專利名稱：：針對TGFβ的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗體分子，特別是結(jié)合轉(zhuǎn)化生長因子P(TGFP)的抗體分子，及其用途。更具體而言，本發(fā)明涉及結(jié)合且優(yōu)選中和TGF01、TGFP2和TGFP3的抗體分子，即所謂的"泛特異性"抗體分子，以及此類抗體分子的用途。背景TGFp在1981年首次被鑒別(Roberts等人，1981)。在人類中存在3種同種型TGFP1、TGFP2和TGFP3(SwissProt登錄號分別為P01137、P08112和P10600)，在其生物活性狀態(tài)下，它們是25kDa同型二聚體，包括兩個通過鏈間二硫橋連接的具有112個氨基酸的單體。TGFP1與TGFP2的不同在于27,并且與TGF卩3的不同在于22，主要是保守性氨基酸改變。這些差異已在通過X射線晶體學測定的TGF卩3D結(jié)構(gòu)上作圖(Schlunegger等人，1992;Peer等人，1996)，并且已確定受體結(jié)合區(qū)域(Griffith等人，1996;Qian等人，1996)。人TGFps非常類似于小鼠TGFPs:人TGFP1與小鼠TGFp1只有l(wèi)個氨基酸的差異，人TGFp2與小鼠TGFP2只有3個氨基酸的差異，并且人TGFP3與小鼠TGFp3相同。因此，在小鼠(包括轉(zhuǎn)基因小鼠)中生產(chǎn)針對人TGFPs的抗體是困難的。TGFps是參與細胞增殖和分化、胚胎發(fā)育、細胞外基質(zhì)形成、骨發(fā)育、傷口愈合、血細胞生成以及免疫和炎癥應(yīng)答的多功能細胞因子(Border等人，1995a)。TGFPs的失調(diào)導致病理過程，這些病理過程在人中已牽涉眾多病狀，例如出生缺陷、癌癥、慢性炎癥、自身免疫和纖維化疾病(Border等人，1994;Border等人，1995b)。在許多纖維化動物模型中已使用中和抗體作為拮抗劑進行了研究(Border等人，1995b;Border等人，1994)，例如腎小球腎炎(Border等人，1990)、神經(jīng)瘢痕化(Logan等人，1994)、皮膚瘢痕化(Shah等人，1994)和肺纖維化(Giri等人，1993)。這些模型代表的所有疾病代表了未滿足的對新型治療產(chǎn)品的需要(Bonewald，1999;Jackson，1998)。然而，在這些及其他動物研究中使用的抗體已在動物中產(chǎn)生，并且它們在人中的治療益處可能是有限的，因為其具有誘導免疫原性應(yīng)答的可能性以及其具有快速的藥物代謝動力學清除(Vaughan等人，1998)。對于治療TGFP介導的疾病，人抗體是更希望的。已知各種抗體片段能夠特異地并且以良好的親和力結(jié)合靶蛋白。例如，只包含通過短肽連接體連接在一起的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的抗體片段，稱為單鏈Fv(scFv)，已被廣泛使用。中和TGFP1(CAT-192)或TGFP2(CAT-152或Trabio)的人抗體以前已產(chǎn)生(EP0945464,EP0853661，Thompson等人1999)。然而，本領(lǐng)域中可獲得的大多數(shù)TGFP抗體是非人的。此外，在本發(fā)明之前唯一針對TGFP的泛特異性(pan-specific)單克隆抗體是嚙齒類動物的。與人TGFP1和人TGFp2結(jié)合的針對中和性和非中和性表位的多克隆抗體已在兔(Danielpour等人，1989b;Roberts等人，1990)、雞(R&DSystems,Minneapolis)和火雞(Danielpour等人，1989c)中產(chǎn)生。代表了部分TGFp序列的肽也已用作免疫原來在兔中產(chǎn)生中和性多克隆抗血清(Border等人，1990;Flanders等人，1988)。此類非人多克隆抗體不適合于人治療用途。1D11.16是鼠類泛特異性抗TGFP抗體，其在廣泛范圍的體外測定法中中和人和小鼠TGFP1、TGFP2和TGFP3(Dasch等人，1989;Dasch等人，1996;R&DSystem關(guān)于MAB1835的產(chǎn)品頁)，并且于在纖維化動物模型中的原理驗證研究之中是有效的(Ling等人，2003;Miyajima等人,2000;Schneider等人，1999;Khanna等人，1999;Shenkar等人，1994)。然而，因為1D11.16是鼠類單克隆抗體(Dasch等人，1989;Dasch等人，1996)，所以它不適合在人中的治療用途。附圖簡述圖1顯示了PET1073G12種系IgG4(實心正方形)和1D11.16(空心圓圏)對來自NHLF細胞的經(jīng)TGFe1(a)、TGFP2(b)或TGFP3(c)(10pM)誘導的纖連蛋白產(chǎn)生的中和作用(％抑制)。實心三角形代表以最高濃度U00nM)測試的無關(guān)IgG4。數(shù)據(jù)顯示為一式兩份進行的n次實驗的平均值±SE平均值。關(guān)于ICs。值見表2。圖2顯示了PET1074B9種系IgG4(實心正方形)和1D11.16(空心圓圏)對來自NHLF細胞的經(jīng)TGFP1(a)、TGFP2(b)或TGFP3(c)(10pM)誘導的纖連蛋白產(chǎn)生的中和作用(％抑制)。實心三角形代表以最高濃度(100nM)測試的無關(guān)IgG4。數(shù)據(jù)顯示為一式兩份進行的n次實驗的平均值±SE平均值。關(guān)于ICs。值見表2。圖3顯示了PET1287A10種系IgG4(實心正方形)和1D11.16(空心圓圏)對來自NHLF細胞的經(jīng)TGFP1(a)、TGFP2(b)或TGFP3(c)(10pM)誘導的纖連蛋白產(chǎn)生的中和作用(％抑制)。實心三角形代表以最高濃度(100nM)測試的無關(guān)IgG4。數(shù)據(jù)顯示為一式兩份進行的n次實驗的平均值±SE平均值。關(guān)于ICs。值見表2。發(fā)明概述在本發(fā)明的各個方面中提供了下文包括的實施方案的主題。本發(fā)明的進一步的方面和實施方案在本文的說明書中公開。本發(fā)明提供了對于TGFP特別是人TGFP的特異性結(jié)合成員。特別提供了針對TGFpl、TGFP2和TGFP3的特異性結(jié)合成員。本發(fā)明內(nèi)的優(yōu)選實施方案是抗體分子，無論是完整的抗體(例如IgG，如IgGl或IgG4)還是抗體片段(例如scFv、Fab、dAb)。提供了抗體抗原-結(jié)合區(qū)域和抗體的抗原結(jié)合位點，如包含此類區(qū)域的抗體VH和VL結(jié)構(gòu)域。提供了在VH和VL結(jié)構(gòu)域內(nèi)的互補性決定區(qū)CDRs，其可以在不同框架區(qū)FR's內(nèi)提供，以視情況而形成VH或VL結(jié)構(gòu)域?？乖Y(jié)合位點可以由抗體VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域或其抗原結(jié)合部分組成。在一個方面，本發(fā)明提供了對于人TGFP的特異性結(jié)合成員，其包括抗體的抗原結(jié)合位點、HCDR組、LCDR組或兩者和/或人抗體VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域或兩者。HCDR1、HCDR2和HCDR3這一組可以具有選自下列的序列HCDR1SEQIDNO:3、HCDR2SEQIDNO:4、HCDR3SEQIDNO:5(在本文中稱為"PET1073G12的HCDRs組")；HCDR1SEQIDNO:13、HCDR2SEQIDNO:14、HCDR3SEQIDNO:15(在本文中稱為"PET1074B9的HCDRs組")；HCDR1SEQIDNO:23、HCDR2SEQIDNO:24、HCDR3SEQIDNO:25(在本文中稱為"PET1287A10的HCDRs組")。LCDR1、LCDR2和LCDR3這一組可以具有選自下列的序列IXDR1SEQIDNO:8、LCDR2SEQIDNO:9、IXDR3SEQIDNO:10(在本文中稱為"PET1073G12的LCDRs組");LCDR1SEQIDNO:18、LCDR2SEQIDNO:19、LCDR3SEQIDNO:20(在本文中稱為"PET1074B9的LCDRs組，，);LCDR1SEQIDNO:28、LCDR2SEQIDNO:29、LCDR3SEQIDNO:30(在本文中稱為"PET1287A10的LCDRs組")。PET1073G12的HCDRs組與PET1073G12的LCDRS組一起在本文中稱為PET1073G12的CDRs組。PET1074B9的HCDRs組與PET1074B9的LCDRS組一起在本文中稱為PET1074B9的CDRs組。PET1287A10的HCDRs組與PET1287A10的LCDRS組一起在本文中稱為PET1287A10的CDRs組。本發(fā)明還提供了包含如本文公開的HCDRs組的VH結(jié)構(gòu)域，同樣地還分開地提供了包含如本文公開的LCDRs組的VL結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，這樣的VH結(jié)構(gòu)域是與這樣的VL結(jié)構(gòu)域配對的，并且最優(yōu)選地VH和VL結(jié)構(gòu)域的配對與如本文所示的克隆中的一樣。本發(fā)明進一步提供了包括HCDR1、HCDR2和HCDR3這一HCDRs組的VH結(jié)構(gòu)域，其中所述HCDRs組相應(yīng)于具有1個或2個氨基酸置換的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的HCDRs組。本發(fā)明進一步提供了包括LCDR1、LCDR2和LCDR3這一LCDRs組的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述CDRs組相應(yīng)于具有1個或2個氨基酸置換的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的LCDRs組。位點的特異性結(jié)合成員。跟隨將多變量數(shù)據(jù)分析技術(shù)應(yīng)用于結(jié)構(gòu)/特性-活性關(guān)系的計算化學的引導(Wold等人，Multivariatedataanalysisinchemistry.Chemometrics-MathematicsandStatisticsinChemistry(Ed.:B.Kowalski)，D.ReidelPublishingCompany,Dordrecht,Holland,1984(ISBN90-277-1846-6)),抗體的定量的活性-特性關(guān)系可以使用眾所周知的數(shù)學技術(shù)例如統(tǒng)計回歸、模式識別和分類來獲得(Norman等人，AppliedRegressionAnalysis.Wiley-Interscience;第三版(April1998)ISBN:0471170828;AbrahamKandel，EricBacker.Computer-AssistedReasoninginClusterAnalysis.PrenticeHallPTR;(May11，1995)，ISBN:0133418847;WojtekKrzanowski.PrinciplesofMultivariateAnalysis:AUser'sPerspective(OxfordStatisticalScienceSeries,No22(Paper))OxfordUniversityPress;(December2000)，ISBN:0198507089;IanH.Witten，EibeFrank.DataMining:PracticalMachineLearningToolsandTechniqueswithJavaImplementations.MorganKaufmann;(October11，1999)，ISBN:1558605525'，DavidG.T.Denison(編者)，ChristopherC.Holmes,BaniK.Mallick,AdrianF.M.Smith.BayesianMethodsforNonlinearClassificationandRegression(WileySeriesinProbabilityandStatistics).JohnWiley&Sons;(July2002),ISBN:0471490369;ArupK.Ghose，VellarkadN.Viswanadhan.CombinatorialLibraryDesignandEvaluationPrinciples,Software,Tools,andApplicationsinDrugDiscovery.ISBN:0-8247-0487-8)?？贵w的特性可以得自抗體序列的經(jīng)驗和理論才莫型(例如，可能接觸的殘基或計算的物理化學特性的分析)、功能和三維結(jié)構(gòu)，并且這些特性可以單獨和組合考慮。已知原子結(jié)構(gòu)的抗體的分析已闡明抗體結(jié)合位點的序列和三維結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系(ChothiaC.等人，JournalMolecularBiology(1992)227，799-817;Al-Uzikani等人，JournalMolecularBiology(1997)273(4)，927-948)。這些關(guān)系暗示，除了VH結(jié)構(gòu)域中的第三個區(qū)域(環(huán))夕卜，結(jié)合位點環(huán)具有少數(shù)主鏈構(gòu)象中的一種正則結(jié)構(gòu)(canonicalstructures)。已顯示，在特定環(huán)中形成的正則結(jié)構(gòu)由其大小以及在環(huán)和框架區(qū)內(nèi)的關(guān)鍵位點處某些殘基的存在來確定(Chothia等人和Al-Lazikani等人，同上)。這一序列-結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究可以用于預(yù)測在已知序列但未知三維結(jié)構(gòu)的抗體中的那些殘基，它們在維持其CDR環(huán)的三維結(jié)構(gòu)中是重要的并因此在維持結(jié)合特異性中是重要的。這些預(yù)測可以通過將預(yù)測與來自先導物優(yōu)化實驗(leadoptimizationexperiments)的輸出結(jié)果進行比較來證實。在結(jié)構(gòu)方法中，可以使用任何可免費獲得或商業(yè)的軟件包例如WAM(Whitelegg,N.R.u.和Rees，A,R(2000)Prot.Eng.,12，815-824)來形成抗體分子的理論模型。然后，蛋白質(zhì)可視化和分析軟件包例如InsightII(Accelerys，Inc.)或DeepView(Guex，N.和Peitsch，M.C.Electrophoresis(1997)18,2714-2723)可用于評估在CDR和FR中每個位置上的可能置換。這個信息隨后可用于進行可能對活性具有最小或有利影響的置換。在CDRs、抗體VH或VL結(jié)構(gòu)域和特異性結(jié)合成員的氨基酸序列內(nèi)進行置換所需的技術(shù)一般是本領(lǐng)域可獲得的。使用可能或不能被預(yù)測對活性具有最小或有利影響的置換，可以制備變體序列，并且測試結(jié)合和/或中和TGFP的能力和/或任何其他所需特性。這在下文中進一步討論。如已注明的，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合成員，其包括指定的CDRs組，特別是PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10的CDRs組，以及在CDRs組內(nèi)有1個或2個置換的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的CDRs組。提供了在抗體框架區(qū)或其他蛋白質(zhì)支架例如纖連蛋白或細胞色素B內(nèi)的相關(guān)CDRs組。優(yōu)選采用抗體框架區(qū)。在一個優(yōu)選實施方案中，重鏈采用人VHl家族基因。在各種實施方案中，與人va家族基因的種系氨基酸序列相比較，重鏈框架氨基酸序列包含1-12，優(yōu)選3-12，和更優(yōu)選3-8個氨基酸差異。在某些實施方案中，重鏈框架序列是種系序列。在特別優(yōu)選的實施方案中，重鏈的抗體框架區(qū)可以是來自VH1家族的人DP-10(VHl-69)或人DP-88(VHl-e)。優(yōu)選地，使用人DP-10基因的實施方案在第27、78和94位殘基處具有非種系氨基酸。在某些實施方案中，第27位殘基是酪氨酸，第78位殘基是蘇氨酸，和第94位殘基是絲氨酸或亮氨酸。在某些實施方案中，輕鏈采用與種系氨基酸序列相比較具有1-5，優(yōu)選1-4，更優(yōu)選1-3個氨基酸差異的人Vk3家族基因。在某些實施方案中，輕鏈框架序列是種系人Vk3家族基因序列。在特別優(yōu)選的實施方案中，輕鏈框架區(qū)可以是人DPK-22(A27)。在某些此類實施方案中，第2位殘基是非種系氨基酸。在某些實施方案中，第2位殘基是蘇氨酸。在一個高度優(yōu)選的實施方案中，提供了具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域，這被稱為"PET1073G12VH結(jié)構(gòu)域"，或具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域，這被稱為"PET1074B9VH結(jié)構(gòu)域"，或具有SEQIDNO:22的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域，這被稱為"PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域，，。在一個進一步高度優(yōu)選的實施方案中，提供了具有SEQIDNO:7的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域，這被稱為"PET1073G12VL結(jié)構(gòu)域"，或具有SEQIDNO:17的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域，這被稱為"PET1074B9VL結(jié)構(gòu)域"，或具有SEQIDNO:27的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域，這被稱為"PET1287A10VL結(jié)構(gòu)域"。根據(jù)本發(fā)明提供的一個高度優(yōu)選的實施方案由PET1073G12VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:2)和PET1073G12VL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:7)組成。根據(jù)本發(fā)明提供的另一高度優(yōu)選的實施方案由PET1074B9VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:12)和PET1074B9VL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:17)組成。根據(jù)本發(fā)明提供的另一高度優(yōu)選的實施方案由PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:22)和PET1287A10VL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:27)組成。根據(jù)本發(fā)明提供的這些或任何其他抗體抗原-結(jié)合位點可以以任何所希望的抗體分子形式提供，例如scFv、Fab、IgGl、IgG4、dAb等，如本文其他地方進一步討論的。在一個進一步高度優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了IgG4抗體分子，其包括PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選還包括相應(yīng)的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VL結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明提供了包括PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域和/或PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VL結(jié)構(gòu)域的其他IgG4或其他抗體分子，正如提供了包括在抗體VH結(jié)構(gòu)域內(nèi)的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的HCDRs組，和/或在抗體VL結(jié)構(gòu)域內(nèi)的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的LCDRs組的其他抗體分子。為了方便，在這里指出，本文中使用的"和/或"被視為具有或不具有另一個的所述兩個指定特征或組分中每一個的具體公開。例如"A和/或B"被視為(i)A、(ii)B以及(iii)A和B中每一個的具體公開，就像每一個單獨在本文中列出。如所注明的，在本發(fā)明的某些實施方案中提供了特異性結(jié)合成員，其結(jié)合人TGFI3的所有3種同種型，并且包括PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH和/或VL結(jié)構(gòu)域，或者那些結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合部分。在某些實施方案中，將VH結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域配對以提供抗原結(jié)合位點。在一個優(yōu)選實施方案中，將PET1073G12VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:2)與PET1073G12VL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:7)配對，從而使得形成了包括PET1073G12VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合位點。在一個優(yōu)選實施方案中，將PET1074B9VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:12)與PET1074B9VL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:17)配對，從而使得形成了包括PET1074B9VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合位點。在一個優(yōu)選實施方案中，將PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:22)與PET1287A10VL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:27)配對，從而使得形成了包括PET1287A10VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合位點。在其他實施方案中，將PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH與除相應(yīng)的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VL以外的VL結(jié)構(gòu)域配對。本領(lǐng)域中良好地建立了輕鏈混雜(promiscuity)。類似地，本文〃>開的任何HCDRs組可以在VH結(jié)構(gòu)域中提供，所述VH結(jié)構(gòu)域單獨地或與VL結(jié)構(gòu)域相組合地用作特異性結(jié)合成員?？梢蕴峁┚哂斜疚墓_的HCDRs組的VH結(jié)構(gòu)域，并且如果將此類VH結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域配對，那么可以提供具有本文公開的LCDRs組的VL結(jié)構(gòu)域。HCDRs組和LCDRs組的配對可以是如本文關(guān)于PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10抗體所公開的那樣。VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)可以是種系框架。重鏈結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)可以選自Vf1家族，并且優(yōu)選的Vf1框架是DP-10或DP-88框架。輕鏈的框架區(qū)可以選自Vk3家族，并且優(yōu)選的此類框架是DPK-22。一個或多個CDRs可以取自VH或VL結(jié)構(gòu)域，其序列是本文公開的并且引入合適的框架中。這在本文中進一步討論。同樣可采用如使用本文描述的方法獲得的抗體的其他CDRs和CDRs組?？贵wVH結(jié)構(gòu)域、抗體VL結(jié)構(gòu)域、HCDRs組、LCDRs組、CDRs組、一種或多種HCDRs例如HCDR3、和/或一種或多種LCR's例如LCDR3，用，例如具有改善的效力的抗原結(jié)合位點的突變和選擇方法。本發(fā)明的VH和VL結(jié)構(gòu)域以及CDRs的變體，包括其氨基酸序列在本文中列出的并且可以在對于TGFP的特異性結(jié)合成員中采用的那些，可以通過序列改變或突變以及篩選的方法獲得。本發(fā)明還提供了此類方法。如所討論的，可以根據(jù)本發(fā)明采用其序列在本文中具體公開的任何VH和VL結(jié)構(gòu)域的可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列變體。特別的變體可以包括一個或多個氨基酸序列改變(添加、刪除、置換和/或插入氨基酸殘基)，可以是少于約20個改變、少于約15個改變、少于約IO個改變或少于約5個改變，4、3、2或1個改變。改變可以在一個或多個框架區(qū)和/或一個或多個CDRs中進行。根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了人、人源化、嵌合或合成的特異性結(jié)合成員，其與任何特異性結(jié)合成員竟爭或交叉竟爭結(jié)合抗原，合區(qū)、本文公開的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域、本文公開的CDRs或HCDR3組、或這些中的任何一種的變體。結(jié)合成員之間的竟爭可以在體外容易地測定，例如使用ELISA和/或通過將特異性的報告分子標記至一個結(jié)合成員，其可以在其他未標記的結(jié)合成員存在下被檢測，從而使得能夠鑒定結(jié)合相同表位或重疊表位的特異性結(jié)合成員。結(jié)合成員之間的交叉竟爭可以容易地通過進行反轉(zhuǎn)測定法(reverseassay)來測定，例如通過顛倒標記的和未標記的結(jié)合成員以鑒定在兩個方向上阻斷結(jié)合的對。因此，本發(fā)明的一個進一步的方面提供了包括抗體的抗原結(jié)合位點的特異性結(jié)合成員，其與PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10抗體分子，特別是PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10scFv和/或lgG4，竟爭或交叉竟爭結(jié)合TGFP。在各種實施方案中，抗體是人、人源化、嵌合或合成的抗體。在進一步的方面，本發(fā)明提供了包括人、人源化、嵌合或合成的抗體的抗原結(jié)合位點的特異性結(jié)合成員，其與本發(fā)明的抗原結(jié)合位點竟爭或交叉竟爭結(jié)合TGFP，其中人、人源化、嵌合或合成的抗體的抗原結(jié)合位點由VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域組成，并且其中VH和VL結(jié)構(gòu)域包括如本文公開的CDRs組?？紤]到本文公開的信息，在本領(lǐng)域中可得各種方法以用于獲得針對TGFP的人、人源化、嵌合或合成的抗體，并且其可以與PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10抗體分子，具有PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的CDRs組的抗體分子，具有PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10HCDRs組的抗體分子，或具有PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10LCDRs組的抗體分子竟爭或交叉竟爭結(jié)合TGFP。在一個進一步的方面，本發(fā)明提供了用于獲得一個或多個能夠結(jié)合TGFP1、TGFP2和TGFP3的特異性結(jié)合成員的方法，該方法包括使根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員文庫與所述TGFps接觸，并且選擇所述文庫中的一個或多個能夠結(jié)合所有所述TGFPs的特異性結(jié)合成員。所述文庫可以展示在噬菌體顆粒表面上，每個顆粒包含編碼展示在其表面上的抗體VH可變結(jié)構(gòu)域(并且任選地，如果存在，還有所展示的VL結(jié)構(gòu)域)的核酸。選擇能夠結(jié)合抗原并展示在噬菌體顆粒上的特異性結(jié)合成員之后，可以從展示所述選擇的特異性結(jié)合成員的噬菌體顆粒上獲取核酸。通過表達具有取自噬菌體顆粒(所述噬菌體顆粒展示所述選擇的特異性結(jié)合成員)的核酸的序列的核酸，此類核酸可以用于后續(xù)生產(chǎn)特異性結(jié)合成員或抗體VH可變結(jié)構(gòu)域(和任選地，抗體VL可變結(jié)構(gòu)域)。具有所述選擇的特異性結(jié)合成員的抗體VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的抗體VH結(jié)構(gòu)域可以以分離的形式提供，如可以提供包括此類VH結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合成員。可以進一步測試結(jié)合所有3種TGFP同種型的能力，以及與PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10(例如以scFv形式和/或IgG形式，例如IgG4)竟爭或交叉竟爭結(jié)合所有3種人的TGF(3同種型的能力。如下文進一步討論的，可以測試中和TGFP的能力。才艮據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以以PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10抗體分子(例如scFv，或優(yōu)選IgG4)的親和力，或以大于上述分子之一的親和力結(jié)合TGFP1、TGFP2和/或TGFP3。根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以以PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10抗體分子(例如scFv，或優(yōu)選PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10IgG4)的效力，或以大于上述分子之一的效力中和TGFP1、TGFP2和/或TGFp3。根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以以PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10抗體分子(例如scFv，或優(yōu)選IgG4)的效力，或以大于上述分子之一的效力中和天然存在的TGFP。不同特異性結(jié)合成員的結(jié)合親和力和中和效力可以在適當條件下進行比較。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案優(yōu)選包括人、人源化、嵌合或合成的抗體，其中和天然存在的TGFP，其中和效力等于或大于由PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VL結(jié)構(gòu)域形成的TGFP抗原結(jié)合位點的效力。除了抗體序列外，根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員還可以包括其他氨基酸，所述其他氨基酸例如形成肽或多肽，例如折疊的結(jié)構(gòu)域，或者賦予該分子除了結(jié)合抗原的能力以外的另一種功能特征。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以攜帶可檢測的標記，或可以綴合至毒素或靶向性部分或酶(例如，經(jīng)由肽基鍵或連接體)。在進一步的方面，本發(fā)明提供了分離的核酸，其包含編碼根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域或CDR的序列，以及提供了制備本發(fā)明的特異性結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域或CDR的方法，所述方法包括在一定條件下表達所述核酸從而導致產(chǎn)生所述特異性結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域、或CDR，并將其回收。根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以在人或動物機體的治療或診斷方法中使用，例如治療(這可以包括預(yù)防性治療)人患者中的疾病或病癥的方法，其包括給所述患者施用有效量的本發(fā)明的特異性結(jié)合成員。根據(jù)本發(fā)明可治療的病狀包括其中TGFP起作用的任何病狀，尤其是纖維化疾病的治療、傷口愈合的調(diào)節(jié)和癌癥治療。更具體而言，本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可用于在體外或體內(nèi)抑制3種人TGFP同種型中的任何一種或全部的活性。此類活性包括但不限于，TGFP介導的信號傳導，細胞外基質(zhì)(ECM)沉積，抑制上皮和內(nèi)皮細胞增殖，促進平滑肌增殖，誘導III型膠原表達，誘導TGF-p、纖連蛋白、VEGF和IL-ll表達，結(jié)合潛在性相關(guān)肽(LatencyAssociatedPeptide)，腫瘤誘導的免疫抑制，促進血管發(fā)生，激活肌成纖維細胞，促進轉(zhuǎn)移和抑制NK細胞活性。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員還可用于治療由TGFp活性直接或間接引起的疾病和病狀。因為本發(fā)明的特異性結(jié)合成員是泛特異性的，即它們結(jié)合并抑制所有3種TGFP同種型的活性，所以它們對于治療涉及兩種或更多種TGFP同種型的病狀和疾病(例如感染和腫瘤)以及其中希望抑制多重靶的嚴重病狀來說是特別有利的。特異性結(jié)合成員可用于治療下列疾病和病狀，所述疾病和病狀包括，但不限于，纖維化疾病(例如腎小球腎炎、神經(jīng)瘢痕化、皮膚瘢痕化、肺纖維化、肺部纖維化、輻射誘導的纖維化、肝纖維化、骨髓纖維化)、燒傷、免疫介導型疾病、炎性疾病(包括類風濕性關(guān)節(jié)炎)、移植排斥、癌癥、杜普伊特倫攣縮和胃潰瘍。它們還可用于治療、預(yù)防和減少腎機能不全發(fā)生的風險，所述腎機能不全包括，但不限于糖尿病性(I型和II型)腎病、輻射性腎病、梗阻性腎病、全身性硬皮病、肺纖維化、同種異體移植物排斥、遺傳性腎臟病(例如多嚢性腎病、髓質(zhì)海綿腎、馬蹄腎)、腎小球腎炎、腎硬化、腎鈣質(zhì)沉著、全身性紅斑狼瘡、斯耶格倫綜合征、貝格爾病、系統(tǒng)性或腎小球性高血壓、腎小管間質(zhì)性腎病、腎小管性酸中毒、腎結(jié)核和腎梗死。特別地，當與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的拮抗劑相組合時它們是有用的，所述拮抗劑包括但不限于腎素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、AngII受體拮抗劑(也稱為"AngII受體阻滯劑")和醛固酮拮抗劑。使用與此類拮抗劑相組合的本發(fā)明的特異性結(jié)合成員的方法在PCT/US04/13677中闡述，其內(nèi)容引入本文作為參考。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員還可用于治療與ECM沉積相關(guān)的疾病和病狀，所述疾病和病狀包括全身性硬皮病、手術(shù)后粘連、瘢痕瘤和肥厚性瘢痕化、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、青光眼引流手術(shù)、角膜損傷、白內(nèi)障、佩羅尼病、成人呼吸窘迫綜合征、肝硬化、心肌梗死后的瘢痕化、血管成形術(shù)后的再狹窄、蛛網(wǎng)膜下出血后的瘢痕化、多發(fā)性硬化癥、推板切除術(shù)后的纖維化、腱及其他修復(fù)后的纖維化、由于紋身去除引起的瘢痕化、膽汁性肝硬化(包括硬化性膽管炎)、心包炎、胸膜炎、氣管造口術(shù)、穿透性CNS損傷、嗜曙紅性肌痛綜合征、血管再狹窄、靜脈閉塞性病、胰腺炎和牛皮痺性關(guān)節(jié)病。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員進一步可用于其中促進上皮重新形成是有益的病狀。此類病狀包括但不限于皮膚疾病，例如靜脈曲張性潰瘍，缺血性潰瘍(褥疳)，糖尿病性潰瘍，移植物部位，移植物供體部位，擦傷和燒傷，支氣管上皮的疾病例如哞喘、ARDS，腸上皮的疾病例如與細胞毒素治療相關(guān)的粘膜炎、食管潰瘍(反流疾病(reflexdisease))、胃潰瘍、小腸和大腸損傷(炎性腸病)。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員的再進一步用途是用于其中希望內(nèi)皮細胞增殖的病狀中，例如在穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊、促進血管吻合愈合中，或者用于其中希望抑制平滑肌細胞增殖的病狀中，例如在動脈疾病、再狹窄和孝喘中。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員還可用于增強針對巨噬細胞介導的感染的免疫應(yīng)答，例如由利什曼蟲屬物種(Ze/s力邁a/z")、克魯茲錐蟲(rr7pa/705^r/7acrwz/)、結(jié)4盡分才支桿菌(y!Z/co6acfer/w邁勵erci/7c^/s)和麻風分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)，以及原生動物鼠弓漿體(7Vj^/7/^/i7a^"力7)，真菌莢膜組織胞漿菌(y/sf0/7as邁aca/7sw/atw/ff)、白色念珠菌((7s力cf/daa76/ca刀s)、近平滑念珠菌(Ca/2d2Vaj^raps/Zos")和新型隱球酵母(CV7/^0c0cci/s/eo尸or/pa/7S)，和立克次氏體(W/ci:eftsia)，J^口普氏立克次氏體(凡pro附zei://)、康氏立克次氏體(W.coro/7//)和恙蟲病立克次氏體(兄"w"^諸i/i力/)引起的那些。它們還可用于減少例如由腫瘤、AIDS或肉芽肺疾病引起的免疫抑制。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員進一步可用于治療過度增生性疾病，例如癌癥，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、腎癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚癌、肺癌、子宮頸癌和膀胱癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，間皮瘤，以及各種白血病和肉瘤，例如卡波西肉瘤，并且特別可用于治療或預(yù)防此類腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。特別地，本發(fā)明的拮抗劑特異性結(jié)合成員可用于抑制環(huán)孢菌素介導的轉(zhuǎn)移。當然，應(yīng)當意識到，在癌癥治療的情況下，"治療，，包括導致減緩腫瘤生長或減少腫瘤轉(zhuǎn)移以及癌癥部分緩解的任何醫(yī)學干預(yù)，以便延長患者的預(yù)期壽命。本發(fā)明的一個進一步方面提供了核酸，其一般是分離的，并且編碼本文公開的抗體VH可變結(jié)構(gòu)域和/或VL可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的另一方面提供了核酸，其一般是分離的，并且編碼本文公開的HCDR或LCDR序列，尤其是選自SEQIDN0:3、4、5、13、14、15、23、24和25的HCDR，或選自SEQIDNO:8、9、10、18、19、20、28、29、30的VLCDR,最優(yōu)選PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10HCDR3(分別為SEQIDNO:5、15或25)。本文還提供了編碼PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的CDRs纟且的核酸，編碼PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的HCDRs組的核酸，以及編碼PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的LCDRs組的核酸，正如提供了編碼單個的CDRs、HCDRs、LCDRs，以及PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10CDRs、HCDRs、LCDRs組的核酸。一個進一步的方面提供了用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細胞。一個再進一步的方面提供了生產(chǎn)抗體VH可變結(jié)構(gòu)域的方法，該方法包括導致從編碼核酸進行表達。此類方法可以包括在用于生產(chǎn)所述抗體VH可變結(jié)構(gòu)域或引起所述抗體VH結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)表達的條件下培養(yǎng)宿主細月包。用于生產(chǎn)VL可變結(jié)構(gòu)域以及包括VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合成員的類似方法作為本發(fā)明的進一步方面提供。生產(chǎn)方法可以包括產(chǎn)物的分離和/或純化的步驟。生產(chǎn)方法可以包括將產(chǎn)物配制到包含至少一種另外組分例如藥學上可接受的賦形劑的組合物中。本發(fā)明的這些及其他方面在下文中進一步詳細描述。發(fā)明詳述術(shù)語特異性結(jié)合成員這描述了具有對于彼此的結(jié)合特異性的分子對的成員。特異性結(jié)一個成員在其表面上具有區(qū)域或腔，所述區(qū)域或腔特異地結(jié)合在該分子對的另一成員表面上的區(qū)域或在其中的腔。因此，所述對的成員具有互相特異地結(jié)合的特性。本發(fā)明與結(jié)合靶抗原的特異性結(jié)合成員有關(guān)。特異性的這可以用于指這樣的情況，即特異性結(jié)合成員將不顯示任何顯著的與來自給定動物的除了其特異性結(jié)合配偶體之外的其他分子的結(jié)合。例如，對人TGFP特異的特異性結(jié)合成員與其他非TGF-P人分子將不具有顯著結(jié)合，然而它可以與來自其他物種的TGF-P交叉反應(yīng)。抗原結(jié)合性特異性結(jié)合成員包括抗原結(jié)合位點。例如，特異性結(jié)合成員可以是抗體分子。抗原結(jié)合位點還可以通過將CDRs排列在非抗體蛋白質(zhì)支架例如纖連蛋白或細胞色素B等上來提供(Koide等人，(1998)JournalofMolecularBiology,284:1141-1151;Nygren等人(1997)CurrentOpinioninStructuralBiology,第7巻463-469)。用于改造蛋白質(zhì)中的新型結(jié)合位點的支架已由Nygren等人(同上)詳細進行了綜述。用于抗體模擬物的蛋白質(zhì)支架在W000/34784中公開，其描述了包括具有至少一個隨機化環(huán)的III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域(fibronectintypeIIIdomain)的蛋白質(zhì)(抗體模擬物)。其中接枝一個或多個CDRs例如HCDRs組的合適支架可以由免疫球蛋白基因超家族的任何結(jié)構(gòu)域成員提供。支架可以是人或非人蛋白質(zhì)。非抗體蛋白質(zhì)支架的優(yōu)點是，它可以提供在保守框架區(qū)中的抗原結(jié)合位點，其比至少某些抗體分子更小和/或更容易制備。特異性結(jié)合成員的小尺寸可以賦予有用的生理學特性，例如進入細胞、滲透到組織深處或到達在其他結(jié)構(gòu)中的耙的能力，或者在靶抗原的蛋白質(zhì)腔內(nèi)進行結(jié)合的能力。非抗體蛋白質(zhì)支架中的抗原結(jié)合位點的用途在Wess，2004中進行了綜述。通常的是具有穩(wěn)定的主鏈以及一個或多個可變環(huán)的蛋白質(zhì)，其中環(huán)的氨基酸序列特異地或隨機地突變以產(chǎn)生具有對于結(jié)合靶抗原而言的特異性的抗原結(jié)合位點。此類蛋白質(zhì)包括來自金黃色葡萄球菌(S.awre^)的A蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、四連蛋白、纖連蛋白(例如第IO個III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域)和脂籠蛋白的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其他方法包括合成的"孩i體(Microbodies)"(SelecoreGmbH)，其基于大環(huán)寡肽(cyclotides)，所述大環(huán)寡肽是具有分子內(nèi)二疏鍵的小蛋白質(zhì)。除了抗體序列和/或抗原結(jié)合位點外，根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以包括其他氨基酸，所述其他氨基酸例如形成肽或多肽，例如折疊的結(jié)構(gòu)域，或者賦予該分子除了結(jié)合抗原的能力以外的另一種功能特征。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以攜帶可檢測的標記，或可以綴合至毒素或靶向性部分或酶(例如，經(jīng)由肽基鍵或連接體)。例如，特異性結(jié)合成員可以包括催化位點(例如在酶結(jié)構(gòu)域中)以及抗原結(jié)合位點，其中所述抗原結(jié)合位點結(jié)合抗原并因此將所述催化位點靶向抗原。所述催化位點可以抑制該抗原的生物學功能，例如通過切割。盡管如所注明的，CDRs可以由支架例如纖連蛋白或細胞色素B攜帶(Haan&Maggos，2004BioCentury，12(5):A1-A6;Koide等人，同上；Nygren等人，同上)，但用于攜帶本發(fā)明的CDR或CDRs組的結(jié)構(gòu)一般將具有抗體重鏈或輕鏈序列或其基本部分，在所述基本部分中所述CDR或CDRs組位于相應(yīng)于由經(jīng)重排的免疫球蛋白基因編碼的天然存在的VH和VL抗體可變結(jié)構(gòu)域的CDR或CDRs組的位置處。免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和位置可以通過參考Kabat，等人，1987及其最新資料來確定，所述資料現(xiàn)在在因特網(wǎng)(http:〃immuno.bme.nwu.edu或使用任何搜索引擎查找"Kabat")上可獲得?？贵w分子這描述了無論是天然的還是部分或全部合成產(chǎn)生的免疫球蛋白。該術(shù)語還涵蓋了包括抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽或蛋白質(zhì)。包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體片段是諸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd和雙抗體的分子。在人種系細胞的基因組中，抗體多肽鏈的遺傳信息包含于在沿著不同染色體分散的基因座內(nèi)的多個基因區(qū)段中。人重鏈(VH)在第14號染色體上編碼，k輕鏈(Vk)在第2號染色體上編碼，并且A輕鏈(V入)在第22號染色體上編碼。在B-淋巴細胞(抗體生成細胞)的發(fā)育過程中，在這些基因座中的基因區(qū)段通過重組進行裝配，導致形成完整的抗體重鏈或輕鏈基因(TonegawaS.Nature,302,575-81,1983)?？贵w恒定區(qū)(VH,Vk和V入)在整個人群中大部分是相同的，但在可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在相當大的多樣性。這樣的多樣性使得能夠形成數(shù)十億種不同的抗體，每種抗體具有對于不同靶抗原的特異性。在抗體可變區(qū)內(nèi)的多樣性是以幾種方式產(chǎn)生的。首先，在基因水平上，在抗體可變種系基因序列中存在相當大的多樣性。已描述了大約50種不同的VH種系(TomlinsonI.M.等人，J.Mol.Biol.，227，776-798，1992)，35種不同的vk種系(TomlinsonI.M.等人，EMBOJ,14，4628-38，1995)和30種不同的V入種系(WUliamsS.C.&WinterG.Eur.J.Immunol,23,1456-61,1993;KawasakiK.等人，Ge議eRes,7，250-61，1997)?？贵w由這些種系基因序列的不同組合產(chǎn)生。然后，通過諸如體細胞重組和超變的過程將進一步的多樣性引入抗體可變結(jié)構(gòu)域中(TonegawaS.Nature,302，575-81，1983)。盡管在抗體可變種系基因序列中存在相當大的多樣性，但基于序列同源性可以將這些序列分組為家族。50種不同的VH基因序列可以分組為7個家族，35種vk序列可以分組為6個家族，和30種VX序列可以分組為10個家族。這些組在大小上從l個成員(VH6和Vk4)到至多21個成員(VH3)不等，并且每個組的成員共享高度的序列同源性?？梢詫⒖贵w與VH和VL種系序列數(shù)據(jù)庫比對，以確定其最接近的種系匹配并鑒定由體細胞超變引入的任何氨基酸改變。研究已顯示，人免疫系統(tǒng)在免疫應(yīng)答過程中優(yōu)先于其他種系(例如VH2)而釆用某些種系(例如VH3DP47)(KnappikA.等人，J.Mol.Biol，296，57-86,2000)。然而，通過噬菌體展示分離的抗體群通常采用廣泛范圍的種系基因，即使當針對單一抗原進行分離時(EdwardsB.等人，J.MolBiol，334，103-118，2003)?？梢圆扇慰寺『推渌贵w并使用重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生保留原始抗體的特異性的其他抗體或嵌合分子。此類技術(shù)可以涉及將編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA與恒定區(qū)連接，或?qū)⒖贵w的互補性決定區(qū)(CDRs)引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)加框架區(qū)內(nèi)。參見，例如EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400,和大量后續(xù)文獻?？梢詫﹄s交瘤或產(chǎn)生抗體的其他細胞實施基因突變或其他改變，其可以改變或不可以改變所產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性。因為抗體可以以多種方式進行修飾，所以術(shù)語"抗體分子"應(yīng)當被解釋為涵蓋任何特異性結(jié)合成員或物質(zhì)，所述特異性結(jié)合成員或物質(zhì)具有有著所需特異性的抗體的抗原結(jié)合位點。因此，這個術(shù)語涵蓋了抗體片段和衍生物，包括包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，無論是天然的還是完全或部分合成的。因此包括了嵌合分子，其包含與另一種多肽融合的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或等價物。嵌合抗體的克隆和表達在EP-A-0120694和EP-A-0125023以及大量后續(xù)文獻中描述。在抗體改造領(lǐng)域中可用的進一步技術(shù)已使得能夠分離人和人源化的抗體。例如，人雜交瘤可以如Konte簡nn等人(KontermannR和DubelStefan;力/7〃6od^^/^/"eer//^Springer—VerlagNewYork,LLC;2001,ISBN:3540413545)所述進行制備。噬菌體展示這一用于產(chǎn)生特異性結(jié)合成員的另一種已建立的技術(shù)已在許多出版物例如Kontermann等人(同上)和WO92/01047(下文進一步討論)中進行了詳細描述。轉(zhuǎn)基因小鼠(其中小鼠抗體基因是失活的并用人抗體基因功能性地替代，同時保持小鼠免疫系統(tǒng)的其他組分完整)可以用于分離針對人抗原的人抗體(Mendez等人，1997)。單克隆或多克隆的人抗體，還可在其他轉(zhuǎn)基因動物例如山羊、牛、綿羊、兔等中制備。合成的抗體分子可以通過從基因進行表達而制備，所述基因借助于合成的并在合適的表達載體內(nèi)裝配的寡核苷酸而產(chǎn)生，例如如Knappik等人(同上)或Krebs等人，/。i/r/a7/邁邁u/7o/og/ca7254200167-84所描述的。已顯示，完整抗體的片段可以執(zhí)行結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的例子是(i)由VL、CL、VH和CHI結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由VH和CHI結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iii)由單一抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward,E.S.等人，^V由re341，544-546(1989)，McCafferty等人(1990)艇wre,348，552-554);(v)分離的CDR區(qū)；(vi)F(ab')2片段，其是包括兩個連接的Fab片段的二價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv),其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域通過肽連接體連接，所述肽連接體允許這兩個結(jié)構(gòu)域聯(lián)合以形成抗原結(jié)合位點(Bird等人，Science,242,423-426，1988;Huston等人，戶roc.Sc/85，5879-5883;1998);(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09665);和(ix)"雙抗體，，，其是通過基因融合構(gòu)建的多價或多特異性片段(WO/13804;F.Holliger等人，細c.iVa〃.Jcs《S"'.yW906444-6448，1993)。Fv、scFv或雙抗體分子可以通過引入連接VH和VL結(jié)構(gòu)域的二石克橋來穩(wěn)定(Y.Reiter等人，#af〃re5/Wec力，14,1239-1245，1996)。還可制備包括與CH3結(jié)構(gòu)域連接的scFv的小抗體(minibodies)(S.Hu等人，C謹er紋，56,3055-3061，1996)。dAb(結(jié)構(gòu)域抗體)是抗體的小單體型抗原結(jié)合性片段，即抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū)(Holt等人，2003)。VHdAbs在駱駝科動物(camelids)(例如駱駝，美洲駝)中天然存在，并且可以通過用靶抗原免疫駱駝科動物、分離抗原特異性B細胞并從單個B細胞中直接克隆dAb基因來產(chǎn)生。dAbs還可在細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生。其小尺寸、良好的溶解性和溫度穩(wěn)定性使得它們在生理學上特別有用，并適合于選擇和親和力成熟。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以是dAb，其包括基本上如本文列出的VH或VL結(jié)構(gòu)域，或含有基本上如本文列出的CDRs組的VH或VL結(jié)構(gòu)域。當使用雙特異性抗體時，這些可以是常規(guī)的雙特異性抗體，其可以以各種方式進行制備(Holliger，P.和WinterG.一.//o/5/Wec力/70/.4，446-449(1993))，例如采用化學方法或由雜種雜交瘤制備，或者可以是上文提及的雙特異性抗體片段中的任何一種。雙特異性抗體的例子包括BiTETM技術(shù)的那些，其中可以使用具有不同特異性的兩種抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并將它們經(jīng)由柔性短肽直接連接。這將兩種抗體組合在短的單個多肽鏈上。只使用可變結(jié)構(gòu)域可以構(gòu)建不含F(xiàn)c區(qū)的雙抗體和scFv，這有效地減少了抗獨特型反應(yīng)的影響。雙特異性雙抗體，與雙特異性完整抗體不同，也可以是特別有用的，因為它們可以容易地在大腸桿菌(Aco/i)中構(gòu)建并表達。使用噬菌體展示(W094/13804)從文庫中可以容易地選擇出具有合適的結(jié)合特異性的雙抗體(以及許多其他多肽例如抗體片段)。如果雙抗體的一個臂保持恒定，例如，具有針對TGFP的特異性，那么就可以制備文庫，其中另一個臂是可變的，并且可以選擇出具有合適的特異性的抗體。雙特異性完整抗體可以通過knobs-into-holes改造進行制備(C.E.B.Ridgeway等人，戶rWe//2A/^.,9，616—621，1996)?？乖Y(jié)合位點這描述了特異性結(jié)合成員例如抗體分子的一部分，其接觸并與結(jié)合對中的另一個成員即抗原的部分或全部互補。在抗體分子中，抗原結(jié)合位點可以稱為抗體抗原-結(jié)合位點，并包括特異地結(jié)合并與靶抗原全部或部分互補的抗體的一部分。當抗原很大時，抗體可以只結(jié)合抗原的特定部分，這個部分稱為表位?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是特異性結(jié)合成員的一部分，其包括抗原結(jié)合位點并結(jié)合耙抗原。在某些實施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由一個或多個抗體可變結(jié)構(gòu)域(例如，由VH結(jié)構(gòu)域組成的所謂的Fd抗體片段)或其抗原結(jié)合部分提供。在某些實施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。特異性結(jié)合成員可以是天然地或通過各種真核細胞系統(tǒng)(例如，CH0或NSO(ECACC85110503)細胞)糖基化的，或它們可以是(例如，如果通過在原核細胞中表達而產(chǎn)生)未糖基化的。還可以有意地改變糖基化，例如通過抑制巖藻糖基化，以便增加所得抗體的ADCC活性。因此，本發(fā)明的特異性結(jié)合成員中的任何一個可以如此表達以便最小化或消除巖藻糖基化。在某些實施方案中，本發(fā)明的CDR或VH或VL結(jié)構(gòu)域?qū)c其序列被在本文中列出的指定區(qū)域等同或高度類似。預(yù)期可以在CDR和/或VH或VL結(jié)構(gòu)域中進行1-5，優(yōu)選1-4或1或2,或3或4個氨基酸置換。高度類似于其序列被在本文中給出的那些的VH或VL結(jié)構(gòu)域以及CDRs和CDRs組由本發(fā)明的方面所涵蓋，正如其序列基本上如本文列出的那些一樣。用于攜帶本發(fā)明的CDR或CDRs組的結(jié)構(gòu)一般將具有抗體重鏈或輕鏈序列或其基本部分，在所述基本部分中所述CDR或CDRs組位于相應(yīng)于由經(jīng)重排的免疫球蛋白基因編碼的天然存在的VH和VL抗體可變結(jié)構(gòu)域的CDR或CDRs組的位置處。免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和位置可以通過參考Kabat,E.A.等人(5^《we/2ces1o/戶rc^e2'/2sof//7M7"/2o/c^7ca7//2tere".第四版.USDepartmentofHealthandHumanServices.1987)及其最新資料來確定，所述資料現(xiàn)在在因特網(wǎng)(http:〃immuno.bme.nwu.edu或使用任何搜索引擎查找"Kabat")上可獲得。CDRs根據(jù)Kabat等人進行定義。CDRs還可由其他支架例如纖連蛋白或細胞色素B攜帶。優(yōu)選地，攜帶基本上如本文列出的CDR氨基酸序列作為在人可變結(jié)構(gòu)域或其基本部分中的CDR?；旧先绫疚牧谐龅腍CDR3序列代表了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，并且優(yōu)選地，攜帶這些中的每一個作為在人重鏈可變結(jié)構(gòu)域或其基本部分中的HCDR3。本發(fā)明中采用的可變結(jié)構(gòu)域可以由任何種系或重排人可變結(jié)構(gòu)域獲得或衍生，或者可以是基于已知人可變結(jié)構(gòu)域的共有或?qū)嶋H序列的合成的可變結(jié)構(gòu)域?？梢允褂弥亟MDNA技術(shù)將本發(fā)明的CDR序列(例如CDR3)引入缺乏CDR(例如CDR3)的可變結(jié)構(gòu)域儲庫中。優(yōu)選的種系框架已在本文中進行了鑒定。例如，Marks等人(A/o/Tec/wo/o^F,1992，M:779-783)描述了產(chǎn)生抗體可變結(jié)構(gòu)域儲庫的方法，其中指向或鄰近可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域5'端的共有引物(consensusprimers)與針對人VH基因的第3個框架區(qū)的共有引物結(jié)合使用，以提供缺乏CDR2的VK可變結(jié)構(gòu)域儲庫。Marks等人進一步描述了這個儲庫如何可以與特定抗體的CDR2相組合。使用類似技術(shù)，本發(fā)明的CDR3-衍生的序列可以與缺乏CDR3的VH或VL結(jié)構(gòu)域儲庫進行改組，并且經(jīng)改組的完整VH或VL結(jié)構(gòu)域與同族(cognate)VL或VH結(jié)構(gòu)域相組合以提供本發(fā)明的特異性結(jié)合成員。然后，儲庫可以在合適的宿主系統(tǒng)中展示，例如WO92/01047的噬菌體展示系統(tǒng)，或大量后續(xù)文獻中的任何一個，包括Kay,B.K.，Winter,J.和McCafferty，J.(1996)PhageDisplayofPeptidesandProteins:ALaboratoryManual,SanDiego:AcademicPress,從而使得可以選擇合適的特異性結(jié)合成員。儲庫可以由104個單個成員以上組成，例如106至108或10"個成員。其他合適的宿主系統(tǒng)包括酵母展示、細菌展示、T7展示、核糖體展示、共價展示等等。類似的改組或組合4支術(shù)還由Stemmer(^t"re，1994，370:389-391)公開，他描述了與p-內(nèi)酰胺酶基因有關(guān)的技術(shù)，但評述到該方法可以用于產(chǎn)生抗體。進一步的備選方案是產(chǎn)生攜帶本發(fā)明的CDR-衍生的序列的新型VH或VL區(qū)，其中使用一個或多個所選擇的VH和/或VL基因的隨機誘變以產(chǎn)生在完整的可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變。此類技術(shù)由Gram等人(1992，Jcad.Sc/.，USA,3576—3580)描述，他們使用易錯PCR。在優(yōu)選實施方案中，在HCDRs和/或LCDRs組中進行1個或2個氨基酸置換?？梢允褂玫牧硪环N方法是將誘變導向VH或VL基因的CDR區(qū)。此類技術(shù)由Barbas等人(1994，戶roc.iVa〃.JcaASc/.,USA，^i:3809—3813)和Schier等人(1996，/.#0人"/o人里551-567)公開。所有上述技術(shù)是在本領(lǐng)域中本身已知的，并且其自身不構(gòu)成本發(fā)明的一部分。在已知本文提供的公開內(nèi)容的情況下，技術(shù)人員將能夠成員。本發(fā)明的一個進一步方面提供了用于獲得對TGFP抗原特異的抗體的抗原結(jié)合位點的方法，該方法包括通過在本文列出的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中添加、刪除、置換或插入一個或多個氨基酸來提供作為所述VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體的VH結(jié)構(gòu)域，任選地將如此提供的VH結(jié)構(gòu)域與一個或多個VL結(jié)構(gòu)域相組合，并測試VH結(jié)構(gòu)域或VH/VL組合以鑒定對TGFP特異并任選地具有一個或多個優(yōu)選特性的特異性結(jié)合成員或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述一個或多個優(yōu)選特性優(yōu)選為中和TGFP活性的能力。所述VL結(jié)構(gòu)域可以具有基本上如本文列出的氨基酸序列?？梢葬娪妙愃品椒?，其中本文公開的VL結(jié)構(gòu)域的一個或多個序列變體與一個或多個VH結(jié)構(gòu)域相組合。在一個優(yōu)選實施方案中，可以對PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域?qū)嵤┩蛔円蕴峁┮粋€或多個VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列變體，其可以與一個或多個VL結(jié)構(gòu)域相組合。本發(fā)明的一個進一步方面提供了用于制備對所有3種人TGFP同種型特異的特異性結(jié)合成員，所述方法包括(a)提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸的起始儲庫，所述VH結(jié)構(gòu)域包括待被替代的CDR3或缺乏CDR3編碼區(qū)；(b)將所述儲庫與編碼基本上如本文對于HCDR3而列出的氨基酸序列的供體核酸組合，從而使得所述供體核酸插入儲庫的CDR3區(qū)內(nèi)，以便提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸的產(chǎn)物儲庫；(c)表達所述產(chǎn)物儲庫的核酸；(d)選擇對至少一種TGF0同種型特異的特異性結(jié)合成員；和(e)回收所述特異性結(jié)合成員或編碼其的核酸。該方法可以進一步包括下述步驟用3種TGFP同種型中的每一種進行結(jié)合測定法和中和測定法，以鑒定結(jié)合并中和所有3種同種型的特異性結(jié)合成員。此外，可以釆用類似方法，其中本發(fā)明的LCDR3與編碼VL結(jié)構(gòu)域的核酸的儲庫相組合，所述VL結(jié)構(gòu)域包括待被替代的CDR3或缺乏CDR3編碼區(qū)。類似地，一個或多個，或所有3個CDRs可以接枝到VH或VL結(jié)構(gòu)域的儲庫中，隨后對它們進行篩選以獲得對所有人TGFp同種型特異的特異性結(jié)合成員。VH結(jié)構(gòu)域可以具有種系序列，并且在一個優(yōu)選實施方案中是DP-IO或DP-88。VL結(jié)構(gòu)域序列可以具有種系序列，并且在一個優(yōu)選實施方案中是DPK-22。在一個優(yōu)選實施方案中，可以采用PET1(H3G12、PETIOWB9或PET1287A10HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一個或多個，或PET1073G12、PET1074B9或PET1287A1Q的HCDRs纟且，和/或PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一個或多個，或PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的LCDRs組。免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的基本部分將包括至少所述3個CDR區(qū)，連同它們的間插框架區(qū)。優(yōu)選地，該部分將還包括第1個和第4個框架區(qū)中任一個或兩個的至少約50%，該50%是第1個框架區(qū)的C-末端50%和第4個框架區(qū)的N-末端50%。在可變結(jié)構(gòu)域的基本部分的N-末端或C-末端的另外殘基可以是通常不與天然存在的可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域相關(guān)聯(lián)的那些。例如，通過重組DM技術(shù)進行的本發(fā)明特異性結(jié)合成員的構(gòu)建可以導致引入由被導入以促進克隆或其他操作步驟的連接體編碼的N-或C-末端殘基。其他操作步驟包括導入連接體以將本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域連接至包括免疫球蛋白重鏈的進一步的蛋白質(zhì)序列、其他可變結(jié)構(gòu)域(例如在雙抗體的產(chǎn)生中)或蛋白質(zhì)標記，如本文其他地方更詳細地"N"論的。盡管在本發(fā)明的優(yōu)選方面，包括VH和VL結(jié)構(gòu)域?qū)Φ奶禺愋越Y(jié)合成員是優(yōu)選的，但基于VH或VL結(jié)構(gòu)域序列的單一結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了本發(fā)明的進一步方面。已知單一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，尤其是VH結(jié)構(gòu)域，能夠以特異的方式結(jié)合靶抗原。在任一種單個特異性結(jié)合成員的情況下，這些結(jié)構(gòu)域可以用于篩選能夠形成二結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合成員的互補結(jié)構(gòu)域，所述二結(jié)構(gòu)域特異性成員能夠結(jié)合3種人TGFP同種型。這可以通過噬菌體展示篩選方法，使用如WO92/01047中公開的所謂的梯級雙重組合方法(hierarchicaldualcombinatorialapproach)來完成，其中包含H或L鏈克隆的單個集落用于感染編碼另一鏈(L或H)的完整克隆文庫，并且根據(jù)噬菌體展示技術(shù)例如在那個參考文獻中所描述的那些來選擇所得的二鏈特異性結(jié)合成員。這項技術(shù)還在Marks等人(同前)中公開。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以進一步包括抗體恒定區(qū)或其部分。例如，VL結(jié)構(gòu)域可以以其C-末端附著至抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，包括人"或C,鏈，優(yōu)選"鏈。類似地，基于VH結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合成員可以以其C-末端附著至免疫球蛋白重鏈的所有或部分(例如CHI結(jié)構(gòu)域)，所述免疫球蛋白重鏈源自任何抗體同種型，例如IgG、IgA、IgE和IgM,以及同種型亞類中的任何一種，優(yōu)選IgGl和IgG4。IgG4是優(yōu)選的。IgG4對于某些應(yīng)用是優(yōu)選的，因為它不結(jié)合補體并且不產(chǎn)生效應(yīng)子功能。當效應(yīng)子功能是希望的時，IgGl是優(yōu)選的。效應(yīng)子功能還可通過釆用本領(lǐng)域已知的方法，經(jīng)由操控抗體的糖基化狀態(tài)例如通過減少巖藻糖含量而增加。重鏈可以具有或不具有C-末端賴氨酸殘基。具有這些特性并穩(wěn)定可變區(qū)的任何合成或其他恒定區(qū)變體對于在本發(fā)明的實施方案中使用來說也是優(yōu)選的。的異質(zhì)性制備物。例如，此類制備物可以是抗體的混合物，所述抗體具有全長重鏈和缺乏c-末端賴氨酸的重鏈，具有各種程度的糖基化，具有衍生的氨基酸(例如N-末端谷氨酸環(huán)化以形成焦谷氨酸殘基)和/或具有脫酰胺形式的重鏈和/或輕鏈。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以用可檢測的或功能性的標記進行標記。可檢測的標記包括放射性標記，例如1311或"TC，其可以使用抗體成像領(lǐng)域中已知的常規(guī)化學附著至本發(fā)明的抗體。標記還包括酶標記例如辣根過氧化物酶。標記進一步包括化學部分，例如生物素，其可以經(jīng)由與特異性同族可檢測部分例如經(jīng)標記的抗生物素蛋白結(jié)合而進行檢測。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員被設(shè)計成在人或動物受試者(優(yōu)選人)的診斷或治療方法中使用。在一些實施方案中，本發(fā)明的特異性結(jié)合成員抑制TGFP1、2和/或3與細胞表面TGF0受體或受體復(fù)合物(包括，但不限于，包括受體絲氨酸/蘇氨酸激酶I型或II型和蛋白聚糖P-聚糖(TGFPIII型受體)的復(fù)合物)的結(jié)合。因此，本發(fā)明包括用于抑制TGFP與細胞表面TGFP受體或受體復(fù)合物的結(jié)合的方法，包括使TGFP與本發(fā)明的特異性結(jié)合成員接觸并檢測與所述受體或受體復(fù)合物結(jié)合的抑制的步驟。在各種實施方案中，TGFP與其受體結(jié)合的抑制可以通過下列表明TGFpI型受體的磷酸化減少、TGFPI型受體的激活減少、R-SMAD蛋白特別是SMAD2和SMAD3的磷酸化和/或激活減少、所述SMAD蛋白至細胞核的移位減少、SMAD蛋白與DNA的結(jié)合減少和/或基因表達的調(diào)節(jié)，所述基因在所述細胞或細胞類型中的表達已知通過TGF^信號傳導進行調(diào)節(jié)。進一步的測定法在實施例中闡述。因此，本發(fā)明的進一步方面提供了包括施用所提供的特異性結(jié)合成員的治療方法，包含此類特異性結(jié)合成員的藥物組合物，以及此類特異性結(jié)合成員在制備用于施用的藥物中的用途，例如在制備藥物或藥物組合物的方法中，該方法包括用藥學上可接受的賦形劑配制所述特異性結(jié)合成員。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以通過注射(例如皮下、靜脈內(nèi)、腔內(nèi)(例如腫瘤切除術(shù)后)、損傷內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌內(nèi))，通過吸入，或局部(例如眼內(nèi)、鼻內(nèi)、直腸、傷口內(nèi)、皮膚上)或口服施用。施用途徑可以通過產(chǎn)品的物理化學特征，通過疾病的特別考慮，通過劑量或給藥間隔，或者通過對于優(yōu)化功效或最小化副作用的要求來確定。設(shè)想抗TGFP治療將不限于由衛(wèi)生保健專業(yè)人士施用。因此，皮下注射，尤其是使用不含針頭的裝置，可以是適當?shù)?。根?jù)本發(fā)明，所提供的組合物可以施用給有此需要的個體。施用優(yōu)選以"治療有效量"，這足以顯示對患者的利益。此類利益可以是至少改善特定疾病或病癥的至少一種癥狀。所施用的實際量，以及施用率和時間過程，將取決于被治療的疾病的性質(zhì)和嚴重度。治療處方，例如關(guān)于劑量等的決定，可以基于臨床前和臨床研究來確定，所述研究的設(shè)計完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平內(nèi)。精確劑量將取決于許多因素，包括所述抗體是用于診斷還是用于治療，待治療區(qū)域的大小和位置，抗體的精確性質(zhì)(例如，完整抗體、片段或雙抗體)，以及附著至所述抗體的任何可檢測標記或其他分子的性質(zhì)。一般的抗體劑量對于全身應(yīng)用來說將是100/ig-lmg，并且對于局部應(yīng)用來說將是1jig-lmg。一般地，抗體將是完整的抗體，優(yōu)選IgG4同種型。這是對于成人患者的單一治療的劑量，對于兒童和嬰兒它可以按比例調(diào)整，并且還可以對于其他抗體形式按分子量和活性而成比例地調(diào)整。根據(jù)醫(yī)師的判斷，治療可以按每天一次、每周二次、每周一次、每月一次或其他時間間隔重復(fù)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，治療是周期性的，并且施用之間的時期是約2周或更多，優(yōu)選約3周或更多，更優(yōu)選約4周或更多，或約一月一次。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員將通常以藥物組合物的形式施用，其可以包含除特異性結(jié)合成員以外的至少一種組分。因此，除活性成分以外，根據(jù)本發(fā)明的并依據(jù)本發(fā)明進行使用的藥物組合物可以包含藥學上可接受的賦形劑、載體、緩沖質(zhì)、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其他材料。此類材料應(yīng)當是非毒性的并且不應(yīng)干擾活性成分的功效。此類材料可以包括，例如任何一種和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑以及生理學相容的物質(zhì)等。藥學上可接受的載體的一些例子是水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及其組合。在許多情況下，在組合物中包括等滲劑，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，或氯化鈉將是優(yōu)選的。藥學上可接受的物質(zhì)的另外例子是濕潤劑或少量輔助物質(zhì)例如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖質(zhì)，其增強抗體的保存期或效用。載體或其他材料的精確性質(zhì)將取決于施用途徑，所述施用途徑可以是口服、局部、通過吸入或通過注射，例如靜務(wù)K內(nèi)。在一個優(yōu)選實施方案中，抗體通過靜脈內(nèi)輸注或注射進行施用。在另一優(yōu)選實施方案中，抗體通過肌內(nèi)或皮下注射進行施用。用于口服施用的藥物組合物可以是片劑、膠嚢、粉劑或液體形式，例如含有惰性稀釋劑或可同化的可食用載體。片劑可以包含固體載體例如明膠或佐劑。液體藥物組合物一般包含液體載體例如水、石油、動物或4直物油、礦物油或合成油。可以包括生理鹽水溶液、葡萄糖或其他糖類溶液或者二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。特異性結(jié)合成員(需要時，以及其他成分)還可包封在硬或軟殼明膠膠嚢內(nèi)，壓縮成片劑，或直接摻入受試者飲食中。對于口服治療施用，活性成分可以與賦形劑相摻合，并以可吸收的片劑(ingestibletablets)、頰含片劑、錠劑、膠嚢、酏劑、懸浮液、糖漿劑、糯米紙嚢劑等的形式進行使用。為了通過除腸胃外施用以外的其他方式施用本發(fā)明的化合物，可能必需用防止其失活的材料包被所述化合物或?qū)⑺龌衔锱c所述材料共施用。對于靜脈內(nèi)注射，或在痛苦部位注射，活性成分將是腸胃外可接受的水溶液的形式，其是無熱原的并且具有合適的pK、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人員將十分能夠例如使用等滲媒介物例如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸鹽林格注射液來制備合適的溶液。需要時，可以包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖質(zhì)、抗氧化劑和/或其他添加劑。組合物可以單獨或與其他治療相組合地同時或順次施用，這取決于凈皮治療的病狀。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以以液體、半固體或固體形式進行配制，例如液體溶液(例如，可注射的和可輸注的溶液)、分散系或懸浮液、片劑、丸劑、粉劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于所希望的施用形式、治療應(yīng)用、所述分子的物理化學特性和遞送途徑。制劑可以包含賦形劑、或賦形劑的組合，例如糖、氨基酸和表面活性劑。液體制劑可以包含廣泛范圍的抗體濃度和pH。固體制劑可以通過例如凍干、噴霧干燥、或經(jīng)超臨界流體技術(shù)進行干燥來生產(chǎn)。通常，治療組合物在制造和貯存條件下必須是無菌的和穩(wěn)定的。組合物可以配制為溶液、微乳液、分散系、脂質(zhì)體或適合于高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。無菌可注射溶液可以通過下列方式制備在需要時將在合適溶劑中的所需量的特異性結(jié)合成員與上文列舉的一種成分或成分組合相摻合，隨后過濾滅菌。一般地，分散系通過將活性化合物整合入無菌媒介物中進行制備，所述無菌媒介物包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來自上文列舉的那些中的所需的其他成分。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉劑的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，這種干燥方式從其先前無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分加上任何另外所需成分的粉末。溶液的合適流動性可以通過下列方式來維持例如，通過使用包衣例如卵磷脂，在分散系的情況下通過維持所需顆粒大小，和通過使用表面活性劑。通過在組合物中包括延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鹽和明膠可以導致可注射組合物的吸收延長。在某些實施方案中，抗體組合物活性化合物可以用保護抗體不被快速釋放的栽體進行制備，例如受控釋放制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠嚢化的遞送系統(tǒng)。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備此類制劑的許多方法是被授予專利權(quán)的，或者一般是本領(lǐng)域沖支術(shù)人員已知的。參見，例如5T/"a/力e(/a/n/Co/2"o"ecrje/ease/r"《5y"e邁s(J.R.Robinson,ed.，MarcelDekker，Inc.,NewYork,1978)TGFP的方法。如所注明的，此類結(jié)合可以在體內(nèi)發(fā)生，例如在給患者施用特異性結(jié)合成員或編碼特異性結(jié)合成員的核酸后，或者它可以在體外發(fā)生，例如在ELISA、蛋白質(zhì)印跡法、免疫細胞化學、免疫沉淀、親和層析、或基于細胞的測定法中，或者在基于離體的治療方法(例如，其中將細胞或體液離體與根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員接觸并隨后施用給患者的方法)中?？梢詼y定與TGFP結(jié)合的特異性結(jié)合成員的量。定量結(jié)果可以與測試樣品中的抗原量相關(guān)，這可能具有診斷意義。還提供了包括根據(jù)本發(fā)明任何方面或?qū)嵤┓桨傅奶禺愋越Y(jié)合成員或抗體分子的試劑盒，作為本發(fā)明的一個方面。在本發(fā)明的試劑盒中，應(yīng)性，例如，如下文進一步描述的。試劑盒的組分一般是無菌的并且在密封的小瓶或其他容器中。試劑盒可以在診斷分析或其中抗體分子是有用的其他方法中釆用。試劑盒可以包含關(guān)于在方法例如根據(jù)本發(fā)明的方法中使用所述組分的說明書。幫助或使得能夠執(zhí)行此類方法的輔助材料可以包括在本發(fā)明的試劑盒內(nèi)。樣品中抗體的反應(yīng)性可以通過任何合適的方法進行測定。放射免疫測定法(RIA)是一種可能性。將放射性標記的抗原與未標記的抗原(測試樣品)混合并允許其結(jié)合抗體。將結(jié)合的抗原與未結(jié)合的抗原在物理上分離，并且測定與抗體結(jié)合的放射性抗原的量。測試樣品中的抗原越多，與抗體結(jié)合的放射性抗原就越少。竟爭結(jié)合測定法還可與非放射性抗原一起使用，使用與報告分子連接的抗原或類似物。報體或激1染料。合適的熒光染料包L焚^素、'羅丹明、藻紅蛋白或德克薩斯紅。合適的生色染料包括二氨基聯(lián)苯胺。其他報告物包括大分子膠粒或顆粒材料例如膠乳珠，它們是有色、磁性或順磁性的，以及可以直接或間接引起可被肉眼觀察、被在電子學上檢測或記錄的可檢測信號的生物學或化學活性劑。這些分子可以是例如催化反應(yīng)的酶，所述反應(yīng)產(chǎn)生或改變顏色或者引起電特性的改變。它們可以是可分子激發(fā)的(molecularlyexcitable)，從而使得能態(tài)之間的電子躍遷導致特征性的光鐠吸收或發(fā)射。它們可以包括與生物傳感器結(jié)合使用的化學實體?？梢圆捎蒙锼?抗生物素蛋白或生物素/鏈霉抗生物素蛋白和堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)。通過單個抗體-報告物綴合物產(chǎn)生的信號可以用于衍生在樣品(正常和測試)中相關(guān)抗體結(jié)合的可定量的絕對或相對數(shù)據(jù)。本發(fā)明還提供了如上的特異性結(jié)合成員用于測量竟爭測定法中的抗原水平的用途，也就是說通過在竟爭測定法中采用本發(fā)明所提供的特異性結(jié)合成員來測量樣品中抗原水平的方法。這可以是結(jié)合的與未結(jié)合的抗原的物理分離不是必需的情況。將報告分子與特異性結(jié)合成員連接，從而在結(jié)合后發(fā)生物理或光學改變，是一種可能性。報告分子可以直接或間接產(chǎn)生可檢測的并優(yōu)選可測量的信號。報告分子的連接可以是直接或間接的、共價的(例如經(jīng)由肽鍵)或非共價的。經(jīng)由肽鍵的連接可能是編碼抗體和報告分子的基因融合物的重組表達的結(jié)果。本發(fā)明還提供了，例如在生物傳感器系統(tǒng)中通過采用根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員來直接測量抗原水平。測定結(jié)合的方式不是本發(fā)明的特征，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)其偏好和一般知識選擇合適的方式。如所注明的，在各個方面和實施方案中，本發(fā)明擴展至人、人源化、嵌合或合成的特異性結(jié)合成員，其與本文定義的任何特異性結(jié)合成員例如PET1037GR、PET1074B9或ET1287A10IgG4竟爭結(jié)合TGFP(TGF01、2和/或3)。結(jié)合成員之間的竟爭或交叉竟爭可以在體外容易地進行測定，例如通過將特異性報告分子標記至一個結(jié)合成員，其可以在其他未標記的結(jié)合成員存在下進行檢測，從而使得能夠鑒定結(jié)合相同表位或重疊表位的特異性結(jié)合成員。可以使用例如ELISA來測定竟爭，其中TGFP被固定至平板，并且將第一種經(jīng)標記的結(jié)合成員(參照結(jié)合成員)連同一種或多種其他未標記的結(jié)合成員一起加入平板中。通過由經(jīng)標記的結(jié)合成員發(fā)出的信號減少而觀察到與經(jīng)標記的結(jié)合成員進行竟爭的未標記的結(jié)合成員的存在。在竟爭測試中，可以采用抗原的肽片段，特別是包括目的表位的肽?？梢允褂镁哂斜砦恍蛄屑由显谌魏我粋€末端的一個或多個氨基酸的肽。此類肽可以說"基本上由指定序列組成，，。根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以是這樣的，即它們與抗原的結(jié)合被具有或包括給定序列的肽所抑制。在為此的測試中，可以使用具有任一序列加上一個或多個氨基酸的肽。結(jié)合特定肽的特異性結(jié)合成員可以例如通過用所述肽進行淘選而從噬菌體展示文庫中分離。本發(fā)明進一步提供了編碼本發(fā)明的特異性結(jié)合成員的分離的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明提供了這樣的核酸，其編碼如上定義的本發(fā)明的CDR或CDRs組，或抗體抗原-結(jié)合位點，或VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域，或抗體分子，例如scFv或IgG4。本發(fā)明還提供了質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達盒形式的構(gòu)建體，其包括至少一個如上的多核苷酸。本發(fā)明還提供了重組宿主細胞，其包含一種或多種如上的構(gòu)建體。編碼所提供的任何CDR或CDRs組或VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域或抗原結(jié)合位點或抗體分子例如scFv或IgG4的核酸，其自身形成本發(fā)明的一個方面，正如生產(chǎn)所編碼的產(chǎn)物的方法一樣，所述方法包括從編碼其的核酸進行表達。表達可以方便地通過在適當條件下培養(yǎng)包含所述核酸的重組宿主細胞來實現(xiàn)。在通過表達而產(chǎn)生后，VH或VL結(jié)構(gòu)域，或特異性結(jié)合成員，可以使用任何合適的技術(shù)進行分離和/或純化，隨后在適當時進行使用。根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員、VH和/或VL結(jié)構(gòu)域以及編碼性核酸分子和載體可以以基本上純或同質(zhì)的形式被提供為分離和/或純化的形式(例如從其天然環(huán)境中)，或在核酸的情況下，不含或基本上不含除編碼具有所需功能的多肽的序列以外的其他核酸或基因來源。根據(jù)本發(fā)明的核酸可以包括DNA和RM,或可以是完全或部分合成的。當提及本文列出的核苷酸序列時，涵蓋了具有指定序列的DNA分子，并涵蓋了具有其中U代替T的指定序列的RNA分子，除非上下文在其他方面要,夂。用于在各種不同宿主細胞中克隆和表達多肽的系統(tǒng)是眾所周知的。合適的宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、真菌、酵母和轉(zhuǎn)基因植物和動物。本領(lǐng)域可用的用于表達異源多肽的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢(CH0)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、NSO小鼠黑素瘤細胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細胞、人胚腎細胞、人胚視網(wǎng)膜細胞以及許多其他細胞。常用的、優(yōu)選的細菌宿主是大腸桿菌?？贵w和抗體片段在原核細胞例如大腸桿菌中的表達是本領(lǐng)域中良好建立的。關(guān)于綜述，參見例如Pliickthun，A."/o/rec力/2o7o^^:545-551(1991)。在培養(yǎng)的真核細胞中的表達對于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是可用的，這可作為用于生產(chǎn)特異性結(jié)合成員的一個選擇，例如ChaddHE和ChamowSM(2001)110Cwrre/7f//25/ofec力/2o/o^FU:188—194;AndersenDC和KrummenL(2002)Cwrre刀fOpi/72.ao//"/c^ec//o7o^ril:117;LarrickJW和ThomasDW(2001)Cwrre/^//5/ofec力/7o7og7U:411-418?？梢赃x擇或構(gòu)建合適的載體，其包含合適的調(diào)節(jié)序列，包括啟動子序列、終止子序列、多腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因以及其他合適序列。適當?shù)?，載體可以是質(zhì)粒，病毒例如噬菌體或噬菌粒、或腺病毒、AAV、慢病毒等。關(guān)于進一步的細節(jié)，參見例如MolecularCloning:ALaboratoryManual，第三版,Sambrook和Russel1,2001，ColdSpringHarborLaboratoryPress,用于操作核酸的許多已知技術(shù)和規(guī)程，例如核酸構(gòu)建體的制備、誘變、測序、將DNA導入細胞和基因表達，以及蛋白質(zhì)分4斤在CurrentProtocolsinMolecularBiology,第二版，Ausubel等人(編者)，JohnWiley&Sons,1986;ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等人(編者)，JohnWiley&Sons,第四版，1999中詳細描述。Sambrook等人和Ausubel等人(兩者)的公開內(nèi)容引入本文作為參考。因此，本發(fā)明的一個進一步的方面提供了包含本文所公開的核酸的宿主細胞。此類宿主細胞可以處于體外或者可以是培養(yǎng)的。此類宿主細胞可以處于體內(nèi)。所述宿主細胞的體內(nèi)存在可以允許本發(fā)明的特異性結(jié)合成員作為"胞內(nèi)抗體"或細胞內(nèi)抗體進行胞內(nèi)表達。胞內(nèi)抗體可以用于基因治療(MarascoWA(1997)Ce72er力era;/，4(1):11)。一個再進一步的方面提供了包括將此類核酸導入宿主細胞的方法。所述導入可以采用任何可用的技術(shù)。對于真核細胞，合適的技術(shù)可以包括磷酸鉤轉(zhuǎn)染、DEAE-Dextran、電穿孔、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染、和使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒(例如牛痘，或?qū)τ诶ハx細胞來說是桿狀病毒)的轉(zhuǎn)導。將核酸導入宿主細胞中，特別是真核細胞中，可以使用病毒系統(tǒng)或基于質(zhì)粒的系統(tǒng)。質(zhì)粒系統(tǒng)可以保持游離狀態(tài)或可以引入宿主細胞中或人工染色體中(CsonkaE等人(2000)/owr/7a7o尸Ce7/i"c/e刀ce,113:3207—3216;VanderbylS等人(2002)#o/ecw7ar7TeraAF，1(5):10。所述引入可以是將一個或多個拷貝隨機地或靶向整合在單個或多個基因座上。對于細菌細胞，合適的技術(shù)可以包括氯化釣轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用噬菌體的轉(zhuǎn)染。導入之后可以是引起或允許從所述核酸的表達，例如通過在用于表達該基因的條件下培養(yǎng)宿主細胞。在一個實施方案中，將本發(fā)明的核酸整合到宿主細胞的基因組(例如染色體)中?？梢砸罁?jù)標準技術(shù)通過包含促進與基因組重組的序列來促進整合。本發(fā)明還提供了方法，其包括在表達系統(tǒng)中使用如上所述的構(gòu)建體，以便表達如上的特異性結(jié)合成員或多肽。本發(fā)明的核酸分子可以經(jīng)由基因療法施用給有此需要的患者。該療法可以是體內(nèi)的或離體的。在一個優(yōu)選的實施方案中，將編碼重鏈和輕鏈的核酸分子施用給患者。在一個更優(yōu)選的實施方案中，核酸分子是這樣施用的，即使得它們穩(wěn)定整合到B細胞的染色體中，因為這些細胞專門用于產(chǎn)生抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，前體B細胞是離體轉(zhuǎn)染或感染的，并再移植到有此需要的患者中。在另一實施方案中，前體B細胞或其他細胞使用已知感染目的細胞類型的病毒進行體內(nèi)感染。用于基因療法的通常載體包括脂質(zhì)體、質(zhì)粒和病毒載體。示例性病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。體內(nèi)或離體感染后，抗體表達的水平可以通過從接受治療的患者獲取樣品并使用本領(lǐng)域已知或本文討論的任何免疫測定法進行監(jiān)控。在基因治療中使用抗-TGF0抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，美國專利5,824,655(Border)，其整體引入本文作為參考。在一個優(yōu)選實施方案中，基因治療方法包括施用分離的核酸分子并表達所述核酸分子的步驟，所述核酸分子編碼抗-TGFP抗體的重鏈或其抗原結(jié)合部分。在另一實施方案中，基因治療方法包括施用分離的核酸分子和表達所述核酸分子的步驟，所述核酸分子編碼抗-TGF&抗體的輕鏈或其抗原結(jié)合部分。在一個更優(yōu)選的方法中，基因治療方法包括下列步驟施用編碼抗-TGF^抗體的重鏈或其抗原結(jié)合部分的分離的核酸分子和編碼抗-TGFp抗體的輕鏈或其抗原結(jié)合部分的分離的核酸分子，以及表達所述核酸分子。物種與物種之間的劑量校正一般只需要對于體重進行調(diào)整，如果活性劑是在血管系統(tǒng)中或附近起作用的抗體。在急性情況下，本發(fā)明抗體的有效劑量在大鼠和小鼠中為0.5-5mg/kg。因此，對于長期按劑量給藥，可能考慮以半衰期(預(yù)期在人中為21天)施用0.3-10mg/kg。優(yōu)選的劑量對于功效是足夠的，但對于促進最佳施用來說足夠低。例如，少于50mg的劑量有利于皮下施用。靜脈內(nèi)施用在早期臨床試驗中是優(yōu)選的，并且可以用作嚴重疾病的遞送途徑，如果劑量高并且給藥間隔長。皮下注射一般比靜脈內(nèi)遞送更方便，因為它允許自我施用。然而，皮下注射有可能增加針對產(chǎn)物的任何免疫應(yīng)答。對于局限性疾病，局部施用可以最小化所需產(chǎn)物的量并最大化作用位點的濃度。通過局部施用可以賦予顯著的安全性(治療窗口)優(yōu)點，避免可能由長期全身施用發(fā)展出的任何潛在的副作用。根據(jù)本公開內(nèi)容(包括下列實驗性例證)，本發(fā)明的進一步的方面和實施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。本說明書任何地方提及的所有文件引入作為參考。實施例1抗-TGF^ScFvs的產(chǎn)生ScFv幼稚(naive)抗體文庫將從20個供體的脾臟淋巴細胞獲得并克隆到噬菌粒載體中的大單鏈Fv(scFv)人抗體文庫(Hutchings等人，2001)用于選擇。ScFv指導的選擇文庫構(gòu)建1D11.16VH-人VL文庫并用于選擇具有所需結(jié)合特性的小鼠-人嵌合抗體。然后，將來自這些嵌合抗體的人輕鏈克隆到人VH-VL和人VH(lDllCDR3)-VL受者文庫中。在這些文庫中篩選具有所需結(jié)合特性的人抗體。ScFv噬菌體文庫的選擇重組人TGFp1和TGFp2由GenzymeCorp.(Framingham，MA)供應(yīng)，并且TGF卩3購自R&DSystems。從scFv指導的選擇文庫中分離出識別TGFP的ScFvs，隨后基本上如Vaughan等人(1996)中描述的在重組人TGFP上進行一系列反復(fù)選擇循環(huán)。簡言之，在與文庫孵育后，已預(yù)偶聯(lián)至順磁性珠且結(jié)合噬菌體的固定化抗原通過磁性分離進行回收，同時洗掉未結(jié)合的噬菌體。然后，結(jié)合的噬菌體如Vaughan等人(1996)所述進行營救，并且重復(fù)選擇過程。才艮據(jù)制造商的建議使用與DynabeadsM-270胺(Dynal)偶聯(lián)的TGFP1、TGFP2或TGFP3進行選擇。備選地，選擇使用生物素化的TGFP1或TGFP2，其根據(jù)制造商的說明書(EZ1inkNHSLCBiotin，Pierce)使用伯胺特異性試劑琥珀酰亞胺基-6-(biotinannido)己酸酯來制備。來自選擇過程的輸出作為周質(zhì)制備物在基于竟爭測定法的高通量篩選中進行測試，所述竟爭測定法測量所述周質(zhì)制備物中存在的scFvs與1D11.16或重組人TGFP可溶性受體II-Fc嵌合體(sRII,R&DSystems)竟爭結(jié)合TGFP的能力。如Vaughan等人(1996)和0sbourn等人(1996)中所述，對在高通量篩選中與1D11.16或sRII竟爭的樣品實施DM測序?？寺”槐磉_并純化為scFvs或IgGs,并且分別如實施例4和5中所述評估其在MLEC和/或NHLF測定法中中和TGFps的能力。如W001/66754的實施例3中所述制備純化的scFv制備物。使用BCA法(Pierce)測定純化的scFv制備物的蛋白質(zhì)濃度。如下文實施例3中所述，制備純化的IgG制備物。實施例2抗-TGFPscFvs的優(yōu)化如實施例1中所述產(chǎn)生出結(jié)合并中和TGF0的ScFvs。使用DNA誘變和/或組合技術(shù)來增加這些抗體對TGFP1和/或TGFP2和/或TGF的中和效力?；旧先鐚嵤├?中所述，通過選擇和篩選噬菌體抗體文庫產(chǎn)生出對TGFPl和/或TGF^2和/或TGFP3的效力明顯改善的抗體。產(chǎn)生的scFvs在MLEC增殖測定法中與1D11.16進行比較。發(fā)現(xiàn)特定種系在高效力的TGFP中和性scFvs群體中具有高度代表性。這些對于重鏈來說為DP-10/1-69和DP-88/l-e(兩者都是VH1種系家族的成員)，和對于輕鏈來說為DPK22/A27(VK3家族)。這些種系似乎提供了特別適合于高效力的TGFP泛中和性抗體的結(jié)構(gòu)框架。這是不可預(yù)測的，因為1D11.16VH基因區(qū)段最接近人種系DP-7，并且1D11.16VL基因區(qū)段最接近人種系L16。在MLEC增殖測定法中，PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10scFvs顯示的效力接近或超過1D11.16對所有3種TGFP同種型的效力。將PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10VH和VL基因區(qū)段的衍生氨基酸序列與VBASE數(shù)據(jù)庫(Tomlinson等人，1997)中已知的人種系序列進行比對，并且通過序列相似性鑒定出了最接近的人種系。對于PET1073G12和PET1074B9的VH基因區(qū)段來說最接近的人種系基因被鑒定為DP-10/1-69(VH1種系家族)，和對于PET1287A10的VH基因區(qū)段來說最接近的人種系基因被鑒定為DP-88/1-e(VH1種系家族)。對于PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10的VL基因區(qū)段來說最接近的人種系基因被鑒定為DPK22/A27(Vk3秤系家族)。使用定點誘變來將不同于種系的框架殘基改變?yōu)榉N系殘基，條件是此類改變不引起所得到的抗體在MLEC增殖測定法中對任何TGFp同種型的效力喪失超過3倍。如果觀察到此類效力喪失，那么將非種系框架氨基酸保留在最終抗體中。在種系化的PET1073G12和種系化的PET1074B9中，所有框架殘基是種系，除了VH中的兩個殘基和VL中的一個殘基外。對于種系化的PET1073G12的氨基酸序列，關(guān)于VH在SEQIDNO:2中描述，和關(guān)于VL在SEQIDNO:7中描述。對于種系化的PET1074B9的氨基酸序列，關(guān)于VH在SEQIDNO:12中描述，和關(guān)于VL在SEQIDNO:17中描述。在種系化的PET1287A10中，所有VH和VL框架殘基是種系。對于種系化的PET1287A10的氨基酸序列，關(guān)于VH在SEQIDNO:22中描述，和關(guān)于VL在SEQIDNO:27中描述。實施例3IgG4s的產(chǎn)生通過將它們的VH和VL結(jié)構(gòu)域分別亞克隆到表達完整抗體重鏈和輕鏈的載體中，而將種系化的scFvsPET1073G12、PET1074B9和PET1287A10從scFv形式轉(zhuǎn)化為IgG4形式。從pCantab6這一表達scFv的載體擴增出VH基因區(qū)段，并克隆到包含人y4重鏈恒定結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)元件的pEU8.1(+)載體中，以在哺乳動物細胞中表達完整的重鏈。類似地，從pCantab6這一表達scFv的載體擴增出VL基因區(qū)段，并克隆到包含人K輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)元件的pEU3.l(-)載體中，以在哺乳動物細胞中表達完整的輕鏈。pEU3.1(-)和pEU8.1(+)載體基于Persic等人(1987)描述的載體，并進行4務(wù)飾以導入oriP序列以增加產(chǎn)生的抗體的產(chǎn)量(Shen.等人，1995;Langle-Rouault等人，1998)。克隆后，所有3種抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域進行測序以證實在克隆過程中沒有導入突變。將用于表達PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10重鏈和輕鏈的載體轉(zhuǎn)染到EBM-293細胞(Invitrogen)中。在細胞上清液中基因表達和分泌后，PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10IgG4通過A蛋白親和層析(Amersham)進4亍純化。將純化的抗體制備物無菌過濾，并在評估前于4'C貯存于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。使用基于如Mach等人(1992)中描述的IgG氨基酸序列的消光系數(shù)，采用分光光度測定法來測定IgG濃度。使用Biosep-SEC-S2000柱(Phenomenex)通過SEC-HPLC來分析純化的IgG以檢查蛋白質(zhì)的聚集或降解。分別如實施例4和5中所述，將重定格式的人IgG4完整抗體在基于MLEC和NHLF細胞的測定法中與1D11.16抗體進行比較。實施例4在TGFP依賴性MLEC增殖測定法中抗-TGF0抗體的中和效力使用貂肺上皮細胞(MLEC)增殖測定法來評估純化的抗體制備物針對人TGFP生物活性的中和效力。MLEC增殖測定法基于Danielpour等人(1989a)描述的測定法。該測定法根據(jù)下述原理工作當將TGFP1、TGFP2或TGFP3加入貂肺上皮細胞中時，這引起血清誘導的細胞增殖的抑制。測試抗體中和TGFP1、TGFp2或TGFP3從而致使細胞增殖恢復(fù)。通過[力]-胸苷的攝入來測量增殖?？贵w的效力定義為以50%(IC5。)的水平中和單一濃度的TGFP1、TGFP2或TGFP3的抗體濃度，單位為nM。MLEC增殖測定法規(guī)程MLEC鋪板MLEC系從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Cat.#CCL-64)獲得。細胞在包含10%FBS(Gibco)、1%青霉素/鏈霉素(Gibco)和1%MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)的極限必需培養(yǎng)基(MEM，Gibco)中生長。將來自T-175燒瓶的匯合細胞從燒瓶上脫離，旋轉(zhuǎn)下來，洗滌，并重懸浮于MLEC測定法培養(yǎng)基中，所述MLEC測定法培養(yǎng)基由包含1%FBS、1%青霉素/鏈霉素和1%MEM非必需氨基酸溶液的MEM制成。然后，將細胞的等分試樣用臺盼藍標記，在血細胞計數(shù)器上計數(shù)，并使用測定法培養(yǎng)基將細胞儲液稀釋至1.75x1()5細胞/ml。將10Qjul這種懸浮液加到組織培養(yǎng)平底96孔板的每個孔中，并孵育3-5小時。TGF0/抗體溶液的制備在MLEC測定法培養(yǎng)基中制備6ng/ml(最終測定法濃度的6倍)的TGF卩1、TGFP2或TGFP3的工作溶液，以及為最終最大測定法濃度的3倍的抗體(包括對照例如1D11.16)的工作溶液。測定法中TGFP的終濃度(1ng/ml或40pM)相應(yīng)于與沒有TGFP的對照相比誘導大約80%細胞增殖抑制的濃度(即ECs。值)。稀釋板的建立將測試和對照抗體的樣品在MLEC測定法培養(yǎng)基中以3倍稀釋梯級進行滴定，并在TGFpl、TGF(32或TGFP3存在或不存在下孵育。在每次實驗中包括所有相關(guān)對照測試1D11.16和/或合適的參照抗體，并進行TGFP1、TGFp2或TGFP3滴定。完成的平板在濕潤的組織培養(yǎng)孵育箱中放置1小時±15分鐘。向鋪板的細胞中加入TGFP/抗體溶液在適當?shù)姆跤龝r間后，將來自稀釋板每個孔的100yl轉(zhuǎn)移至鋪板的MLEC，并將平板放回孵育箱44±2小時。添加。H]-胸苷向每個孔中加入25pl的10MCi/ml[3H]-胸苷(在PBS中稀釋)(0.25jjCi/細胞)。然后將平板放回孵育箱4小時土30分鐘。細胞收獲向每個孔中加入IOOpL胰蛋白酶-EDTA(0.25%,Gibco)，將平板在孵育箱中孵育IO分鐘，并且使用Tomtec或Packard96孔細胞收獲器來收獲細胞。數(shù)據(jù)積累和分析使用P-平板閱讀器(TopCount，Packard)閱讀來自收獲的細胞的數(shù)據(jù)。分析數(shù)據(jù)以獲得ICs。和標準差值。使用Prism2.G(GraphPad)軟件獲得ICs。值。結(jié)果將純化的PET1073G12、PET1074B9和FET1287A10種系化的IgG4s在MLEC增殖測定法中與1D11.16—起進行測試。如實施例3中所述產(chǎn)生IgG4s。IC5。算術(shù)平均值土標準差(其中ICs。是中和50%40pMTGFPl、TGF02或TGFP3所需的抗體濃度)顯示于表1中。關(guān)于PET1073G12和PET1287A10IgG4s的ICw平均值數(shù)據(jù)顯示，這些抗體具有的效力類似或接近1D11.16對TGFP1、TGFP2或TGFp3的那些。IC5。平均值數(shù)據(jù)暗示，PET1074B9IgG4明顯對于TGFP1更有效(盡管在MLEC測定法中沒有獲得完全劑量應(yīng)答曲線)。作為用于比較的手段，1D11.16在91pM的濃度上顯示出對TGFp1的12%中和，并且PET1074B9在92pM的類似濃度上顯示出78%中和。此外，PET107化9還在正常人肺成纖維細胞(NHLF)纖連蛋白產(chǎn)生測定法中與1D11.16一起進行測試(實施例5)。NHLF測定法中獲得的結(jié)果證實了在MLEC測定法中獲得的那些結(jié)果PET1074B9具有的效力類似于1D11.16對TGFp2和TGFP3的效力，并且PET1074B9比1D11.16對于TGFP1更具效力。實施例5在TGFP3依賴性NHLF細胞測定法中抗-TGFP抗體的中和效力使用正常人肺成纖維細胞(冊LF)纖連蛋白產(chǎn)生測定法來評估純化的抗體制備物針對人TGFp生物活性的中和效力。該測定法測量抗體中和細胞外基質(zhì)(ECM)糖蛋白(纖連蛋白)的產(chǎn)生的能力。TGFPs是培養(yǎng)的成纖維細胞中纖連蛋白產(chǎn)生的有效刺激物(Ignotz和Massaoue，1986)，經(jīng)由激活c-JunN-末端激酶途徑發(fā)揮其效應(yīng)(Hocevar等人，1999)。NHLF細胞測定法規(guī)程NHLF細胞從CloneticsTM獲得，并于37。C在包含5%C02的濕潤氣氛中維持在完全成纖維細胞生長培養(yǎng)基-2(FGM-2)中。在90-100%匯合時，將成纖維細胞在1.5mlFGM-2培養(yǎng)基中鋪板(1.5xl05/孔，24孔形式)，并允許于37。C貼壁24小時。細胞用無血清的成纖維細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(FBM)洗滌，和在補充有人胰島素(100yg/ml)、慶大霉素/兩性霉素(50jag/ml)和抗壞血酸(50jag/ml)的1.5mlFBM中血清饑餓過夜，并于37。C孵育24小時。所有實驗對傳代3-6次之間的細胞進行。TGFfi和抗體溶液的制備在測定法培養(yǎng)基中制備25ng/ml(1nM)的TGFP1、TGFp2或TGFP3的工作溶液，以及抗體(包括對照例如1D11.16)的工作溶液。測定法中TGFP的終濃度(250pg/ml或10pM)相應(yīng)于與沒有TGFP的對照相比誘導大約80%纖連蛋白產(chǎn)生刺激的濃度(即ECs。值)。稀釋板的建立將測試和對照抗體的樣品在測定法培養(yǎng)基中以10倍稀釋梯級進行系列稀釋，并在TGFP1、TGFP2或TGFP332存在或不存在下預(yù)孵育30分鐘。NHLF細胞在2ml/孔的測定法培養(yǎng)基中于37'C孵育48小時。48小時后，取0.5ml培養(yǎng)基上清液的等分試樣用于通過ELISA進行纖連蛋白分析。人纖連蛋白ELISA使用TechnocloneTM人纖連蛋白抗原ELISA試劑盒來分析新鮮或冷凍的(-20°C)NHLF上清液樣品，所述試劑盒包括人抗纖連蛋白捕獲單克隆抗體(克隆6FN)和綴合有HRP的單克隆抗纖連蛋白二抗。方Nunc-ImmunoMaxisorp96孔板用在包被緩沖液(在蒸餾水中的12mMNa2C03、35mMNaHC03、0.01%(w/v)石克柳汞，pH9.6)中的抗纖連蛋白捕獲抗體(ljLig/孔)于4'C包被16小時。去除捕獲抗體，并且每個孔用100p1稀釋緩沖液(在PBS中的1%(w/v)BSA)于37'C封閉l小時。用洗滌緩沖液(250jag/孔在PBS中的0.5%(v/v)Tween20)洗滌3次后，將人血漿纖連蛋白標準和樣品加入平板，并于37'C孵育1小時。然后，將平板洗滌3次，并與抗纖連蛋白HRP二抗(100jag/孔，在稀釋緩沖液中)一起于37t:孵育30分鐘。平板用洗滌緩沖液洗滌3次，并向平板中加入100jag/孔的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物。平板在室溫下孵育20分鐘后，用100Mg/孔的2M硫酸中止反應(yīng)。然后使用DynexMRX平板閱讀器測定450nm處的吸光度。數(shù)據(jù)分析將數(shù)據(jù)提供為在測試下對TGFP同種型的對照應(yīng)答的百分比(100%)。使用四參數(shù)邏輯曲線擬合(Prism2,GraphPadSoftware,SanDiego，USA)來評估pIC50幾何平均值和95%置信界限。當四參數(shù)擬合失敗時，通過保持曲線頂端和/或底部值恒定來進行三或二參數(shù)擬合。結(jié)果將純化的PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10種系化的IgG4s在NHLF纖連蛋白產(chǎn)生測定法中與1D11.16—起進行測試。如實施例3中所述生產(chǎn)IgG4s。ICs。算術(shù)平均值士標準差(其中IC5。是中和50%10pMTGFP1、TGFP2或TGFP3所需的抗體濃度)顯示于表2中。實施例6在IL-11誘導測定法中的效力我們使用A549細胞(人肺上皮癌細胞)IL-ll誘導測定法來評估純化的抗體制備物針對人TGFP生物活性的中和效力。我們在生長/測定法培養(yǎng)基(435mLDMEM，50mL胎牛血清(FBS)，5mL青霉素/鏈霉素，5mL改進的Eagle培養(yǎng)基非必需氨基酸，5mL100XL-谷氨酰胺；全部來自Gibco/Invitrogen)中維持A549細胞(ATCC，Part#:CCL-185)。在大約90%匯合時，我們將細胞在100juL生長/測定法培養(yǎng)基中鋪板，并讓細胞在37。C、5%C02下貼壁24小時。TGF0和抗體溶液的制備我們在生長/測定法培養(yǎng)基中制備TGFp1(1.8ng/ml)、TGFP2(4.2ng/ml)或TGFP3(4.2ng/ml)和抗體(包括對照)的工作溶液。稀釋板的建立我們在生長/測定法培養(yǎng)基中以5倍(TGFP2或TGFP3)或10倍(TGFP1)的稀釋梯級對測試和對照抗體樣品進行系列稀釋，并在TGFP1、TGFP2或TGFP3存在或不存在下于37。C預(yù)孵育75分鐘。我們在200m1/孔的測定法培養(yǎng)基中于37。c孵育a549細胞18-24小時。18-24小時后，取100ial培養(yǎng)基上清液的等分試樣用于通過ELISA進行IL-ll分析。實施例7為了測定人泛中和性(pan-neutralizing)TGF-P單克隆抗體用于治療特征為致病性纖維化的慢性腎病及其他臨床適應(yīng)癥的生物學功效，我們在大鼠單側(cè)尿道阻塞(UU0)模型中研究所述抗體的效應(yīng)。重250-280克(約6周)的成年SpragueDawley大鼠(TaconicFarms,Germantown,NY)在控制空氣、溫度和光照的環(huán)境中飼養(yǎng)。經(jīng)歷uuo的大鼠接受小腹中線剖腹術(shù)以暴露左腎和上輸尿管。我們用絲縫線在腎較低一端的位置處結(jié)扎輸尿管，并且在笫一個之下約0.2cm處進行第二次結(jié)扎。經(jīng)假手術(shù)的大鼠接受相同的手術(shù)方案，但不進行輸尿管結(jié)扎。經(jīng)阻塞的大鼠用PBS、鼠類泛中和性單克隆抗體(1D11)、同種型匹配的對照抗體(13C4)或本發(fā)明的人泛中和性TGF-p單克隆抗體如下進行處理。我們從輸尿管結(jié)扎當天開始給大鼠腹膜內(nèi)施用所述抗體，療程為3周。13C4和1D11以5mg/kg施用(3次/周)，并且將人泛中和性抗體以5mg/kg給予大鼠(每5天)。在3周結(jié)束時，我們處死大鼠，用PBS灌注腎3分鐘，并收獲經(jīng)灌注的腎用于分析mRNA、測定膠原含量和組織學檢查。為了評估組織纖維化的程度，我們根據(jù)Kivirikko等人所述通過在水解提取物中羥脯氨酸的生物化學分析來測定組織膠原的總含量。該測定法基于動物組織中基本上所有的羥脯氨酸均在膠原中發(fā)現(xiàn)這一觀察。對于總膠原含量我們還進行了Sircol膠原測定法。Sircol膠原測定法基于Siriusred染料與組織膠原側(cè)鏈的特異性結(jié)合來測量全部的酸/胃蛋白酶可溶性膠原的量。當與經(jīng)PBS處理的組(3.5±0.3jag/mg干組織，p<0.05)比較時，用人泛中和性單克隆抗體處理的UU0大鼠顯示出羥脯氨酸含量減少43.4%(1.98±0.26|ag/mg干組織)。如通過基于Siriusred染料的測定法所測定的，在受影響的腎中總?cè)芙饽z原的減少進一步支持了腎纖維化的減輕(假的18.5±2.6，PBS:69.3±3.8，和人泛中和性單克隆抗體35.6±5.2yg/100mg組織，p<0.05對PBS)。我們還通過免疫組織化學檢查評估了人泛中和性抗TGF-P單克隆抗體減少組織纖維化的能力。在對照動物中，尿道阻塞3周導致腎臟管狀結(jié)構(gòu)的廣泛破壞，伴隨著顯著的膨脹、細胞萎縮和壞死/凋亡、組織炎癥和腎小管間質(zhì)擴張(伴隨明顯纖維化)。關(guān)于腎小球損害的證據(jù)很少。另一方面，如通過減弱的腎小管擴大和解體、減少的炎性浸潤物(細胞構(gòu)成)和減少的腎小管間質(zhì)擴張和纖維化所判斷的，用1D11或人泛中和性單克隆抗體處理的大鼠顯示出腎結(jié)構(gòu)的保存。我們還測量了用人泛中和性抗TGF-p單克隆抗體進行處理對于受TGF-P調(diào)節(jié)的基因表達的影響。與經(jīng)PBS處理或經(jīng)13C4對照抗體處理的動物相比，在經(jīng)人泛中和性單克隆抗體處理的UU0動物中TGF-P1mRNA顯著減少。與用PBS或13C4處理的那些相比，在用人和鼠類抗TGF-p抗體處理的阻塞的腎中還可見III型膠原的mRM水平顯著減少，這表明膠原合成減少。我們通過測量總腎TGF-P1蛋白進一步證實了人泛中和性抗TGF-P單克隆抗體減少自誘導的TGF-P合成的功效。與進行假手術(shù)的動物相比，阻塞的腎顯示出總組織TGF-P1明顯增加。然而用人泛中和性單克隆抗體進行給藥的阻塞的大鼠顯示出組織TGF-p1水平減少75%,明顯低于關(guān)于兩個對照組所記錄的水平。通過比較，與對照組相比，鼠類1D11抗體使組織TGF-P1水平減少45%。上述結(jié)果證實，用人泛中和性抗TGF-p單克隆抗體中和TGF-P有效地中斷了TGF-P自分泌-調(diào)節(jié)環(huán)，并伴隨著防止TGF-e1產(chǎn)生和膠原IIImRNA表達。我們進一步測定了人泛中和性抗TGF-e單克隆抗體對于作為TGF-P抑制的間接指示物的平滑肌肌動蛋白(oc-SMA)表達的影響。平滑肌肌動蛋白表達是激活的肌成纖維細胞的指示物，所述激活的肌成纖維細胞與組織纖維化相關(guān)并產(chǎn)生纖維結(jié)締組織。TGF-P是基質(zhì)成要誘導劑。，我們通過標準蛋白質(zhì)印跡分析檢測了ct-SMA蛋白。如通過組織勻漿物的蛋白質(zhì)印跡法所測量的，當與進行假手術(shù)的動物相比較時，具有阻塞的腎的大鼠顯示出oc-SMA蛋白顯著上調(diào)(數(shù)據(jù)未顯示)。用人泛中和性抗TGF-p單克隆抗體進行給藥的阻塞的大鼠顯示出在可測量的a-SMA表達方面的顯著減少(75%,與PBS對照相比)。這些結(jié)果證實，人泛中和性抗TGF-P單克隆抗體在纖維化腎中減少膠原沉積的功效，這清楚地表明，在這種嚴重腎損傷和腎小管間質(zhì)性纖維化模型中所述抗體是腎膠原產(chǎn)生和沉積的有效抑制劑。因為器官例如肺、肝或腎中的組織纖維化過程具有共同的機制或途徑，所以技術(shù)人員將理解，所述抗體可用于治療特征為致病性纖維化的慢性腎病以及其他臨床適應(yīng)癥。本發(fā)明的某些優(yōu)選權(quán)利要求的描述如下。SEQIDNO1編碼PET1073G12VH的核苷酸序列CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCAGTAGCAATGTTATCAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGGGGGGTCAT'CCCTATTGTTGATATTGCGAACTACGCACAGAGATTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACTAGTACAACTTACATGGAGTTGAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGCACACTTGGTCTCGTCCTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACGTTGGTCACCGTCTCCTCASEQIDNO2PET1073G12VH的氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLE麗GGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO3PET1073G12HCDR1的氨基酸序列SNVISSEQIDNO4PET1073G12HCDR2的氨基酸序列GVIPIVD工ANYAQRFKGSEQIDNO5PET1073G12HCDR3的氨基酸序列TLGLVLDAMt)YSEQIDNO6編碼PET1073G12VL的核苷酸序列AGCCGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCACJTTTATTACTGTCAGCAGTATGCTGACTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAASE(JIDNO7PET1073G12VL的氨基酸序列ETVLTQSPGTriSIiSPGERATLSCRASQSIjGSSYIxAWYQQKPGQAPRLLJY'GASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTliTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRIiEIKSEQIDNO8PET1073G12LCDRl的氨基酸序列RASQSLGSSY1ASEQIDNO9PET1073G12LCDR2的氨基酸序列GASSRAPSEQIDNO10PET1073G12LCDR3的氨基酸序列GQYADSP工TSEQIDNO11編碼PET1074B9VH的核苷酸序列GCGAACTACGCACAGAGATTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACTTTGGTGACCGTCTCCTCASEQIDNO12PET1074B9VH的氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNV工SWVRQAPGQGLEWMGGV工PIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMEIiSSLRSEDTAVYYCALPRAFVLDAMDYWGQOTLVTVSSSEQIDNO13PET1074B9HCDR1的氨基酸序列SNVISSEQIDNO14PET1074B9HCDR2的氨基酸序列PIVDIANYAQRF始SEQIDNO15PET1074B9HCDR3的氨基酸序列prafvldamdySEQIDNO16編碼PET1074B9VL的核苷酸序列g(shù)aaacggtactcacgcagtctccaggtaccctgtctttgtctccaggggAaagagccACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTCTTGGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGTCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCACCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGTACCGACTTCACTCTCACCATCAGCCGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATGCTGACTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAASEQIDNO17PET1074B9VL的氨基酸序列ETVLTQSPGTIiSIjSPGERATIiSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLIjIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKSEQIDNO18PET1074B9LCDR1的氨基酸序列RASQSLGSSYLASEQIDNO19PET1074B9LCDR2的氨基酸序列CJASSRAPSEQIDNO20PET1074B9LCDR3的氨基酸序列SEQIDNO21編碼PET1287A10VH的核苷酸序列CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAG(3TGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAAGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCACCTCTTTCATCAATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGAtATAACAAACTACGCACAGAAATTTCAGAGGAGAGTCACTATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGCGCACGCGGAAATGGTAACTACGCCCTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACGTTGGTCACCGTCTCCTCASEQIDNO22PET1287A10VH的氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTSFINWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDITNYAQKFQSRVT工TADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGNGNYALDAMDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO23PET1287A10HCDR1的氨基酸序列TSF工NSEQIDNO24PET1287A10HCDR2的氨基酸序列GI工PIFDITNYAQKFQSSEQIDNO25PET1287A10HCDR3的氨基酸序列GNGNYALDAMDYSEQIDNO26編碼PET1287A10VL的核苷酸序列GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTTGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGGATCCCTGACAGATTCAGTGGCApCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCCGCCTGGAGCCTGAM3ATTTCGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATGATAGTCCCATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAASEQIDNO27PET1287A10VL的氨基酸序列EIVXjTQSPGTLiSLSPGERATLSCRASQSVSSSYFAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTIjTISRLEPEDFAVYYCQQYYDSPITFGQGTRlijEIKSEQIDNO28PET1287A10LCDR1的氨基酸序列RASQSVSSSYFASEQIDNO29PET1287A10LCDR2的氨基酸序列GASSRATSEQIDNO30PET1287A10LCDR3的氨基酸序列QQYYDSPITSEQIDNO31WGQGTLVTVSS注CDRs根據(jù)Kabat等人(1991)進行定義表1<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>使用PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10種系化的IgG4s或1D11.16來中和TGFP1、TGFP2和TGF03對于MLEC的抗增殖效應(yīng)。對于每個平均值的數(shù)據(jù)點總數(shù)由n的數(shù)目所指明，并且代表了每種抗體的獨立滴定。弁ICs。值不能測定，因為該抗體在所測試的濃度范圍內(nèi)太過有效，并且沒有獲得完全劑量應(yīng)答曲線。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>在NHLF測定法中PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10種系化的IgG4s或1D11.16的效力。對于每個平均值的數(shù)據(jù)點總數(shù)由n的數(shù)目所指明，并且代表了每種抗體的獨立滴定。權(quán)利要求1.結(jié)合并中和人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的分離的特異性結(jié)合成員，包括抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括HCDR1、HCDR2和HCDR3這一CDRs組，并且其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域采用人VH1家族基因，和其中所述HCDR3具有選自SEQIDNO5、SEQIDNO15和SEQIDNO25的氨基酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1的特異性結(jié)合成員，其中所述人VH1家族基因是人VHl-2基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2的特異性結(jié)合成員，其中所述人VH1-2基因是DP-10或DP-88基因。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的特異性結(jié)合成員，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域進一步包括LCDR1、LCDR2和LCDR3這一CDRs組，并且其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域采用人Vk3家族基因，和其中所述LCDR3具有選自SEQIDNO:10、SEQIDNO:20和SEQIDNO:30的氨基酸序列。5.根據(jù)權(quán)利要求4的特異性結(jié)合成員，其中所述HCDR3和LCDR3選自(a)分別為SEQIDNO:5和SEQIDNO:10，(b)分別為SEQIDNO:15和SEQIDNO:20，和(c)分別為SEQIDNO:25和SEQIDNO:30。6.根據(jù)權(quán)利要求4的特異性結(jié)合成員，其中所述人Vk3家族基因是人VkDPK22基因。7.根據(jù)權(quán)利要求1的特異性結(jié)合成員，其中所述VH結(jié)構(gòu)域的HCDR1、HCDR2和HCDR3在種系重鏈框架內(nèi)。8.根據(jù)權(quán)利要求1的特異性結(jié)合成員，其中所述VH結(jié)構(gòu)域的HCDRl、HCDR2和HCDR3在來自所述種系氨基酸序列并包含至多12個突變的框架內(nèi)。9.根據(jù)權(quán)利要求4的特異性結(jié)合成員，其中所述VK結(jié)構(gòu)域的LCDR1、LCDR2和LCDR3在種系重鏈框架內(nèi)。10.根據(jù)權(quán)利要求4的特異性結(jié)合成員，其中所述vk結(jié)構(gòu)域的LCDR1、LCDR2和LCDR3在來自所述種系vk氨基酸序列并包含至多5個突變的框架內(nèi)。11.結(jié)合并中和人TGFP1、TGFP2和TGFP3的分離的特異性結(jié)合成員，包括抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域釆用人VHDP-10基因或人VHDP-88基因，并且包括包含SEQIDNO:31中的氨基酸序列的FR4氨基酸序列。12.根據(jù)權(quán)利要求11的特異性結(jié)合成員，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域采用人VHDP-10基因或人VHDP-88基因，并且包括HCDR1、HCDR2和HCDR3這一CDRs組，其中所述HCDR3具有選自SEQIDNO:5、SEQIDNO:15和SEQIDNO:25的氨基酸序列，并進一步包括包含SEQIDNO:31中的氨基酸序列的FR4氨基酸序列。13.根據(jù)權(quán)利要求11的特異性結(jié)合成員，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域進一步采用人vk3家族基因和人Jk5基因。14.根據(jù)權(quán)利要求13的特異性結(jié)合成員，其中采用人Vk3家族基因和人jk5基因的所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括LCDR1、LCDR2和LCDR3這一CDRs組，并且其中所述LCDR3具有選自SEQIDNO:10、SEQIDNO:20和SEQIDNO:30的氨基酸序列。15.結(jié)合并中和人TGFP1、TGFP2和TGFP3的分離的特異性結(jié)合成員，包括抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括(a)SEQIDNO:3的氨基酸序列的HCDR1,SEQIDNO:4的氨基酸序列的HCDR2，SEQIDNO:5的氨基酸序列的HCDR3;(b)SEQIDNO:13的氨基酸序列的HCDR1,SEQIDNO:14的氨基酸序列的HCDR2，SEQIDNO:15的氨基酸序列的HCDR3;或(c)SEQIDNO:23的氨基*列的HCDRl，SEQIDNO:24的氨基酸序列的HCDR2，SEQIDNO:25的氨基酸序列的HCDR3。16.根據(jù)權(quán)利要求15的分離的特異性結(jié)合成員，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域進一步包括抗體VL結(jié)構(gòu)域。17.根據(jù)權(quán)利要求15的分離的特異性結(jié)合成員，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域所包括的LCDRs選自(a)SEQIDNO:8的氨基酸序列的LCDRl，SEQIDNO:9的氨基酸序列的LCDR2，SEQIDNO:10的氨基酸序列的LCDR3;(b)SEQIDNO:18的氨基酸序列的LCDRl，SEQIDNO:19的氨基酸序列的LCDR2，SEQIDNO:20的氨基酸序列的LCDR3;和(c)SEQIDNO:28的氨基^^列的LCDRl，SEQIDNO:29的氨基酸序列的LCDR2，SEQIDNO:30的氨基酸序列的LCDR3。18.根據(jù)權(quán)利要求15的分離的特異性結(jié)合成員，其中所述VH結(jié)構(gòu)域的HCDR1、HCDR2和HCDR3在種系重鏈框架內(nèi)。19.根據(jù)權(quán)利要求18的分離的特異性結(jié)合成員，其中所述種系重鏈框架是人VH1家族框架。20.根據(jù)權(quán)利要求15的分離的特異性結(jié)合成員，其中所述VH結(jié)構(gòu)域的HCDR1、HCDR2和HCDR3在種系人重鏈框架VH1DP-10或DP-88內(nèi)。21.根據(jù)權(quán)利要求17的分離的特異性結(jié)合成員，其中所述VL結(jié)構(gòu)域的LCDRl、LCDR2和LCDR3在種系輕鏈框架內(nèi)。22.根據(jù)權(quán)利要求21的分離的特異性結(jié)合成員，其中所述種系輕鏈框架是人Vk3家族框架。23.根據(jù)權(quán)利要求21的分離的特異性結(jié)合成員，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域進一步釆用人jk5基因。24.根據(jù)權(quán)利要求22的分離的特異性結(jié)合成員，其中所述人Vk3家族基因是VkDPK22基因。25.分離的特異性結(jié)合成員，其包括具有至多5個突變的PET1073G12VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:2)或其抗原結(jié)合部分。26.分離的特異性結(jié)合成員，其包括具有至多5個突變的PET1074B9VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:12)或其抗原結(jié)合部分。27.分離的特異性結(jié)合成員，其包括具有至多5個突變的PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:22)或其抗原結(jié)合部分。28.根據(jù)權(quán)利要求10的分離的特異性結(jié)合成員，其進一步包括具有至多5個突變的PET1073G12VL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:7)或其抗原結(jié)合部分。29.根據(jù)權(quán)利要求25的分離的特異性結(jié)合成員，其進一步包括具有至多5個突變的PET1074B9VL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:17)或其抗原結(jié)合部分。30.根據(jù)權(quán)利要求26的分離的特異性結(jié)合成員，其進一步包括具有至多5個突變的PET1287A10VL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:27)或其抗原結(jié)合部分。31.抗體，其包括PET1073G12VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:2)和PET1073G12VL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:7)。32.抗體，其包括PET1074B9VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:12)和PET1074B9VL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:17)。33.抗體，其包括PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:22)和PET1287A10VL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:27)。34.根據(jù)權(quán)利要求l-30中任一項的分離的特異性結(jié)合成員，其包括scFv抗體分子。35.根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項的分離的特異性結(jié)合成員，其包括抗體恒定區(qū)。36.根據(jù)權(quán)利要求35的分離的特異性結(jié)合成員，其中所述恒定區(qū)來自IgG4。37.組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項的特異性結(jié)合成貝。38.分離的核酸，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項的特異性結(jié)合成員的核苷酸序列。39.宿主細胞，其用根據(jù)權(quán)利要求38的核酸轉(zhuǎn)化。40.生產(chǎn)特異性結(jié)合成員的方法，其包括在用于生產(chǎn)所述特異性結(jié)合成員的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求39的宿主細胞，并分離和/或純化所述特異性結(jié)合成員。41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其進一步包括將所述特異性結(jié)合成員或者抗體VH或VL可變結(jié)構(gòu)域配制到包含至少一種另外的活性組分的組合物中。42.生產(chǎn)特異地結(jié)合人TGFP1、TGFP2和TGFp3的特異性結(jié)合成員的方法，所述方法包括(a)提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的起始核酸或各自編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸的起始儲庫，其中所述VH結(jié)構(gòu)域包括種系人框架VH1DP-10或DP-88,并且任何一個包括待^皮取代的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，或缺乏HCDR1、HCDR2和/或HCDR3編碼區(qū)；(b)將所述起始核酸或起始儲庫與供體核酸組合，其中所述供體核酸編碼潛在的HCDR或所述供體核酸編碼潛在的HCDRs，從而使得所述供體核酸插入到所述起始核酸或起始儲庫的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3區(qū)內(nèi)，以便提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸的產(chǎn)物儲庫；(c)表達所述產(chǎn)物儲庫的核酸以產(chǎn)生產(chǎn)物VH結(jié)構(gòu)域；(d)任選地將所述產(chǎn)物VH結(jié)構(gòu)域與一個或多個VL結(jié)構(gòu)域組合；(e)選擇對于人TGFP1、TGFP2和TGFP3的特異性結(jié)合成員，所述特異性結(jié)合成員包括產(chǎn)物VH結(jié)構(gòu)域和任選地VL結(jié)構(gòu)域；和(f)回收所述特異性結(jié)合成員或編碼其的核酸。43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述供體核酸編碼下列氨基酸序列或通過下列氨基酸序列的突變而產(chǎn)生(a)SEQIDNO:3、SEQIDNO:13或SEQIDNO:23的HCDRl;(b)SEQIDNO:4、SEQIDNO:14或SEQIDNO:24的HCDR2;和/或(c)SEQIDNO:5、SEQIDNO:15或SEQIDNO:25的HCDR3。44.根據(jù)權(quán)利要求42或43的方法，其進一步包括使所述回收的特異性結(jié)合成員與抗體恒定區(qū)融合。45.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述特異性結(jié)合成員是scFv抗體分子。46.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述特異性結(jié)合成員是Fab抗體分子。47.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述特異性結(jié)合成員是完整的抗體。48.通過施用藥學上有效量的根據(jù)權(quán)利要求37的組合物來治療選自纖維化疾病、癌癥或免疫介導型疾病的疾病或病癥的方法。49.根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項的特異性結(jié)合成員在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療選自纖維化疾病、癌癥或免疫介導型疾病的疾病或病癥。50.用于抑制TGFP1、TGFp2或TGFP3信號傳導的方法，其包括使TGF01、TGFP2和TGFP3在體內(nèi)與根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項的特異性結(jié)合成員接觸的步驟。51.用于抑制TGFP1、2或3介導的纖連蛋白產(chǎn)生的方法，其包括使TGFP1、TGFP2和TGFP3與根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項的特異性結(jié)合成員接觸的步驟。52.用于抑制TGFP1、2或3介導的VEGF產(chǎn)生的方法，其包括使TGFP1、TGFP2和TGF03與根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項的特異性結(jié)合成員接觸的步驟。53.用于調(diào)節(jié)細胞增殖的方法，所述調(diào)節(jié)選自(a)減少TGFpi、2或3介導的上皮細胞增殖抑制；(b)減少TGFpi、2或3介導的內(nèi)皮細胞增殖抑制；和(c)抑制TGFP1、2或3介導的平滑肌細胞增殖，所述方法包括使表達TGFP1、TGFP2或TGFP3的細胞與才艮據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項的特異性結(jié)合成員接觸的步驟。54.用于抑制環(huán)孢菌素誘導的TGFP1、2或3活性的方法，其包括使TGFP1、TGFP2或TGFP3與根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項的特異性結(jié)合成員接觸的步驟。55.用于增加NK細胞活性的方法，其包括4吏表達TGFp1、TGFP2或TGFP3的細胞與根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項的特異性結(jié)合成員接觸的步驟。56.用于抑制TGFP1、2或3介導的免疫抑制的方法，其包括使表達TGFP1、TGFP2或TGFp3的細胞與才艮據(jù)4又利要求1-30中任一項的特異性結(jié)合成員接觸的步驟。57.用于抑制表達TGFP1、2或3的腫瘤生長的方法，其包括使表達TGFP1、TGFp2或TGFP3的細胞與根據(jù)權(quán)利要求1—30中任一項的特異性結(jié)合成員接觸的步驟。58.特異地結(jié)合并中和TGFp1、TGF02和TGFP3的分離的特異性結(jié)合成員，包括來自人VH1基因家族的種系重鏈框架序列。59.根據(jù)權(quán)利要求58的分離的特異性結(jié)合成員，其中所述種系重鏈框架序列來自人DP-IOVH1基因家族。60.根據(jù)權(quán)利要求59的分離的特異性結(jié)合成員，其中所述種系重鏈框架序列來自人DP-88VH1基因家族。61.特異地結(jié)合并中和人TGFP1、TGFP2和TGFP3的分離的特異性結(jié)合成員，包括來自人VK3基因家族的種系輕鏈序列。62.根據(jù)權(quán)利要求61的分離的特異性結(jié)合成員，其中所述輕鏈的框架區(qū)來自DPK-22。63.根據(jù)權(quán)利要求35的分離的特異性結(jié)合成員，其中所述恒定區(qū)來自IgGl。全文摘要本發(fā)明涉及抗體分子，特別是結(jié)合轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)的抗體分子，及其用途。更具體而言，本發(fā)明涉及結(jié)合且優(yōu)選中和TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的抗體分子，即所謂的“泛特異性”抗體分子，以及此類抗體分子的用途。本發(fā)明內(nèi)的優(yōu)選實施方案是抗體分子，無論是完整的抗體(例如IgG，如IgG1或IgG4)還是抗體片段(例如scFv、Fab、dAb)。文檔編號A61K39/395GK101163502SQ200680008838公開日2008年4月16日申請日期2006年2月8日優(yōu)先權(quán)日2005年2月8日發(fā)明者亞歷山大·R·鄧肯,卡特里昂納·L·布坎南,盧茨·U·杰爾穆圖斯,史蒂文·R·萊德貝特,唐訥·K·芬奇,羅伯特·G·霍爾蓋特,西莉亞·P·哈特申請人:根茨美公司;奧普泰恩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