋白。在整個(gè)洗脫過(guò)程中使用每分鐘1ml的流速。梯度洗脫過(guò)程中收集柱分級(jí)組分(每個(gè)分級(jí)組分2ml)，并在Vydac(Hesperia,Ca.)C18柱(0.46×25cm)上通過(guò)RP-HPLC進(jìn)行分析。使用含0.1％三氟乙酸(TFA)、濃度為40％到65％的乙腈梯度。該梯度以每分鐘1.5ml的流速進(jìn)行30分鐘。收集到一起的分級(jí)組分對(duì)4升(50到500倍過(guò)量)10mM醋酸銨(NH4Ac),pH4.0透析，其中更換2次該溶液，總共進(jìn)行18小時(shí)。使用一張MWCO為3,500道爾頓的Spectra/Por 3膜進(jìn)行透析。最后，將樣品用0.22μm的注射濾器(μStarLB syringe Filter,Costar,Cambridge,Ma.)除菌過(guò)濾，并保存在4℃。
在一些情況下可以使用親和試劑，如連接到一種合適基質(zhì)上的mAb或受體亞基，來(lái)對(duì)折疊的蛋白進(jìn)行親和層析?；蛘撸?或此外)可以使用多種色譜分離法，如離子交換、凝膠過(guò)濾或疏水層析或反相HPLC中的任一種完成純化。
這些和其它蛋白純化方法的詳細(xì)描述可參見(jiàn)由Murray Deutscher編輯的Methods in Enzymology，第182卷“蛋白純化指南”，AcademicPress,San Diego,CA(1990)。蛋白特征的鑒定使用RP-HPLC、電噴射質(zhì)譜學(xué)和SDS-PAGE分離純化的蛋白。用氨基酸組成、RP-HPLC和Bradford蛋白測(cè)定法定量測(cè)定蛋白。在一些情況下，使用胰蛋白酶肽作圖法(tryptic peptide mapping)結(jié)合電噴射質(zhì)譜學(xué)來(lái)確認(rèn)蛋白的身份。甲基纖維素測(cè)定該測(cè)定反映了集落刺激因子在體外刺激正常骨髓細(xì)胞產(chǎn)生不同類(lèi)型造血集落的能力(Bradley等人，Aust.Exp Biol.Sci.44:287-300,1966,Pluznik等人，J.Cell Comp.Physio 66:319-324,1965)。方法獲得同意后，從個(gè)體身上獲取大約30ml新鮮、正常、健康的骨髓抽取物(aspirate)。在無(wú)菌條件下，在50ml錐形管(#25339-50 Corning,Corning MD)中將樣品用1×PBS(#14040.059 Life Technologies,Gaithersburg,MD.)溶液1∶5稀釋。將Ficoll(Histopaque 1077 Sigma H-8889)鋪墊在稀釋的樣品下，并以300×g離心30分鐘。取出單核細(xì)胞帶，并兩次用1×PBS、一次用1％ BSA PBS(CellPro Co.Bothel,WA)沖洗。計(jì)數(shù)單核細(xì)胞并用Ceprate LC(CD34)Kit(CellPro Co.Bothel,WA)柱選擇CD34+細(xì)胞。進(jìn)行這個(gè)分級(jí)分離是因?yàn)楣撬柚兴懈杉?xì)胞和祖細(xì)胞都呈現(xiàn)CD34表面抗原。
一式三份地建立培養(yǎng)物，最終體積在35×10mm培養(yǎng)皿(Nunc#174926)中是1.0ml。培養(yǎng)基購(gòu)自Terry Fox Labs.(HCC-4230培養(yǎng)基(Terry Fox Labs,Vancouver,B.C.,Canada))并在培養(yǎng)基中加入促紅細(xì)胞生成素(Amgen,Thousand Oaks,CA.)。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入3,000-10,000 CD34+細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染哺乳類(lèi)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的EPO受體激動(dòng)劑蛋白或由轉(zhuǎn)染哺乳類(lèi)細(xì)胞或大腸桿菌的條件培養(yǎng)基純化得到的EPO受體激動(dòng)劑蛋白加入其中，使最終濃度達(dá)到.001nm至10nm。用一個(gè)3cc的注射器重懸浮培養(yǎng)物，并每個(gè)培養(yǎng)皿鋪展1.0ml。對(duì)照(基線反應(yīng))培養(yǎng)物未接受集落刺激因子。陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)物接受條件培養(yǎng)基(PHA刺激過(guò)的人類(lèi)細(xì)胞Terry Fox Lab.H2400)。將培養(yǎng)物在37℃、5％ CO2和潤(rùn)濕過(guò)的空氣的條件下培養(yǎng)。
在峰值反應(yīng)當(dāng)天(第10-11天)，用一臺(tái)Nikon倒置顯微鏡用40倍物鏡組合計(jì)數(shù)那些定義為多于50個(gè)細(xì)胞的造血集落。包含少于50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞集團(tuán)被稱(chēng)為簇?；蛘?，可以通過(guò)將集落鋪展在載玻片上并染色來(lái)鑒別集落，或者可以將集落挑出來(lái)，重懸浮并旋轉(zhuǎn)細(xì)胞到旋轉(zhuǎn)載玻片(cytospin slide)上并染色。人類(lèi)臍帶血的造血生長(zhǎng)因子測(cè)定骨髓細(xì)胞傳統(tǒng)上用于造血集落刺激因子(CSF)活性的體外測(cè)定。然而，人類(lèi)骨髓并不總是能得到的，而且在捐獻(xiàn)者之間還有相當(dāng)?shù)淖儺惗取Ｗ鳛樵煅杉?xì)胞和祖細(xì)胞的來(lái)源，臍帶血與骨髓相當(dāng)(Broxmeyer等人，PANS USA 89:4109-113,1992:Mayani等人，Blood 81:3252-3258,1993)。與骨髓相比，臍帶血在經(jīng)常性的基礎(chǔ)上更容易得到，將從幾個(gè)捐獻(xiàn)者身上新鮮得到的細(xì)胞匯集在一起，或?yàn)榇四康慕⒁粋€(gè)低溫保存細(xì)胞庫(kù)，還有降低測(cè)定變異度的潛力。通過(guò)改變培養(yǎng)條件，和/或分析譜系特異性標(biāo)記，有可能特異性地測(cè)定爆發(fā)形成集落(BFU-E)的活性。方法在收集后24小時(shí)內(nèi)，用標(biāo)準(zhǔn)密度梯度(1.077g/ml Histopaque)從臍帶血中分離單核細(xì)胞(MNC)。通過(guò)幾個(gè)程序來(lái)已進(jìn)一步富集了臍帶血MNC的干細(xì)胞和祖細(xì)胞，包括免疫磁性篩選CD14-、CD34+細(xì)胞；用Applied Immune Science(Santa Clara,CA)的包被瓶淘選SBA-、CD34+的分級(jí)組分；用CellPro(Bothell,WA)抗生物素蛋白柱進(jìn)行CD34+篩選。使用新鮮分離的或低溫保存的CD34+細(xì)胞富集組分來(lái)進(jìn)行測(cè)定。用在1ml含有未添加生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基(Methocult H4230，得自StemCell Technologies,Vancouver,BC.)的0.9％甲基纖維素中的1×104細(xì)胞，制備樣品每個(gè)連續(xù)稀釋度(濃度范圍為1pM到1204pM)的一式兩份培養(yǎng)物。培養(yǎng)后7-9天，計(jì)數(shù)包含＞30細(xì)胞的集落。受轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如BHK或鼠原B細(xì)胞系(pro B cellline)Baf/3的細(xì)胞系能用一個(gè)該細(xì)胞系沒(méi)有的集落刺激因子受體(如人類(lèi)EPO受體)轉(zhuǎn)染。這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可以用于確定細(xì)胞的增殖活性和/或受體結(jié)合。
實(shí)施例1可以采用這里介紹的任何一種方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它重組方法，構(gòu)建編碼序列重組的EPO配體的基因。為該實(shí)施例的目的，變更的位點(diǎn)處于EPO的殘基131(Arg)和132(Thr)之間。這是一個(gè)易于受到蛋白水解的位點(diǎn)，因此意味著具有相對(duì)高水平柔性的表面暴露。
在這個(gè)實(shí)施例中，產(chǎn)生了新的N端和C端，而沒(méi)有連接原始末端的接頭。如方法Ⅱ所述，這通過(guò)兩步PCR和一次平端連接完成。
在第一個(gè)PCR步驟中，使用一個(gè)含有作為模板的SEQ ID NO:12的DNA序列的載體，并使用引物“新起始”和“平端起始”，產(chǎn)生一個(gè)編碼該新N端的DNA片段。這個(gè)片段被稱(chēng)為“片段起始”。新起始引物中下劃線的序列是Nco Ⅰ限制性位點(diǎn)。
新起始引物=gcgcgcCCATGGACAATCACTGCTGAC SEQ IDNO:131平端起始引物=TCTGTCCCCTGTCCT SEQ ID NO:132在第二個(gè)PCR步驟中，使用一個(gè)含有作為模板的SEQ ID NO:120所示DNA序列的載體，并使用引物“新終止”和“平端終止”，產(chǎn)生一個(gè)編碼該新C端的DNA片段。這個(gè)片段被稱(chēng)為“片段終止“。新終止引物中下劃線的序列是HindⅢ限制性位點(diǎn)。
新終止引物=
gcgcgcAAGCTTATTATCGGAGTGGAGCAGCTGAGGCCGCATC SEQ ID NO:133平端終止引物=GCCCCACCACGCCTCATCTGT SEQ IDNO:134在連接步驟中，將兩個(gè)PCR反應(yīng)中所產(chǎn)生的兩個(gè)片段連接在一起，用NcoⅠ和HindⅢ消化并克隆進(jìn)一個(gè)表達(dá)載體。用限制性分析和DNA測(cè)序，篩選克隆以確認(rèn)具有合適的序列。引物經(jīng)設(shè)計(jì)產(chǎn)生除NcoⅠ和HindⅢ外的限制性位點(diǎn)，以克隆進(jìn)其它表達(dá)載體。
實(shí)施例2本發(fā)明的序列重排的EPO受體激動(dòng)劑的生物測(cè)定，可以采用這里描述的方法或那些熟悉本行的人所知道的其它測(cè)定。
其它用于構(gòu)建變異基因、重組DNA表達(dá)、蛋白純化、蛋白特征鑒定、生物活性測(cè)定的技術(shù)可參見(jiàn)WO94/12639、WO94/12638、WO95/20976、WO95/21197、WO95/20997、WO95/21254，這些專(zhuān)利通過(guò)引用完整地結(jié)合到本文中。
所有在此引用的參考資料、專(zhuān)利或申請(qǐng)都通過(guò)引用完整地結(jié)合到本文中，就好象在這里書(shū)面寫(xiě)出一樣。
閱讀這里揭露的資料后，各種其它的實(shí)施例對(duì)于那些熟悉本行的人來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，而不會(huì)偏離本發(fā)明的精神和范圍。所有這樣的其它實(shí)施例都將包括在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人G.D.Searle and Company(ⅱ)發(fā)明名稱(chēng)新型促紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑(ⅲ)序列數(shù)134(ⅳ)通信地址(A)收信人G.D.Searle & Co(B)街道P.O.Box 5110(C)城市Chicago(D)州IL(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼60680(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ for Windows Version 2.0(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)提交日期1997年10月21日(C)分類(lèi)(ⅶ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?0/034,044(B)提交日期1996年10月25日(ⅷ)代理律師/代理人資料(A)姓名Bennett,Dennis A(B)注冊(cè)號(hào)34,547(C)參考/檔案號(hào)2991/1(ⅸ)電訊資料(A)電話314-737-6986(B)傳真314-737-6972(C)電報(bào)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:1:Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile1 5 10 15Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu20 25 30Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser35 40 45Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro50 55 60Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg65 70 75 80Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile85 90 95Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala100 105 110Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly115 120 125Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly130 135 140Gly Gly Ser Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu145 150 155 160Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu165 170(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:2:Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr1 5 10 15Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val20 25 30Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu35 40 45Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp50 55 60Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser65 70 75 80Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser85 90 95Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ale Asp100 105 110Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys115 120 125Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly130 135 140Gly Ser Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg145 150 155 160Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn165 170(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:3:Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val1 5 10 15Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly20 25 30Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala35 40 45Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu50 55 60Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu65 70 75 80Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro85 90 95Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr100 105 110Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu115 120 125Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly Gly130 135 140Ser Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr145 150 155 160Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile165 170(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:4:Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro1 5 10 15Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Mer Glu Val Gly Gln20 25 30Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val35 40 45Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro50 55 60Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr65 70 75 80Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro85 90 95Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe100 105 110Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys115 120 125Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly Gly Ser130 135 140Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu145 150 155 160Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr165 170(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:5:Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp1 5 10 15Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln20 25 30Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu35 40 45Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu50 55 60Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr65 70 75 80Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp85 90 95Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg100 105 110Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu115 120 125Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly Gly Ser Ala130 135 140Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu145 150 155 160Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr165 170(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:6:Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr1 5 10 15Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala20 25 30Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg35 40 45Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln50 55 60Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu65 70 75 80Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala85 90 95Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys100 105 110Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr115 120 125Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly Gly Ser Ala Pro130 135 140Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu145 150 155 160Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly165 170(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:7:Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys1 5 10 15Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val20 25 30Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly35 40 45Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu50 55 60His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu65 70 75 80Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala85 90 95Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu100 105 110Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr115 120 125Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly Gly Ser Ala Pro Pro130 135 140Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala145 150 155 160Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys165 170(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:8:Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val1 5 10 15Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu20 25 30Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln35 40 45Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His50 55 60Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg65 70 75 80Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser85 90 95Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe100 105 110Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly115 120 125Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly Gly Ser Ala Pro Pro Arg130 135 140Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys145 150 155 160Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala165 170(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:9:His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn1 5 10 15Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Mer Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val20 25 30Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala35 40 45Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val50 55 60Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala65 70 75 80Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala85 90 95Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg100 105 110Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu115 120 125Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly Gly Ser Ala Pro Pro Arg Leu130 135 140Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu145 150 155 160Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu165 170(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:10:Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe1 5 10 15Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp20 25 30Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu35 40 45Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp50 55 60Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu65 70 75 80Gly Ala Gln Lys 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(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:17:Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val1 5 10 15Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu20 25 30Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp35 40 45Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser50 55 60Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser65 70 75 80Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp85 90 95Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys100 105 110Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly115 120 125Gly Ser Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg130 135 140Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala145 150 155 160Glu His Cys Ser Leu ASn Glu Asn Ile Thr165 170(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:18:Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val 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(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:28:Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys1 5 10 15Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly20 25 30Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro35 40 45Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr50 55 60Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys65 70 75 80Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly Gly Ser Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys85 90 95Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu100 105 110Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile115 120 125Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu130 135 140Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser145 150 155 160Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu165 170(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:29:Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys 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NO:38的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:38:Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser1 5 10 15Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe20 25 30Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly35 40 45Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly Gly Ser Ala Pro Pro Arg50 55 60Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys65 70 75 80Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn85 90 95Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys100 105 110Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala115 120 125Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser130 135 140Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser145 150 155 160Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg165 170(2)SEQ ID NO:39的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:39:Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala1 5 10 15Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg20 25 30Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu35 40 45Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly Gly Ser Ala Pro Pro Arg Leu50 55 60Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu65 70 75 80Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu85 90 95Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg100 105 110Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu115 120 125Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser130 135 140Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly145 150 155 160Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala165 170(2)SEQ ID NO:40的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:40:Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala 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NO:49的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:49:Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr1 5 10 15Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu20 25 30Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly Gly35 40 45Ser Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr50 55 60Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu65 70 75 80His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn85 90 95Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val100 105 110Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala115 120 125Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val130 135 140Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala145 150 155 160Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro165 170(2)SEQ ID NO:50的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:50:Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe1 5 10 15Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys20 25 30Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly Gly Ser35 40 45Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu50 55 60Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His65 70 75 80Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe85 90 95Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp100 105 110Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu115 120 125Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp130 135 140Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu145 150 155 160Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro165 170(2)SEQ ID NO:51的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:51:Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe 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(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:69:TGCAGCTTGA ATGAGAATAT CACTGTCCCA GACACCAAAG TTAATTTCTA TGCCTGGAAG 60AGGATGGAGG TCGGGCAGCA GGCCGTAGAA GTCTGGCAGG GCCTGGCCCT GCTGTCGGAA120GCTGTCCTGC GGGGCCAGGC CCTGTTGGTC AACTCTTCCC AGCCGTGGGA GCCCCTGCAG180CTGCATGTGG ATAAAGCCGT CAGTGGCCTT CGCAGCCTCA CCACTCTGCT TCGGGCTCTG240GGAGCCCAGA AGGAAGCCAT CTCCCCTCCA GATGCGGCCT CAGCTGCTCC ACTCCGAACA300ATCACTGCTG ACACTTTCCG CAAACTCTTC CGAGTCTACT CCAATTTCCT CCGGGGAAAG360CTGAAGCTGT ACACAGGGGA GGCCTGCAGG ACAGGGGACA GATGAGGCGG CGGCTCCCCC420CACCACGCCT CATCTGTGAC AGCCGAGTCC TGGAGAGGTA CCTCTTGGAG GCCAAGGAGG480CCGAGAATAT CACGACGGGC TGTGCTGAAC AC 512(2)SEQ ID NO:70的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度512個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:70:AGCTTGAATG AGAATATCAC TGTCCCAGAC ACCAAAGTTA ATTTCTATGC CTGGAAGAGG 60ATGGAGGTCG GGCAGCAGGC CGTAGAAGTC TGGCAGGGCC TGGCCCTGCT GTCGGAAGCT120GTCCTGCGGG GCCAGGCCCT GTTGGTCAAC TCTTCCCAGC CGTGGGAGCC CCTGCAGCTG180CATGTGGATA AAGCCGTCAG TGGCCTTCGC AGCCTCACCA CTCTGCTTCG GGCTCTGGGA240GCCCAGAAGG 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(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:80:AGGATGGAGG TCGGGCAGCA GGCCGTAGAA GTCTGGCAGG GCCTGGCCCT GCTGTCGGAA 60GCTGTCCTGC GGGGCCAGGC CCTGTTGGTC AACTCTTCCC AGCCGTGGGA GCCCCTGCAG120CTGCATGTGG ATAAAGCCGT CAGTGGCCTT CGCAGCCTCA CCACTCTGCT TCGGGCTCTG180GGAGCCCAGA AGGAAGCCAT CTCCCCTCCA GATGCGGCCT CAGCTGCTCC ACTCCGAACA240ATCACTGCTG ACACTTTCCG CAAACTCTTC CGAGTCTACT CCAATTTCCT CCGGGGAAAG300CTGAAGCTGT ACACAGGGGA GGCCTGCAGG ACAGGGGACA GATGAGGCGG CGGCTCCCCC360CACCACGCCT CATCTGTGAC AGCCGAGTCC TGGAGAGGTA CCTCTTGGAG GCCAAGGAGG420CCGAGAATAT CACGACGGGC TGTGCTGAAC ACTGCAGCTT GAATGAGAAT AATCACTGTC480CCAGACACCA AAGTTAATTT CTATGCCTGG AAG 513(2)SEQ ID NO:8 1的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度513個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:81ATGGAGGTCG GGCAGCAGGC CGTAGAAGTC TGGCAGGGCC TGGCCCTGCT GTCGGAAGCT 60GTCCTGCGGG GCCAGGCCCT GTTGGTCAAC TCTTCCCAGC CGTGGGAGCC CCTGCAGCTG120CATGTGGATA AAGCCGTCAG TGGCCTTCGC AGCCTCACCA CTCTGCTTCG GGCTCTGGGA180GCCCAGAAGG AAGCCATCTC CCCTCCAGAT GCGGCCTCAG CTGCTCCACT CCGAACAATC240ACTGCTGACA CTTTCCGCAA ACTCTTCCGA GTCTACTCCA ATTTCCTCCG GGGAAAGCTG300AAGCTGTACA CAGGGGAGGC CTGCAGGACA GGGGACAGAT GAGGCGGCGG CTCCCCCCAC360CACGCCTCAT CTGTGACAGC CGAGTCCTGG AGAGGTACCT CTTGGAGGCC AAGGAGGCCG420AGAATATCAC GACGGGCTGT GCTGAACACT GCAGCTTGAA TGAGAATAAT CACTGTCCCA480GACACCAAAG TTAATTTCTA TGCCTGGAAG AGG 513(2)SEQ ID NO:82的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度513個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:82:GAGGTCGGGC AGCAGGCCGT AGAAGTCTGG CAGGGCCTGG CCCTGCTGTC GGAAGCTGTC 60CTGCGGGGCC AGGCCCTGTT GGTCAACTCT TCCCAGCCGT GGGAGCCCCT GCAGCTGCAT120GTGGATAAAG CCGTCAGTGG CCTTCGCAGC CTCACCACTC TGCTTCGGGC TCTGGGAGCC180CAGAAGGAAG CCATCTCCCC TCCAGATGCG GCCTCAGCTG CTCCACTCCG AACAATCACT240GCTGACACTT TCCGCAAACT CTTCCGAGTC TACTCCAATT TCCTCCGGGG AAAGCTGAAG300CTGTACACAG GGGAGGCCTG CAGGACAGGG GACAGATGAG GCGGCGGCTC CCCCCACCAC360GCCTCATCTG TGACAGCCGA GTCCTGGAGA GGTACCTCTT GGAGGCCAAG GAGGCCGAGA420ATATCACGAC GGGCTGTGCT GAACACTGCA GCTTGAATGA GAATAATCAC TGTCCCAGAC480ACCAAAGTTA ATTTCTATGC CTGGAAGAGG ATG 513(2)SEQ ID NO:83的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度513個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:83:GTCGGGCAGC AGGCCGTAGA AGTCTGGCAG GGCCTGGCCC TGCTGTCGGA AGCTGTCCTG 60CGGGGCCAGG CCCTGTTGGT CAACTCTTCC CAGCCGTGGG AGCCCCTGCA GCTGCATGTG120GATAAAGCCG TCAGTGGCCT TCGCAGCCTC ACCACTCTGC TTCGGGCTCT GGGAGCCCAG180AAGGAAGCCA TCTCCCCTCC AGATGCGGCC TCAGCTGCTC CACTCCGAAC AATCACTGCT240GACACTTTCC GCAAACTCTT CCGAGTCTAC TCCAATTTCC TCCGGGGAAA GCTGAAGCTG300TACACAGGGG AGGCCTGCAG GACAGGGGAC AGATGAGGCG GCGGCTCCCC CCACCACGCC360TCATCTGTGA CAGCCGAGTC CTGGAGAGGT ACCTCTTGGA GGCCAAGGAG GCCGAGAATA420TCACGACGGG CTGTGCTGAA CACTGCAGCT TGAATGAGAA TAATCACTGT CCCAGACACC480AAAGTTAATT TCTATGCCTG GAAGAGGATG GAG 513(2)SEQ ID NO:84的信息
(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度513個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:84:CAGGCCCTGT TGGTCAACTC TTCCCAGCCG TGGGAGCCCC TGCAGCTGCA TGTGGATAAA 60GCCGTCAGTG GCCTTCGCAG CCTCACCACT CTGCTTCGGG CTCTGGGAGC CCAGAAGGAA120GCCATCTCCC CTCCAGATGC GGCCTCAGCT GCTCCACTCC GAACAATCAC TGCTGACACT180TTCCGCAAAC TCTTCCGAGT CTACTCCAAT TTCCTCCGGG GAAAGCTGAA GCTGTACACA240GGGGAGGCCT GCAGGACAGG GGACAGATGA GGCGGCGGCT CCCCCCACCA CGCCTCATCT300GTGACAGCCG AGTCCTGGAG AGGTACCTCT TGGAGGCCAA GGAGGCCGAG AATATCACGA360CGGGCTGTGC TGAACACTGC AGCTTGAATG AGAATAATCA CTGTCCCAGA CACCAAAGTT420AATTTCTATG CCTGGAAGAG GATGGAGGTC GGGCAGCAGG CCGTAGAAGT CTGGCAGGGC480CTGGCCCTGC TGTCGGAAGC TGTCCTGCGG GGC 513(2)SEQ ID NO:85的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度513個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:85:GCCCTGTTGG TCAACTCTTC CCAGCCGTGG GAGCCCCTGC AGCTGCATGT GGATAAAGCC 60GTCAGTGGCC TTCGCAGCCT CACCACTCTG CTTCGGGCTC TGGGAGCCCA GAAGGAAGCC120ATCTCCCCTC CAGATGCGGC CTCAGCTGCT CCACTCCGAA CAATCACTGC TGACACTTTC180CGCAAACTCT TCCGAGTCTA CTCCAATTTC CTCCGGGGAA AGCTGAAGCT GTACACAGGG240GAGGCCTGCA GGACAGGGGA CAGATGAGGC GGCGGCTCCC CCCACCACGC CTCATCTGTG300ACAGCCGAGT CCTGGAGAGG TACCTCTTGG AGGCCAAGGA GGCCGAGAAT ATCACGACGG360GCTGTGCTGA ACACTGCAGC TTGAATGAGA ATAATCACTG TCCCAGACAC CAAAGTTAAT420TTCTATGCCT GGAAGAGGAT GGAGGTCGGG CAGCAGGCCG TAGAAGTCTG GCAGGGCCTG480GCCCTGCTGT CGGAAGCTGT CCTGCGGGGC CAG 513(2)SEQ ID NO:86的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度513個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性()ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:86:CTGTTGGTCA ACTCTTCCCA GCCGTGGGAG CCCCTGCAGC TGCATGTGGA TAAAGCCGTC 60AGTGGCCTTC GCAGCCTCAC CACTCTGCTT CGGGCTCTGG GAGCCCAGAA GGAAGCCATC120TCCCCTCCAG ATGCGGCCTC AGCTGCTCCA CTCCGAACAA TCACTGCTGA CACTTTCCGC180AAACTCTTCC GAGTCTACTC CAATTTCCTC CGGGGAAAGC TGAAGCTGTA CACAGGGGAG240GCCTGCAGGA CAGGGGACAG ATGAGGCGGC GGCTCCCCCC ACCACGCCTC ATCTGTGACA300GCCGAGTCCT GGAGAGGTAC CTCTTGGAGG CCAAGGAGGC CGAGAATATC ACGACGGGCT360GTGCTGAACA CTGCAGCTTG AATGAGAATA ATCACTGTCC CAGACACCAA AGTTAATTTC420TATGCCTGGA AGAGGATGGA GGTCGGGCAG CAGGCCGTAG AAGTCTGGCA GGGCCTGGCC480CTGCTGTCGG AAGCTGTCCT GCGGGGCCAG GCC 513(2)SEQ ID NO:87的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度513個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:87:TTGGTCAACT CTTCCCAGCC GTGGGAGCCC CTGCAGCTGC ATGTGGATAA AGCCGTCAGT 60GGCCTTCGCA GCCTCACCAC TCTGCTTCGG GCTCTGGGAG CCCAGAAGGA AGCCATCTCC120CCTCCAGATG CGGCCTCAGC TGCTCCACTC CGAACAATCA CTGCTGACAC TTTCCGCAAA180CTCTTCCGAG TCTACTCCAA TTTCCTCCGG GGAAAGCTGA AGCTGTACAC AGGGGAGGCC240TGCAGGACAG GGGACAGATG AGGCGGCGGC TCCCCCCACC ACGCCTCATC TGTGACAGCC300GAGTCCTGGA GAGGTACCTC TTGGAGGCCA AGGAGGCCGA GAATATCACG ACGGGCTGTG360CTGAACACTG CAGCTTGAAT GAGAATAATC ACTGTCCCAG ACACCAAAGT TAATTTCTAT420GCCTGGAAGA GGATGGAGGT CGGGCAGCAG GCCGTAGAAG TCTGGCAGGG CCTGGCCCTG480CTGTCGGAAG CTGTCTGCG GGGCCAGGCC CTG 513(2)SEQ ID NO:88的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度513個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:88:GTCAACTCTT CCCAGCCGTG GGAGCCCCTG CAGCTGCATG TGGATAAAGC CGTCAGTGGC 60CTTCGCAGCC TCACCACTCT GCTTCGGGCT CTGGGAGCCC AGAAGGAAGC GATCTCCCCT120CCAGATGCGG CCTCAGCTGC TCCACTCCGA ACAATCACTG CTGACACTTT CCGCAAACTC180TTCCGAGTCT ACTCCAATTT CCTCCGGGGA AAGCTGAAGC TGTACACAGG GGAGGCCTGC240AGGACAGGGG ACAGATGAGG CGGCGGCTCC CCCCACCACG CCTCATCTGT GACAGCCGAG300TCCTGGAGAG GTACCTCTTG GAGGCCAAGG AGGCCGAGAA TATCACGACG GGCTGTGCTG360AACACTGCAG CTTGAATGAG AATAATCACT GTCCCAGACA CCAAAGTTAA TTTCTATGCC420TGGAAGAGGA TGGAGGTCGG GCAGCAGGCC GTAGAAGTCT GGCAGGGCCT GGCCCTGCTG480TCGGAAGCTG TCCTGCGGGG CCAGGCCCTG TTG 513(2)SEQ ID NO:89的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度513個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:89:AACTCTTCCC AGCCGTGGGA GCCCCTGCAG CTGCATGTGG ATAAAGCCGT CAGTGGCCTT 60CGCAGCCTCA CCACTCTGCT TCGGGCTCTG GGAGCCCAGA AGGAAGCCAT CTCCCCTCCA120GATGCGGCCT CAGCTGCTCC ACTCCGAACA ATCACTGCTG ACACTTTCCG CAAACTCTTC180CGAGTCTACT CCAATTTCCT CCGGGGAAAG CTGAAGCTGT ACACAGGGGA GGCCTGCAGG240ACAGGGGACA GATGAGGCGG CGGCTCCCCC CACCACGCCT CATCTGTGAC AGCCGAGTCC300TGGAGAGGTA CCTCTTGGAG GCCAAGGAGG CCGAGAATAT CACGACGGGC TGTGCTGAAC360ACTGCAGCTT GAATGAGAAT AATCACTGTC CCAGACACCA AAGTTAATTT CTATGCCTGG420AAGAGGATGG AGGTCGGGCA GCAGGCCGTA GAAGTCTGGC AGGGGCTGGC CCTGCTGTCG480GAAGCTGTCC TGCGGGGCCA GGCCCTGTTG GTC 513(2)SEQ ID NO:90的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度513個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:90:TCTTCCCAGC CGTGGGAGCC CCTGCAGCTG CATGTGGATA AAGCCGTCAG TGGCCTTCGC 60AGCCTCACCA CTCTGCTTCG GGCTCTGGGA GCCCAGAAGG AAGCCATCTC CCCTCCAGAT120GCGGCCTCAG CTGCTCCACT CCGAACAATC ACTGCTGACA CTTTCCGCAA ACTCTTCCGA180GTCTACTCCA ATTTCCTCCG GGGAAAGCTG AAGCTGTACA CAGGGGAGGC CTGCAGGACA240GGGGACAGAT GAGGCGGCGG CTCCCCCCAC CACGCCTCAT CTGTGACAGC CGAGTCCTGG300AGAGGTACCT CTTGGAGGCC AAGGAGGCCG AGAATATCAC GACGGGCTGT GCTGAACACT360GCAGCTTGAA TGAGAATAAT CACTGTCCCA GACACCAAAG TTAATTTCTA TGCCTGGAAG420AGGATGGAGG TCGGGCAGCA GGCCGTAGAA GTCTGGCAGG GCCTGGCCCT GCTGTCGGAA480GCTGTCCTGC GGGGCCAGGC CCTGTTGGTC AAC 513(2)SEQ ID NO:91的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度513個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:91:TCCCAGCCGT GGGAGCCCCT GCAGCTGCAT GTGGATAAAG CCGTCAGTGG CCTTCGCAGC 60CTCACCACTC TGCTTCGGGC TCTGGGAGCC CAGAAGGAAG CCATCTCCCC TCCAGATGCG120GCCTCAGCTG CTCCACTCCG AACAATCACT GCTGACACTT TCCGCAAACT CTTCCGAGTC180TACTCCAATT TCCTCCGGGG AAAGCTGAAG CTGTACACAG GGGAGGCCTG CAGGACAGGG240GACAGATGAG GCGGCGGCTC CCCCCACCAC GCCTCATCTG TGACAGCCGA GTCCTGGAGA300GGTACCTCTT GGAGGCCAAG GAGGCCGAGA ATATCACGAC GGGCTGTGCT GAACACTGCA360GCTTGAATGA GAATAATCAC TGTCCCAGAC ACCAAAGTTA ATTTCTATGC CTGGAAGAGG420ATGGAGGTCG GGCAGCAGGC CGTAGAAGTC TGGCAGGGCC TGGCCCTGCT GTCGGAAGCT480GTCCTGCGGG GCCAGGCCCT GTTGGTCAAC TCT 513(2)SEQ ID NO:92的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度513個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:92:CAGCCGTGGG AGCCCCTGCA GCTGCATGTG GATAAAGCCG TCAGTGGCCT TCGCAGCCTC 60ACCACTCTGC TTCGGGCTCT GGGAGCCCAG AAGGAAGCCA TCTCCCCTCC AGATGCGGCC120TCAGCTGCTC CACTCCGAAC AATCACTGCT GACACTTTCC GCAAACTCTT CCGAGTCTAC180TCCAATTTCC TCCGGGGAAA GCTGAAGCTG TACACAGGGG AGGCCTGCAG GACAGGGGAC240AGATGAGGCG 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(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:102:CAGAAGGAAG CCATCTCCCC TCCAGATGCG GCCTCAGCTG CTCCACTCCG AACAATCACT 60GCTGACACTT TCCGCAAACT CTTCCGAGTC TACTCCAATT TCCTCCGGGG AAAGCTGAAG120CTGTACACAG GGGAGGCCTG CAGGACAGGG GACAGATGAG GCGGCGGCTC CCCCCACCAC180GCCTCATCTG TGACAGCCGA GTCCTGGAGA GGTACCTCTT GGAGGCCAAG GAGGCCGAGA240ATATCACGAC GGGCTGTGCT GAACACTGCA GCTTGAATGA GAATAATCAC TGTCCCAGAC300ACCAAAGTTA ATTTCTATGC CTGGAAGAGG ATGGAGGTCG GGCAGCAGGC CGTAGAAGTC360TGGCAGGGCC TGGCCCTGCT GTCGGAAGCT GTCCTGCGGG GCCAGGCCCT GTTGGTCAAC420TCTTCCCAGC CGTGGGAGCC CCTGCAGCTG CATGTGGATA AAGCCGTCAG TGGCCTTCGC480AGCCTCACCA CTCTGCTTCG GGCTCTGGGA GCC 513(2)SEQ ID NO:103的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度513個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:103:AAGGAAGCCA TCTCCCCTCC AGATGCGGCC TCAGCTGCTC CACTCCGAAC AATCACTGCT60GACACTTTCC GCAAACTCTT CCGAGTCTAC TCCAATTTCC TCCGGGGAAA GCTGAAGCTG 120TACACAGGGG AGGCCTGCAG GACAGGGGAC AGATGAGGCG GCGGCTCCCC CCACCACGCC 180TCATCTGTGA CAGCCGAGTC CTGGAGAGGT ACCTCTTGGA GGCCAAGGAG GCCGAGAATA 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(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:13:TCAGCTGCTC CACTCCGAAC AATCACTGCT GACACTTTCC GCAAACTCTT CCGAGTCTAC 60TCCAATTTCC TCCGGGGAAA GCTGAAGCTG TACACAGGGG AGGCCTGCAG GACAGGGGAC120AGATGAGGCG GCGGCTCCCC CCACCACGCC TCATCTGTGA CAGCCGAGTC CTGGAGAGGT180ACCTCTTGGA GGCCAAGGAG GCCGAGAATA TCACGACGGG CTGTGCTGAA CACTGCAGCT240TGAATGAGAA TAATCACTGT CCCAGACACC AAAGTTAATT TCTATGCCTG GAAGAGGATG300GAGGTCGGGC AGCAGGCCGT AGAAGTCTGG CAGGGCCTGG CCCTGCTGTC GTAAGCTGTC360CTGCGGGGCC AGGCCCTGTT GGTCAACTCT TCCCAGCCGT GGGAGCCCCT GCAGCTGCAT420GTGGATAAAG CCGTCAGTGG CCTTCGCAGC CTCACCACTC TGCTTCGGGC TCTGGGAGCC480CAGAAGGAAG CCATCTCCCC TCCAGATGCG GCC 513(2)SEQ ID NO:114的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度513個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:114:GCTGCTCCAC TCCGAACAAT CACTGCTGAC ACTTTCCGCA AACTCTTCCG AGTCTACTCC 60AATTTCCTCC GGGGAAAGCT GAAGCTGTAC ACAGGGGAGG CCTGCAGGAC AGGGGACAGA120TGAGGCGGCG GCTCCCCCCA CCACGCCTCA TCTGTGACAG CCGAGTCCTG GAGAGGTACC180TCTTGGAGGC CAAGGAGGCC GAGAATATCA CGACGGGCTG TGCTGAACAC TGCAGCTTGA240ATGAGAATAA 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60GAGGCCGAGA ATATCACGAC GGGCTGTGCT GAACACTGCA GCTTGAATGA GAATATCACT120GTCCCAGACA CCAAAGTTAA TTTCTATGCC TGGAAGAGGA TGGAGGTCGG GCAGCAGGCC180GTAGAAGTCT GGCAGGGCCT GGCCCTGCTG TCGGAAGCTG TCCTGCGGGG CCAGGCCCTG240TTGGTCAACT CTTCCCAGCC GTGGGAGCCC CTGCAGCTGC ATGTGGATAA AGCCGTCAGT300GGCCTTCGCA GCCTCACCAC TCTGCTTCGG GCTCTGGGAG CCCAGAAGGA AGCCATCTCC360CCTCCAGATG CGGCCTCAGC TGCTCCACTC CGAACAATCA CTGCTGACAC TTTCCGCAAA420CTCTTCCGAG TCTACTCCAA TTTCCTCCGG GGAAAGCTGA AGCTGTACAC AGGGGAGGCC480TGCAGGACAG GGGACAGATG A 501(2)SEQ ID NO:121的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度166個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:121:Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165(2)SEQ ID NO:122的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:122:Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu1 5 10 15Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser20 25 30Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Ash Ser Ser Gln Pro35 40 45Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg50 55 60Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile65 70 75 80Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala85 90 95Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly100 105 110Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly115 120 125Gly Gly Ser Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu130 135 140Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys145150 155 160Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile165 170(2)SEQ ID NO:123的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:123:Gly Gly Gly Ser1(2)SEQ ID NO:124的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:124:Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser1 5(2)SEQ ID NO:125的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:125:Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:126的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度7個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:126:Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser1 5(2)SEQ ID NO:127的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:127:Glu Phe Gly Asn Met1 5(2)SEQ ID NO:128的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:128:Glu Phe Gly Gly Asn Met1 5(2)SEQ ID NO:129的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:129:Glu Phe Gly Gly Asn Gly Gly Asn Met1 5(2)SEQ ID NO:130的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度7個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:130:Gly Gly Ser Asp Met Ala Gly1 5(2)SEQ ID NO:131的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:131:GCGCGCCCAT GGACAATCAC TGCTGAC27(2)SEQ ID NO:132的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:132:TCTGTCCCCT GTCCT 15(2)SEQ ID NO:133的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:133:GCGCGCAAGC TTATTATCGG AGTGGAGCAG CTGAGGCCGC ATC 43(2)SEQ ID NO:134的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:132:GCCCCACCAC GCCTCATCTG T 2權(quán)利要求
1．一種人類(lèi)EPO受體激動(dòng)劑多肽，包含修飾過(guò)的下面結(jié)構(gòu)式的EPO氨基酸序列AlaProProArgLeuIleCysAspSerArgValLeuGluArgTyrLeuLeuGluAlaLys1020GluAlaGluAsnIleThrThrGlyCysAlaGluHisCysSerLeuAsnGluAsnIleThr3040ValProAspThrLysValAsnPheTyrAlaTrpLysArgMetGluValGlyGlnGlnAla5060ValGluValTrpGlnGlyLeuAlaLeuLeuSerGluAlaValLeuArgGlyGlnAlaLeu7080LeuValAsnSerSerGlpProTrpGluProLeuGlnLeuHisValAspLysAlaValSer90100GlyLeuArgSerLeuThrThrLeuLeuArgAlaLeuGlyAlaGlnLysGluAlaIleSer110 120ProProAspAlaAlaSerAlaAlaProLeuArgThrIleThrAlaAspThrPheArgLys130 140LeuPheArgValTyrSerAsnPheLeuArgGlyLysLeuLysLeuTyrThrGlyGluAla140 160CysArgThrGlyAspArg166其中N端的1-6個(gè)氨基酸和C端的1-5個(gè)氨基酸可以可任選地從所述EPO受體激動(dòng)劑多肽上缺失。其中N端與C端或是直接地，或是通過(guò)一個(gè)能連接N端和C端的接頭相連接，并分別在下列氨基酸上有新的C和N端23-2448-49111-11224-2550-51112-11325-2651-52113-11426-2752-53114-11527-2853-54115-11628-2954-55116-11729-3055-56117-11830-3156-57118-11931-3257-58119-12032-3377-78120-12133-3478-79121-12234-3579-80122-12335-3680-81123-12436-3781-82124-12537-3882-83125-12638-3984-85126-12740-4185-86127-12841-4286-87128-12943-4487-88129-13044-4588-89131-13245-46 108-10946-47 109-11047-48 110-111并且所述EPO受體激動(dòng)劑多肽可以可選地緊跟著(甲硫氨酸-1)、(丙氨酸-1)或(甲硫氨酸-2，丙氨酸-1)。
2．如權(quán)利要求1所陳述的EPO受體激動(dòng)劑多肽，其中所述接頭選自GlyGlyGlySerSEQ ID NO:123GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerSEQ ID NO:124GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerSEQ ID NO:125SerGlyGlySerGlyGlySerSEQ ID NO:126GluPheGlyAsnMetSEQ ID NO:127GluPheGlyGlyAsnMetSEQ ID NO:128GluPheGlyGlyAsnGlyGlyAsnMetSEQ ID NO:129和GlyGlySerAspMetAlaGlySEQ ID NO:130。
3．權(quán)利要求1的EPO受體激動(dòng)劑，選自SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13；SEQID NO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ IDNO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ IDNO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ IDNO:26；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ IDNO:30；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ IDNO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:37；SEQ IDNO:38；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ IDNO:42；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:45；SEQ IDNO:46；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:49；SEQ IDNO:50；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:52；SEQ ID NO:53；SEQ IDNO:54；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ IDNO:58；SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:122。
4．權(quán)利要求3的EPO受體激動(dòng)劑多肽，其中的接頭序列(GlyGlyGlyGlySer SEQ ID NO:123)被選自以下的一個(gè)接頭序列置換GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerSEQ ID NO:124GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerSEQ ID NO:125SerGlyGlySerGlyGlySerSEQ ID NO:126GluPheGlyAsnMetSEQ ID NO:127GluPheGlyGlyAsnMetSEQ ID NO:128GluPheGlyGlyAsnGlyGlyAsnMetSEQ ID NO:129和GlyGlySeAspMeAlaGlySEQ ID NO:130。
5．一種核酸分子，包含編碼權(quán)利要求1的EPO受體激動(dòng)劑多肽的DNA序列。
6．一種核酸分子，包含編碼權(quán)利要求2的EPO受體激動(dòng)劑多肽的DNA序列。
7．一種核酸分子，包含編碼權(quán)利要求3的EPO受體激動(dòng)劑多肽的DNA序列。
8．一種核酸分子，包含選自以下的一個(gè)編碼權(quán)利要求3的EPO受體激動(dòng)劑多肽的DNA序列SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:65；SEQ ID NO:66；SEQ ID NO:67；SEQID NO:68；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:70；SEQ ID NO:71；SEQ IDNO:72；SEQ ID NO:73；SEQ ID NO:74；SEQ ID NO:75；SEQ IDNO:76；SEQ ID NO:77；SEQ ID NO:78；SEQ ID NO:79；SEQ IDNO:80；SEQ ID NO:81；SEQ ID NO:82；SEQ ID NO:83；SEQ IDNO:84；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:87；SEQ IDNO:88；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:90；SEQ ID NO:91；SEQ IDNO:92；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:94；SEQ ID NO:95；SEQ IDNO:96；SEQ ID NO:97；SEQ ID NO:98；SEQ ID NO:99；SEQ IDNO:100；SEQ ID NO:101；SEQ ID NO:102；SEQ ID NO:103；SEQ IDNO:104；SEQ ID NO:105；SEQ ID NO:106；SEQ ID NO:107；SEQ IDNO:108；SEQ ID NO:109；SEQ ID NO:110；SEQ ID NO:111；SEQ IDNO:112；SEQ ID NO:113；SEQ ID NO:114；SEQ ID NO:115；SEQ IDNO:116；SEQ ID NO:117；SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119。
9．一種核酸分子，包含編碼權(quán)利要求4的EPO受體激動(dòng)劑多肽的DNA序列。
10．一種產(chǎn)生EPO受體激動(dòng)劑多肽的方法，包括讓用一個(gè)復(fù)制型載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞在適宜的營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，其中所述載體包含權(quán)利要求5、6、7、8或9所述的核酸分子，其方式允許所述EPO受體激動(dòng)劑多肽表達(dá)，并且回收所述EPO受體激動(dòng)劑多肽。
11．一種組合物，包括一種依照權(quán)利要求1、2、3或4的EPO受體激動(dòng)劑多肽；和一種藥學(xué)上可接受的載體。
12．一種組合物，包括一種依照權(quán)利要求1、2、3或4的EPO受體激動(dòng)劑多肽；一種因子；和一種藥學(xué)上可接受的載體。
13．權(quán)利要求12的組合物，其中所述因子選自GM-CSF、G-CSF、c-mpl配體、M-CSF、IL-1、IL-4、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、LIF、flt3/flk2配體、人類(lèi)生長(zhǎng)激素、B細(xì)胞生長(zhǎng)因子、B細(xì)胞分化因子、嗜酸性粒細(xì)胞分化因子和干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、IL-3變異體、融合蛋白、G-CSF受體激動(dòng)劑、c-mpl受體激動(dòng)劑、IL-3受體激動(dòng)劑、多功能受體激動(dòng)劑。
14．一種刺激患者體內(nèi)造血細(xì)胞產(chǎn)生的方法，包括下面步驟將權(quán)利要求1、2、3或4的一種EPO受體激動(dòng)劑多肽給予所述患者。
15．一種用于紅細(xì)胞祖細(xì)胞(progenitor)的選擇性離體擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，包括下面步驟(a)在包含權(quán)利要求1、2、3或4的多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)紅細(xì)胞祖細(xì)胞；然后(b)收獲所述的培養(yǎng)細(xì)胞。
16．一種用于紅細(xì)胞祖細(xì)胞的選擇性離體擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，包括下面步驟(a)將紅細(xì)胞祖細(xì)胞與其它細(xì)胞分離開(kāi)來(lái)；(b)在包含權(quán)利要求1、2、3或4的多肽的選定培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述分離的紅細(xì)胞祖細(xì)胞；然后(c)收獲所述的培養(yǎng)細(xì)胞。
17．一種方法，用于對(duì)患有造血紊亂的患者的治療，包括下面步驟(a)取出紅細(xì)胞祖細(xì)胞；(b)在包含權(quán)利要求1、2、3或4的多肽的選定培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述紅細(xì)胞祖細(xì)胞；(c)收獲所述的培養(yǎng)細(xì)胞；然后(d)將所述培養(yǎng)細(xì)胞移植入所述患者體內(nèi)。
18．一種方法，用于對(duì)患有造血紊亂的患者的治療，包括下面步驟(a)取出紅細(xì)胞祖細(xì)胞；(b)將紅細(xì)胞祖細(xì)胞與其它細(xì)胞分離開(kāi)來(lái)；(c)在包含權(quán)利要求1、2、3或4的多肽的選定培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述分離的紅細(xì)胞祖細(xì)胞；(d)收獲所述的培養(yǎng)細(xì)胞；然后(e)將所述培養(yǎng)細(xì)胞移植入所述患者體內(nèi)。
19．一種權(quán)利要求15的方法，其中所述紅細(xì)胞祖細(xì)胞是從外周血中分離的。
20．一種權(quán)利要求16的方法，其中所述紅細(xì)胞祖細(xì)胞是從外周血中分離的。
21．一種權(quán)利要求17的方法，其中所述紅細(xì)胞祖細(xì)胞是從外周血中分離的。
22．一種權(quán)利要求18的方法，其中所述紅細(xì)胞祖細(xì)胞是從外周血中分離的。
全文摘要
公開(kāi)了新型促紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑蛋白、編碼所述促紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑蛋白的DNA、制備所述促紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑蛋白的方法以及使用所述促紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑蛋白的方法。
文檔編號(hào)A61K38/22GK1234073SQ97198973
公開(kāi)日1999年11月3日 申請(qǐng)日期1997年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月25日
發(fā)明者C·A·麥惠特, Y·Q·馮, N·薩默斯 申請(qǐng)人:G·D·瑟爾公司