專利名稱：T細胞受體的制作方法
T細胞受體本發(fā)明涉及結(jié)合YLEPGPVTA肽(衍生自gplOO蛋白)的T細胞受體(TCR)，所述肽以肽-HLA-A2復(fù)合物呈遞，相對于天然gplOO TCRa和/或β可變域，所述TCR發(fā)生突變并且對所述復(fù)合物的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期至少是參比gplOO TCR的兩倍。
背景技術(shù)：
YLEPGPVTA (SEQ ID No 1)肽對應(yīng)于人糖蛋白100(gpl00)的氨基酸殘基號 280-288. GplOO在黑色素瘤癌細胞上廣泛而顯著地過量表達。例如，一項研究(Trefzer 等.，(2006)Melanoma Res. 16(2) :137-45)發(fā)現(xiàn)觀位黑色素瘤患者的192例黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶中有82%表達gplOO。幾項研究報道了黑色素瘤組織中g(shù)plOO表達水平較高(Hofbauer 等.，(2004)J Immunother. 27 (1) :73-8, Barrow 等.，(2006)Clin Cancer Res. 12 764-71)。YLEPGPVTA (SEQ ID No :1)肽由 gpl00+/HLA-A2 癌細胞上的 I 類 HLA 分子呈遞。 (Salgaller 等·，(1996)Cancer Res 56 :4749-4757)。因此，YLEPGPVTA HLA-A2復(fù)合物提供本發(fā)明TCR能靶向的癌癥標記物。例如，本發(fā)明TCR可用于將細胞毒性劑遞送至癌細胞的目的，或可轉(zhuǎn)化入T-細胞，從而使得它們能破壞呈遞HLA復(fù)合物的腫瘤細胞，以便在稱為過繼性治療的治療過程中給予患者。然而，為前一目的，如果TCR具有較高的親和力和/或較慢的解離速率，從而該TCR能長期駐留在所靶向的腫瘤細胞上，則是理想的。為后一目的，如果TCR對肽-HLA復(fù)合物相比于具有該復(fù)合物特異性的天然TCR具有較高的親和力和/或較低的解離速率，但不如前一目的的親和力那樣高，則是理想的。親和力的急劇增加與TCR基因-修飾的CD8T細胞中抗原特異性喪失相關(guān)，從而能導(dǎo)致這些TCR-轉(zhuǎn)染⑶8T細胞的非特異性激活，因此中等親和力TCR是過繼性治療所優(yōu)選的(參見 Zhao 等·，(2007) J Immunol. 179 :5845-54 ；Robbins 等·，(2008) J Immunol. 180 :6116-31 ；還參見公布的WO 2008/038002)。本發(fā)明提供此類TCR。采用國際免疫遺傳學(xué)(IMGT) TCR命名法描述TCR，將其與TCR序列的IMGT公開數(shù)據(jù)庫相關(guān)聯(lián)。天然α-β異源二聚TCR具有α鏈和β鏈。廣義上，各鏈包含可變區(qū)、連接區(qū)和恒定區(qū)，β鏈通常還在可變區(qū)和連接區(qū)之間含有短的多變區(qū)，但該多變區(qū)常視作連接區(qū)的一部分。各可變區(qū)包含嵌合在框架序列中的3個CDR(互補決定區(qū))，其中一個是稱為 ⑶R3的超變區(qū)。根據(jù)框架、⑶Rl和⑶R2序列以及部分確定的⑶R3序列，α鏈可變(Va ) 區(qū)可分成幾類，β鏈可變(νβ)區(qū)可分成幾類。在IMGT命名法中，通過唯一的TRAV編號指代Va類型。因此，“TRAV17”限定了具有獨特框架及⑶Rl和⑶R2序列和⑶R3序列的 TCR Va區(qū)，所述⑶R3序列部分由TCR之間保守性的氨基酸序列確定，但其還包含TCR之間不同的氨基酸序列?！癟RBV19”以相同方式限定了具有獨特框架及⑶Rl和⑶R2序列的TCR V β區(qū)，但僅包含部分確定的⑶R3序列。通過獨特的IMGT TRAJ和TRBJ命名法類似地確定TCR的連接區(qū)，通過IMGT TRAC 和TRBC命名法確定恒定區(qū)。IMGT命名法通過縮寫TRBD指代β鏈多變區(qū)，如上所述，連鎖的TRBD/TRBJ區(qū)常一起視作連接區(qū)。a i3TCR的α和β鏈常視作各自具有兩個“結(jié)構(gòu)域”，即，可變域和恒定域?？勺冇蛴蛇B鎖的可變區(qū)和連接區(qū)構(gòu)成。因此，在本申請的說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語“TCR α可變域”指連鎖的TRAV和TRAJ區(qū)，術(shù)語TCR α恒定域指胞外TRAC區(qū)或C-末端截短的 TRAC序列。類似地，術(shù)語“TCR β可變域”指連鎖的TRBV和TRBD/TRBJ區(qū)，術(shù)語TCR β恒定域指胞外TRBC區(qū)或C-末端截短的TRBC序列。TCR領(lǐng)域的工作人員廣為知曉并可得到IMGT命名法確定的獨特序列。例如，可在 IMGT公開數(shù)據(jù)庫中找到?！啊鼎臣毎荏w手冊(Τ cell receptor Factsbook)))", (2001)， LeFranc 和 LeFranc，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press), ISBN 0-12-441352-8 還公開了 IMGT 命名法確定的序列，但由于其公布日期和隨后的時間滯后，有時需要參考IMGT數(shù)據(jù)庫驗證其中的信息。我們證實了天然gp 100 TCR克隆具有以下α鏈和β鏈V、J和C基因應(yīng)用α 鏈-TRAV17/TRAJ29/TRAC (天然 gplOO TCR α 鏈的胞外序列見 SEQ ID No :2)。β 鏈-TRBV19*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2(天然 gplOO TCR β 鏈的胞外序列見SEQ ID No 3)。(注意TRBV19序列具有3個等位基因變體，在IMGT命名法中分別稱為 TRBV19*01、*02和*03，上述天然gplOOTCR克隆具有*01變異。同樣，TRBJ2-7序列具有兩個已知的變異，上述TCR克隆中存在的是*01序列。還應(yīng)注意，缺乏”*”限定符表示相關(guān)序列僅已知一種等位基因。)術(shù)語“野生型TCR”、“天然TCR”、“野生型gplOO TCR”和“天然gplOOTCR”在文本同義使用，指代具有胞外α和β鏈SEQ ID No 2和3的該天然產(chǎn)生的TCR。發(fā)明詳述本發(fā)明提供具有結(jié)合YLEPGPVTA(SEQ ID No 1) HLA-A2復(fù)合物特性的包含TCR α 可變域和/或TCR β可變域的T細胞受體(TCR)，其特征在于所述TCR (i)相對于具有胞外 α和β鏈序列SEQ ID No 2和3的天然gplOOTCR，在其α鏈可變域(SEQ ID No 2的氨基酸1-109)和/或其β鏈可變域(SEQ ID No 3的氨基酸1-112)中發(fā)生突變；和(ii)對 YLEPGPVTA-HLA-A2復(fù)合物的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期是參比gplOO TCR的至少兩倍， 所述參比gplOO TCR具有胞外α鏈序列SEQ ID No :45和胞外β鏈序列SEQ ID No :46。注意，SEQ ID No 45是天然α鏈胞外序列ID No :2，除了 C157取代了 Τ157(即， TRAC的Τ48)和Κ113取代了 Ν113。類似地，SEQ ID No 46是天然β鏈胞外序列ID No :3， 除了 C169 取代了 S169(即，TRBC2 的 S57)，A187 取代了 C187，D201 取代了 N201。相比于天然α和β鏈胞外序列，這些半胱氨酸取代能形成穩(wěn)定重折疊的可溶性TCR的鏈間二硫鍵， 艮口，通過重折疊胞外α和β鏈形成的TCR。利用穩(wěn)定的二硫鍵連接的可溶性TCR作為參比 TCR能更方便地評估結(jié)合親和力和結(jié)合半衰期。與天然α和β鏈SEQ ID No :2和3相比， α鏈SEQ ID Νο:45和β鏈SEQ ID No :46中的其它突變是“沉默突變”，意味著相對于天然序列，它們不影響結(jié)合親和力或結(jié)合半衰期。因此，如果本發(fā)明TCR對YLEPGPVTA-HLA-A2 復(fù)合物的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期是參比gplOO TCR的至少兩倍，其還隱含符合上述天然gplOO TCR克隆的那些標準。下文中“具有胞外α鏈序列SEQ ID No 45和胞外β鏈序列SEQ ID No 46的參比gplOO TCR”與“參比TCR”或“參比gplOO TCR”同義?？赏ㄟ^任何合適的方法測定結(jié)合親和力(與平衡參數(shù)Kd成反比)和結(jié)合半衰期 (表示為T1/2)。應(yīng)該了解，TCR的親和力翻倍導(dǎo)致Kd減半。T1/2計算為1η2除以解離-速率(k。ff)。因此，T1/2翻倍導(dǎo)致k。ff減半。TCR的Kd和k。ff值通常檢測為TCR的可溶性形式，即，截短以除去疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域殘基的那些形式。因此，應(yīng)該了解，給定的TCR符合以下要求，即，其對YLEPGPVTA-HLA-A2復(fù)合物具有結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期，如果可溶形式的該TCR符合該要求的話。優(yōu)選采用相同的試驗方案檢測給定TCR的結(jié)合親和力或結(jié)合半衰期數(shù)次，例如3次或更多次，取結(jié)果的平均值。在優(yōu)選的實施方式中，采用本文實施例 3的表面等離振子共振(BIAcore)方法進行這些檢測。該方法檢測到參比gplOO TCR的Kd 約為 19 μ M，k。ff 約為 Is—1 (S卩，Τ1Λ 約為 0.7s)。如本文所述，YLEPGPVTA是在HLA A2復(fù)合物中呈遞的天然gpl0028(1_288肽。然而， 眾所周知，略作修飾形式的該肽(YLEPGPVTV(SEQ ID No :6))顯示對HLA-A2的結(jié)合增強， 從而增加了肽-HLA 復(fù)合物的穩(wěn)定性(Salgaller 等.(1996) Cancer Res 56:4749-57)。因此，變體YLEPGPVTV肽-HLA-A2復(fù)合物更適于評估能結(jié)合YLEPGPVTA-HLA-A2復(fù)合物的潛在 TCR的試驗工作。此類TCR結(jié)合兩類肽HLA復(fù)合物的Kd和T1/2和基本上相似。本發(fā)明TCR對YLEPGPVTA-HLA-A2復(fù)合物的親和力和/或結(jié)合半衰期是參比gplOO TCR的至少兩倍，同時保留了可接受的YLEPGPVTA-HLA-A2復(fù)合物特異性，例如，與參比 gplOO TCR相似。通常，相比于參比gp 100 TCR，需要作為靶向劑以便將治療劑，例如細胞毒性或免疫效應(yīng)劑遞送至呈遞HLA復(fù)合物的細胞的TCR對所述YLEPGPVTA-HLA-A2復(fù)合物應(yīng)具有高很多的親和力和/或長很多的結(jié)合半衰期。如果TCR需要為過繼性治療轉(zhuǎn)染T-細胞，通常要求，例如較低的親和力和/或較短的結(jié)合半衰期(雖然仍分別是參比TCR那些值的至少兩倍)。例如，本發(fā)明的TCR對復(fù)合物的Kd可以是彡8μΜ、彡5 μ Μ、< 1 μ Μ、彡0. 1 μ Μ、 彡0.01 μ Μ、彡0.001 μ M或彡0. 0001 μΜ和/或?qū)?fù)合物的結(jié)合半衰期(T1/2)可以為彡 1. 5s、彡 3s、彡 10s、彡 20s、彡 40s、彡 60s、彡 600s 或彡 6000s。出于本發(fā)明的目的，TCR是具有至少一個TCR α和/或TCR β可變域的部分。 它們通常同時包含TCR α可變域和TCR β可變域。它們可以是α β異源二聚體或是單鏈形式。為用作靶向劑以便將治療劑遞送至抗原呈遞細胞，α β異源二聚TCR可以是可溶形式(即，不具有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的跨膜區(qū))。對于穩(wěn)定性而言，此類可溶性TCR優(yōu)選在各恒定域的殘基之間引入二硫鍵，例如WO 03/020763中所述。可在一個或多個C末端截短本發(fā)明α β異源二聚體中存在的一個或兩個恒定域的，例如最多15、或最多10或最多8個或更少的氨基酸。為用于過繼性治療，可將α β異源二聚TCR，例如，作為具有胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域的全長鏈轉(zhuǎn)染。如果需要，各恒定域的殘基之間可存在引入的二硫鍵(參見，例如WO 2006/000830)。為用作靶向劑將治療劑遞送至抗原呈遞細胞，可溶性TCR可以是單鏈形式。 這些可包括 V α -L-V β、V β -L-V α、V α -C α -L-V β 或 V α -L-V β -C β 類型的 α β TCR 多肽，其中Va和νβ分別是TCR α禾口 β可變區(qū)，Ca和分別是TCRα禾口 β恒定區(qū)，L 是接頭序列。過繼性治療可利用全長TCR序列，其摻入跨膜域同時作為天然二硫鍵和引入的二硫鍵形式，或作為單鏈TCR構(gòu)建物；或/和與其相似的變化形式。無論何種形式，與具有胞外α和β鏈序列SEQ ID No 2和3的天然gplOO TCR 相比，本發(fā)明TCR在其α可變域(從SEQ ID No 2的Sl延伸到A109)和/或β可變域 (從SEQ ID No :3的Dl延伸到Τ112)發(fā)生突變。天然gplOO TCR或參比gplOO TCR可用作模板，其中引入各種突變導(dǎo)致本發(fā)明TCR與YLEPGPVTA-HLA-A2復(fù)合物之間相互作用的親和力高和/或解離速率慢。本發(fā)明的實施方式包括與從SEQ ID No 2的Sl延伸到A109的 α鏈可變域和/或從SEQ ID No :3的D 1延伸到Τ112的β鏈可變域相比，在至少一個互補決定區(qū)(CDR)和/或可變域框架區(qū)中突變的TCR?？刹捎萌魏魏线m的方法進行突變，包括但不限于依據(jù)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的那些、依據(jù)限制性酶的克隆或不依賴連接的克隆(LIC)方法。許多標準分子生物學(xué)教材詳述了這些方法。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)誘變和依據(jù)限制性酶的克隆的更多細節(jié)可參見 Sambrook 和 Russell，(2001)《分子克隆-實驗室手冊(Molecular Cloning-Α Laboratory Manual)》(第3版)CSHL出版社。LIC方法的更多信息可見(Rashtchian，(1995) Curr Opin Biotechnol 6(1) :30-6)。產(chǎn)生本發(fā)明的高親和力gplOO TCR的一種方法是從展示此類TCR的噬菌體顆粒的多樣性文庫中選擇，例如WO 2004/044004所公開的。應(yīng)該注意，包含與參比8 100110 相似的￥0和νβ基因使用和由此的可變域氨基酸序列的任何α β TCR均可制備方便的模板TCR。然后可以在編碼模板α β TCR的一個或兩個可變域的DNA中引入產(chǎn)生本發(fā)明的突變型高親和力TCR所需的改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難了解，可通過許多方法，例如定點誘變來引入必需的突變。本發(fā)明的優(yōu)選TCR包括其α可變域與SEQ ID No 2的氨基酸序列1-109具有至少90% (例如，至少93%和優(yōu)選至少94% )序列相同性(S卩，不到10% (或不到7%或優(yōu)選不到6% )的天然Va結(jié)構(gòu)域的殘基發(fā)生改變)，和/或其β可變域與SEQ ID No 3的氨基酸序列1-112具有至少90% (例如，至少93%和優(yōu)選至少94% )序列相同性(即，不到10% (或不到7%或優(yōu)選不到6%)的天然Vi3結(jié)構(gòu)域的殘基發(fā)生改變)的那些。單個改變包括單個插入、缺失或突變?？赏ㄟ^，例如手工或利用計算機程序進行序列比對來測定序列相同性。在一些實施方式中，本發(fā)明TCR具有從SEQ ID No :2的Sl延伸至Α109的α鏈可變域，除了 94D、97L、98V或102G位中一個或多個的氨基酸殘基發(fā)生突變，和/或具有從 SEQ ID No :3 的 Dl 延伸至 T112 的 β 鏈可變域，除了 27LJ8NJ9H、30D、31A、50Q、51I、52V、 53N、54D、61A、94S、95I、96g、97G、98P或IOOE位中一個或多個的氨基酸殘基發(fā)生突變。例如，本發(fā)明的TCR可具有α鏈可變域氨基酸殘基94S、94T、94R、97M、98M、98Q、98G、98S、98A 或102D中的一個或多個(利用SEQ ID No 2所示編號)和/或β鏈可變域氨基酸殘基 27I、28F、29Q、30K、31K、50W、51A、51G、52Q、52Y、52T、53G、53F、54N、54H、61T、94L、95Y、95H、 95ff,95F,95S,95V,96C,97E,97A,98G, 100Q 100P 中的一個或多個(利用 SEQ ID No 3 所不編號)O本發(fā)明的特異性TCR包括含有α鏈可變域氨基酸序列SEQ ID No :7、8和9之一和 / 或 β 鏈可變域氨基酸序列 SEQ ID No :10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35之一的那些。因此，含有野生型α鏈的可變域序列(SEQ ID No 2的S1-A109)的TCR可與具有SEQ ID No :10_；35之一的β鏈結(jié)合。 或者，具有SEQ ID No :7-9之一的α鏈可與野生型β鏈的可變域序列(SEQ ID No 3的 D1-T112)結(jié)合?；蛘呔哂蠸EQ ID Νο:7_9之一的α鏈可與具有SEQ ID No :10-35之一的 β鏈結(jié)合。就靶向應(yīng)用，主要是它們的高親和力和緩慢解離速率(即，長半衰期)而言，目前優(yōu)選的可溶性TCR是包含α鏈可變域氨基酸序列SEQ ID No 8 (X = S或A或G)和β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID Νο:27的那些。此類優(yōu)選的TCR宜是α β異源二聚體形式，即， 包含TRAC和TRBC結(jié)構(gòu)域。如本文所述，可在一個C-末端或兩個C-末端截短此類TRAC和 TRBC結(jié)構(gòu)域。例如，可通過刪除最多15，或最多10或最多8或更少的氨基酸來截短參比 TCRa鏈的恒定域的C-末端。上述TCR的表型沉默變體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。術(shù)語“表型沉默變體”所指TCR 的序列與本發(fā)明TCR相同，除了在恒定和/或可變域中摻入改變，但所述改變不會改變與肽-HLA復(fù)合物相互作用的親和力和/或解離速率。此類變體的一個例子是本發(fā)明TCR，其中采用SEQ ID NO 2的編號，該TCR α恒定域含有取代130絲氨酸(S)氨基酸殘基的苯丙氨酸(F)氨基酸殘基。如上所述，本發(fā)明的α β異源二聚TCR可在它們的恒定域之間引入二硫鍵。該類型的優(yōu)選TCR包括具有TRAC恒定域序列和TRBCl或TRBC2恒定域序列的那些，除了 TRAC 的Thr 48和TRBCl或TRBC2的kr 57被半胱氨酸殘基替代，所述半胱氨酸在TCR的TRAC 恒定域序列和TRBCl或TRBC2恒定域序列之間形成二硫鍵。含或不含上文所述的引入的鏈間鍵，本發(fā)明的α β異源二聚TCR均可具有TRAC 恒定域序列和TRBCl或TRBC2恒定域序列，TCR的TRAC恒定域序列和TRBCl或TRBC2恒定域序列可通過TRAC的外顯子2的Cys4和TRBCl或TRBC2的外顯子2的Cys2之間的天然二硫鍵相連。如本文所述，本發(fā)明的可溶性TCR可與可檢測標記物(為診斷目的，其中所述TCR 用于檢測呈遞YLEPGPVTA HLA-A2復(fù)合物的細胞的存在)；治療劑；Hi修飾部分(例如，通過 PEG化)；或以上的組合結(jié)合(共價或其它方式)。用于診斷目的的可檢測標記物包括但不限于熒光或發(fā)光標記物、放射性標記物、 MRI或CT造影劑、或產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的酶?？膳c本發(fā)明TCR結(jié)合的治療劑包括但不限于放射性化合物、前藥激活酶(例如， DT-心肌黃酶(DTD)或聯(lián)苯基水解酶-樣蛋白質(zhì)(BPHL))、化療劑(例如，順鉬)、毒素(例如，假單胞菌外毒素，如PE38、卡西霉素(calcimycin)或白喉毒素)、免疫調(diào)節(jié)抗體片段 (例如抗-CD3或抗-CD16)、或免疫調(diào)節(jié)細胞因子(例如，IL-幻。為確保在所需位置施加毒性效應(yīng)，毒素可以在連接于TCR的脂質(zhì)體內(nèi)，從而使該化合物緩慢釋放，或者通過不穩(wěn)定的接頭將毒素偶聯(lián)于TCR。如此可防止在體內(nèi)轉(zhuǎn)運期間的破壞作用，確保TCR與相關(guān)抗原呈遞細胞結(jié)合后毒素具有最大作用。其它合適的治療劑包括 小分子細胞毒性劑，即，能殺傷哺乳動物細胞、分子量低于700道爾頓的化合物。此類化合物還能含有能具有細胞毒性效應(yīng)的毒性金屬。此外，應(yīng)該了解，這些小分子細胞毒性劑還包含前藥，即，在生理條件下分解或轉(zhuǎn)化以釋放細胞毒性劑的化合物。此類試劑的例子包括順鉬、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡奇霉素、多西他賽、依托泊甙、 吉西他濱、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、美法侖、米托蒽醌、嚇吩姆鈉(sorfimer sodium)光敏素 II、替莫唑胺、拓撲替康、葡糖醛酸三甲曲沙、耳他汀(auristatirOE、長春新堿和阿霉素； 肽細胞毒素，S卩，能殺傷哺乳動物細胞的蛋白質(zhì)或其片段。例如，蓖麻毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌細菌內(nèi)毒素A、DNA酶和RNA酶；
放射性核素，S卩，元素的不穩(wěn)定同位素，其在衰減的同時發(fā)出一種或多種的α 或β粒子，或Y射線。例如，碘131、錸186、銦111、釔90、鉍210和213、錒225和砹213 ； 可利用螯合劑促進這些放射性核素與高親和力TCR或它們的多聚體的結(jié)合； 免疫刺激劑，即，刺激免疫應(yīng)答的免疫效應(yīng)分子。例如，細胞因子，如IL-2和 IFN-Y ； 超抗原及其突變體；· TCR-HLA融合體，其中所述HLA決定免疫原性抗原； 趨化因子，例如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生長刺激蛋白，等； 抗體或其片段，包括抗-T細胞或NK-細胞決定抗體(例如，抗-⑶3或抗-⑶觀或抗-CD16)； 補體激活物； 異種蛋白結(jié)構(gòu)域、同種異體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、病毒/細菌蛋白結(jié)構(gòu)域、病毒/細菌肽。一個優(yōu)選的實施方式是與抗-CD3抗體或所述抗-CD3抗體的功能片段或變體結(jié)合的本發(fā)明TCR。適用于本文所述組合物和方法的抗體片段和變體/類似物包括但不限于 小抗體(minib0dy)、Fab片段、F(ab，)2片段、dsFv和scFv片段、或其它抗體支架蛋白，例如NanobodiesTM(由比利時阿比林公司(Ablynx)投入市場的這些構(gòu)建物包含源自駝科動物 (例如駱駝或美洲駝)抗體的合成單一免疫球蛋白可變重鏈結(jié)構(gòu)域)、結(jié)構(gòu)域抗體(由比利時多曼提斯公司(Domantis)投入市場，包含親和力成熟的單一免疫球蛋白可變重鏈結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白可變輕鏈結(jié)構(gòu)域)、UniBodies (由金邁公司O^enmab)投入市場，UniBodies 是修飾的全人IgG4抗體，其中刪除了該抗體的絞鏈區(qū))、三功能抗體(具有兩種不同抗原的結(jié)合位點的單克隆抗體)、Affibodies (由昂飛公司(Affibody)投入市場，Affibodies 依據(jù)58-氨基酸殘基的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其為一個三螺旋束結(jié)構(gòu)域，源自葡萄球菌A蛋白的 IgG-結(jié)合域之一)、抗脂質(zhì)運載蛋白(從人脂質(zhì)運載蛋白合成的抗體模擬物，其還能構(gòu)建成雙靶向蛋白質(zhì)，即，所謂的雙脂質(zhì)運載蛋白(Duocalins))或DARPins (設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白)(其是依據(jù)重復(fù)蛋白，例如錨蛋白或富含亮氨酸重復(fù)蛋白的抗體模擬物的另一例子，它們是普遍存在的結(jié)合分子)。更具體的本發(fā)明TCR-抗⑶3融合體包括選自下組的TCR α鏈氨基酸序列(i)TCR α鏈序列SEQ ID No :45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No :8替代，其中1位的氨基酸是S;(ii)TCR α 鏈序列 SEQ ID No :45，其中氨基酸 1-109 被序列 SEQ ID No 8 替代， 其中1位的氨基酸是A ；(iii)TCR α 鏈序列 SEQ ID No :45，其中氨基酸 1-109被序列 SEQ ID Νο:8 替代， 其中1位的氨基酸是G ；(iv) TCR α 鏈序列 SEQ ID No :45，其中氨基酸 1-109 被序列 SEQ ID No 8 替代， 其中1位的氨基酸是S，依據(jù)SEQ ID No 45的編號，該α鏈的C-末端從F196到S203截短8個氨基酸(包括端點)；(V)TCR α鏈序列SEQ ID No :45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No :8替代，其中1位的氨基酸是Α，依據(jù)SEQ ID No 45的編號，該α鏈的C-末端從F196到S203截短8個氨基酸(包括端點)；(vi)TCR α 鏈序列 SEQ ID No :45，其中氨基酸 1-109 被序列 SEQ ID No 8 替代， 其中1位的氨基酸是G，依據(jù)SEQ ID No 45的編號，該α鏈的C-末端從F196到S203截短8個氨基酸(包括端點)；和選自下組的TCR β鏈-抗-⑶3氨基酸序列(vii) TCR β鏈-抗-CD3序列SEQ ID No :36，其中1和2位的氨基酸分別是D禾口 I ；(viii)TCR β鏈-抗-CD3序列SEQ ID No :36，其中1和2位的氨基酸分別是A 和I ；(ix) TCR β鏈-抗-CD3序列SEQ ID No :36，其中1和2位的氨基酸分別是A禾口 Q;(x) TCR β鏈-抗-CD3序列SEQ ID No :36，其中1和2位的氨基酸分別是D和I， 108-131 位的氨基酸被RTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG (SEQ ID No 44)替代，254-258 位的氨基酸被 GGEGGGSEGGGS (SEQ ID No 47)替代；(xi) TCR β鏈-抗-CD3序列SEQ ID No :36，其中1和2位的氨基酸分別是D禾口 I，257位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；(xii) TCR β鏈-抗-CD3序列SEQ ID No :36，其中1和2位的氨基酸分別是D禾口 I，256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；(xiii)TCR β鏈-抗-CD3序列SEQ ID No :36，其中1和2位的氨基酸分別是D 和I，255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；(xiv)具有序列SEQ ID No 36的TCR β鏈-抗-CD3，其中1和2位的氨基酸分別是A和Q，257位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；(XV)具有序列SEQ ID No 36的TCR β鏈-抗-⑶3，其中1和2位的氨基酸分別是A和Q，256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；(xvi)具有序列SEQ ID No 36的TCR β鏈-抗-CD3，其中1和2位的氨基酸分別是A和Q，255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；(xvii)具有序列SEQ ID No 36的TCR β鏈-抗-CD3，其中1和2位的氨基酸分別是A和I，257位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；(xviii)具有序列SEQ ID No 36的TCR β鏈-抗-CD3，其中1和2位的氨基酸分別是A和I，256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；(xix)具有序列SEQ ID No 36的TCR β鏈-抗-CD3，其中1和2位的氨基酸分別是A和I，255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；此類TCR-抗⑶3融合體的例子是如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(i)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(vii)；如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(i)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(X)；如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(ix)；
如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(ν)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(viii)；如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(vii)；如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(i)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(xi)；如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(i)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(xii)；如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(i)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(xiii)；如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(xiv)；如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(XV)；如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(xvi)；如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(ν)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(xvii)；如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(ν)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(xviii)；如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(ν)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(xix)；如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(xi)；如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(xii)；和如權(quán)利要求18所述的TCR，其中所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β鏈-抗-⑶3 氨基酸序列是(xiii)。由于本發(fā)明的α β異源二聚TCR可用于過繼性治療，本發(fā)明還包括呈遞本發(fā)明 TCR的分離細胞，特別是T-細胞。有許多方法適合于用編碼本發(fā)明的高親和力TCR的DNA 或 RNA 轉(zhuǎn)染 T 細胞。(參見，例如 Robbins 等.，(2008) J. Immunol. 180 :6116-6131))。表達本發(fā)明的高親和力TCR的T細胞適用于gpl00+HLA-A2+癌癥的基于過繼性治療的治療。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知進行過繼性治療的許多合適方法。(參見，例如Rosenberg等.，(2008) Nat Rev Cancer 8(4) :299-308)。為某些目的，本發(fā)明的TCR可多聚成包含數(shù)個TCR的復(fù)合物以形成多價TCR復(fù)合物。有許多人蛋白含有可用于產(chǎn)生多價TCR復(fù)合物的多聚結(jié)構(gòu)域。例如，利用p53的四聚結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生scFv抗體片段的四聚體，與單體scFc片段相比，其顯示血清持久性增加和解離速率顯著降低。(Willuda 等.(2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392)。血紅蛋白也具有可能用于此類應(yīng)用的四聚結(jié)構(gòu)域。與非多聚野生型或本發(fā)明的T細胞受體異源二聚體相比，本發(fā)明的多價TCR復(fù)合物對YLEPGPVTA-HLA-A2復(fù)合物的結(jié)合能力可增強。因此，本發(fā)明TCR的多價復(fù)合物也屬于本發(fā)明。本發(fā)明的此類多價TCR復(fù)合物尤其可用于體外或體內(nèi)追蹤或靶向呈遞特定抗原的細胞，也可用作產(chǎn)生具有此類應(yīng)用的其它多價TCR復(fù)合物的中間體。由轉(zhuǎn)染的T細胞表達時，打算用于過繼性治療的本發(fā)明TCR被糖基化。本領(lǐng)域熟知，可通過轉(zhuǎn)染基因的突變來修飾轉(zhuǎn)染TCR的糖基化模式。為給予患者，本發(fā)明的TCR和本發(fā)明TCR轉(zhuǎn)染的T細胞可與藥學(xué)上可接受的載體一起在藥物組合物中提供。本發(fā)明的治療性或成像TCR、多價TCR復(fù)合物和細胞通常作為無菌藥物組合物的一部分提供，所述組合物通常包含藥學(xué)上可接受的載體。該藥物組合物可以是任何合適的形式(取決于給予患者的所需方法)。其可采用單位劑型提供，通常在密封的容器中提供，可作為試劑盒的一部分提供。此類試劑盒通常(但非必需)包括使用說明書。其可包括多個所述單位劑型。可改進藥物組合物以便通過任何合適的途徑給予，優(yōu)選胃腸外(包括皮下、肌肉內(nèi)，或優(yōu)選靜脈內(nèi))途徑?？赏ㄟ^藥學(xué)領(lǐng)域已知的任何方法制備此類組合物，例如在無菌條件下將活性成分與一種或多種載體或賦形劑混合。根據(jù)所治療的疾病或病癥、所治療個體的年齡和情況等，本發(fā)明物質(zhì)的劑量可在很寬范圍內(nèi)變化，最終由醫(yī)師決定所用的合適劑量。
實施例以下實施例進一步描述了本發(fā)明，其中參考了以下附圖。圖IA和2A分別顯示具有TRAV17/TRAJ29/TRAC基因使用的天然gplOOTCR α 鏈的胞外氨基酸序列，除了 Κ113取代附13( S卩，TRAC的N4)，和具有TRBV19*01/TRBD1/ TRBJ2-7*01/TRBC2基因使用的天然gplOO TCR β鏈的胞外氨基酸序列(分別是SEQ ID No 2 禾口 3)。圖IB和2Β分別顯示編碼可溶性野生型gplOOTCRa和β鏈(也稱為參比 gplOOTCR α和β鏈)的DNA序列。這些序列包含額外的半胱氨酸殘基以形成非天然二硫鍵。陰影部分標出了編碼額外的半胱氨酸殘基的突變密碼子。下劃線標出NdeI和HindIII 限制性酶識別序列。圖IC和2C分別顯示分別從圖IB和2Β所示DNA序列產(chǎn)生的可溶性野生型 gplOOTCR或參比gp TCRa和β鏈胞外氨基酸序列(分別是SEQ ID Νο:45和46)，但不含為在細菌中有效表達而插入的引入前導(dǎo)甲硫氨酸。引入的半胱氨酸以黑體字和下劃線顯
7J\ ο圖3A-C顯示高親和力gplOOTCR變體的α鏈可變域氨基酸序列。突變的殘基以黑體字和下劃線顯示。圖4A-Z顯示高親和力gplOOTCR變體的β鏈可變域氨基酸序列。突變的殘基以黑體字和下劃線顯示。圖5Α顯示借助高親和力gplOOTCR作Τ2細胞體外染色的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)，該細胞用 YLEPGPVTV (SEQ ID NO 6)變體 gplOO 肽脈沖。圖5B顯示借助高親和力gplOOTCR作T2細胞染色的顯微圖像，該細胞用YLEPGPVTV (SEQ ID NO :6)變體 gplOO 肽脈沖。圖6顯示通過接頭GGGGS SEQ ID No :48 (下劃線顯示)在gplOOTCR β鏈的N-末端融合的抗-⑶3scFv抗體片段(黑體字)的氨基酸序列。所述gplOOTCR β鏈含有可變區(qū) SEQ ID No :27ο圖7是顯示在非放射性細胞毒性試驗中，抗-⑶3 scFv-gplOO高親和力TCR使得 T細胞重定向以殺傷黑色素瘤細胞系的應(yīng)答曲線。圖8A顯示用于轉(zhuǎn)導(dǎo)T-細胞的野生型gplOO-特異性TCR基因(含豬捷申病毒 CTeSCh0ViruS)-12A序列的野生型(WT) α鏈-2A-WT β鏈構(gòu)建物，黑體字和下劃線顯示) 的DNA序列。圖8Β顯示從圖8Α所示DNA序列產(chǎn)生的用于T-細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的野生型gplOO-特異性 TCR的氨基酸序列。豬捷申病毒-12A序列以黑體字和下劃線顯示。圖9a和9b顯示在ELISP0T試驗中，gplOOTCR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的T-細胞對一系列靶細胞起反應(yīng)而釋放IFN-γ。這些附圖顯示與用天然gplOOTCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞相比，用高親和力 gplOOTCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞的特異性激活增加。

圖10顯示TCR-pMHC親和力增加的不同gp 100TCR-抗_CD3scFv融合體激活的CD8+ T細胞釋放IFN- γ。圖11顯示不同gplOO TCR-抗-⑶3scFv融合體激活的⑶8+ T細胞釋放IFN- γ。圖12顯示體內(nèi)模型中平均腫瘤體積的進展情況，該模型利用含人黑色素瘤異種移植物的免疫缺陷小鼠，并檢驗gplOO高親和力TCR-抗-CD3scFV融合蛋白的抗腫瘤效力。實施例1將參比gplOO TCRa和β鏈可變區(qū)序列克隆入基于pGMT7的表達質(zhì)粒從gplOO T細胞克隆分離的總cDNA中PCR擴增參比gplOO TCR可變α和TCR可變β結(jié)構(gòu)域。在α鏈的情況中，利用α鏈可變區(qū)序列特異性寡核苷酸AKggaattccatat gagtcaacaaggagaagaagatcc SEQ ID No 39)和 α 鏈恒定區(qū)序列特異性寡核苷酸 Α2 (ttgt cagtcgacttagagtctctcagctggtacacg SEQ ID No 40)擴增 α 鏈可變區(qū)，前者編碼限制性位點Ndel，為在細菌中有效啟動表達而引入的甲硫氨酸，后者編碼限制性位點Mil。在β 鏈的情況中，利用β鏈可變區(qū)序列特異性寡核苷酸Bl (tctctcatatggatggtggaattactcaat ccccaa SEQ ID No 41)和 β 鏈恒定區(qū)序列特異性寡核苷酸 Β2 (tagaaaccggtggccaggcacac cagtgtggc SEQ ID No 42)擴增β鏈可變區(qū)，前者編碼限制性位點Ndel，為在細菌中有效啟動表達而引入的甲硫氨酸，后者編碼限制性位點Agel。通過《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三版，Sambrook和Russell)中描述的標準方法將α和β可變區(qū)克隆入含有Ca或Ci3的基于PGMT7的表達質(zhì)粒。利用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)的3730x1 DNA分析儀測序質(zhì)粒。將NdeI和MlI切割的編碼TCR α鏈的DNA序列連接入用NdeI和XhoI切割的 PGMT7+C α載體。將NdeI和AgeI切割的編碼TCR β鏈的DNA序列連接入也用NdeI和 AgeI切割的不同pGMT7+Ci3載體。連接將連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌(Escherichia coli)菌株XLl-藍色細胞，接種在含有IOOy g/ml氨芐西林的LB/瓊脂板上。37°C溫育過夜后，挑取單個菌落，37°C， 在含有100μ g/ml氨芐西林的IOmL LB中振蕩生長過夜。利用恰根公司的迷你制備試劑盒 (Miniprep kit, Qiagen)純化克隆的質(zhì)粒，利用百靈技術(shù)公司(Lark Technologies)的自動DNA測序儀測序插入物。圖IC和2C分別顯示分別從圖IB和2B所示DNA序列產(chǎn)生的可溶性二硫鍵-連接的參比gplOO TCR α和β鏈胞外氨基酸序列，但不含為在細菌中有效表達而插入的引入前導(dǎo)甲硫氨酸(分別為SEQ ID Ν0:45和46)。應(yīng)注意，半胱氨酸被取代入α和β鏈的恒定區(qū)以在重折疊時提供人工鏈間二硫鍵，從而形成異源二聚TCR。引入的半胱氨酸以陰影部分顯示。圖IB和2Β所示DNA序列中的限制性酶識別序列以下劃線顯示。實施例2可溶性參比gplOO TCR的表達、重折疊和純化將實施例1中分別制備的含有TCR α -鏈和β -鏈的表達質(zhì)粒各自轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株Rosetta (DE;3)pLysS，37°C下將單氨芐西林耐受性菌落在TYP (氨芐西林100 μ g/ ml)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_約為0.6-0.8，然后用0.5!111 IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。誘導(dǎo)后3小時用Beckman J-6B以4000rpm離心30分鐘收獲細胞。在有MgCl2和DNA酶I存在下，用 25ml Bug Buster (諾瓦金公司(NovaGen))裂解細胞沉淀物。用Beckman J2-21離心機以 13000rpm離心30分鐘以回收包涵體沉淀物。然后進行三次洗滌劑洗滌以除去細胞碎片和膜組分。每次先將包涵體沉淀物在曲通(Triton)緩沖液(50mM Tris-HCI pH8. 0，0. 5%曲通-X100，200mM NaCLlOmM NaEDTA)中勻漿再以4，OOOrpm離心15分鐘使之沉淀。然后利用以下緩沖液作類似的洗滌以除去洗滌劑和鹽50mM Tris-HCiamM NaEDTA, pH 8.0。最終，將包涵體分成30mg等份試樣，-70°C冷凍。用6M胍-HCl溶解包涵體蛋白產(chǎn)物對其定量，利用日立(Hitachi)U-2001分光光度計檢測0D。然后利用消光系數(shù)計算蛋白質(zhì)濃度。從冷凍儲備物中解凍約30mg TCR β鏈和60mg TCR α鏈溶解包涵體，用15ml胍溶液(6M胍-鹽酸，50mM Tris HCl pH 8. 1, IOOmM NaCl, IOmM EDTA, IOmM DTT)稀釋以確保完全的鏈變性。然后將含有完全還原和變性的TCR鏈的胍溶液注射入以下的1升重折疊緩沖液100mM Tris pH 8. l,400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5M脲。加入氧化還原對(鹽酸半胱胺和二鹽酸胱胺)至終濃度分別為6. 6mM和3. 7mM，約5分鐘后加入變性的TCR鏈。溶液靜置約1小時。5°C 士3°C下，用透析管狀纖維素膜(西格瑪-阿爾德里奇公司(Sigma-Aldrich)； 產(chǎn)品編號D9402)和10L H2O對重折疊的TCR透析18-20小時。然后，將透析緩沖液更換為新鮮的IOmM Tris pH 8. 1 (10L)兩次，在5°C 士3°C下繼續(xù)透析約8小時。將透析的重折疊物加載于P0R0S 50HQ陰離子交換柱，利用Akta純化儀(GE保健公司(GE Healthcare))用IOmM Tris pH 8. 1配制的0_500mM NaCl梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)6個柱體積以上，從而將可溶性TCR與錯誤折疊的、降解產(chǎn)物和雜質(zhì)分開。將蛋白酶抑制劑的混合物(卡爾生物化學(xué)公司(Calbiochem))加入峰組分。將諸組分保存于4°C，通過考馬斯-染色的SDS-PAGE分析，然后合并、濃縮。最后，利用在PBS緩沖液(西格瑪公司 (Sigma))中預(yù)平衡的GE保健公司的Superdex 75HR凝膠過濾柱純化并表征可溶性TCR。合并、濃縮在相對分子量約為50kDa洗脫的峰，然后通過BIAcore表面等離振子共振分析進行表征。實施例3
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結(jié)合表征BIAcore 分析可利用表面等離振子共振生物傳感器(BIAcore 3000 )分析可溶性TCR與其肽-MHC配體的結(jié)合。產(chǎn)生能固定于鏈霉親和素包被結(jié)合表面(傳感器芯片)的可溶性生物素化肽_HLA(“pHLA”)復(fù)合物有助于該分析。所述傳感器芯片包含能同時檢測T細胞受體與4個不同pHLA復(fù)合物結(jié)合的4個獨立流動小室。手工注射pHLA復(fù)合物易于操控固定的I類分子的精確水平。體外重折疊含有亞單位蛋白組分和合成肽的細菌表達包涵體中生物素化I類 HLA-A*02分子，然后純化并在體外進行酶促生物素化(0，Callaghan等(1999)Anal. Biochem. 266 9-15)。表達的HLA_A*02_重鏈具有C-末端生物素化標簽，其在合適的構(gòu)建物替代了該蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。獲得的包涵體表達水平約75mg/升細菌培養(yǎng)物。還在大腸桿菌中從合適構(gòu)建物表達了作為包涵體的HLA輕鏈或β 2-微球蛋白(β 2m)， 其水平約為500mg/升細菌培養(yǎng)物。裂解大腸桿菌細胞，處理包涵體至約80%純度。將合成肽(gplOO YLEPGPVTA)溶解于 DMSO 至 4mg/ml 的終濃度。用 6M 鹽酸胍、50mM Tris pH 8. UlOOmM NaClUOmM DTT、 IOmM EDTA使ban和重鏈的包涵體各自變性。制備含有0. 4M L-精氨酸、IOOmM Tris pH 8. 1、3. 7mM 二鹽酸胱胺、6. 6mM鹽酸半胱胺的重折疊緩沖液并冷卻至< 5°C。優(yōu)選先將肽加入重折疊緩沖液，然后加入變性的Mm，再加入變性的重鏈。將gplOOYLEPGPVTA肽以4毫克 /升(終濃度)加入重折疊緩沖液。然后依次加入30毫克/升的bail和30毫克/升的重鏈(終濃度)。使重折疊在4°c進行至少1小時至完成。用10體積的IOmM Tris pH 8. 1作透析來更換緩沖液。必需更換緩沖液兩次來充分降低溶液的離子強度。然后經(jīng)1. 5μπι乙酸纖維素濾膜過濾蛋白質(zhì)溶液，加載到P0R0S 50HQ陰離子交換柱上(8ml床體積)。利用Akta純化儀(GE保健公司的)，用IOmM Tris pH 8. 1配制的0-500mM NaCl線性梯度液洗脫蛋白。HLA_A*02_肽復(fù)合物約在250mM NaCl處洗脫，收集諸峰組分，加入蛋白酶抑制劑混合物(卡爾生物化學(xué)公司)，各組分置于冰上冷卻。用相同緩沖液平衡的GE保健公司的快速脫鹽柱將生物素化標記的pHLA分子的緩沖液更換為IOmM Tris pH 8. l,5mM NaCl。洗脫后立即將含有蛋白質(zhì)的組分置于冰上冷卻，加入蛋白酶抑制劑混合物(卡爾生物化學(xué)公司)。然后加入生物素化試劑lmM生物素、 5mM ATP (緩沖至 pH 8)、7. 5mM MgCl2 和 5 μ g/ml BirA 酶(按照 0，Callaghan 等，(1999)， Anal. Biochem. 266 :9-15純化)。然后室溫培育混合物過夜。采用凝膠過濾層析純化生物素化的pHLA_A*02分子。利用Akta純化儀(GE保健公司)，用過濾的PBS預(yù)平衡GE保健公司Superdex 75HR 10/30柱，加載Iml生物素化反應(yīng)混合物，用PBS以0. 5毫升/分鐘過柱。生物素化pHLA-A*02分子在約15ml時作為單峰洗脫。合并含有蛋白質(zhì)的組分，置在冰上冷卻，加入蛋白酶抑制劑混合物。采用考馬斯結(jié)合試驗(PB公司(PerBio))測定蛋白質(zhì)濃度，將生物素化pHLA_A*02分子的等份試樣冷凍保存在-20"C。此類固定的復(fù)合物能結(jié)合T-細胞受體和輔助受體⑶8 α α，可將二者注入可溶相。如果采用可溶相或固定相的TCR，觀察到可溶性TCR的pHLA結(jié)合特性在質(zhì)量和數(shù)量上相似。這是對可溶性物質(zhì)的部分活性的重要控制，也提示生物素化的PHLA復(fù)合物與非生物素化復(fù)合物的生物活性相同。利用BIAcore 3000 表面等離振子共振(SPR)生物傳感器檢測小型流動小室內(nèi)傳感器表面附近以響應(yīng)單位(RU)表示的折射率變化，該原理可用于檢測受體配體相互作用和分析它們的親和力以及動力學(xué)參數(shù)。在25°C下進行BIAcore實驗，利用PBS緩沖液(西格瑪公司，PH 7. 1-7. 5)作為運行緩沖液和制備蛋白質(zhì)樣品的稀釋液。通過標準胺偶聯(lián)方法將鏈霉親和素固定于流動小室。通過生物素標簽固定PHLA復(fù)合物。然后使可溶性TCR以恒定流速通過不同流動小室的表面，檢測該情況下的sra響應(yīng)以進行試驗。平衡結(jié)合常數(shù)采用以上BIAcore分析方法測定平衡結(jié)合常數(shù)。制備參比gplOO TCR的二硫鍵連接可溶性異源二聚體形式的連續(xù)稀釋液，以5微升/分鐘的恒定流速注射到兩個不同的流動小室上；一個包被有約300RU的特異性YLEPGPVTA HLA-A2復(fù)合物(或變體肽YLEPGPVTV HLA-A2復(fù)合物)，第二個包被有約300RU非特異性HLA-A2-WT1野生型肽(RMFPNAPYL)復(fù)合物。利用對照細胞的檢測值標準化各濃度的響應(yīng)。繪制標準化的數(shù)據(jù)響應(yīng)與TCR樣品濃度的圖，根據(jù)非線性曲線擬合模型擬合以計算平衡結(jié)合常數(shù)，KD。(Price和Dwek，《生物化學(xué)家的物理化學(xué)原理和問題(Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemi sts)》(第二版)，1979，克拉倫登出版社(Clarendon Press)，牛津)。參比 gplOO TCR的二硫鍵連接可溶性形式(實施例2)顯示Kd為約19μΜ。根據(jù)同一 BIAcore數(shù)據(jù)， Τ1/2 約為 0. 8s。還禾Ij用 HLA-A*0201 力卩載的 gplOO YLEPGPVTA(SEQ ID NO 1)肽的變體肽(YLEPGPVTV-SEQ ID NO :6)重復(fù)該親和力測定?？扇苄远蜴I連接的參比gplOO TCR 對 YLEPGPVTV (SEQ ID NO :6)_HLA*0201 復(fù)合物的親和力(Kd)(約 19 μ M)與 gplOOYLEPGPVTA(SEQ ID NO 1) _HLA*0201 復(fù)合物所得的相似。動力學(xué)參數(shù)還采用以上BIAcore分析方法測定平衡結(jié)合常數(shù)和解離速率。通過實驗檢測解離速率常數(shù)k。ff和結(jié)合速率常數(shù)k。n來確定高親和力TCR的Kd (參見以下實施例4)。平衡常數(shù)Kd計算為k。ff/k。n。將TCR注射流過兩個不同小室，一個用約300RU的特異性YLEPGPVTA HLA_A*02 復(fù)合物(或指定時的YLEPGPVTV HLA-A*02復(fù)合物)包被，第二個用約300RU的非特異性HLA-A2-肽復(fù)合物包被。流速設(shè)置為50微升/分鐘。通常注射入250 μ 1濃度約等于 Kd的10倍的TCR。然后使緩沖液流過直到響應(yīng)回復(fù)到基線或時間過去2小時以上。用 Biaevaluation軟件計算動力學(xué)參數(shù)。也將解離相擬合為單指數(shù)衰變方程式從而能計算半衰期。實施例4產(chǎn)生天然gplOO TCR的高親和力變體噬菌體展示是產(chǎn)生gplOO TCR變體的文庫以鑒定高親和力突變體的一種手段。將 Li等G2005)Nature Biotech 23(3) :349-354)描述的TCR噬菌體展示和篩選方法應(yīng)用于實施例2的參比gplOO TCR。通過誘變靶向所有6個gplOOTCR CDR區(qū)域(參比TCR中與天然TCR中相同)，分別淘選和篩選各CDR文庫。
鑒定了親和力和/或結(jié)合半衰期至少是參比gplOO TCR兩倍的TCR(因此，隱含表示是天然TCR的至少兩倍)，采用SEQ ID No :2中所示編號，其具有一個或多個α鏈可變域氨基酸殘基 94S、94T、94R、97M、98M、98Q、98G、98S、98A 或 102D 和 / 或采用 SEQ ID No 3 中所示編號，其具有一個或多個β鏈可變域氨基酸殘基27IJ8FJ9Q、30K、31K、50W、51A、 51G、52Q、52Y、52T、53G、53F、54N、54H、61T、94L、95Y、95H、95W、95F、95S、95V、96C、97E、97A、 98GU00Q 或 100P。高親和力TCR 的 α 鏈(SEQ ID No :7、8 和 9)禾口 β 鏈(SEQ ID No :10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34 和 35)的可變區(qū)的氨基酸序列的具體例子分別示于圖3A-C和4Α-Ζ。這些α鏈僅在⑶R3中突變，β鏈在 CDR1、CDR2和CDR3的一個或多個中突變。采用以上實施例2的方法重折疊TCR異源二聚體(包括在恒定區(qū)中引入的半胱氨酸以提供人工鏈間二硫鍵)。以此方式制備的TCR由以下部分構(gòu)成(a)參比TCR β鏈以及經(jīng)突變包含可變域SEQ ID No :7、8和9的α鏈；(b)參比TCR α鏈以及經(jīng)突變包含 β 鏈可變域 SEQ ID No :10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34和35的β鏈；和(c)包含突變型可變域的β和α鏈的各種組合物。采用上述BIAcore方法分析高親和力可溶性二硫鍵連接的gplOO TCR和天然肽 YLEPGPVTA HLA-A*02復(fù)合物之間的相互作用，結(jié)合數(shù)據(jù)示于表1。表IA顯示當利用變體肽 YLEPGPVTV HLA-A*02復(fù)合物檢驗時，這些高親和力TCR的結(jié)合數(shù)據(jù)。采用上述BIAcore方法分析高親和力可溶性二硫鍵連接的gplOO TCR和 YLEPGPVTV HLA-A*02復(fù)合物之間的相互作用，結(jié)合數(shù)據(jù)示于表2。表 權(quán)利要求
1.一種T細胞受體(TCR)，其具有結(jié)合YLEPGPVTA(SEQ ID No 1) HLA-A2復(fù)合物的特性并包含TCR α可變域和/或TCR β可變域，其特征在于(i)相對于具有胞外α和β鏈序列SEQID No :2和3的TCR，所述TCR在SEQ ID No 2所示其α鏈可變域氨基酸1到109和/或在SEQ ID No 3所示其β鏈可變域氨基酸1 至IJ 112發(fā)生突變；和(ii)所述α可變域與SEQID No 2的氨基酸序列1到109有至少90%序列相同性， 和/或所述β可變域與SEQ ID No 3的氨基酸序列1到112有至少90%序列相同性；和(iii)所述TCR對YLEPGPVTA-HLA-A2復(fù)合物的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期是參比 TCR的至少兩倍，所述參比TCR具有胞外α鏈序列SEQ ID No :45和胞外β鏈序列SEQ ID No :46ο
2.如權(quán)利要求1所述的TCR，其特征在于，所述一個或多個突變在所述α和/或β可變域的一個或多個互補決定區(qū)中。
3.如權(quán)利要求1或2所述的TCR，其特征在于，所述一個或多個突變在所述α鏈可變域的互補決定區(qū)3中和/或在所述β鏈可變域的一個或多個互補決定區(qū)中。
4.一種TCR，其具有結(jié)合YLEPGPVTA(SEQ ID No :1)HLA_A2復(fù)合物的特性并具有SEQ ID No 2的氨基酸1到109的α鏈可變域序列，除了 94D、97L、98V或102G位中一個或多個的氨基酸殘基發(fā)生突變，和/或具有SEQ ID No 3的氨基酸1到112的β鏈可變域序列，除 7 27L、28N、29H、30D、31A、50Q、51I、52V、53N、54D、61A、94S、95I、96G、97G、98P 或 100E 位中一個或多個的氨基酸殘基發(fā)生突變。
5.如權(quán)利要求4所述的TCR，其特征在于，所述TCR對YLEPGPVTA-HLA-A2復(fù)合物的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期是參比TCR的至少兩倍。
6.如以上權(quán)利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，采用SEQID No :2所示編號，所述 TCR 包含 α 鏈可變域氨基酸殘基 94S、94T、94R、97M、98M、98Q、98G、98S、98A 或 102D 的一個或多個取代。
7.如以上權(quán)利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，采用SEQID No :3所示編號，所述 TCR 包含 β 鏈可變域氨基酸殘基 27IJ8FJ9Q、30K、31K、50W、51A、51G、52Q、52Y、52T、 53G,53F,54N,54H,61T,94L,95Y,95H,95ff,95F,95S,95V,96C,97E,97A,98GU00Q^<； 100P 的一個或多個取代。
8.如以上權(quán)利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR包含α鏈可變域氨基酸序列SEQ ID No :7、8和9之一。
9.如以上權(quán)利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR包含β鏈可變域氨基酸序列 SEQ ID No :10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、四、 30、31、32、33、34 和 35 之一。
10.如以上權(quán)利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR是αβ異源二聚TCR， 其具有α和β鏈恒定域序列，其中半胱氨酸殘基取代TRAC的Thr 48和TRBCl或TRBC2 的義！· 57，所述半胱氨酸在所述TCR的α和β恒定域之間形成二硫鍵。
11.如以上權(quán)利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR是αβ異源二聚TCR， 其具有α和β鏈恒定域序列，其中恒定域序列通過TRAC的外顯子2的Cys4和TRBCl或 TRBC2的外顯子2的Cys2之間的天然二硫鍵相連。
12.如以上權(quán)利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR與可檢測標記物、治療齊IJ、PK修飾部分或任何這些物質(zhì)的組合結(jié)合。
13.如權(quán)利要求12所述的TCR，其特征在于，所述治療劑是共價連接于所述TCR的α 或β鏈的C-或N-末端的抗-⑶3抗體。
14.如以上權(quán)利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，與具有胞外α和β鏈序列SEQ ID No :2和3的TCR相比，所述TCR具有修飾的糖基化。
15.一種多價TCR復(fù)合物，其包含至少兩個以上權(quán)利要求中任一項所述的TCR。
16.編碼權(quán)利要求1到14中任一項所述TCR的DNA或RNA。
17.一種分離的細胞，其呈遞權(quán)利要求1到11中任一項所述的TCR。
18.如權(quán)利要求13所述的TCR，其特征在于，所述TCR包含選自下組的TCR α鏈氨基酸序列(i)TCRa鏈序列SEQID No :45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No 8替代，其中1 位的氨基酸是S;(ii)TCRα鏈序列SEQ ID No :45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No 8替代，其中 1位的氨基酸是A ；(iii)TCRα鏈序列SEQ ID No :45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No :8替代，其中 1位的氨基酸是G ；(iv)TCRα鏈序列SEQ ID No :45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No 8替代，其中 1位的氨基酸是S，依據(jù)SEQ ID No 45的編號，該α鏈的C-末端從F196到S203截短8個氨基酸(包括端點)；(v)TCRα鏈序列SEQ ID No :45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No :8替代，其中1 位的氨基酸是A，依據(jù)SEQ ID No 45的編號，該α鏈的C-末端從F196到S203截短8個氨基酸(包括端點)；和(vi)TCRa鏈序列SEQID No :45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No:8替代，其中1 位的氨基酸是G，依據(jù)SEQ ID No 45的編號，該α鏈的C-末端從F196到S203截短8個氨基酸(包括端點)；和選自下組的TCR β鏈-抗-⑶3氨基酸序列(vii)TCR β鏈-抗-CD3序列SEQ ID No :36，其中1和2位的氨基酸分別是D和I ；(viii)TCRβ鏈-抗-CD3序列SEQ ID No :36，其中1和2位的氨基酸分別是A和I ；(ix)TCR β鏈-抗-⑶3序列SEQ ID No :36，其中1和2位的氨基酸分別是A和Q ；(X)TCR β鏈-抗-⑶3序列SEQ ID No :36，其中1和2位的氨基酸分別是D和I，108-131位的氨基酸被SEQ ID No 44替代，2Μ-258位的氨基酸被SEQ ID No 47替代；(xi)TCRβ鏈-抗-CD3序列SEQ ID No :36，其中1和2位的氨基酸分別是D和I，257 位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；(xii)TCR^鏈-抗-⑶3序列SEQID No :36，其中1和2位的氨基酸分別是D和I，256 位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；(xiii)TCRβ鏈-抗-⑶3序列SEQ ID No :36，其中1和2位的氨基酸分別是D和I， 255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；(xiv)具有序列SEQID No 36的TCR β鏈-抗-⑶3，其中1和2位的氨基酸分別是A和Q，257位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；(XV)具有序列SEQ ID No 36的TCR β鏈-抗-⑶3，其中1和2位的氨基酸分別是A 和Q，256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；(xvi)具有序列SEQID No 36的TCR β鏈-抗-⑶3，其中1和2位的氨基酸分別是 A和Q，255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；(xvii)具有序列SEQID No 36的TCR β鏈-抗-⑶3，其中1和2位的氨基酸分別是 A和I，257位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；(xviii)具有序列SEQID No 36的TCR β鏈-抗-⑶3，其中1和2位的氨基酸分別是A和I，256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；和(xix)具有序列SEQID No 36的TCR β鏈-抗-⑶3，其中1和2位的氨基酸分別是 A和I，255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G。
19.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(i)，所述β 鏈-抗-⑶3氨基酸序列是(vii)。
20.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(i)，所述β 鏈-抗-CD3氨基酸序列是(χ)。
21.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β 鏈-抗-CD3氨基酸序列是(ix)。
22.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(ν)，所述β 鏈-抗-⑶3氨基酸序列是(viii)。
23.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β 鏈-抗-⑶3氨基酸序列是(vii)。
24.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(i)，所述β 鏈-抗-CD3氨基酸序列是(xi)。
25.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(i)，所述β 鏈-抗-⑶3氨基酸序列是(xii)。
26.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(i)，所述β 鏈-抗-⑶3氨基酸序列是(xiii)。
27.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β 鏈-抗-⑶3氨基酸序列是(xiv)。
28.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β 鏈-抗-CD3氨基酸序列是(XV)。
29.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β 鏈-抗-⑶3氨基酸序列是(xvi)。
30.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(V)，所述β 鏈-抗-⑶3氨基酸序列是(xvii)。
31.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(ν)，所述β 鏈-抗-⑶3氨基酸序列是(xviii)。
32.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(ν)，所述β 鏈-抗-⑶3氨基酸序列是(xix)。
33.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β 鏈-抗-CD3氨基酸序列是(xi)。
34.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β 鏈-抗-⑶3氨基酸序列是(xii)。
35.如權(quán)利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α鏈氨基酸序列是(vi)，所述β 鏈-抗-⑶3氨基酸序列是(xiii)。
全文摘要
一種T細胞受體(TCR)，其具有結(jié)合gp 100YLEPGPVTA肽-HLA-A2復(fù)合物的特性并包含TCR α可變域和/或TCR β可變域，其特征在于(i)相對于具有胞外α和β鏈序列SEQ ID No2和3的TCR，所述TCR在SEQ ID No2所示其α鏈可變域氨基酸1到109和/或在SEQ ID No3所示其β鏈可變域氨基酸1到112發(fā)生突變；和(ii)所述α可變域與SEQ ID No2的氨基酸序列1到109有至少90％序列相同性，和/或所述β可變域與SEQ ID No3的氨基酸序列1到112有至少90％序列相同性；和(iii)所述TCR對YLEPGPVTA-HLA-A2復(fù)合物的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期是參比TCR的至少兩倍，所述參比TCR具有胞外α鏈序列SEQ ID No45和胞外β鏈序列SEQ ID No46。還描述了此類TCR在過繼性治療中的應(yīng)用，和此類TCR與治療劑的融合體。
文檔編號C07K14/705GK102574906SQ201080035140
公開日2012年7月11日 申請日期2010年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者B·K·雅各布森, N·R·利迪, N·哈伍德 申請人:英美偌科有限公司