專利名稱：：用于治療動脈粥樣硬化和/或相關心血管疾病的核受體激動劑的制作方法用于治療動脈粥樣硬化和/或相關心血管疾病的核受體激動劑本發(fā)明涉及化合物在治療動脈粥樣硬化和/或與動脈粥樣硬化相關的心血管疾病中的新應用。本發(fā)明特別涉及所述化合物在治療動脈粥樣硬化和/或與動脈粥樣硬化相關的心血管疾病和/或涉及平滑肌細胞(SMC)過度增殖的病癥中的應用，所述的涉及平滑肌細胞(SMC)過度增殖的病癥諸如支架內(nèi)再狹窄、靜脈-移植物疾病、移植動脈硬化和動靜脈短路故障。目前支架在治療冠狀動脈狹窄中的廣泛應用顯著地增加了支架內(nèi)再狹窄損害的發(fā)生率。在患者亞群中，支架誘發(fā)的動脈損傷與細胞活化和平滑肌細胞再進入細胞周期有關，這導致生長過度的細胞增殖和基質(zhì)產(chǎn)生，且由此導致腔狹窄。經(jīng)證實可成功地降低支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率的策略的目的在于抑制平滑肌細胞增殖。值得注意的是，用雷帕霉素(西羅莫司)涂敷支架導致細胞周期在Gl/S過渡時停止，而用紫杉醇涂敷通過穩(wěn)定微管誘導有絲分裂阻斷。盡管這些手段提供了一定的希望，但是它們也存在某些局限，諸如抑制所有細胞，包括內(nèi)皮細胞生長的雷帕霉素和紫杉烷類的特異性阻止了支架化管壁的適當再內(nèi)皮化，由此存在發(fā)生不需要的全身毒性作用和損傷愈合不適當?shù)娘L險。旁路手術為治療冠狀動脈疾病的已確立的干預。冠狀動脈旁路移植(CABG)術已恢復到達因冠狀動脈疾病而喪失了血液的心臟組織的血流。在旁路手術過程中，通過手術方式將在冠狀動脈中的阻塞周圍攜帶氧合的血液的新移植血管從體內(nèi)的另一個位置上移開。該移植血管為從例如腿，臂或胸部取出的健康動脈或靜脈。然后將其轉(zhuǎn)移到心臟的外部。隱靜脈和乳房內(nèi)動脈常常用作分流術材料。動脈分流術具有優(yōu)于靜脈分流術的顯著特性，而在靜脈分流術中，可能發(fā)生靜脈-移植物疾病，導致每年有10-30%的患者發(fā)生靜脈-移植物故障。靜脈-移植物疾病是可以由機械應變導致的平滑肌細胞過度增殖的結(jié)果。乳房動脈相對較短，從而限制了可利用的分流術材料的量。因此，重要的是改善靜脈分流術在壽命增強方面的功能。移植動脈硬化是器官移植后長期器官衰竭的原因并且涉及植入器官動脈內(nèi)的平滑肌細胞過度增殖，從而產(chǎn)生阻塞血流的集中性的內(nèi)膜損害。將動靜脈短路施用于血液透析患者，而這種短路的故障是靜脈血管壁的不成比例的機械牽張造成的，從而導致短路的靜脈部分中血管平滑肌細胞超常增生。用血管內(nèi)支架放置治療衰竭的動靜脈短路。平滑肌細胞由此在血管病理情況中起關鍵作用，諸如上述的血管成形術后(支架內(nèi))再狹窄，移植動脈硬化，冠狀動脈旁路手術，動靜脈短路故障后和動脈粥樣硬化中的靜脈-移植物疾病。盡管前兩種和最后兩種類型的血管疾病分別在動脈血管壁和靜脈血管壁中發(fā)生，但是平滑肌細胞超常增生是這些大血管疾病發(fā)作和發(fā)展的關鍵因素。各種刺激物涉及平滑肌細胞增殖的開始，其中涉及活化的巨噬細胞的炎癥途經(jīng)得到充分確立。在導致本發(fā)明的研究中，通過全基因組表達分析，本發(fā)明者揭示出在動脈粥樣硬化條件下巨噬細胞和平滑肌細胞中特異性誘導的基因中有TR3核孤獨受體(TR3，也稱作Nur77，NAK1，NGFI-B，NR4A1)和促分裂原誘導的核孤獨受體(MINOR,也稱作N0R-1，NR4A3)和T-細胞的核孤獨受體(NOT，也稱作nurrl，NR4A2)。這三種基因形成轉(zhuǎn)錄因子核受體超家族中的單獨的亞族，包括約60種等，包括雌激素受體和PPAR。經(jīng)證實TR3，MINOR和NOT在人動脈粥樣硬化損害，靜脈-移植物疾病和支架內(nèi)再狹窄(ISR)和豬動靜脈短路-損害中表達。為了評價體內(nèi)損害形成過程中TR3樣因子的功能，產(chǎn)生表達全長TR3或在使轉(zhuǎn)基因表達定向于動脈平滑肌細胞的啟動子控制下的所有三種轉(zhuǎn)錄因子(稱作TR3dTA或ATA)抑制劑的轉(zhuǎn)基因小鼠。通過頸動脈連接攻擊小鼠，導致富含平滑肌細胞的損害形成。這類血管損害發(fā)生得相對較快并且可以視為再狹窄的數(shù)模型。表達TR3dTA的轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比發(fā)生基本上更大的新內(nèi)膜。在具有這些數(shù)據(jù)的品系中，內(nèi)膜超常增生在表達動脈平滑肌細胞中TR3的轉(zhuǎn)基因小鼠中受到強烈抑制。這些結(jié)果清楚地表明TR3，并且也可以想像到MINOR和NOT抑制富含平滑肌細胞的損害形成。因此，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)TR3為抑制血管損害形成過程中平滑肌細胞過度增殖的保護因子。除表達平滑肌細胞中的TR3,MIN0R和N0T外，TR3樣因子(即TR3，MINOR和NOT)還在人動脈粥樣硬化巨噬細胞和內(nèi)皮細胞中表達。TR3，MINOR和NOT的表達在培養(yǎng)的巨噬細胞活化時得到強烈促進，既在初級人巨噬細胞中，又在單核細胞/巨噬細胞細胞系THP-1中。因此，已經(jīng)證實TR3樣因子抑制活化巨噬細胞的細胞因子和趨化因子釋放，更具體地說，抑制白細胞介素-1P、白細胞介素-6、白細胞介素-8、單核細胞趨化蛋白-1、巨噬細胞炎性蛋白-lot和巨噬細胞炎性蛋白-lp的表達。此外，在培養(yǎng)的巨噬細胞中，載脂受到抑制，這與清除受體-A和CD36的表達降低有關。因此，TR3樣因子也界定了復雜的粥樣硬化病變形成。還證實TR3促進內(nèi)皮細胞存活和血管發(fā)生(ZengH等，JExpMed.2006，203:719-729)，這有利于血管損傷，諸如，例如血管成形術和支架放置后血管壁中的愈合過程?；谏鲜鼋Y(jié)果，刺激TR3-類核受體活性表現(xiàn)為一般預防或減輕與動脈粥樣硬化相關的心血管疾病，且特別是發(fā)生支架內(nèi)狹窄，靜脈-移植物疾病，移植動脈硬化和動靜脈短路故障的關鍵。本發(fā)明由此涉及核受體TR3，MIN0R和NOT中的一種或多種的激動劑在制備治療動脈粥樣硬化和/或與動脈粥樣硬化相關的心血管疾病的藥物中的應用。特別地，本發(fā)明涉及核受體TR3，MINOR和NOT中的一種或多種的激動劑在制備治療支架內(nèi)再狹窄，靜脈-移植物疾病，移植動脈硬化和/或動靜脈短路故障的藥物中的應用。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)證實TR3，MINOR和NOT的轉(zhuǎn)錄活性由非傳統(tǒng)的激動劑調(diào)節(jié)，所述的非傳統(tǒng)激動劑諸如包含三氟甲基(DIM-C-pPhCF3),氫(DIM-C-Ph)和/或曱氧基(DIM-C-pPh0CH3)取代基的l，l-雙(3'"引哚基)-l-(對位取代的苯基)甲烷類，下文稱作"C-DIM"，它們增加TR3樣因子的活性(Chintharlapalli等，JBiolChem.2005;280:24903-24914)，這些化合物本身及其合成描述在W002/28832中。因此，本發(fā)明優(yōu)選的激動劑為下式的化合物RsW其中R!、R2、R4、R5、R6、R厶R2'、R/、R5'、IV和R/各自獨立地選自氫、卣素、直鏈C廣Cu烷基、支鏈d-d。烷基、包含1-10個碳原子的烷氧基和硝基；且Rs和R8,各自獨立地選自氫、直鏈C廣d。烷基、支鏈C廣d。烷基、包含1-10個碳原子的環(huán)烷基和芳基。在一個優(yōu)選的實施方案中，R"R2、1、R5、R"R/、R/、R厶R厶V和R/各自為氫，且R/各自為氫，且Rs和IV中至少一個為支鏈烷基、環(huán)烷基或芳基。優(yōu)選Rs和R8'各自獨立為氫、甲基、C6H5、C6H4OH、C6H4CH3、C6H4CF3、C10H7、C肌H5或C6H4OCH3?？梢杂米鞅景l(fā)明TR3，MINOR和/或NOT激動劑的特別優(yōu)選的化合物為這類化合物，其中R!、R2、R"R"R厶R厶R5'、V和R/各自為氫，且R8和R/之一為氫且另一個為C6H5、C晶CF3或C6H4OCH3。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的激動劑為TR3激動劑。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，治療借助于其中結(jié)合和/或其上涂敷了所述激動劑的支架來進行。支架一般為由生物相容性材料，優(yōu)選金屬或塑料構(gòu)成的長管形裝置。典型的支架包括開放式的柔性結(jié)構(gòu)。該支架結(jié)構(gòu)允許支架以放射狀壓縮態(tài)放置以便管腔內(nèi)導管插入適當位置。一旦在血管腔內(nèi)適當定位，支架就呈放射狀擴張以便支持和加強血管。支架的放射狀擴張可以由與導管連接的可膨脹氣嚢完成，或支架可以具有一旦展開就呈放射狀膨脹的自我膨脹樣式?？梢酝ㄟ^諸如浸漬，噴霧，氣相淀積，等離子聚合以及電鍍和靜電沉積這類方法涂布涂層。本領域技術人員能夠極為充分地選擇生物相容性和與激動劑，諸如"C-DIM"相容的涂層材料，并且這類涂層為本領域公知的。優(yōu)選這類涂層在較長時間期限內(nèi)具有釋放活性組分的洗脫分布型?；蛘撸Ъ茏陨砜梢杂善渲薪Y(jié)合了激動劑的材料制成。它還可以為在較長時間期限內(nèi)釋放激動劑的緩釋材料。支架還可以由生物可降解的材料制成，可以涂敷或其中結(jié)合了所述的激動劑。本發(fā)明可以使用的合適的生物可降解材料為本領域技術人員眾所周知的。為了治療靜脈-移植物疾病，可以以各種方式將所述的激動劑涂布在植入的靜脈上?？梢栽谥踩肭皩⒓觿┙Y(jié)合放置在靜脈周圍的套嚢中或涂敷在其上?；蛘?，可以給靜脈涂敷包含所述激動劑的液體。合適的這類液體可以固化以避免激動劑從血管中滲漏。優(yōu)選這類固化可以在將靜脈植入所治療部位前進行。合適的物質(zhì)的實例為普盧蘭尼克凝膠(也稱作普盧蘭尼克F127或泊洛沙姆407)，它是展示出反向熱膠凝特性的生物相容性聚合物，即該材料在室溫下作為液體存在，而在體溫下作為固體存在。在冷卻時，普盧蘭尼克凝膠為無味，無色和無油膩性的。在體溫下，它快速增厚。普盧蘭尼克凝膠在使用阿司匹林治療靜脈移植物中的應用由Torsney等，Circ.Res.94(11):1466-1473(2004)描述。為了治療靜脈-移植物疾病，如Vijayan等，J.Vase.Surg.40(5):1011-1019(2004))所述，也可以通過使用聚催乳激素生物可降解的外部支架特別所述的激動劑。本發(fā)明由此還涉及能夠洗脫核受體TR3，MIN0R和NOT中的一種或多種的激動劑，特別是上述激動劑的醫(yī)療裝置，該裝置用于治療動脈粥樣硬化和/或與動脈粥樣硬化相關的心血管病癥，諸如支架內(nèi)再狹窄，動靜脈短路故障和/或靜脈-移植物疾病。為了能夠洗脫所述的激動劑，可以給醫(yī)療裝置涂敷結(jié)合了所述激動劑中的一種或多種的合適的涂層，并且在將所述的裝置放入例如血管后可以從涂層中洗脫所述的激動劑。該醫(yī)療裝置自身也可以包含結(jié)合了所述激動劑中的一種或多種的合適的材料，從這種材料中可以洗脫所述的激動劑。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述的醫(yī)療裝置為支架。為了治療支架內(nèi)再狹窄，優(yōu)選使用管腔內(nèi)支架。特別地，為了治療靜脈-移植物疾病，所述的醫(yī)療裝置優(yōu)選為能夠洗脫核受體TR3，MINOR和NOT中的一種或多種的激動劑的套囊。本發(fā)明合適的套嚢由例如結(jié)合了本發(fā)明的一種或多種激動劑的普盧蘭尼克凝膠制成。本發(fā)明的激動劑還可以適當與任意其它生物活性劑聯(lián)用，即具有治療價值的藥物或其它物質(zhì)，包括，但不限于抗血栓藥、抗凝藥、抗血小板藥、溶栓劑、抗增殖藥、抗炎藥和抑制再狹窄的其它活性劑、平滑肌細胞抑制劑、抗生素等及其混合物。在如下的實施例中進一步解釋本發(fā)明，但這些實施例并不指定以任何方式來限定本發(fā)明。在實施例中，參照下列圖圖1表示內(nèi)皮細胞特異性免疫組織化學和灌注靜脈段中的TR3mRNA表達。在旁路手術過程中將靜脈段放入體外旁路回路并且在動脈壓下接觸自體全血流1小時。在灌注時，非支架化靜脈移植物(B，D，F(xiàn))展示出過度擴張。在具有外部支架的靜脈移植物(A，C，E)內(nèi)，防止生物機械活化。在高壓下接觸灌注的靜脈段表現(xiàn)出內(nèi)皮缺失，而在外膜附近觀察到毛細管內(nèi)皮細胞(紅色)作為操作步驟(B)的對照組。外部支架放置保護了內(nèi)皮完整性(A;紅色單層)。通過在非支架化靜脈移植物中的圓形(Ci)平滑肌細胞層中的放射性原位雜交(黑色斑點)觀察到TR3mRNA表達(D200x;F權x)。在支架化靜脈移植物(C200x;E400x)或長(Lo)平滑肌細胞層(C-F)中難以觀察到TR3表達。靜脈血管壁結(jié)構(gòu)的圖示表明了兩種不同的平滑肌細胞層；即Lo和Ci平滑肌細胞層。虛線表示Lo與Ci平滑肌細胞層之間的邊界。用紫色復染核(C-F)。圖2表示在灌注靜脈段中的TR3和PAI-1表達。使靜脈段在動脈壓下接觸6小時自體全血(B，D)或即刻固定用作對照組(A，C)。通過在灌注6小時后遍及靜脈移植物中的放射性原位雜交(黑色斑點)檢測TR3mRNA和PAI-lmRNA表達(B，D)，而TR3和PAI-1表達幾乎僅存在于對照組靜脈段中(A，C)。圖3表示環(huán)狀牽張誘導的靜脈平滑肌細胞增殖。DNA合成增加作為對來源于兩種不同供體的靜脈平滑肌細胞環(huán)狀牽張24小時的反應，而相同供體的動脈平滑肌細胞與牽張無關(A)。將牽張后的[3H-]胸苷摻入表示為占對照組值中的百分比。在靜脈平滑肌細胞牽張24小時后p27一得到減量調(diào)節(jié)，而p21""表達水平仍然保持與蛋白質(zhì)印跡所證實的相同(B)。此外，SMoc-肌動蛋白得到減量調(diào)節(jié)作為對靜脈平滑肌細胞牽張的反應。在動脈細胞裂解物中，這些蛋白質(zhì)的表達未改變。ot-微管蛋白表達用作等同加載的對照組。SV表示隱靜脈靜脈平滑肌細胞；IMA,乳房內(nèi)動脈平滑肌細胞；c,對照組；s,牽張組。圖4表示牽張誘導的靜脈SMC中的TR3表達和TR3siRNA擊倒后DNA合成的增加。(A)TR3mRNA表達在牽張后1-2小時在靜脈SMC中以最佳方式增加。通過校準HPRTmRNA表達的程度校準TR3mRNA表達的等同mRNA含量，(B)靜脈SMC的siRNA轉(zhuǎn)染導致具有TR3基因一特異性"RNA序列的環(huán)狀牽張2小時后TR3mRNA表達比對照組siRM減量調(diào)節(jié)。(C)通過免疫熒光檢測TR3蛋白質(zhì)表達。在IMASMC中，僅檢測到了背景信號(a，b)。TR3蛋白質(zhì)表達作為對SVSMC中牽張的反應(5小時)增加(比較c和d)并且被TR3-siRM減量調(diào)節(jié)(比較d和f)。(D)正如通過[3H-]胸苷摻入所測定的，siRNA-TR3擊倒內(nèi)源性TR3表達導致DNA合成比用siRNA-Con轉(zhuǎn)染的SMC增加作為對牽張的反應。SV，隱靜脈SMC;IMA,乳房內(nèi)動脈SMC，*=P<0.01。在來源于6個獨立供體的SV-SMC中獲得了A中的結(jié)果，在B/C中，用3種不同的SV-SMC培養(yǎng)物并且在D中用5種不同的SV-SMC培養(yǎng)物重復本實驗。圖5表示具有TR3腺病毒的靜脈平滑肌細胞中增殖降低。通過蛋白質(zhì)印跡證實用編碼TR3的腺病毒感染靜脈平滑肌細胞后的TR3蛋白質(zhì)表達(A)。TR3在TR3-感染的牽張的平滑肌細胞中表達，而模擬感染的細胞無法表達可測定的內(nèi)源性TR3蛋白質(zhì)。在TR3-感染的細胞中，SMot-肌動蛋白，鉀調(diào)理蛋白和p27一合成比在模擬感染的細胞中更為顯著；oc-微管蛋白用作等同加載的對照組。卩H-]胸苷摻入在模擬病毒感染的平滑肌細胞中環(huán)狀牽張24小時后增加，而TR3病毒感染的平滑肌細胞與牽張無關(B)。將[力-]胸苷摻入表示為占模擬對照值的百分比。圖6表示TR3-激動劑抑制經(jīng)歷環(huán)狀牽張的靜脈SMC中的DNA合成。(A)fH-]胸苷摻入在SMC中增加作為對24小時環(huán)狀牽張的反應，而6-MP以劑量依賴性方式降低了牽張介導的增殖。將PH-]胸苷摻入表示為占對照值的百分比。(B)通過蛋白質(zhì)印跡檢測SMa-肌動蛋白，鈣調(diào)理蛋白和p27""蛋白在不用(-)或用(+)25jiM6-MP處理的牽張的靜脈SMC中的表達。a-微管蛋白用作等同加載的對照組。(C)當用sUNA-TR擊倒TR3表達時，6-MP不再抑制通過[3H-]胸苷摻入測定的DM合成。數(shù)據(jù)的AN0VA分析揭示出數(shù)據(jù)的意義。*=P<0.05，**=P<0.01，NS二無意義。圖7表示支架內(nèi)再狹窄損害的免疫組織化學分析和TR3mRNA表達。檢測支架內(nèi)再狹窄樣品連續(xù)切片的(a)平滑肌細胞含量；和(b)存在的巨噬細胞。經(jīng)證實僅存在有限數(shù)量的巨噬細胞；(c在d中擴大)。使用對TR3具有特異性的核糖核酸探針的放射性原位雜交揭示出遍在損害中的表達相當于損害平滑肌細胞中的主要表達。表達TR3mRNA的細胞包含黑色斑點。用紫色復染核。圖8表示證實TR3，MINOR和NOTmRNA表達在支架內(nèi)再狹窄動脈粥樣硬化斑切除術樣品(樣品1;a-f和樣品2;g-l)中的放射性原位雜交。對TR3(a，在b中擴大；g在h中擴大)，N0T(c，在d中擴大；i在j中擴大)和MINOR(e，在f中擴大；k在1中擴大)觀察到了遍在損害的分散表達。相應的有義核糖核酸探針未表現(xiàn)出任何背景(數(shù)據(jù)未顯示)。圖9表示證實TR3蛋白質(zhì)表達的免疫組織化學。將圖7中顯示的樣品的連續(xù)切片與定向于TR3的抗體一起孵育以便揭示出TR3蛋白質(zhì)表達(紅棕色)在支架內(nèi)再狹窄中與TR3mRNA;(a，在b中擴大)樣品l和(c在d中擴大)樣品2類似的模式。圖10表示通過接受動靜脈移植物4周的豬的新內(nèi)膜和外膜中放射性原位雜交的TR3，MINOR和NOT的mRNA表達。相應的有義核糖核酸探針未表現(xiàn)出任何背景(數(shù)據(jù)未顯示)。A.通過放射性原位雜交的肩區(qū)和移植物區(qū)域中用蘇木精復染的TR3inRNA表達(黑色斑點)；B.通過放射性原位雜交的肩區(qū)和移植物區(qū)域中用蘇木精復染的MINORmRNA表達(黑色斑點)；C.通過放射性原位雜交的肩區(qū)和移植物區(qū)域中用蘇木精復染的NOTmRNA表達(黑色斑點)。圖11表示Nur77-激動劑6-MP增強培養(yǎng)的SMC中的Nurn活性。通過測定用包含源自POMC的NurRE的Nur77報道分子-螢光素酶構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的表達Nur77的SMC中的螢光素酶活性監(jiān)測NurW的轉(zhuǎn)錄活性。在沒有(C，白色條)或有6-MP(6-MP，灰色條)存在下將細胞培養(yǎng)24小時(平均值土SD);*P<0.05。圖12:NR4A激動劑抑制培養(yǎng)的SMC中的增殖涉及Nur77。A:生長在含有(對照組，白色條)或所示濃度的6-MP(灰色條)媒介物中的SMC的DNA合成。通過[311-]胸苷摻入檢測DNA合成。在25yM或50MM6-MP下，DM合成降低。(平均值士SD，n=3);*P<0.05.B:Nur77mRM表達在用siNur77轉(zhuǎn)染的SMC中比在用對照組siRNA轉(zhuǎn)染的SMC中降低。通過實時RT-PCR測定mRM水平并且對P0表達校準樣品中cDNA含量(平均值土SD，n=2);*P<0.05C:通過用對照組siRNA(白色三角形)轉(zhuǎn)染或用siNur77(黑色正方形)轉(zhuǎn)染的SMC中的PH-]胸苷摻入測定6-MP對DM合成的作用。6-MP抑制DNA合成的有效性在siNur77轉(zhuǎn)染的細胞中比在對照組siRNA轉(zhuǎn)染的細胞中低，從而證實6-MP的抑制作用至少部分通過Nur77的活化介導(平均值士SD，n-2);*P<0.05。圖13表示激動劑6-MP對SMC無細胞毒性并且不會誘導編程性細胞死亡。A:與媒介物(對照組，白色條)，6-MP(灰色條)或星形孢菌素(Stau，陰影條)一起孵育24小時的SMC存活率。通過MTT測定法測定細胞存活率并且表示為占對照組的百分比(平均值±SD，n=3);*P<0.05。B:將SMC與媒介物，6-MP或星形孢菌素一起孵育24小時。隨后使用Hoechst染料染色核。僅星形孢菌素誘導編程性細胞死亡并且降低細胞存活率。圖14表示套嚢損傷后鼠血管壁中Nur77的mRNA表達。在套嚢放置后的不同時間點(6小時至7天)，收集套嚢的血管節(jié)段將檢測Nur77mRNA含量。將mRNA表達水平表示為與才莫擬手術的血管相比的相對表達。(平均值土SEM，n-6)。在損傷后6小時Nur77mRNA已經(jīng)升高并且保持升高至7天。圖15表示局部NR4A-激動劑遞送對新內(nèi)膜形成的作用。A:使用包含不同量的6-MP的野生型小鼠(Wt)，表達全長Nur77cDNA(Nur77)的轉(zhuǎn)基因小鼠或表達Nur77的顯性失活變體(△TA)的小鼠的股動脈的有代表性的橫截面。在4周后通過HPS染色分析Wt和Nur"轉(zhuǎn)基因小鼠并且在2周后分析ATA轉(zhuǎn)基因小鼠的套嚢的血管節(jié)段(放大倍數(shù)400x;箭頭表示內(nèi)彈性膜)。B:對套嚢的血管節(jié)段的形態(tài)測定分析揭示出在放置套嚢后4周7只Wt和Nur轉(zhuǎn)基因小鼠中的總內(nèi)膜面積。套囊不含(對照組)，包含0.5%或1%6-MP。C:在放置不含，包含0.5%或1%6-MP的套嚢后2周在ATA轉(zhuǎn)基因小鼠中套嚢的股動脈中的總內(nèi)膜面積(平均值士SEM，n=6);*P<0.05;**P<0.01。圖16表示C-DIM衍生物抑制培養(yǎng)的人SMC的增殖。通過在有血清和增加濃度的C-DIM-H，C-DIM-OCH3或C-DIM-CF3存在下的[3H-]胸苷摻入測定SMC的合成。所有三種C-DIM以劑量依賴性抑制SMC中的DNA合成。C-DIM-H的有效性低于C-DIM-0CH3和C-DIM-CF3。圖17表示在增加濃度的C-DIM-衍生物下，通過MTT測定法評價的SMC存活率。C-DIM-H和C-DIM-0CH3在達10孩i摩爾濃度下也不會影響SMC存活率，而C-DIM-CFS在IO微摩爾下降低SMC存活率并且在20微摩爾下對細胞具有毒性。圖18表示C-畫-H，C-腿-0CH3或C-DIM-CF3不會誘導SMC中的編程性細胞死亡。將SMC與媒介物，C-DIM化合物(在IO微摩爾下)或星形孢菌素一起孵育24小時。隨后使用Hoechst染料染色核并且測定細胞凋亡核的百分比。僅星形孢菌素誘導編程性細胞死亡。圖19表示C-DIM-0CH3抑制SMC的增殖和涉及的TR3。通過在有血清存在下的PH-]胸苷摻入測定SMC的合成。TR3-特異性siRM擊倒TR3表達，并且經(jīng)證實C-DIM-0CH3的抑制作用至少部分通過TR3的活化介導。圖20表示Nur77，Nurrl和NOR-1在人動脈粥樣硬化中的巨噬細胞特異性表達。通過免疫組織化學分析人II型損害的連續(xù)切片(表1中的供體III(承))，以便檢測巨噬細胞(A)和SMC(B)。為了證實Nur77,Nurrl和N0R-1的巨噬細胞特異性表達，通過巨噬細胞特異性免疫組織化學和使用基因-特異性探針(C-H)的原位雜交同時分析切片。如通過Nur77(D),Nurrl(F)和N0R-1(H)的放大倍數(shù)的增加證實的mRNA表達(黑色銀粒)與大量巨噬細胞(用紅色表示)共同定位。D，F(xiàn)，H分別在C，E，G中所示的面積擴大。M(J)，巨噬細胞；Neo，新內(nèi)膜；Lu，腔；M，培養(yǎng)基。D,F和H中的箭頭指向表達特異性mRNAs的巨噬細胞。圖21表示人動脈粥樣硬化中Nur77，Nurrl和N0R-1的蛋白質(zhì)表達。通過免疫組織化學分析人II型損害(表1中的供體V(t))的連續(xù)切片，以便檢測巨噬細胞(A)，SMC(B)，Nur77(C)，Nurrl(D)或NOR-I(E)。Nur77，Nurrl和N0R-1蛋白質(zhì)主要在新內(nèi)膜細胞中表達并且定位于核。未對C-E中所示的切片復染核。Mcj)，巨噬細胞；Neo，新內(nèi)膜；Lu，腔；M，培養(yǎng)基。虛線表示內(nèi)彈性膜。圖22表示作為對LPS和TNFct反應的Nur77,Nurrl和N0R-1在初級巨噬細胞和THP-1衍生的巨噬細胞中的表達。通過實時RT-PCR測定mRNA表達水平。在用LPS(100ng/ml)，TNFoc(10ng/ml)或?qū)φ掌诽幚?小時的2種不同供體的初級巨噬細胞中，觀察到了Nur77，Nurrl和N0R-1的mRNA表達水平增加(A)。在THP-l-氧化的巨噬細胞中，作為對LPS(250ng/ml，2小時)(B)和TNFoc(10ng/ml，對Nur77和Nurrl而言，1小時；對NOR-1而言3小時)(C)反應的Nur77，Nurrl和N0R-1的衍生的巨噬細胞mRNA表達水平增加。在上組顯示了最佳表達并且將時程給出在下組中。最佳表達實驗(n-3，±SD，斯氏t-檢驗，p<0.05)。在時程實驗中，顯示了有代表性的實驗(n-2)。通過免疫熒光分析在LPS-處理(6小時)的THP-1衍生的巨噬細胞中NOR-I的蛋白質(zhì)表達并且它們定位于核(D)。圖23表示THP-l細胞的慢病毒感染的轉(zhuǎn)導效率和編碼的核受體的核定位。通過流式細胞計量術(A-D)分析感染了空慢病毒模擬物(A，B)或編碼EGFP的慢病毒(C，D)的THP-1細胞。慢病毒感染產(chǎn)生了80-90%的轉(zhuǎn)導效率。同時感染了編碼EGFP(E-G)、Nur77(I-K)，Nurrl(M-O)，NOR-l(Q-S)的重組慢病毒感染了模擬病毒(H，L，P和T)的THP-1細胞胞中定位的免疫熒光EGFP表達，而核受體主要存在于核內(nèi)。IF,(免疫)熒光。圖24表示THP-1衍生的巨噬細胞中NR4A-因子超表達降低了Dil標記的ox-LDL攝取和SR-A和CD36的表達。(A)通過熒光測定法測定3，6和24小時的Dil標記的ox-LDL的攝取。超表達Nur77，Nurrl或N0R-1的THP-1巨噬細胞中的脂質(zhì)荷載顯著低于Mock(n-3,±SD,斯氏t-檢驗，p<0.01)。(B)Dil標記的ox-LDL處理24小時后，用共聚焦顯微鏡分析THP-1巨噬細胞，顯示在超表達N11r77的巨噬細胞中Dil-熒光強度下降，從而定位于脂質(zhì)空泡。(C)通過實時RT-PCR測定SR-A和CD36的mRNA表達。超表達Nur77，Nurrl和NOR-1的THP-l巨噬細胞表達顯著低水平的SR-A和CD36(B，n=3，土SD，斯氏t-檢驗；p<0.01)。圖25表示Nur77，Nurrl或NOR-1超表達降低了炎性細胞因子和趨化因子產(chǎn)生。用LPS(100ng/ml)，TNFa(20ng/ml)或?qū)φ掌反碳こ磉_Nur77,Nurrl和N0R-1的THP-1巨噬細胞3小時并且通過實時RT-PCR測定MIP-1ct，M1P-1P和MCP-1(A.1)以及IL-1P，IL-6和IL-8(A."的mRNA水平。在模擬慢病毒感染的細胞中，所有分析的細胞在LPS后被誘導了20-8000倍并且在TNFoc后被誘導了3-10倍(除外IL-6，在TNFoc后未檢測到(ND))。超表達Nur77，Nurrl和N0R-1的THP-1巨噬細胞在所分析的大部分基因中表達顯著低的mRNA水平(降低〉50%)(n=3，士SD，斯氏t-檢驗，p<0.05)。在條件培養(yǎng)基中測定IL-8，IL-lp和IL-6的蛋白質(zhì)水平(B)。在使用LPS處理后0，6和24小時時采集上清液。IL8，IL-1和IL-6的蛋白質(zhì)水平在超表達Nur77,Nurrl和N0R-ls的THP-1巨謹細胞中顯著降低(n-3，土SD，斯氏t-檢驗，p〈0.05;ND:未檢測到；NS:不顯著)。實施例實施例1TR3核孤獨受體預防環(huán)狀牽張誘導的靜脈平滑肌細胞增殖為了確定牽張在啟動靜脈-移植物疾病中的相對貢獻和描繪與來在不同SMC牽張模型中研究早期應答基因TR3的表達。首先，使來源于隱靜脈和乳房內(nèi)動脈的培養(yǎng)的SMC接觸環(huán)狀牽張，并且根據(jù)公布的數(shù)據(jù)證實靜脈SMC變增殖，而動脈SMC保持靜止。其次，在施加動脈(搏動的)壓的專用器官培養(yǎng)模型中研究人和(轉(zhuǎn)基因)小鼠血管。第三，通過超表達所述的基因，使用siRM抑制內(nèi)源性TIU表達并且通過使用TR3激動劑6-MP促進TR3活性證實TR3在抑制牽張誘導的增殖中的功能參。材料和方法人體組織樣品如上所述使用人隱靜脈段在動脈壓下接觸全血的離體灌注模型(Stooker等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg,，121:290-297，2001)。簡言之，在旁路手術過程中將靜脈段放入體外循環(huán)的回路中并且使其在流動(非搏動的)和動脈壓(60mmHg)下接觸自體血液。為了研究過度擴張對旁路靜脈的作用，在有或沒有外部支架存在下灌注靜脈段。在灌注1和6小時后，收集靜脈段，固定在福爾馬林中并且包埋在石蠟中以便進行組織學檢查。對在本研究中包括的患者需得到告知的許可，并且本研究需得到了地方醫(yī)學倫理委員會批準。按照常規(guī)方案進行麻醉和心肺旁路手術。原位雜交如BootRG等所述進行原位雜交(ArteriosclerTh腦bVaseBiol.，19:687-94，1999)。合成TR3和PAI-1探針TR3，GenBankNo.L13740,堿基對(bp)1221-1905;PAI-1，GenBankNo.X12701,bp52-1308。使用["S〗-UTP標記探針(AmershamBiosciences,Buckinghamshire,U.K.)。將對照組石蠟切片(5微米)和灌注的隱靜脈段固定在SuperFrostPlus載玻片(Menzel-Glaser，Braunschweig,德國)上。在雜交和嚴格洗滌后，用核研究乳劑(ILFORDImagingUKLimited,Cheshire,U.K.)覆蓋原位切片，使其接觸2-9周，然后展開并且用蘇木精和伊紅復染。對每一基因檢測匹配有義核糖核酸探針并且證實既無背景，又沒有無特異性信號。作為RNA的完整性的控制，使用反義核糖核酸探針對凝血酶受體PAR-1(GenbankM62424bp3076-3472)進行原位雜交。PAR-1大量在對照組和灌注靜脈段中表達，表明RNA的完整性在所有樣品中相差無幾(數(shù)據(jù)未顯示)。免疫組織化學將石蠟切片(5微米(uM))去石蠟化，再水合并且與0.3%(v/v)過氧化氫一起孵育且用在lOmMTris-HCl(pH8.0)，150raMNaCl(TBS)中10。/。(v/v)的免疫前山羊血清(DAK0，Glostrup，Denmark)封閉。隨后在41C下將切片與生物素標記的在TBS中的UlexEuropaeusAgglutinin(VectorLaboratories,Inc.Burlingame,CA)(按照1:50稀釋)一起孵育過夜，隨后使用鏈霉抗生物素-辣根過氧化物酶綴合物(DAKO)檢測，且然后用氨基-乙基啼唑和過氧化氫檢測。使用甲醇固定培養(yǎng)的細胞并且用單克隆抗體1A4(1:200;DAKO)和生物素標記的山羊抗小鼠二次抗體(DAKO)染色SMot-肌動蛋白。在用蘇木精復染后，將切片包埋在glycergel(Sigma,St.Louis,MO)中。使用Hoechst33258(Sigma)進行免疫熒光核染色。平滑肌細胞培養(yǎng)在具有包含20%(v/v)胎牛血清(FBS)與青霉素和鏈霉素(GIBCO，InvitrogenLifeTechnology,Breda,荷蘭)的HEPES的MedijaM199用;第4-6;。使用一定向于SMot-肌動蛋白(DAKO)的單克隆抗體IA4表征平滑肌細胞并且顯示出同質(zhì)性的原纖維染色。與10jaM碳酰氰基-對-氯苯腙(CCCP)孵育過夜誘導平滑肌細胞編程性細胞死亡。為了研究牽張誘導的反應，將平滑肌細胞接種在包含膠原蛋白涂布柔性膜的6孑L平板(BioFlex⑧培養(yǎng)板，DunnUbortechnikGmbH,Asbach，德國)中并且使其在FlexercellFX3000儀器(DunnLabortechnik)中在10%牽張和0.5Hz下牽張1,2，4，6或24小時或用作對照組(無牽張)。涂布基于硅氧烷的潤滑劑以防止膜與加載后之間的摩擦。[3H]-胸苷摻入，腺病毒感染，siRNA電穿孔和6-MP處理SMC:將平滑肌細胞接種在6孔牽張平板中并且在孔中細胞匯合時，使平滑肌細胞在包含0.5%(v/v)FBS的培養(yǎng)基中靜止16小時。將平板轉(zhuǎn)入LoadingStationTM并且牽張24小時。在相同條件下培養(yǎng)無牽張的對照平板。此后使用0.5jaCi/mL[曱基」H]-胸苷(AmersharaBiosciences)將細胞標記4小時。在4'C下使用10。/。(wt/v)三氟乙酸使摻入的放射性沉淀30分鐘，用5%(wt/v)三氟乙酸洗滌兩次并且溶于0.5NNaOH。通過液體閃爍計數(shù)測定。H]-胸苷。當用包含模擬物或包含TR3的腺病毒(3x108個噬斑形成單位)感染細胞2小時時，使細胞在完全培養(yǎng)基中恢復24小時，此后使它們保持靜。在用Q，1，10，25iaMC-DIM(在DMSO中的40mM儲備溶液)牽張前啟動激動劑處理(6-MP)。使用如下小干擾RM(siRNA)序列TR3siRM，5'-CAGUCCAGCCAUGCUCCUCdTdT-3';和突變的對照組siRNA，5'-CAGACGAGCCUUGCUCGUCdTdT-3'(AmbionInc.,UK)。使用用于SMC的Nucleofector試劑(AmaxaGmbH,Cologne,德國)，根據(jù)每個制造商的推薦將每個Flexerplate孑L1pg的siRNA轉(zhuǎn)染入5乂105個SMC，且隨后將細胞放入牽張平板并且如上所述處理。蛋白質(zhì)印跡分析使用細胞裂解物(每個泳道30微克)和濃培養(yǎng)基(每個泳道等量的200微升)進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入硝化纖維-Protran(Schleicher和Schuell，'s-Hertogenbosch，荷蘭)。使用定向于這些蛋白質(zhì)的所示抗體研究p27Kipl(BDBiosciences,Alphena/dRijn，荷蘭)，p21一(BD)，SMa-肌動蛋白(DAK0)，PAI-1(MAI-12;Biopool，固ea，Sweden),TR3(M-210;SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA),鉤調(diào)理蛋白(克隆hCP;Sigma)和ot-微管蛋白(CedarUne，Hornby,Ontario,Canada)的表達。將初級抗體在4'C下和在TBS中的5%Protifarplus(Nutricia，Cuijk，荷蘭)中孵育過夜，作為二次抗體，使用按照1:S000在TBS中稀釋的辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔(用于p27""和TR3檢測)或山羊抗小鼠(用于所有其它的檢測)(BioRad11LaboratoriesInc.，Hercules,CA)。通過增強的化學發(fā)光檢測(L|nMi-Lightplus;RocheDiagnosticsGmbH，Mannheim,德國)顯現(xiàn)蛋白質(zhì)。通過LpMi-Imager(BoehringerMannheim,Mannheim,德國)進行定量分析。將ot-微管蛋白染色用作加載對照組。實時RT-PCR使用Trizol試劑(GIBCO)分離總RNA。通過使用SuperscriptII(GIBCO)和0.5微克(dT)12-18引物從1微克總RM逆轉(zhuǎn)錄(RT)合成cDNA。使用FastStartDMMasterSYB綠色I試劑盒(Roche)在LightCyclerSystem(Roche)中進行實時聚合酶鏈反應(PCR)。用于TR3的引物如下(正向)5'-GTTCTCTGGAGGTCATCCGCAAG-3'和(反向)5'-GCAGGGACCTTGAGAAGGCCA-3'。作為在不同樣品中等量的第一鏈cDNA的對照組，我們使用如下引物測定了次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)mRNA水平(正向)5'-TAATTATGGACAGGACTGAACG-3。和(反向)5'-CACAATCAAGACATTCTTTCCAG-3,.結(jié)果灌注的隱靜脈段中的TR3表達為了研究導致靜脈-移植物疾病的分子過程，使用離體灌注模型，其中在冠狀動脈旁路手術過程中將隱靜脈段放入體外循環(huán)。在灌注過程中，在未支架化的隱靜脈中觀察到顯著的擴張，這種未支架化的隱靜脈在動脈壓下已經(jīng)灌注1小時后導致內(nèi)皮細胞層幾乎完全喪失。防止因放置外部支架導致的過度機械牽張的靜脈在灌注后包含完整的內(nèi)皮(如內(nèi)皮-特異性免疫組織化學例示的，圖1A)。在未支架化的靜脈段中，細胞特異性染色揭示出在外膜處的毛細管內(nèi)存在內(nèi)皮細胞，而腔內(nèi)皮已經(jīng)消失(圖1B)。隱靜脈結(jié)構(gòu)在平滑肌細胞構(gòu)造方面不同于動脈壁，因為靜脈包含以反向定向的兩層平滑肌細胞?？v向平滑肌細胞層接近血管腔定位并且環(huán)狀平滑肌細胞層(類似于在動脈管中)與外膜相鄰存在(圖1,圖示)。在尋找涉及靜脈-移植物疾病的基因過程中，通過放射性原位雜交檢測離體灌注靜脈段中的早期應答基因TR3的mRNA表達。灌注1小時后，檢測在支架化靜脈段中的偶見內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中的TR3表達(圖1C,E)。然而，主要檢測在未支架化靜脈段的環(huán)狀平滑肌細胞層中中的過度TR3表達(圖1D,F)。在對照組靜脈段中實際上不存在TR3表達(圖2A)。而在灌注6小時后，在未支架化的灌注靜脈中，在整個血管內(nèi)的縱向和環(huán)狀平滑肌細胞層中大量遍在TR3(圖2B)。此外，分析PAI-1mRNA表達，因為目前PAI-1為唯一的已知基因，它既涉及血管生物學，又具有功能性TR3應答元件。PAI-1存在于對照組靜脈中(圖2C)和1小時灌注后(數(shù)據(jù)未顯示)的偶見內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中。然而，在6小時灌注后，PAI-1表達在平滑肌細胞中顯著增加(圖2D)?？傊?，TR3-和PAI-1mRNA在動脈壓下進行灌注的隱靜脈中的平滑肌細胞中表達，并且TR3mRNA表達最初定位于環(huán)狀定向的SMC中。環(huán)狀SMC層為靜脈血管壁外部，表明推定TR3表達并非由血液中的循環(huán)因子或?qū)?nèi)皮細胞損害做出反應誘導，而關鍵刺激是環(huán)狀牽張。環(huán)狀牽張誘導的靜脈平滑肌細胞增殖為了研究乳房動脈旁路材料為何具有優(yōu)于來源于隱靜脈的旁路材料的顯著性，研究了作為對機械牽張反應的來源于這些不同血管的平滑肌細胞之間的內(nèi)在差異。為了進行體外牽張實驗，施用實驗牽張-裝置(FlexercellFX-3000儀器)，其中使所有細胞接觸相同程度的牽張。這種牽張模型的標準化包括分析DNA合成。使來源于乳房動脈或隱靜脈的平滑肌細胞經(jīng)歷10%環(huán)狀牽張(0.5Hz)24小時并且測定卩H]-胸苷摻入。觀察到在靜脈平滑肌細胞中牽張誘導的DNA合成(2-3.5倍，依賴于供體A或B)，而來源于相同個體的動脈平滑肌細胞保持靜止(圖3A)。為了進一步證實細胞周期進展中的改變，分析牽張的靜脈和動脈來源的平滑肌細胞的細胞裂解物中的細胞周期蛋白表達水平。發(fā)現(xiàn)在靜脈平滑肌細胞中牽張時，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27"p'降低(圖3B)。相反，牽張不會改變動脈平滑肌細胞中的pU""表達。另一種細胞周期抑制劑p2fiP'的表達不受靜脈和動脈平滑肌細胞中牽張的影響。將SMoc-肌動蛋白表達檢測為靜止平滑肌細胞的標記并且在牽張后的靜脈平滑肌細胞中適度降低(圖3B)?？傊?，環(huán)狀機械牽張誘導隱靜脈平滑肌細胞中的增殖表型，而乳房動脈平滑肌細胞保持靜止。靜脈平滑肌細胞中環(huán)狀牽張誘導的TR3表達為了擴展接觸灌注的SV段中形成的觀察結(jié)果，測定環(huán)狀牽張時TR3mRNA也由體外培養(yǎng)的SMC表達。使隱靜脈和乳房動脈SMC牽張1，2，4或6小時期限，而未-牽張的細胞用作對照組。TR3mRNA在動脈SMC中增量調(diào)節(jié)(圖4A)。然而，在靜脈SMC中，環(huán)狀牽張l-2小時后TR3mRNA表達被誘導14.2+/-1.7倍，達到明顯高于動脈SMC中的水平。T通過免疫熒光分析R3蛋白質(zhì)表達(圖4C，a-d)，證實在有和無牽張的乳房動脈中僅有背景信號(a，b)。在泳對照組siRNA感染的隱靜脈SMC中，在5小時牽張后TR3蛋白質(zhì)表達受到強烈誘導(c，d)。此外，乳房動脈衍生的SMC表現(xiàn)出不同于靜脈SMC并且看起來對環(huán)狀牽張的應答較低。在上述研究中，我們描述并且應用了抑制所有TR3樣因子的活性的TR3的顯性失活變體(ATA)。在目前的研究中，我們選擇了靜脈SMC中TR3-特異性siRM特異性擊倒的TR3表達。顯然TI^-特異性siRM在2小時環(huán)狀牽張后將內(nèi)源性TR3mRNA表達誘導至在有對照組siRNA存在下表達的約30%(圖4B)。TR3蛋白質(zhì)表達也如圖4C中根據(jù)免疫熒光所示被擊倒的siRNA降低(比較d和f)。令人意外的是，這種TR3表達的降低導致細胞的增殖應答增加作為對牽張的反應，正如[力]-胸苷摻入實驗中所示(圖4D)。TR3的腺病毒表達降低靜脈平滑肌細胞的增殖為了評價TR3在靜脈平滑肌細胞對機械牽張反應中涉及的功能性，使用腺病毒感染超表達TR3。通過蛋白質(zhì)印跡分析證實牽張的平滑肌細胞中的TR3蛋白質(zhì)表達(圖5A)。甚至在牽張后，TR3病毒-感染的平滑肌細胞表現(xiàn)出根據(jù)SMoc-肌動蛋白，鉤調(diào)理蛋白和p27""蛋白質(zhì)合成增加反映出的多于模擬病毒感染細胞時的分化的平滑肌細胞表型(圖5A)。在牽張24小時后，通過[3H]-胸苷摻入檢測病毒感染的細胞的DM合成。模擬病毒感染的細胞表現(xiàn)出與未感染的靜脈平滑肌細胞類似的反應(與圖3A相比)。牽張時[3H]-胸苷摻入被誘導2.7-倍(圖5B)。TR3-感染的平滑肌細胞在環(huán)狀牽張條件下不增殖，正如在對照組和牽張的TR3-感染的平滑肌細胞中等量[3H]-胸苷摻入所揭示出的?？傊?，TR3超表達防止了分化成增殖表型。通過TR3-激動劑處理的靜脈平滑肌細胞中的增殖降低為了確定已知的TR3激動劑6-巰嘌呤(6-MP)是否影響牽張誘導的增殖，用不同濃度的6-MP處理靜脈SMC。經(jīng)歷24小時牽張的未處理的靜脈SMC表現(xiàn)出2.5倍的卩H]-胸苷摻入誘導，而通過6-MP處理以劑量依賴性方式降低了對DM合成的作用(圖6A)。在25juM6-MP下，牽張誘導的DNA合成受到完全抑制。與TR3超表達類似，6-MP在牽張條件下也增加了SMa-肌動蛋白和鈣調(diào)理蛋白以及p27一蛋白質(zhì)表達(圖6B)。為了揭示出TR3在6-MP介導的牽張誘導的增殖抑制中的相對貢獻，我們檢測了6-MP對用TR3-siRNA轉(zhuǎn)染的SMC中的DM合成的作用(圖6C)。siRM擊倒TR3完全消除了6-MP對牽張誘導的DNA合成的作用。這些數(shù)據(jù)清楚地表明TR3介導6-MP對SMC在牽張中的增殖反應的抑制作用和TR3激動劑，諸如本發(fā)明的激動劑"c-DIM"為治療與動脈粥樣硬化相關的心血管疾病中的極為富有希望的藥物候選物。結(jié)論總之，靜脈-移植物疾病為作為對靜脈旁路移植物的生物機械刺激的反應的過度SMC增殖的結(jié)果。靜脈SMC通過啟動增殖對環(huán)狀牽張起反應，而同時細胞周期抑制反饋系統(tǒng)也得到活化，諸如目前對IEX-1途經(jīng)(Schulze等，Circ.Res.93:207-212，2003)和如本研究中鑒定的TR3轉(zhuǎn)錄因子途經(jīng)所述。6-MP促進內(nèi)源性TR3T的活性，這表示TR3的激動劑，諸如6-MP可以調(diào)節(jié)旁路手術后的生物機械內(nèi)膜增厚作為預防過度SMC增殖和隨后靜脈-移植物疾病的方式。上述數(shù)據(jù)由此證實TR3可以作為靜脈-移植物疾病中介入的乾標起作用。實施例2支架內(nèi)再狹窄和豬動靜脈短路損害中核受體TR3，MINOR和NOT的表達在當前的實施例中，通過原位雜交和免疫組織化學研究支架內(nèi)再狹窄和豬動靜脈短路損害中的TR3樣因子的表達。材料和方法人體組織樣品按照MedicalEthicalCommitteesoftheAcademicMedicalCenter,Amsterdam和UniversityofGroningen，Groningen(荷蘭)批準的方案，從對支架內(nèi)再狹窄進行定向冠狀動脈粥樣硬化斑切除術的患者中獲得告知許可的人體組織樣品。將提取的樣品即刻冷凍在液氮，儲存在-80X:下并且將5mm的切片固定在Superfrostplus玻璃載玻片上以便進行免疫組織化學和原位雜交(Emergo，Tournai，比利時)。豬組織樣品雌性長白豬在頸動脈與頸靜脈之間雙側(cè)接受使用展開的聚四氟乙烯(ePTFE)的動靜脈移植物(AV移植物)。4周后，用鹽水且隨后用福爾馬林在生理壓力下灌注移植物和相鄰血管。隨后切下移植物和相鄰血管并且浸入福爾馬林至少24小時，此后用石蠟包埋5mm的塊。在提取的樣品中，將5-jam切片固定在Superfrostplus玻璃載玻片上以便進行原位雜交(Emergo，Tournai,比利時)。豬^莫型和移植物新內(nèi)膜損害組織學由RotmansJL等在JournalofSurgicalResearch113，161-171(2t)03)和Circulation111，1537-42(2005)詳細描述。將該模型用作動靜脈移植物故障(換句話說為狹窄)的模型。原位雜交如上所述進行放射性原位雜交。使用如下核糖核酸探針TR3，GenbankL13740,堿基對(bp)1221-1905;MINOR,GenbankU12767,bp1435-2172;NOT,GenbankX75918,bp119-1003。對每一基因檢測匹配的有義核糖核酸探針并且證實既未產(chǎn)生背景也未產(chǎn)生特異性信號。免疫組織化學，蛋白質(zhì)印跡和免疫放射測定通過使用定向于Nur77家兔抗血清(M-210,SantaCruzBiotechnology,CA)進行的免疫組織化學檢測TR3抗原。結(jié)果動脈粥樣硬化斑切除術樣品中的TR3，MINOR和NOT表達通過原位雜交和免疫組織化學檢驗9位不同患者的冠狀動脈中通過血管內(nèi)定向動脈粥樣硬化斑切除術獲得的9個支架內(nèi)再狹窄樣品的核受體TR3，MINOR和NOT表達。表1表示結(jié)果。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>存在于支架內(nèi)再狹窄損害中的主要細胞類型為平滑肌細胞，正如通過平滑肌細胞特異性免疫組織化學的圖7a中所示。然而，在某些區(qū)域中，存在分散的巨噬細胞(圖7b)。大量TR3mRNA表達如圖7c中所示觀察到(在圖7d中擴大)。對TR3，MINOR和NOTmRNA表達進行深入分析并且有關來源于兩個不同供體的兩個樣品的數(shù)據(jù)如圖8中所示(分別為a-f和g-l的樣品1和2)。在連續(xù)切片中的每個樣品中，實際上觀察到TR3(a，b，g，h)，MINOR(c,d，I，j)和NOT(e，f,k，1)mRNA的表達。在9個分析的樣品中，與所示典型實施例中類似，大部分樣品表現(xiàn)出遍在損害中的這些轉(zhuǎn)錄因子的表達，其中顯然并非所有的平滑肌細胞均表達TR3樣因子。測定表達所述核受體之一的細胞百分比并且揭示出33±22%的細胞對TR3為陽性，36±17%的細胞具有NOT表達，而17±10%表達MINOR(表1)。在具有對TR3mRNA表達獲得的結(jié)果的品系中，使用抗TR3抗體進行的免疫組織化學揭示出TR3蛋白質(zhì)也在這些支架內(nèi)再狹窄樣品的連續(xù)切片中表達(圖9)。在AV移植物故障的豬模型中的動靜脈移植物新內(nèi)膜中的TR3，MI難和匿表達通過放射性原位雜交分析豬術石蠟切片的TR3，MINOR和NOT的mRNA表達。所有3種核受體TR3，MINOR和NOT在主要由增殖的血管平滑肌細胞組成的移植物新內(nèi)膜的肩和墊區(qū)中廣泛和高度表達。此外，TR3，MINOR和NOT也在移植物周圍區(qū)域中表達，其中除平滑肌細胞外，還存在炎性細胞，如巨噬細胞(圖10A-C)。結(jié)論本實施例證實了在支架內(nèi)新內(nèi)膜和動靜脈移植物新內(nèi)膜中的所有三種TR3-類亞族成員表達。盡管TR3對平滑肌細胞生長具有明顯的抑制作用，但是其活性顯然不足以預防放置在所研究的患者體內(nèi)的支架和/或移植物部位上的癥狀性再狹窄。本發(fā)明基于通過介入目的在于降低一般的新內(nèi)膜形成和再狹窄的激動劑增加預先存在的TR3的活性。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)C-DIM促進TR3樣因子的活性。使用小分子化合物，諸如C-DIM靶向這些因子對血管樹的患病區(qū)域具有高度特異性，因為在損害平滑肌細胞，而非在正常動脈中以特有方式合成TR3樣因子。實施例3NUR77(TR3)的激動劑活化預防新內(nèi)膜形成充分定義的新內(nèi)膜形成的小鼠模型由在小鼠股動脈周圍放置非壓縮性血管周圍套嚢組成(Quax等Circulation103:562-569，2001)。已經(jīng)證實可以由適合于控制藥物遞送的聚合物制品構(gòu)建非壓縮性血管周圍套嚢(Pires等Biomaterials26:5386-5394，2005)。這類新的洗脫藥物的聚合物套嚢同時誘導可再現(xiàn)的內(nèi)膜超常增生和允許藥物受限地遞送至套嚢的血管節(jié)段。在當前的研究中，施用這些洗脫藥物的套嚢以便評價TR3-激動劑對新內(nèi)膜形成的局部作用。材料和方法SMC培養(yǎng)物從胯帶動脈中移出人SMC。在包含10%(v/v)胎牛血清(FBS)與青霉素和鏈霉素(Invitrogen)的DMEM(InvitrogenLifeTechnology,Breda，荷蘭)中培養(yǎng)細胞。使用第5-7代的細胞。使用定向于oc-肌動蛋白(1A4，DAKO)的平滑肌單克隆抗體表征SMC并且顯示均勻的原纖維染色。為了測定細胞存活率，用PBS洗滌細胞且隨后在有0.5-mg/ml3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物(MTT;SigmaDiagnostics,St.Louis)存在下的培養(yǎng)基中孵育。2小時后，棄去培養(yǎng)基，將甲月替晶體溶于異丙醇并且在590nm處測定光密度。通過在含有O.25mM星形抱菌素(Sigma)的培養(yǎng)基中將細胞孵育24小時誘導編程性細胞死亡。隨后固定SMC，用Hoechst染料染色并且測定凋亡細胞核的相對數(shù)量。轉(zhuǎn)染實驗和螢光素酶測定使用Amaxa法(Amaxa，德國)與用于SMC的nucleofector試齊，J對細胞進行電穿孔。在每一轉(zhuǎn)染中，使用0.5-1.0x106個細胞和3.5pgNur77-報道質(zhì)粒與1.5jugRenilla螢光素酶質(zhì)粒(包含胸苷激酶啟動子)校準細胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率。NUR77-報道質(zhì)粒包含P0MC-啟動子的Nur效應元件(NurRE)，其中使用P0MC基因的-34/+63最小啟動子進行一式三份實驗。"轉(zhuǎn)染后24小時后，將細胞與6-MP(Sigma)—起孵育24小時并且使用雙重螢光素酶報道系統(tǒng)(Promega，Madison,WI)檢測螢光素酶活性。腿合成測定將SMC以每孔1-4x104個細胞接種在24孔平板中并且在24小時后達到60°/。-70%匯合率。通過在不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中孵育24小時使SMC靜止。將6-MP溶于二甲亞砜并且在FBS刺激前應用1小時。使用10%(v/v)FBS將SMC刺激24小時且隨后用0.25uCi/孔[甲基」H]胸脊(AmershamBiosciences,Buckinghamshire,UK)將細胞標記18小時。在4"C下使用10。/。(w/v)三氟乙酸將摻入的放射性沉淀30分鐘，用5W(w/v)三氟乙酸洗滌兩次并且溶于0.5NNa0H(0.5mL/孔)。通過液體閃爍計數(shù)測定結(jié)合的[311]胸苷。si飄實驗4吏用下列小干擾(si)RNA序列Nur77siRNA，5'-CAGUCCAGCCAUGCUCCUCdTdT-3',如上所述2°;和對照組siRNA，5'-CAGACGAGCCUUGCUCGUCdTdT-3'(AfflbionInc.,Austin,Texas)。使用用于SMC(Amaxa)的Nucleofector試劑，如每一制造商的建議將5siRNA轉(zhuǎn)染入0.5-1x105SMC。在轉(zhuǎn)染后5天使用完全mRNA小量制備試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA)分離總mRM。隨后使用iScriptcDNA合成試劑盒(Biorad，Hercules,CA)進行隨后的cDNA合成。使用SYBR綠色混合物(Biorad)在MyIQSystem(Biorad)中進行實時聚合酶鏈反應(PCR)。用于Nur77的引物如下(正向)5,一GTTCTCTGGAGGTCATCCGCAAG-3'和(反向)5'-GCAGGGACCTTGAGAAGGCCA-3'。作為等量的用于不同樣品中第一鏈cDNA對照組，我們校準了使用如下引物測定的核糖體磷蛋白(P0)mRNA水平(正向)5'-TCGACAATGGCAGCATCTAC-3,和波向)-ATCCGTCTCCACAGACAAGG-3,。藥物洗脫套嚢如上所述生產(chǎn)基于聚(s-己內(nèi)酯)的藥物遞送套嚢(Pires等Biomaterials26:5386-5394，2005)。簡言之，將6-MP以不同濃度溶于摻合的熔化藥物-聚合物混合物并且將套嚢設計成可置于小鼠股動脈周圍。使藥物洗脫套嚢成形為可縱向切割的圓柱體，它具有0.5mm內(nèi)徑，l.Omm外徑，2.0mm長和約5.0mg重給藥物洗脫套嚢加載0.5。/。(w/w)和l%(w/w)6-MP，并且如上所述將體外釋放特性測定4周期限(n-5/組)。6-MP表現(xiàn)出持續(xù)和劑量依賴性釋放。在4周時的總體釋放為對0.5%和1%6-MP-洗脫套囊而言分別為11.3±2.3ng(46.3%)和30.0±3.5jag(58.7%)。股動脈套嚢鼠模型所有動物的操作均得到AMC公共管理當局批準并且在承諾荷蘭政府頒布的指導方針的條件下進行。將在FVB背景下的野生型FVB小鼠(Wt)，表達全長Nur77基因(Nur77)的轉(zhuǎn)基因小鼠或表達Nur"的顯性失活變體(ATA)的小鼠(后兩種品系在SM22ot啟動子控制下，它指導對SMC具有特異性的轉(zhuǎn)基因的表達)用于實驗。給雄性10-12周齡小鼠飼喂標準膳食。在手術時，用腹膜內(nèi)注射5mg/kg多美康(Roche，Basel,Switzerland),0.5mg/kgDormitor(Orion,Helsinki,Finland)和0.05mg/kg芬太尼(Janssen，Geel，比利時)麻醉小鼠。從其環(huán)境中剖離股動脈并且用非壓縮性套嚢松弛套住。使用對照組空套嚢或6-MP洗脫套嚢(0.5%或1%w/w)(n-6/組)。套囊的小鼠股動脈中的Nur77(TR3)mRNA表達雄性Wt小鼠如上所述進行股動脈套嚢放置。對每一時間點使用4只小鼠在手術后的不同時間點處死動物(O，6，24,48，72小時和7天)。分離股動脈，收集并且速凍。使用RNeasyFibrousTissueMini-Kit(Qiagen，Venlo，荷蘭)，按照制造商的方案分離總RNA。使用立即可除掉的(立即可除掉的)RT-PCR珠(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)由所有的RNA樣品制備cDNA。使用PrimerExpress1.5(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)設計內(nèi)含子跨越引物和探針以便與鼠Nur77cDNA雜交(有義5'-GGGCATGGTGAAGGAAGTTGT-3。反義-AGGCTGCTTGGGTTTTGAAG-3,;探針5'-CCGCCCTTTTAGGCTGTCTGTCCG-30。檢測次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)以便校準cDNA輸入。對每一時間點而言，按照一式兩份進行RT-PCR。將數(shù)據(jù)提供為受損血管中超過非損傷血管中的Nur77mRNA表達的誘導倍數(shù)。套嚢的股動脈中內(nèi)膜損害的定量和組織學評價在套嚢放置后28天時處死超表達Wt和Nur77的轉(zhuǎn)基因小鼠，而在手術后14天時處死ATA轉(zhuǎn)基因小鼠。打開胸腔并且通過心臟穿刺將使用在O.9%(w/v)NaCl中4W(v/v)福爾馬林的適度壓力灌注(100mmHg)進行5分鐘。在灌注后，收集股動脈，在4i(v/v)福爾馬林中固定過夜，脫水并且用石蠟包埋。在套嚢的股動脈全長中遍在使用用于組織學分析的連續(xù)橫切片(5juM厚)。對所有樣品用蘇木精-焰紅染料-藏紅花(HPS)進行常規(guī)染色。將Weigert氏彈性蛋白染色用于顯現(xiàn)彈性層。在所有小鼠中使用IO個等距的橫切片以便對內(nèi)膜損害進行定量。使用影像分析軟件(LeicaQwin，Wetzlar，德國)測定外與內(nèi)彈性層之間的全部橫切片中層面積；測定內(nèi)皮細胞單層與內(nèi)部彈性層之間的全部橫切片內(nèi)膜面積。統(tǒng)計學分析將體外實驗至少重復兩次并且表示為平均值士SD且通過斯氏t-檢驗分析。將動物實驗列為平均值±SEM并且使用曼-懷二氏U-檢驗分析(用于Windows的SPSS11.5)。將P-值小于0.05視為具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果6-MP促進培養(yǎng)的SMC中的Nur77(TR3)活性為了研究6-MP是否增加血管細胞中Nur77的轉(zhuǎn)錄活性，用編碼Nur77的慢病毒轉(zhuǎn)導人SMC，導致在85-90°/。感染細胞中表達并且Nur77mRNA水平比模擬感染的SMC增加(數(shù)據(jù)未顯示)。轉(zhuǎn)導的SMC的免疫熒光揭示出位于核中的Nur77蛋白質(zhì)的超表達(數(shù)據(jù)未顯示)。隨后用包含回文NurRE(來自P0MC-啟動子的Nur77應答元件)序列(TGATATTTn6AAATGCCA)的螢火蟲螢光素酶報道構(gòu)建體對超表達Nur77的SMC進行電穿孔，以便監(jiān)測Nur77的轉(zhuǎn)錄活性與作為對照組的胸苷激酶-renilla螢光素酶構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染效率。SMC與50yM6-MP—起醉育24小時導致Nur77活性增加IO-倍(圖11)。這些數(shù)據(jù)清楚地表明激動劑6-MP強烈地促進培養(yǎng)的SMC中的Nur77(TR3)活性。6-MP抑制SMC增殖涉及Nur77(TR3)為了研究6-MP是否調(diào)節(jié)SMC增殖，我們研究了培養(yǎng)的人SMC在有增加濃度的6-MP存在下的DNA合成。正如預計的，6-MP抑制SMC中的DNA合成(圖12A)。為了評價在該過程中Nur77的具體貢獻，通過在人SMC中的小干擾(si)RNA擊倒Nur77表達。使用定向于NurH的siRNA或使用對照組siRNA轉(zhuǎn)染導致在siNur77轉(zhuǎn)染細胞中FBS誘導的Nur77mRNA水平減量調(diào)節(jié)，正如通過實時RT-PCR測定的(圖12B)。在被基因-特異性siRM擊倒Nur77的細胞中[3H]胸苷摻入顯著高于用對照組siRNA轉(zhuǎn)染的SMC。為了顯現(xiàn)6-MP對用siNur77RNA或用對照組siRNA轉(zhuǎn)染的SMC中的DNA合成的作用，我們將[3H]胸苷摻入表示為占對照組條件的百分比(圖12C)。在用對照組siRNA轉(zhuǎn)染SMC時，DNA合成受到6-MP抑制61%,而6-MP在用Nur77-特異性siRNA轉(zhuǎn)染的SMC中的作用明顯較低，因為僅觀察到了4"/。的DNA合成抑制。這些數(shù)據(jù)清楚地表明6-MP至少部分通過Nur77活化抑制SMC中的MA合成。6-MP的剩余作用可以歸因于殘留的Nur77活性和/或6-MP介導的Nurrl和/或NOR-1活化。6-MP對SMC無細胞毒性并且不會誘導編程性細胞死亡為了驗證P-MP是否為細胞毒性的，將靜止的SMC與增加濃度的6-MP—起孵育24小時并且使用標準MTT測定法測定細胞存活率。存活細胞數(shù)量降低作為對星形孢菌素的反應(降低35%)，而6-MP不會影響細胞存活率(圖13A)，表明在這些條件下，6-MP對人SMC無細胞毒性作用。為了研究6-MP是否誘導SMC中的編程性細胞死亡，將靜止的SMC與增加濃度的6-MP—起孵育24小時。作為陽性對照，經(jīng)證實星形孢菌素誘導SMC中的編程性細胞死亡(50%±4%)。與對照組細胞相比(4%±2%)，顯然未發(fā)現(xiàn)6-MP在這些條件下影響細胞死亡的證據(jù)(3%±2%)(圖13B)。Nur77(TR3)在新內(nèi)膜形成過程中表達為了評價NUR77(TR3)激動劑6-MP體內(nèi)對富含SMC的損害形成的潛在抑制作用，應用套嚢誘導的新內(nèi)膜形成的充分建立的鼠模型。在新內(nèi)膜形成過程中研究Nur77mRNA表達，并且如圖"中所示，在套嚢放置厚Nur77mRNA表達作為時間的函數(shù)得到增量調(diào)節(jié)并且在血管損傷后6小時表現(xiàn)出最佳表達(增加189士26-倍)。在手術后NurWmRM表達比無套嚢的模擬手術操作的血管(增加13.4±1.1-倍)提高達7天。由于Nur77mRNA轉(zhuǎn)錄物在血管損傷時嚴格依賴于條件和時間調(diào)節(jié)，所以可以想像Nur77在新內(nèi)膜形成過程中起作用。6-MP對套嚢誘導的野生型，Nur77和ATA轉(zhuǎn)基因小鼠的新內(nèi)膜形成的作用為了評價6-MP對套嚢誘導的套嚢新內(nèi)膜形成的作用，使用加栽了增加濃度的6-MP的藥物洗脫套嚢，它能夠?qū)⒂邢薜木植垦苤車幕衔镞f送值套嚢的血管節(jié)段。最初在野生型(Wt)動物和表達動脈血管壁中全長Nur77cDNA的轉(zhuǎn)基因小鼠中評價6-MP。套嚢的股動脈節(jié)段的顯微鏡分析揭示出，4周后，在Wt和Nur77-轉(zhuǎn)基因小鼠中接受對照組空藥物洗脫套嚢的小鼠中形成同心新內(nèi)膜。接受6-MP-洗脫套嚢的動物表現(xiàn)出內(nèi)膜超常增生降低(圖15A)。形態(tài)測定分析揭示出在Wt(P-O.02)和Nur77轉(zhuǎn)基因小鼠中，在局部用(1%)6-MP濃度處理的血管節(jié)段中套嚢誘導的新內(nèi)膜形成顯著抑制(P=0.007，圖15B)。用0.5%6-MP-洗脫套嚢處理的Wt動物未表現(xiàn)出新內(nèi)膜形成降低(P=0.32)，而相同6-MP濃度基本上降低了Nur77轉(zhuǎn)基因小鼠的新內(nèi)膜形成(P-O.02)。在套嚢的股動脈中層區(qū)域中未觀察到改變(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，在內(nèi)膜/中層比的6-MP-處理的Nur77轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到類似的劑量依賴性降低；對照組套囊0.75±0.11;0.5%6-MP:0.47±0.05，(P-O.04);1%6-MP:0.30±0.06，(P-O.003)。此外，Wt小鼠套嚢的動脈的內(nèi)膜/中層比僅在l。/。6-MP套嚢中顯著下降對照組套嚢1.10±0.1P;0.5%:0.75±0.05，(P=0.15);1%:0.51±0.03，(P=0.008)。為了進一步確立Nur77在6-MP介導的對新內(nèi)膜形成的涉及的功能，將6-MP-洗脫套嚢放置在表達抑制所有三種Nur77-類因子活性的Nur77顯性失活變體(ATA)的轉(zhuǎn)基因小鼠股動脈周圍。預先證實富含SMC的損害在(TA轉(zhuǎn)基因小鼠頸動脈連接后發(fā)展得較快。在具有這些數(shù)據(jù)的品系中，在本研究中觀察到了在最新應用的股動脈套嚢中損害形成增強，在4周內(nèi)幾乎產(chǎn)生完全閉塞性損害(數(shù)據(jù)未顯示)。為了可靠地評價6-MP-洗脫套嚢在(TA轉(zhuǎn)基因小鼠中的作用，我們在2周后分析了新內(nèi)膜形成(圖15A)。對內(nèi)膜區(qū)域的形態(tài)測定分析揭示出6-MP在(TA轉(zhuǎn)基因小鼠中的局部遞送不會改變中層的厚度并且對新內(nèi)膜形成均無顯著作用，既未出現(xiàn)在0.5°/。(P=0.46)，也未出現(xiàn)在""P-0.37)6-MP套嚢中(圖150。這些數(shù)據(jù)共同出現(xiàn)在具有體外觀察結(jié)果的品系中并且證實6-MP抑制套嚢誘導的涉及Nur77活化的新內(nèi)膜形成。由此證實6-MP對NUR77(TR3)活性的促進抑制了SMC增殖并且防止了富含SMC的損害形成。這些觀察結(jié)果清楚地表明核受體Nur77(TR3)為預防(支架內(nèi))再狹窄的潛在靶標。結(jié)論總之，已經(jīng)證實Nur77在套嚢誘導的新內(nèi)膜形成過程中的小鼠中高度表達，但在鼠模擬手術操作動脈中沒有此現(xiàn)象。此外，清楚地表明6-MP活化Nur77降低人SMC增殖并且防止可小鼠再狹窄模型中的新內(nèi)膜形成。6-MP或其它活化劑/激動劑對核受體Nur77的活化由此為治療(支架內(nèi))再狹窄的合理手段。實施例4C-DIM介導的TR3活化防止了小鼠過度平滑肌細胞增殖和富含平滑肌細胞的損害形成在本實施例中證實C-DIM衍生物抑制體外SMC增殖，并且描述了C-DIM在具有藥物洗脫套嚢的經(jīng)驗證的小鼠再狹窄小鼠模型中的體內(nèi)應用。在如MoroiM等所述的小鼠模型中(J.Clin.Invest.(1998)101:1225-32)，在股動脈周圍松弛放置的血管周圍套嚢誘導富含平滑肌細胞的損害形成，這種情況類似在人體內(nèi)觀察到的平滑肌細胞特異性病理情況。這種模型適合于藥物洗脫套嚢，由此暗示了藥物洗脫支架。C-DIM可逆地于這些套嚢結(jié)合并且通過手術操作評價在損害形成中的作用。本實驗使用野生型，TR3和dTA轉(zhuǎn)基因小鼠進行。有關C-DIM衍生物的藥理學和毒性的廣泛知識為可得到的。材料和方法SMC培養(yǎng)從臍帶動脈中移出人SMC。在包含10%(v/v)胎牛血清(FBS)與青霉素和鏈霉素(Invitrogen)的腿M(InvitrogenUfeTechnology,Breda，荷蘭)中培養(yǎng)細胞。使用第5-7代的細胞。使用定向于ot-肌動蛋白(1A4，DAKO)的平滑肌單克隆抗體表征SMC并且顯示均勻的原纖維染色。為了測定細胞存活率，用PBS洗滌細胞且隨后在有0.5-mg/ml3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物(MTT;SigmaDiagnostics,St.Louis)存在下的培養(yǎng)基中孵育。2小時后，棄去培養(yǎng)基，將甲月替晶體溶于異丙醇并且在590認處測定光密度。通過在含有o.25jjM星形抱菌素(Sigma)的培養(yǎng)基中將細胞孵育24小時誘導編程性細胞死亡。隨后固定SMC，用Hoechst染料染色并且測定凋亡細胞核的相對數(shù)量。DNA合成測定將SMC以每孔1-4x104個細胞接種在24孔平板中并且在24小時后達到60%-70%匯合率。通過在不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中孵育24小時使SMC靜止。將6-MP溶于二甲亞砜并且在FBS刺激前應用1小時。使用10%(v/v)FBS將SMC刺激24小時且隨后用0.25uCi/孔[甲基-3H]胸普(AmershamBiosciences,Buckinghamshire,UK)將細胞標記18小時。在4X:下使用1(^(w/v)三氟乙酸將摻入的放射性沉淀30分鐘，用5。/。(w/v)三氟乙酸洗滌兩次并且溶于0.5NNa0H(0.5mL/孔)。通過液體閃爍計數(shù)測定結(jié)合的[3H]胸苷。siRNA實驗使用如下小干擾RNA(siRNA)序列Nur77siRNA，5'-CAGUCCAGCCAUGCUCCUCdTdT-3'，如上所述20;和對照組siRM，5'-CAGACGAGCCUUGCUCGUCdTdW(AmbionInc.，Austin,Texas)。使用用于SMC的Nucleofector試劑(Amaxa)，根據(jù)每個制造商的推薦將每個5iug的siRNA轉(zhuǎn)染入0.5-1x106個SMC。在轉(zhuǎn)染后5天使用完全mRNA小量制備試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA)分離總mRNA。隨后j吏用iScriptcDNA合成試劑盒(Biorad，Hercules,CA)進行隨后的cDNA合成。使用SYBR綠色混合物(Biorad)在MyIQSystem(Biorad)中進行實時聚合酶鏈反應(PCR)。用于Nur77的引物如下(正向)5,_GTTCTCTGGAGGTCATCCGCAAG-3'和(反向)5'"GCAGGGACCTTGAGAAGGCCA-3'。作為等量的用于不同樣品中第一鏈cDNA的對照組，我們校準了使用如下引物測定的核糖體磷蛋白(P0)mRM水平(正向)5'-TCGACAATGGCAGCATCTAC-3'和(反向)S'-ATCCGTCTCCACAGACAAGO。藥物洗脫套囊通過在70'C下將與C-DIM衍生物于聚己內(nèi)酯混合并且鑄塑成管(0.5mm內(nèi)徑，1.0mm外徑)制備C-DIM洗脫套囊。詳細描述在Pires等，Bio歸terials.2005;26:5386-94中。股動脈套囊放置所有動物的操作均得到AMC公共管理當局批準并且在承諾荷蘭政府頒布的指導方針的條件下進行。將在FVB背景下的野生型FVB小鼠(Wt)，表達全長Nur77基因(Nur77)的轉(zhuǎn)基因小鼠或表達Nur77的顯性失活變體((TA)的小鼠(后兩種品系在SM22oc啟動子控制下，它指導對SMC具有特異性的轉(zhuǎn)基因的表達)用于實驗。給雄性10-U周齡小鼠祠喂標準膳食。用腹膜內(nèi)注射咪達唑侖(12.5mg/kg體重)和Hypnorm(O.01ml/小鼠)的溶液麻醉小鼠。從周圍組織中分離左側(cè)股動脈，木>弛地套上由聚己內(nèi)酯和聚乙二醇制成的0.5mm內(nèi)徑，1.0mm外徑的2.0ram套嚢，將其松弛地置于股動脈周圍并且用6-0號縫合線適當扎緊。套囊比血管寬并且不會妨礙血流。從周圍組織中剖離右側(cè)股動脈(模擬手術)，但不放置套嚢。更換股動脈并且縫合傷口。在從麻醉中恢復后，給予動物標準膳食并且可以隨意引水。用空的，對照組套嚢或C-D頂-洗脫套嚢治療野生型小鼠TR3-或dTA-轉(zhuǎn)基因小鼠，每組中包括6只小鼠。內(nèi)膜損害的組織學評價在麻醉小鼠2-4周后，打開胸腔并且通過心臟穿刺將使用在0.9%(w/v)NaCl中3.7。/。(v/v)福爾馬林的適度壓力灌注(100隱Hg)進行10分鐘。在灌注后，收集股動脈，固定過夜并且用石蠟包埋。在套嚢的股動脈全長中遍在使用用于組織學分析的連續(xù)切片(5mM厚)。套嚢的股動脈切片中的形態(tài)定量用蘇木精/伊紅染色石蠟切片并且使用10個等距(200mm)的橫切片對內(nèi)膜損害進行定量。使用影像分析軟件(Leica，Qwin)測定外與內(nèi)彈性層之間的全部橫切片中層面積。還測定了內(nèi)皮細胞單層與內(nèi)部彈性層之間的全部橫切片內(nèi)膜面積。統(tǒng)計學分析使用SPSS,version10.0.5軟件進行統(tǒng)計學分析。將實驗值表示為平均值SEM。通過使用曼-懷二氏2尾U檢驗確定差異的顯著性并且表示為概率值。結(jié)果C-DIM-衍生物抑制SMC增殖為了研究C-DIM是否調(diào)節(jié)SMC增殖，我們通過[力]胸苷摻入測定法研究了培養(yǎng)的人SMC在有增加濃度的C-DIM-H，C-DIM-0CH3或C-DIM-CF3存在下的DM合成。所有三種C-DIM均以劑量依賴性方式抑制SMC中的DNA合成(圖16)。C-DIM-H的有效性低于C-DIM-0CH3和C-DIM-CF3。C-DIM-衍生物和平滑肌細胞存活率胞毒性的，將靜止的SMC與增加濃度的C-DIM化合物一起孵育24小時并且使用標準MTT測定法測定細胞存活率。C-DIM-H和C-DIM-0CH3在20yM下適度降低了細胞的細胞存活率，而在C-DIM-H和C-DIM-OCH3達10jiM時觀察到在細胞存活率方面無顯著性下降(圖17)。為了研究C-DIM是否誘導SMC中的編程性細胞死亡，將靜止的SMC與終濃度為10juM的C-DIM—起孵育24小時。作為陽性對照，證實星形孢菌素誘導SMC中的編程性細胞死亡。與對照組細胞相比，顯然未發(fā)現(xiàn)C-DIM在這些條件下影響細胞死亡(圖18)。C-DIM-0CH3抑制SMC增殖涉及TR3為了評價TR3在C-DIM-0CH3介導的SMC增殖抑制中的具體貢獻，通過在人SMC中的小干擾(si)RNA擊倒TR3表達。使用定向于TR3的siRNA或使用對照組siRM轉(zhuǎn)染導致在siTR3轉(zhuǎn)染細胞中FBS誘導的TR3mRNA水平減量調(diào)節(jié)，正如通過實時RT-PCR測定的(圖12B)。為了揭示出C-DIM-0CH3對用siTR3RNA或用對照組siRNA轉(zhuǎn)染的SMC中的DNA合成的相對作用，我們將rH]胸苷摻入表示為占對照組條件的百分比(圖19)。在用對照組siRNA轉(zhuǎn)染SMC時，DNA合成受到C-DIM-0CH3抑制49.7%，而C-DIM-0CH3在用TR3-特異性siRM轉(zhuǎn)染的SMC中的作用明顯較低，因為僅觀察到了40.1%的DNA合成抑制。這些數(shù)據(jù)清楚地表明C-DIM-OCH3至少部分通過TR3活化抑制SMC中的DNA合成。最可能的情況是，Nurrl也涉及C-DIM-0CH3介導的作用，并且NOR-1也可能涉及這一作用，從而解釋了為何在TR3擊倒后C-DIM-0CH3作用的未完全抑制。C-DIM對套嚢誘導的野生型，TR3和ATA-轉(zhuǎn)基因小鼠中富含平滑肌細胞的損害形成的作用在來自用空的，對照組套囊治療的小鼠中，TR3小鼠表現(xiàn)出左側(cè)股動脈中富含平滑肌細胞的損害形成低于野生型小鼠。DTA小鼠發(fā)生富含平滑肌細胞的損害高于野生型小鼠，這種情況出現(xiàn)在已知dTA為TR3，MINOR和NOT的顯性失活抑制劑的品系中。使用C-DIM-洗脫套嚢治療的TR3-小鼠再次發(fā)生的損害小于空套嚢治療的TR3小鼠。此外，在野生型小鼠中，因套嚢中摻入了DIM而導致?lián)p害尺寸較小。相反，對空套嚢和C-DIM-洗脫套嚢而言，dTA小鼠中的損害形成程度類似。預計到了后面的結(jié)果，因為在dTA小鼠中，內(nèi)源性和轉(zhuǎn)基因TR3樣因子的活性受到阻斷。這些數(shù)據(jù)清楚地表明C-DIM衍生物以TR3樣因子依賴性方式抑制富含平滑肌細胞的損害形成。實施例5在動脈粥樣硬化損害巨噬細胞中表達的核受體Nur77，Nurrl和NQR-1降低脂質(zhì)荷載和炎癥應答在本實施例中首次證實，所有三種NR4A家族成員Nur77，Nurrl和N0R-1均在人動脈粥樣硬化損害巨噬細胞中表達，并且證實這些因子降低氧化的低密度脂蛋白(ox-U)L)攝取并且抑制對炎性刺激物在人巨噬細胞中的炎癥應答。材料和方法人纟且織才羊品按照人AcademicMedicalCenter,Amsterdam的MedicalEthicsCommittee批準的方案，從告知許可的器官供體中獲得組織樣品。用石蠟包埋樣品，切片并且固定在玻璃載玻片(Superfrost-Plus，Emergo)上。通過使用對SMC和巨噬細胞具有特異性的抗體的免疫組織化學表征血管樣品,以便按照AmericanHeartAssociationclassification確立疾病的階段。免疫組織化學和雙重原位免疫組織化學在人血管樣品中用單克隆抗體Ham56(DAKO)檢測巨噬細胞并且用定向于平滑肌ct-肌動蛋白的單克隆抗體1A4(DAK0)檢測SMC?？筃ur77(M-210,SantaCruzBiotechnology)，抗Nurr1(M-196，SantaCruzBiotechnology)和抗N0R-1用于檢測NR4A核受體。筒言之，在去石蠟化和內(nèi)源性過氧化物酶猝滅后，進行檸檬酸鹽抗原提取，隨后用l%(w/vol)牛血清清蛋白，l°/。(vol/vol)正常山羊血清和0.5%Triton-X100進行封閉和透化并且在4X:下進行初級抗體孵育過夜。在生物素標記的山羊抗兔IgG二次抗體(DAKO)孵育，隨后鏈霉抗生物素-HRP(DAK0)后，應用AEC(Sigma)檢測。在單獨二次抗體孵育后的染色用作陰性對照?；旧先缟纤鰧嵤┓派湫曰?特異性原位雜交和巨噬細胞特異性免疫組織化學的組合。就原位雜交而言，合成下列核糖核酸探針Nur77，GenBankNo.L13740,bp1221-1905;Nurrl，GenBankNo.X75918,bp119-1003和NOR-l，GenBankNo.U12767,bp1435-2172。在雜交后，如上所述使用免疫組織化學檢測巨噬細胞，隨后對每一基因檢測匹配的有義核糖核酸探針并且證實既未得到背景，也未得到非特異性信號。將切片暴露4-8周。用蘇木精復染所有載玻片并且將它們包埋在glycergel(恵0)中。細胞培養(yǎng)初級人單核細胞/巨噬細胞分離自獲自Dutch中心血庫Sanquin的血液供體的血沉棕黃層。通過菲科帕克(PharmaciaBiotech)梯度離心分離，單核細胞-陰性選擇試劑盒(Dynal)和粘著介導的純化后，以0.5-lxl(^個細胞/ml的密度將細胞培養(yǎng)48小時，此后進行實驗。在RPMI1640，10%(vol/vol)胎牛血清和100U/ml青霉素/鏈霉素(GIBC0-BRL)中培養(yǎng)人單核THP-1細胞(ATCC)。以0.5xl(T個細胞/ml的密度將細胞在12孔平板鋪板，借助于PMA(10Gng/ml)分化成巨噬細胞48小時。在分化后，用PBS將細胞洗滌兩次并且使其生長在培養(yǎng)基中24小時。所用的試劑為PMA(Sigma)，LPS(Sigma)，重組人TNFoc(R&D)和Dil標i己的ox-LDL(Intrace卜RP-173)。慢病毒載體構(gòu)建和純化將hNur77cDNA(GenBankD49728，bp8-1920)克隆入pRRl-cPPt-PGK-PreSIN載體(PGK-Nur77)的Xbal-Ndel位點。將hNurrlcDNA(GenbankX75918,bp73-2310)放入pRRl-cPPt-PGK-PreSIN載體(PGK-Nurrl)的Sall-Nsil位點并且將hN0R-lcDNA(GenbankD78579,bp513-2872)連入pRRl-cPPt-PGK-PreSIN載體(PGK-N0R-1)的Xbal位點，通過使用Sall-Xbal消化從表達載體pEGFP-N2(Clontech)中分離EGFPc腿構(gòu)建PGK-EGFP-PreSIN(PGK-EGFP)，隨后連入pRRl-cPPt-PGK-PreSIN載體相應的位點。通過DNA測序驗證所有的構(gòu)建體。如公知的生產(chǎn)病毒儲備溶液。簡言之，使用磷酸鈣共沉淀法將20ugPGK轉(zhuǎn)移載體，13iugpMDLg/pRRE，7jjgpVSV-g和5mgpRSV-REV共-轉(zhuǎn)染入180cm2HEK293T細胞。在轉(zhuǎn)染后48小時和72小時時收集條件培養(yǎng)基，通過0.45jjM濾膜過濾并且通過超速離心濃縮(20.000rpm,2小時，4'C)。通過使用連續(xù)稀釋的病毒濃縮物轉(zhuǎn)導HEK293細胞測定病毒滴度，在轉(zhuǎn)導后48小時，從這些細胞中分離總基因組DNA并且使用PCR分析，應用pRRl-cPPt-PGK-PreSIN載體作為校準標準品測定栽體DNA拷貝數(shù)(正向引物5'-GTGCAGCAGCAGAACAATTTG-3'，反向引物-CCCCAGACTGTGAGTTGCAA-3,)。慢病毒感染在有10jagr/mlDEAE-葡聚糖與重組慢病毒存在下以3的感染復數(shù)將THP-1轉(zhuǎn)導24小時。取空(模擬)和EGFP慢病毒作為takenalong對照品。在轉(zhuǎn)導后，在混懸液中培養(yǎng)細胞72小時，使其分化成巨噬細胞并且如上所述培養(yǎng)。通過流式細胞測量分析(EGFP)和免疫熒光檢驗Nur77，Nurrl，廳-l和EGFP的超表達(圖16)。簡言之，用4%(w/vol)低聚甲醛PBS將在玻璃上培養(yǎng)的細胞固定20分鐘并且使用0.5%(vol/vol)Triton-X-100進行透化處理。用分別用于檢測Nur77,Nurrl和N0R-1的抗Nur77(M-210，SantaCruzBiotechnology),抗Nurrl(M-196，SantaCruzBiotechnology)和抗腿一l,隨后用AlexaFluor488綴合的山羊抗兔IgG或AlexaFluor568綴合的驢抗山羊IgG(MolecularProbes)染色細胞。用Hoechst染色核。RNA和蛋白質(zhì)分析使用RNA完全小量制備試劑盒(Stratagene)提取總RM。使用iScriptcDNA合成涉及(Biorad)制備cDNA并且使用iQSYBR-GreenSuper-Mix在MyiQRT-PCR系統(tǒng)(Biorad)中進行半定量實時RT-PCR。如下設計用于Nur77，Nurrl，NOR-l，清除受體-A(SR-A)，CD36，巨噬細胞炎性蛋白-lot(MIP-lcc)和-lP(M1P-1P)，MCP-l，IL-8,IL-lP，IL-6和核糖體蛋白質(zhì)P0的特異性引物；Nur77:Fw:5'-gttctctggaggtcatccgcaag-3'Rv:-gcagggaccttgagaaggcca-3'Nurrl:Fw:-tattccaggttccaggcgaa-3'Rv:5'-gctaatcgaaggacaaacag-3'NOR-1:Fw:5'-ccaagccttagcctgcctgtc-3'Rv:5'-agcctgtcccttactctggtgg-3'IL-1p:Fw:5'-tggcagaaagggaacagaaagg-3'Rv:5,-gtgagtaggagaggtgagagagg-3,IL-6:Fw:5'-tgtagccgccccacacag-3'Rv:5'-gctgctttcacacatgttactcttg-3'IL8:Fw:5'-ctgcgccaacacagaaatta-3'Rv:-attgcatctggcaaccctac-3'M1P-1卩Fw:5'-gcgtgactgtcctgtctctcc-3'Rv:5'-accacaaagttgcgaggaagc-3'MIP-la:Fw:5,-acgggcagcagacagtgg-3'Rv:5'-ggcgtgtcagcagcaagtg-3'MCP-1:Fw:5'-cctagctttccccagacacc-3'Rv:5'-cccaggggtagaactgtgg-3'SR-A:Fw:5,-ctcgctcaatgacagctttgcttc-3Rv:5'-tcgtttcccacttcaggagttgag-3,CD36:Fw:5'-gagaactgttatggggctat-3'Rv:5'-ttcaactggagaggcaaagg-3'P0:Fw:5'-tcgacaatggcagcatctac-3'Rv:5'-atccgtctccacagacaagg-3'對官家基因核糖體蛋白質(zhì)PO校準所有的RT-PCR數(shù)據(jù)。通過BDTMCytometricBeadArray,按照制造商的方案測定細胞培養(yǎng)物上清液中IL-8，IL-1P和IL-6的蛋白質(zhì)水平。一式兩份進行實驗并且至少重復兩次。脂質(zhì)加載，定量和顯微鏡檢查在慢病毒感染后，用Dil標記的ox-LDL將THP-l衍生的巨噬細胞處理所示的時間期限，隨后用PBS洗滌兩次并且在純的異丙醇中裂解。在聲處理和10分鐘離心(13000g)后，通過熒光測定法測定上清液。為了進行共焦顯微鏡檢查，在玻璃上培養(yǎng)細胞并且用Dil標記的ox-LDL處理。一式兩份進行實驗并且至少重復兩次。統(tǒng)計學分析進行斯氏t-檢驗。在對對照組校準后計算誘導倍數(shù)和百分比。結(jié)果Nur77，Nurrl和N0R-1在人動脈粥樣石更化損害巨噬細胞中表達在上述研究中，證實動脈粥樣硬化損害中SMC和Ecs中Nur77，Nurrl和N0R-1的表達。在本研究中，通過合并巨噬細胞特異性免疫染色與基因-特異性原位雜交證實Nur77，Nurrl和N0R-1在動脈粥樣硬化損害巨謹細胞中的表達。通過按照AmericanHeartAssociation指導原則的免疫組織化學表征8個不同器官供體的主動脈樣品(3位男性和5位女性，年齡40-69歲)(表2;圖20A，B和21A,B)。所分析的損害復雜性的范圍在II-VI級。對損害巨噬細胞和SMC中Nur77，Nurrl和NOR-1的mRNA表達水平評分并且顯示了損害中表達的特異性定位。作為早期損害的典型實例，顯示了具有所有三種核受體在巨噬細胞中高度mRNA表達水平的II型損害(圖20，C-H;表2中的t)。Nur77，Nurrl和N0R-1的蛋白質(zhì)表達定位于富含巨噬細胞區(qū)域中的核并且與mRNA表達模式相差無幾(圖21,A-E;表2中的W。值得注意的是，在復雜的損害中，顯性巨噬細胞特異性表達定位于不同損害區(qū)域，尤其是定位于肩區(qū)和培養(yǎng)基中浸潤的巨噬細胞?；罨某跫壢司奘杉毎蚑HP-1衍生的巨噬細胞表達Nur77，Nurrl和N0R-1動脈粥樣硬化損害巨噬細胞中NR4A因子的高度表達水平促使我們研究其表達是否依賴于通常在這些患病區(qū)域中遇到的炎癥條件。此外，在體外研究中測定了這些轉(zhuǎn)錄因子的功能活性。通過半定量實時RT-PCR和對炎癥刺激的反應的免疫熒光檢測Nur77，Nurrl和N0R-1在初級單核細胞/巨噬細胞以及PMA-處理的THP-1衍生的巨噬細胞中的表達。LPS顯著誘導所有三種核受體在初級單核細胞/巨噬細胞(來源于2種不同供體)中的mRNA表達水平并且它們在刺激后2小時由TNFoc適度誘導(圖22A)。類似地，在THP-1衍生的巨噬細胞中，在刺激后2小時Nur77，Nurrl和N0R-1受到強烈誘導(50-150倍)作為對LPS的反應并且低-中度誘導(3-6倍)作為對TNFa的反應。Nur77和Nurr1表達在1小時時最佳，而NOR-lmRNA誘導在TNFa刺激后3小時最佳(圖22B)。制作時程mRNA表達曲線并且顯示所有三種轉(zhuǎn)錄因子作為對LPS和TNFa刺激的反應的瞬時誘導(圖22C)。免疫熒光分析揭示出在定位于核的LPS刺激后6小時早期的NOR-1蛋白質(zhì)表達(圖22D)。Nur77，Nurrl和NOR-1的慢病毒超表達降低了ox-LDL脂質(zhì)加載為了研究Nur77，Nurrl和NOR-l在巨噬細胞中的功能，用表達這些因子的慢病毒或?qū)φ战M模擬病毒感染THP-1細胞并且測定對脂質(zhì)加載，即動脈粥樣硬化標志的作用。由重組慢病毒超表達的Nur77，Nurrl和N0R-1產(chǎn)生了80-90%的轉(zhuǎn)導效率和編碼的蛋白質(zhì)的核定位(圖23)。通過熒光測定法對Dil標記的ox-LDL攝取進行定量。在超表達NR4A因子的巨噬細胞中，3-6小時后存在脂質(zhì)攝取已經(jīng)降低的趨勢，其中24小時后降低超過30%(圖24A)。進行共焦顯微鏡檢查以便評價Dil標記的ox-LDL在巨噬細胞中的細胞定位。在24小時后，Dil-熒光定位于脂質(zhì)空泡并且熒光強度在超表達Nur77的巨噬細胞中比模擬-慢病毒感染的細胞中低(圖24B)。因為SR-A和CD36為涉及改進的脂蛋白攝取的重要基因，通過半定量實時RT-PCR測定這些基因的mRNA表達水平。超表達Nur77，Nurr1和N0R-1的THP-1巨噬細胞表達顯著低于模擬病毒感染的細胞的SR-A和CD36水平(圖24C)。Nur77，Nurrl和N0R-1的慢病毒超表達降低炎性趨化因子和細胞因子表達接下來檢測慢病毒介導的Nur77，Nurrl和NOR-1超表達對趨化因子-和細胞因子-mRNA表達和分泌蛋白質(zhì)濃度的作用(圖25)。在使用LPS，TNFa或載體刺激后，通過半定量實時RT-PCR測定趨化因子MIP-1ot和-lP，MCP-l和IL-8和促炎細胞因子IL-1P和IL-6的mRNA水平(圖25A)。作為用于LPS和TNFa活性的對照組，檢測模擬感染的巨噬細胞中的mMA水平(圖25A)。除TNFot刺激后不可檢測到的IL-6表達(ND)外，這些炎性基因的mRM表達水平被LPS誘導20-8000倍并且被TNFa誘導3-10倍。這些分析的趨化因子和細^^子在LPS和TNFa刺激后的超表達Nur77，Nurrl或N0R-1的THP-1-巨噬細胞中比在模擬感染的細胞及其未刺激的對照組中的mRM水平明顯下降(2-10倍)。作為例外，MCP-1mRNA表達被超表達NOR-1的巨噬細胞中的TNFa誘導2.5倍并且在超表達Nurrl的細胞中與模擬感染的細胞中相比無顯著性差異。除所述的mRNA結(jié)果外，我們還測定了IL-8，IL-1P和IL-6(圖25B)在慢病毒-感染的THP-1巨噬細胞的條件培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)濃度。在用LPS處理后0，6和24小時時收集條件培養(yǎng)基并且通過BDTM細胞計數(shù)珠粒陣列(CytometricBeadArray)測定蛋白質(zhì)濃度。Nur77，Nurrl或N0R-1的超表達導致THP-1巨噬細胞的LPS誘導的IL_8，IL-1P和IL-6分泌顯著降低，但N0R-1超表達情況中的IL-8除外。表2:Nur77，Nurrl和N0R-1的供體特征和mRNA表達分布<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>M:男性；F:女性；yrs:歲；AHA:AmericanHeartAssociationClassification;+:低表達，++:中度表達，+++:高度表達；f:圖20中所示；％:圖21中所示。實施例6C-DIM-洗脫套嚢在預防小鼠動脈粥樣硬化損害(包含平滑肌細胞和炎性細胞)形成在的應用TR3,MINOR和NOT在人動脈粥樣硬化損害中的平滑肌細胞，內(nèi)皮細并且還在巨噬細胞亞型中表達。此外，TR3，MINOR和NOT的表達在培養(yǎng)的巨噬細胞，既包括初級人巨噬細胞，也包括單核細胞/巨噬細胞細胞系THP-1活化時受到強烈促進。我們已經(jīng)證實TR3樣因子抑制細胞因子釋放并且降低活化的巨噬細胞的脂質(zhì)加栽且由此可以界定動脈粥樣硬化損害形成。為了分析C-DIM-化合物對包含巨噬細胞的動脈粥樣硬化損害形成的作用，如實施例3和4中所述進行類似的實驗，但應用ApoE〃—或ApoE,3萊頓小鼠。使ApoE+或ApoE*3萊頓小鼠接觸富含膽固醇的膳食且隨后將血管周圍套嚢放置在股動脈周圍，它導致加速的動脈粥樣硬化。在2-4周內(nèi)，在套嚢的動脈內(nèi)形成富含巨噬細胞和平滑肌細胞的損害，正如LardenoyeJ.H.等Circ.Res.(2000)87:248-53所述，材料和方法動物在這些實驗中，應用ApoE—〃小鼠或ApoE*3萊頓小鼠。將8-12周齡的小鼠在手術前4周保持富含膽固醇的高脂肪膳食以改善腸膽固醇吸收并且抑制膽汁酸合成。藥物洗脫套嚢通過在70°C下將DIM與聚己內(nèi)酯混合并且鑄塑成管制備C-DIM洗脫套嚢(O.5mm內(nèi)徑，1.0ra外徑)。詳細描述在Pires等，Biomaterials.2005/26:5386-94中。股動脈套嚢放置用腹膜內(nèi)注射咪達唑侖(12.5mg/kg體重)和Hypnorm(O.Olml/小鼠)的溶液麻醉小鼠。從周圍組織中分離左側(cè)股動脈，松弛地套上由聚己內(nèi)酯和聚乙二醇制成的0.5腿內(nèi)徑，1.0mm外徑的2.Omm套囊，將其松弛地置于股動脈周圍并且用6-0號縫合線適當扎緊。套嚢比血管寬并且不會妨礙血流。從周圍組織中剖離右側(cè)股動脈(模擬手術)，但不放置套囊。更換股動脈并且縫合傷口。在從麻醉中恢復后，給予動物富含膽固醇的高脂肪膳食并且可以隨意引水。用空的，對照組套嚢或C-DIM-洗脫套嚢治療小鼠，每組中包括6只小鼠。詳細描述在Pires等，Biomaterials.2005/26:5386-94中。內(nèi)膜損害的組織學評價在麻醉小鼠2-4周后，打開胸腔并且通過心臟穿刺將使用在0.9%(w/v)NaCl中3.7W(v/v)福爾馬林的適度壓力灌注(100mmHg)進行10分鐘。在灌注后，收集股動脈，固定過夜并且用石蠟包埋。在套嚢的股動脈全長中遍在使用用于組織學分析的連續(xù)切片(5jLiM厚)。套嚢的股動脈切片中的形態(tài)定量用蘇木精/伊紅染色石蠟切片并且使用10個等距(200mm)的橫切片對內(nèi)膜損害進行定量。使用影像分析軟件(Leica，Qwin)測定外與內(nèi)彈性層之間的全部橫切片中層面積；還測定了內(nèi)皮細胞單層與內(nèi)部彈性層之間的全部橫切片內(nèi)膜面積。使用細胞類特異性抗體顯現(xiàn)平滑肌細胞和巨喧細胞；所述檢測SMot-肌動蛋白和Mac-3(AccurateChemicals)的單克隆抗1A4(Dako，Glastrup，Denmark)分另寸用于檢測單核細胞和巨噬細胞。統(tǒng)計學分析使用SPSS,version10.0.5軟件進行統(tǒng)計學分析。將實驗值表示為平均值SEM。通過使用曼-懷二氏2尾U檢驗確定差異的顯著性并且表示為概率值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)C-DIM-衍生物在從藥物洗脫套嚢中施用時以統(tǒng)計學顯著性方式抑制動脈粥樣硬化損害形成。在C-DIM-洗脫套嚢與空套嚢中相比巨噬細胞和平滑肌細胞在損害中的貢獻降低。這些數(shù)據(jù)支持了DIM人體內(nèi)洗脫藥物的血管內(nèi)支架中的潛在應用。權利要求1.核受體TR3、MINOR和NOT中的一種或多種的激動劑在制備治療動脈粥樣硬化和與動脈粥樣硬化相關的心血管疾病的藥物中的應用。2.如權利要求1中所述的應用，其中與動脈粥樣硬化相關的心血管疾病為支架內(nèi)再狹窄、靜脈-移植物疾病、移植動脈硬化和/或動靜脈短路故障。3.如權利要求3中所述的應用，其中所述的激動劑為下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中R!、R2、R4、R5、R6、R/、R/、R/、R5'、V和R/各自獨立地選自氫、鹵素、直鏈C「d。烷基、支鏈d-d。烷基、包含1-10個碳原子的烷氧基和硝基；且Rs和V各自獨立地選自氫、直鏈d-d。烷基、支鏈C!-d。烷基、包含1-10個碳原子的環(huán)烷基和芳基。4.如權利要求3中所述的應用，其中R2、R4、R5、R6、R/、R/、R4'、R5'、Re'和R/各自為氫，且Rs和V中至少一個為支鏈烷基、環(huán)烷基或芳基。5.如權利要求3或4中所述的應用，其中Rs和Rs'各自分別為氫、甲基、C6H5、C6,、C6H4CH3、C6H4CF3、C1QH7、(:6!1^6115或C6H4OCH3。6.如權利要求5中所述的應用，其中Rs和R/之一為氫且另一個為C6H5、C6HXF3islC6H4OCH3。7.如權利要求1-6中任一項所述的應用，其中所述的治療借助于其中摻入了和/或其上涂敷了所述激動劑的支架來進行。8.如權利要求1-6中任一項所述的應用，其中所述的治療借助于血管涂層來進行。9.如權利要求8中所述的應用，其中所述的血管涂層為用于移植靜脈的套嚢形式。10.如權利要求8中所述的應用，其中所述的血管涂層為在植入前涂布在移植靜脈上并且固定在其上的液體涂層形式。11.如權利要求8中所述的應用，其中所述的涂層為包含所述激動劑的普盧蘭尼克凝膠。12.能夠洗脫核受體TR3、MINOR和NOT中的一種或多種的激動劑的醫(yī)療裝置，用于治療動脈粥樣硬化和/或與動脈粥樣硬化相關的心血管疾病。13.如權利要求12中所述的醫(yī)療裝置，其中與動脈粥樣硬化相關的心血管疾病為支架內(nèi)再狹窄、靜脈-移植物疾病、移植動脈硬化和/或動靜脈短路故障。14.如權利要求13中所述的醫(yī)療裝置，其中所述的激動劑為下式的化合物:其中Id、R2、R4、R5、R6、R/、R2'、R4'、R5'、V和R/各自獨立地選自氫、卣素、直鏈d-d。烷基、支鏈d-d。烷基、包含1-10個碳原子的烷氧基和硝基；且Rs和R/各自獨立地選自氫、直鏈d-d。烷基、支鏈C「d。烷基、包含1-10個碳原子的環(huán)烷基和芳基。15.如權利要求14中所述的醫(yī)療裝置，其中R,、R2、R"R5、R6、R/、R2'、R/、R5'、R6'和R/各自為氬，且Rs和IV中至少一個為支鏈烷基、環(huán)烷基或芳基。16.如權利要求14或15中所述的醫(yī)療裝置，其中Rs和V各自分別為氬、甲基、C6H5、C6H4OH、C6H4CH3、C6H4CF3、C10H7、C晶CJl5或C6H4OCH3。17.如權利要求16中所述的醫(yī)療裝置，其中Rs和R/之一為氫且另一個為C6H5、C品CF3或C6H4OCH3。18.如權利要求12-17中任一項所述的醫(yī)療裝置，其中在所述的醫(yī)療裝置內(nèi)摻入了和/或其上涂敷了所述的激動劑。19.如權利要求12-18中任一項所述的醫(yī)療裝置，其中所述的醫(yī)療裝置為支架。20.如權利要求12-18中任一項所述的醫(yī)療裝置，其中所述的醫(yī)療裝置為套嚢。全文摘要本發(fā)明涉及核受體TR3、MINOR和NOT中的一種或多種的激動劑在制備治療心血管疾病，特別是支架內(nèi)再狹窄和/或靜脈-移植物疾病的藥物中的應用。本發(fā)明進一步涉及涂敷了所述的激動劑或其中摻入了該激動劑并且用于治療支架內(nèi)再狹窄或靜脈-移植物疾病的醫(yī)療裝置，諸如支架和套囊。文檔編號A61F2/06GK101242830SQ200680029937公開日2008年8月13日申請日期2006年6月15日優(yōu)先權日2005年6月15日發(fā)明者C·J·M·德弗里斯,E·K·阿肯布特,H·潘尼凱克,V·德瓦德申請人:學術醫(yī)學中心