抗erbB3抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及識別erbB3的胞外域且抑制依賴于EGF樣配體的erbB3的磷酸化的抗體及該抗體片段、編碼該抗體及該抗體片段的DNA、該抗體及該抗體片段的制造方法、含有該抗體及該抗體片段的治療藥以及使用該抗體及該抗體片段的治療用途。
【專利說明】抗erbB3抗體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及識別erbB3的胞外域且抑制依賴于EGF樣配體的erbB3的磷酸化的抗體及該抗體片段、編碼該抗體及該抗體片段的DNA、該抗體及該抗體片段的制造方法、含有該抗體及該抗體片段的治療藥以及使用該抗體及該抗體片段的治療用途。
【背景技術(shù)】
[0002]erbB3 是屬于表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor ;EGFR)家族的一次跨膜型蛋白質(zhì)(非專利文獻(xiàn)1、2及3)。erbB3的立體結(jié)構(gòu)與EGFR、Her2及erbB4類似，胞外域自N端側(cè)起由結(jié)構(gòu)域1、2、3及4這四個結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)構(gòu)成。erbB3以外的EGFR家族分子在細(xì)胞內(nèi)保有激酶結(jié)構(gòu)域，通過受體的活化發(fā)揮激酶活性，但erbB3的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域不具有激酶活性。
[0003]關(guān)于erbB3的活化，已知如下兩個通路:1.作為erbB3的特異性配體的調(diào)蛋白與erbB3結(jié)合,通過與erbB3形成異二聚體的其他EGFR家族使erbB3磷酸化,然后使磷脂酰肌醇 _3_ 憐酸激酶(phosphatidyl inositol_3phosphate kinase ;PI3 激酶)、Akt 活化的信號級聯(lián)；2.通過配體的結(jié)合或過度表達(dá)使erbB3以外的EGFR家族(EGFR或Her2等)活化，結(jié)果使erbB3磷酸化,然后使PI3激酶、Akt活化的信號級聯(lián)。
[0004]使用蛋白質(zhì)陣列對EGFR家族分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的親和性進(jìn)行網(wǎng)羅性分析的結(jié)果是，EGFR家族分子中，erbB3對PI3激酶的親和性特別高，強烈地暗示其對PI3激酶的活化很重要(非專利文獻(xiàn)4)。最近，報道了 erbB3與癌癥變得耐受EGFR抑制劑有關(guān)(非專利文獻(xiàn)5、6)。
[0005]已經(jīng)明確，藥劑耐受性的腫瘤中，肝細(xì)胞生長因子受體(hepatocyte growthfactor receptor; HGFR或Met)引起erbB3的憐酸化(非專利文獻(xiàn)5)或者M(jìn)et使erbB3的表達(dá)增加(非專利文獻(xiàn)6)，結(jié)果使藥劑存在下的腫瘤細(xì)胞增殖得以維持。
[0006]關(guān)于erbB3的表達(dá)與癌癥的預(yù)后的關(guān)聯(lián)性，有若干報道。Chen等人(非專利文獻(xiàn)7)基于陣列分析的結(jié)果選擇出與肺癌的預(yù)后關(guān)聯(lián)性高的5個基因(DUSP6、MMD, STATUERBB3 及 LCK)，其中包含 erbB3。
[0007]免疫組織學(xué)分析中也報道了 erbB3的表達(dá)為肺癌的預(yù)后不良因子(非專利文獻(xiàn)8)。Muller-Tidow等人(非專利文獻(xiàn)9)通過陣列分析考察了肺癌中與轉(zhuǎn)移相關(guān)的激酶，結(jié)果，erbB3被鑒定為繼INSR、NTRK1之后第3個與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險的關(guān)聯(lián)性高的基因。除了肺癌以外，在乳腺癌(非專利文獻(xiàn)10)及卵巢癌(非專利文獻(xiàn)11)中也報道了 erbB3的表達(dá)為預(yù)后不良因子。
[0008]關(guān)于抗erbB3的抗體,報道了抑制調(diào)蛋白(heregulin)與erbB3的結(jié)合的抗體(非專利文獻(xiàn)12)、不與erbBl及erbB2反應(yīng)而特異性地與erbB3反應(yīng)的抗體(專利文獻(xiàn)I)、抑制依賴于調(diào)蛋白的erbB2-erbB3的相互作用的erbB3抗體(專利文獻(xiàn)2)、與erbB3胞外域反應(yīng)的抗體(專利文獻(xiàn)3)以及與erbB3的結(jié)構(gòu)域I結(jié)合而抑制依賴于調(diào)蛋白的erbB3的磷酸化的抗體(專利文獻(xiàn) 4)。[0009]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0010]專利文獻(xiàn)
[0011]專利文獻(xiàn)1:美國專利第5480968號說明書
[0012]專利文獻(xiàn)2:美國專利第5968511號說明書
[0013]專利文獻(xiàn)3:國際公開第2007/077028號
[0014]專利文獻(xiàn)4:國際公開第2008/100624號
[0015]非專利文獻(xiàn)
[0016]非專利文獻(xiàn)1:Harari P.M.et.al., Endocr Relat Cancer.2004, 11, 689-708.[0017]非專利文獻(xiàn)2:Nagy P.et.al., Pathol Oncol Res.1999, 5, 255-71.[0018]非專利文獻(xiàn)3:Hynes N.E.et.al., Nat Rev Cancer.2005, 5, 341-54.[0019]非專利文獻(xiàn)4: Jones R.B.et.al., Nature.2006, 439, 168-74.[0020]非專利文獻(xiàn)5:EngeIman J.A.et.al., Science.2007, 316, 1039-43.[0021]非專利文獻(xiàn)6:Sergina N.V.et.al., Nature.2007, 445, 437-41.[0022]非專利文獻(xiàn)7:Chen H.Y.et.al.，N Engl J Med.2007，356，11-20
[0023]非專利文獻(xiàn)8:Hilbe ff.et.al.，J Clin Pathol.2003，56，736-41
[0024]非專利文獻(xiàn)9 =Muller-Tidow C.Et.Al.，Cancer Res.2005，65，1778-82
[0025]非專利文獻(xiàn)10 =Bieche 1.et.al.，Int J Cancer.2003，106，758-65.[0026]非專利文獻(xiàn)11 =Tanner B.et.al.，J Clin Oncol.2006，24，4317-23
[0027]非專利文獻(xiàn)12:Chen et al.，J Bio Cheml996, 271，7620-7629，1996.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0028]發(fā)明所要解決的問題
[0029]正尋求erbB3表達(dá)細(xì)胞相關(guān)疾病的治療藥。根據(jù)本發(fā)明，能夠提供抑制依賴于EGF樣配體的erbB3的磷酸化的抗體及該抗體片段、編碼該抗體及該抗體片段的DNA、該抗體及該抗體片段的制造方法、使用該抗體及該抗體片段的治療方法以及含有該抗體及該抗體片段的治療藥。另外，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供使用抗erbB3抗體的聯(lián)合療法。
[0030]用于解決問題的方法
[0031]本發(fā)明涉及以下⑴~(15)項。
[0032](I) 一種抗體及該抗體片段，其與erbB3的胞外域特異性結(jié)合且抑制依賴于表皮生長因子(epidermal growth factor ；EGF)樣配體的erbB3的憐酸化。
[0033](2) 一種抗體,其與erbB3的胞外域特異性結(jié)合且抑制依賴于erbB3特異性配體的erbB3的磷酸化及不依賴于erbB3特異性配體的erbB3的磷酸化這兩種磷酸化。
[0034](3)如(I)或(2)所述的抗體及該抗體片段，其中，erbB3的磷酸化為依賴于選自表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子a (transforming growth factor- a ;TGF_a)、雙調(diào)蛋白(amphiregulin)、^細(xì)胞素(betacellulin)、表皮調(diào)節(jié)素(epiregulin)、肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子(heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor ；HB-EGF)及調(diào)蛋白(heregulin)中的至少兩種配體的erbB3的磷酸化。
[0035](4)如⑴~(3)中任一項所述的抗體及該抗體片段，其中，erbB3的胞外域為包含選自由序列號3所示的氨基酸序列的第20位至第179位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域1、由第180位至第328位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域2、由第329位至第487位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域3及由第488位至第643位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域4中的至少一個結(jié)構(gòu)域的胞外域。
[0036](5)如⑴~⑷中任一項所述的抗體及該抗體片段，其中，抗體為選自下述(a)~(C)中的抗體，
[0037](a)與選自1153抗體克隆、12511抗體克隆、920104抗體克隆及1126抗體克隆中的任何一個抗體克隆發(fā)生競爭反應(yīng)的抗體及該抗體片段，
[0038](b)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段，所述表位包含與選自1153抗體克隆、12511抗體克隆、920104抗體克隆及1126抗體克隆中的任何一個抗體克隆反應(yīng)的表位，
[0039](c)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段，所述表位和與選自1153抗體克隆、12511抗體克隆、920104抗體克隆及1126抗體克隆中的任何一個抗體克隆反應(yīng)的表位相同的表位。
[0040](6)如⑴~(5)中任一項所述的抗體及該抗體片段，其中，抗體為選自包含含有序列號57所示的氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)(以下也稱為VH)及含有序列號58所示的氨基酸序列的抗體輕鏈可變區(qū)(以下也稱為VL)的抗體、包含含有序列號69所示的氨基酸序列的VH及含有序列號70所示的氨基酸序列的VL的抗體、包含含有序列號81所示的氨基酸序列的VH及含有序列號82所示的氨基酸序列的VL的抗體、以及包含含有序列號93所示的氨基酸序列的VH及含有序列號94所示的氨基酸序列的VL的抗體中的任何一種抗體。 [0041](7) 一種編碼(I)~(6)中任一項所述的抗體及該抗體片段的DNA。
[0042](8) 一種制造(I)~(6)中任一項所述的抗體及該抗體片段的方法，其特征在于，在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)將包含(7)所述的DNA的載體導(dǎo)入細(xì)胞而得到的轉(zhuǎn)化體，使⑴~(6)中任一項所述的抗體及該抗體片段在培養(yǎng)液中生成并蓄積，并從培養(yǎng)液純化抗體及該抗體片段。
[0043](9) 一種抗體組合物，其包含:
[0044]第一抗體或該抗體片段，其與erbB3的胞外域的選自由序列號3所示的氨基酸序列的第20位至第179位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域1、由第180位至第328位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域2、由第329位至第487位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域3及由第488位至第643位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域4中的至少一個結(jié)構(gòu)域反應(yīng)；以及
[0045]第二抗體或該抗體片段，其與不同于與第一抗體反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域反應(yīng)。
[0046](10)如(9)所述的抗體組合物，其中，第一抗體或該抗體片段為與erbB3的胞外域的結(jié)構(gòu)域2或結(jié)構(gòu)域4反應(yīng)的抗體或該抗體片段。
[0047](11)如(9)或(10)中任一項所述的抗體組合物，其中，第二抗體或該抗體片段為與erbB3的胞外域的結(jié)構(gòu)域I或結(jié)構(gòu)域3反應(yīng)的抗體或該抗體片段。
[0048](12)如(9)~(11)中任一項所述的抗體組合物，第一抗體或該抗體片段為選自下述(a)~(C)中的抗體或該抗體片段，
[0049](a)與1126抗體克隆發(fā)生競爭反應(yīng)的抗體及該抗體片段，
[0050](b)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段，所述表位包含與1126抗體克隆反應(yīng)的表位，[0051](c)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段，所述表位和與1126抗體克隆反應(yīng)的表位相同。
[0052](13)如(9)~(12)中任一項所述的抗體組合物，其中，第二抗體或該抗體片段為選自下述(a)~(C)中的抗體或該抗體片段，
[0053](a)與1153抗體克隆發(fā)生競爭反應(yīng)的抗體及該抗體片段，
[0054](b)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段，所述表位包含與1153抗體克隆反應(yīng)的表位，
[0055](c)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段，所述表位和與1153抗體克隆反應(yīng)的表位相同。
[0056](14) 一種erbB3表達(dá)細(xì)胞相關(guān)疾病的治療方法，其使用(9)~(13)中任一項所述的抗體組合物。
[0057](15)如(14)所述的治療方法，其中，erbB3表達(dá)細(xì)胞相關(guān)疾病為癌癥。
[0058](16) 一種erbB3表達(dá)細(xì)胞相關(guān)疾病的治療藥，其含有(9)~(13)中任一項所述的抗體組合物。
[0059]發(fā)明效果
[0060]根據(jù)本發(fā)明，能夠提供識別erbB3的胞外域并抑制依賴于EGF樣配體的erbB3的磷酸化的抗體及該抗體片段、編碼該抗體及該抗體片段的DNA、該抗體及該抗體片段的制造方法、含有該抗體及該抗體片段的藥物及使用該抗體及該抗體片段的治療用途。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0061]圖1 (a)表示抗人ebB3抗體對人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)431中的調(diào)蛋白a (HRG a )。圖1(b)表示抗人ebB3抗體對人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)431中的依賴于調(diào)蛋白P (HRGP)的erbB3磷酸化及Akt磷酸化的抑制效果。左側(cè)表示依賴于調(diào)蛋白a的磷酸化，右側(cè)表示依賴于調(diào)蛋白P的磷酸化，從上方開始表示磷酸化erbB3、總erbB3蛋白、磷酸化Akt及總Akt蛋白。另外，左右最上部表示使用的抗體。
[0062]圖2 (a)和(b)表示抗人erbB3抗體對人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)431中的依賴于EGF樣配體的erbB3磷酸化的抑制效果。圖2 (a)表示依賴于雙調(diào)蛋白或P細(xì)胞素的erbB3的磷酸化，圖2 (b)表示依賴于表皮調(diào)節(jié)素或TGF a的erbB3的磷酸化，圖2 (c)表示依賴于EGF或HB-EGF的erbB3的磷酸化。各圖的上部表示磷酸化erbB3，下部表示總erbB3蛋白。另外，各圖的最上部表示使用的抗體。
[0063]圖3 (a)和(b)表不抗人erbB3抗體對人乳腺癌細(xì)胞系T47D中的依賴于EGF樣配體的erbB3磷酸化的抑制效果。圖3 (a)表示依賴于表皮調(diào)節(jié)素的erbB3的磷酸化，圖3 (b)表示依賴于TGFa的erbB3的磷酸化，圖3(c)表示依賴于HB-EGF的erbB3的磷酸化，圖3(d)表示依賴于調(diào)蛋白P的erbB3的磷酸化。各圖的上部表示磷酸化erbB3，下部表示總erbB3蛋白。另外，各圖的最上部表不使用的抗體。
[0064]圖4表示人乳腺癌細(xì)胞系T47D移植小鼠模型中的抗人erbB3抗體的抗腫瘤效果。橫軸表示移植腫瘤后的天數(shù)，縱軸表示腫瘤體積?！醣硎咀鳛閷φ盏目笵NP抗體，?表示1153抗體，〇表示12511抗體，X表示920104抗體，A表示1126抗體，?表示U1-59抗體。
[0065]圖5表示人乳腺癌細(xì)胞系T47D移植小鼠模型中的抗人erbB3抗體的聯(lián)用效果。X表不作為對照的抗DNP抗體，□表不1153抗體，?表不1126抗體，〇表不1153+1126聯(lián)用抗體(1153抗體及1126抗體的聯(lián)用抗體)。橫軸表示移植腫瘤后的天數(shù),縱軸表示腫瘤體積。
[0066]圖6表示人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)431移植小鼠模型中的抗人erbB3抗體的聯(lián)用效果?！醣硎咀鳛閷φ盏目笵NP抗體，?表示1153+12511聯(lián)用抗體(1153抗體及12511抗體的聯(lián)用抗體)，〇表示12511+1126聯(lián)用抗體(12511及1126抗體的聯(lián)用抗體)，X表示1153+1126聯(lián)用抗體(1153抗體及1126抗體的聯(lián)用抗體)。橫軸表示移植腫瘤后的天數(shù)，縱軸表示腫瘤體積。
【具體實施方式】
[0067]本發(fā)明的抗體涉及與erbB3的胞外域(extracellular domain,有時簡記為EO))特異性結(jié)合且抑制依賴于EGF樣配體的erbB3的磷酸化的抗體及該抗體片段。
[0068]erbB3是作為酪氨酸激酶(tyrosine kinase)型受體家族的表皮生長因子受體(EGFR)家族(也稱為HER家族、erbB家族)之一，也稱為erbB3受體、表皮生長因子受體3 (epidermal growth factor receptor3 ；EGFR3)、HER3 受體、Her3 受體或僅稱為 HER3、Her3。
[0069]erbB3為一次跨膜型膜蛋白，胞外域包含配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、二聚體形成結(jié)構(gòu)域，并且細(xì)胞內(nèi)包含酪氨酸磷酸化結(jié)構(gòu)域。已知作為erbB3的特異性配體的調(diào)蛋白與其胞外域的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合時，引起erbB3的二聚體化,從而傳播細(xì)胞增殖信號。
[0070]特別是已知erbB3與其他的作為EGF受體(EGFR)家族的erbBl (EGFR1或HER1)、erbB2 (EGFR2、HER2或Neu)或erbB4 (EGFR4或HER4)的異二聚體參與細(xì)胞增殖。
[0071]本發(fā)明中，erbB3是指包含由Kraus等人(Proc.Nat.Acad.Sc1.86:9193-9197, 1989.)揭示的氨基酸序列的多肽，具體而言是指包含序列號2所示的氨基酸序列的膜蛋白及包含序列號3所示的氨基酸序列的膜蛋白。
[0072]另外，erbB3的氨基酸序列信息可以從 NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)等公知的數(shù)據(jù)庫獲得，可以列舉例如:包含序列號2所示的氨基酸序列的人erbB3(NCBI登記號:NP_001973.2)、包含序列號5所示的氨基酸序列的小鼠erbB3 (NCBI登記號:NP_034283.1)等。
[0073]本發(fā)明中，作為erbB3，可以列舉例如:由在序列號2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一個以上的氨基酸而成的氨基酸序列構(gòu)成且具有erbB3的功能的多肽。
[0074]本發(fā)明的erbB3還包括:包含與序列號2所示的氨基酸序列具有70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上的同源性的氨基酸序列的多肽；最優(yōu)選的由與序列號2所示的氨基酸序列具有95%、96%、97%、98%及99%以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成且具有erbB3的功能的多肽。
[0075]具有在序列號2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一個以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽可以通過如下方法得到:使用定點誘變法[MolecularCloning, A Laboratory Manual,第二 版，冷泉港實驗室出版社(1989) ；CurrentProtocols in Molecular Biology,約翰威立父子出版公司(1987-1997) ；NucleicAcids Research, 10, 6487 (1982) ；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 79, 6409 (1982)；Gene, 34, 315 (1985) ；Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985) ；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82，488(1985)]等，在例如編碼序列號2所示的氨基酸序列的DNA中導(dǎo)入定點突變。缺失、取代或添加的氨基酸數(shù)沒有特別限定，優(yōu)選為一個至數(shù)十個、例如I~20個氨基酸，更優(yōu)選為一個至數(shù)個、例如I~5個氨基酸。
[0076]作為編碼erbB3的基因，可以列舉例如序列號I (NCBI登記號:NM_001982.3)所示的堿基序列的第277位~第4305位所示的人erbB3的堿基序列、序列號4(NCBI登記號:NM_010153.1)所示的小鼠erbB3的堿基序列。
[0077]本發(fā)明的編碼erbB3的基因還包括:含有由在序列號I所示的第277位~第4305位的堿基序列中缺失、取代或添加一個以上的堿基而成的堿基序列構(gòu)成且編碼具有erbB3的功能的多肽的DNA的基因；含有由與序列號I所示的第277位~第4305位的堿基序列具有至少60%以上的同源性的堿基序列、優(yōu)選具有70%、80%以上的同源性的堿基序列、更優(yōu)選具有90%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同源性的堿基序列構(gòu)成且編碼具有erbB3的功能的多肽的DNA的基因；以及含有由在嚴(yán)格條件下與具有序列號I所示的第277位~第4305位的DNA雜交的DNA且編碼具有erbB3的功能的多肽的DNA的基因等。
[0078]在嚴(yán)格條件下雜交的DNA是指使用序列號I所示的第277位~第4305位的DNA作為探針，通過集落雜交法、噬菌斑雜交法、DNA印跡雜交法或DNA微陣列法等得到的能夠雜交的DNA。
[0079]具體而言，可以列舉能夠通過如下方法進(jìn)行鑒定的DNA:使用固定有來源于雜交的集落或噬菌斑的DNA或者具有該序列的PCR產(chǎn)物或寡聚DNA的濾膜或載玻片，在0.7~1.0摩爾/升的氯化鈉存在下，在65°C下進(jìn)行雜交[Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版，冷泉港實驗室出版社(1989) ；Current Protocols in Molecular Biology,約翰威立父子出版公司(1987-1997) ；DNA Cloningl: Core Techniques, APractical Approach,第二版，牛津大學(xué)，(1995)]，然后，使用0.1~2倍濃度的SSC溶液(I倍濃度的SSC溶液的組成為:150毫摩爾/升的氯化鈉 、15毫摩爾/升的檸檬酸鈉)，在65°C的條件下清洗濾膜或載玻片，由此進(jìn)行鑒定。
[0080]作為能夠雜交的DNA，可以列舉與序列號I所示的第277位~第4305位的堿基序列具有至少60%以上同源性的DNA，優(yōu)選具有70%或80%以上同源性的DNA，更優(yōu)選具有90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 以上同源性的 DNA。
[0081]編碼真核生物的蛋白質(zhì)的基因的堿基序列常?？梢源_認(rèn)到基因的多態(tài)性。本發(fā)明的編碼erbB3的基因還包括使本發(fā)明中使用的基因由于這種多態(tài)性而在堿基序列中產(chǎn)生小規(guī)模突變而得到的基因。
[0082]除了特別說明的情況以外，本發(fā)明中的同源性的數(shù)值可以是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的同源性檢索程序計算出的數(shù)值，對于堿基序列而言，可以列舉使用BLAST [J.Mol.Biol., 215, 403 (1990)]中默認(rèn)的參數(shù)算出的數(shù)值等，對于氨基酸序列而言，可以列舉使用 BLAST2[Nucleic AcidsRes.,25, 3389(1997);Genome Res.,7,649 (1997);http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/informations, html]中默認(rèn)的參數(shù)計算出的數(shù)值等。
[0083]作為默認(rèn)的參數(shù)，G(起始空位罰分，Cost to open gap)在堿基序列的情況下為5,在氨基酸序列的情況下為11 ;_E(空位延伸罰分，Cost to extend gap)在堿基序列的情況下為2,在氨基酸序列的情況下為I ;_q(核苷酸錯配罰分，Penalty for nucleotidemismatch)為-3 ;-r(核苷酸匹配得分，reward for nucleotide match)為 I ;-e(期望值，expect value)為10 ;_W(字長大小，word size)在堿基序列的情況下為11個殘基，在氨基酸序列的情況下為3個殘基；-y (非空位延伸下降的閾值，Dropoff (X) for blastextensions in bits)在blastn中為20,在blastn以外的程序中為7 ;-X(空位比對的下降閾值，X dropoff value for gapped alignment in bits)為 15 ;_Z(最終空位比對的下降值，final X dropoff value for gapped alignment in bits)在 blastn 中為 50,在blastn 以外的程序中為 25 (http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
[0084]包含序列號2所示的氨基酸序列的部分序列的多肽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來制作，例如，可以通過使編碼序列號2所示的氨基酸序列的DNA的一部分缺失并對導(dǎo)入有包含上述DNA的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)來制作。
[0085]另外，可以基于使用上述方法制作的多肽或DNA，通過與上述同樣的方法，得到具有在序列號2所示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加一個以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽。
[0086]此外，包含序列號2所示的氨基酸序列的部分序列的多肽或者包含在序列號2所示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加一個以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽，也可以通過芴甲氧羰基(Fmoc)法和叔丁氧羰基(tBoc)法等化學(xué)合成法來制造。
[0087]作為本發(fā)明中的erbB3的胞外域，可以列舉例如:使用公知的跨膜區(qū)預(yù)測程序 SOSUI(http://sosu1.proteome.bi0.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html)、TMHMM2.0 版(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)或 ExPASy Proteomics Server (ExPASy蛋白質(zhì)組服務(wù)器)(http://Ca.expasy.0rg/)等對序列號2所示的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測而得到的區(qū)域等。具體而言，可以列舉例如在ExPASy蛋白質(zhì)組服務(wù)器中預(yù)測出的胞外域。
[0088]已知erbB3的胞外域(ECD)分為結(jié)構(gòu)域I~4 (Dl~D4)，與其他EGFR家族同樣，結(jié)構(gòu)域I和結(jié)構(gòu)域3對于配體結(jié)合很重`要，結(jié)構(gòu)域2對于二聚體形成很重要。具體而言，序列號3所示的氨基酸序列的第20位至第179位氨基酸序列為結(jié)構(gòu)域1，第180位至第328位氨基酸序列為結(jié)構(gòu)域2，第329位至第487位氨基酸序列為結(jié)構(gòu)域3，第488位至第643位氨基酸序列為結(jié)構(gòu)域4。
[0089]EGF樣配體是指與EGFR家族結(jié)合的EGF配體家族。具體而言，可以列舉例如:表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子a (TGF-a)、雙調(diào)蛋白、P細(xì)胞素、表皮調(diào)節(jié)素、肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)、NTAK及調(diào)蛋白[神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulin)]。
[0090]本發(fā)明中，作為erbB3的功能，可以列舉如下功能:誘導(dǎo)依賴于調(diào)蛋白的結(jié)合的erbB3的同二聚體化及異二聚體化,使erbB3磷酸化,結(jié)果促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化。這種erbB3的功能可以通過將該目的蛋白導(dǎo)入宿主細(xì)胞中制作蛋白表達(dá)細(xì)胞并在適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)條件下確認(rèn)配體依賴性效果。
[0091]作為本發(fā)明的抗體，可以列舉:與erbB3的胞外域特異性結(jié)合且抑制依賴于EGF樣配體的erbB3的磷酸化的抗體、與erbB3的胞外域特異性結(jié)合且抑制依賴于erbB3特異性配體的erbB3的磷酸化及不依賴于erbB3特異性配體的erbB3的磷酸化這兩種磷酸化的抗體。[0092]本發(fā)明中，依賴于erbB3特異性配體的erbB3的磷酸化是指，作為erbB3的特異性配體而已知的調(diào)蛋白與erbB3的胞外域結(jié)合，結(jié)果使erbB3的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化。
[0093]本發(fā)明中，不依賴于erbB3特異性配體的erbB3的磷酸化是指,包括作為erbB3特異性配體的調(diào)蛋白的EGF樣配體與erbB3以外的erbB家族的胞外域結(jié)合,結(jié)果，與erbB3形成異二聚體而使erbB3的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化?；蛘?，不依賴于erbB3特異性配體的erbB3的磷酸化可以指以依賴于EGF樣配體的方式引起的間接的erbB3的磷酸化。
[0094]本發(fā)明的抗體能夠同時抑制上述依賴于/不依賴于erbB3特異性配體的erbB3的
磷酸化。
[0095]具體而言，可以列舉:抑制依賴于選自表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子a (TGF-a)、雙調(diào)蛋白、P細(xì)胞素、表皮調(diào)節(jié)素、肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)、NTAK及調(diào)蛋白(neuregulin)中的至少2種、3種、4種、5種或6種配體的erbB3的磷酸化的抗體、優(yōu)選抑制所有依賴于EGF樣配體的erbB3的磷酸化的抗體。
[0096]作為本發(fā)明的抗體，可以列舉:與包含選自由序列號3所示的氨基酸序列的第20位至第179位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域1、由第180位至第328位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域
2、由第329位至第487位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域3及由第488位至第643位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域4中的至少一個結(jié)構(gòu)域的胞外域結(jié)合的抗體，優(yōu)選列舉與包含結(jié)構(gòu)域2或結(jié)構(gòu)域4中的至少一個結(jié)構(gòu)域的胞外域結(jié)合的抗體，更優(yōu)選列舉與包含結(jié)構(gòu)域2的胞外域結(jié)合的抗體及與包含結(jié)構(gòu)域4的胞外域結(jié)合的抗體。
[0097]另外，作為本發(fā)明的抗體，可以列舉與erbB3的胞外域中的Dl至D4各結(jié)構(gòu)域中存在的表位結(jié)合的抗體。
[0098]此外，作為本發(fā)明的抗體，可以列舉能夠抑制erbB3的二聚體化的抗體、能夠抑制erbB3與其他erbB家族(erbBl、erbB2及erbB4)的異二聚體化的抗體。具體而言，可以列舉能夠抑制選自erbB3_erbBl、erbB3_erbB2及erbB3_erbB4中的至少一組的相互作用的抗體。
[0099]此外，作為本發(fā)明的抗體，也包含抑制依賴于與erbB3相互作用的生長因子受體的erbB3的磷酸化的抗體。具體而言，可以列舉抑制依賴于肝細(xì)胞生長因子(hepatocytegrowth factor ；HGF)受體(c_Met)的erbB3的憐酸化的抗體。
[0100]本發(fā)明的抗體包括單克隆抗體、寡克隆抗體及多克隆抗體中的任何一種抗體。
[0101]本發(fā)明中，單克隆抗體為單一克隆的抗體產(chǎn)生細(xì)胞所分泌的抗體，該抗體僅識別一個表位(也稱為抗原決定簇)，并且構(gòu)成單克隆抗體的氨基酸序列(一級結(jié)構(gòu))一致。寡克隆抗體、多克隆抗體為含有兩種以上的單克隆抗體的抗體混合物。
[0102]作為表位，可以列舉例如:單克隆抗體所識別并結(jié)合的單一氨基酸序列、由氨基酸序列構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)、結(jié)合有糖鏈的氨基酸序列以及由結(jié)合有糖鏈的氨基酸序列構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)等。立體結(jié)構(gòu)是天然存在的蛋白質(zhì)所具有的三維立體結(jié)構(gòu)，是指在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜上表達(dá)的蛋白質(zhì)所構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)。
[0103]作為本發(fā)明的抗體識別的表位，可以列舉例如:在細(xì)胞膜上表達(dá)的erbB3上存在的表位中由erbB3的氨基酸序列構(gòu)成的一級結(jié)構(gòu)、由erbB3的氨基酸序列構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)、在erbB3的氨基酸序列上結(jié)合有糖鏈的立體結(jié)構(gòu)及由EGFR家族蛋白的晶體結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果規(guī)定的三維立體結(jié)構(gòu)上的氨基酸殘基等。
[0104]抗體分子也稱為免疫球蛋白(以下記作Ig)，人抗體根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的差異分為IgAU IgA2、IgD、IgE、IgGU IgG2、IgG3、IgG4和IgM各同種型。氨基酸序列的同源性較高的 IgGU IgG2、IgG3 和 IgG4 也統(tǒng)稱為 IgG。
[0105]抗體分子由稱為重鏈(Heavy chain,以下記作H鏈)和輕鏈(Light chain,以下記作L鏈)的多肽構(gòu)成。另外，H鏈從N端側(cè)起由H鏈可變區(qū)(也記作VH)、H鏈恒定區(qū)(也記作CH)各區(qū)域構(gòu)成，L鏈從N端側(cè)起由L鏈可變區(qū)(也記作VL)、L鏈恒定區(qū)(也記作CL)各區(qū)域構(gòu)成。
[0106]各亞類抗體的CH分別已知a、S、e、Y和ii鏈。而且，CH從N端側(cè)起由CHl結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域各結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。
[0107]結(jié)構(gòu)域是指構(gòu)成抗體分子的各多肽的功能性結(jié)構(gòu)單元。另外，將CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域合并稱為Fe段或簡稱Fe。CL已知C A鏈和C K鏈。
[0108]本發(fā)明中的CHl結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和Fe段可以根據(jù)EU 索引 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept.Health and Human Services (1991)]用自N端起的氨基酸殘基的編號來確定。
[0109]具體而言，CHl確定為EU索引第118~215位的氨基酸序列，鉸鏈確定為EU索引第216~230位的氨基酸序列，CH2確定為EU索引第231~340位的氨基酸序列，CH3確定為EU索引第341~447位的氨基酸序列。
[0110]作為本發(fā)明的抗體，特別地，也包括人嵌合抗體(以下也簡記為嵌合抗體)、人源化抗體[也稱為互補決定區(qū)(Complementarity Determining Region ;Q)R)移植抗體]和人抗體等基因重組抗體。
[0111]嵌合抗體是指包含人以外的動物(非人動物)的抗體的VH和VL與人抗體的CH和CL的抗體。作為非人動物，只要是例如小鼠、大鼠、倉鼠和兔等能夠制作雜交瘤的動物，則均可以使用。
[0112]雜交瘤是指通過使對非人動物進(jìn)行抗原免疫而獲得的B細(xì)胞與來源于小鼠等的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合而得到的、產(chǎn)生具有期望的抗原特異性的單克隆抗體的細(xì)胞。因此，構(gòu)成雜交瘤所產(chǎn)生的抗體的可變區(qū)包含非人動物抗體的氨基酸序列。
[0113]人嵌合抗體可以通過如下方法進(jìn)行制造:由生產(chǎn)單克隆抗體的非人動物細(xì)胞來源的雜交瘤獲取編碼VH和VL的cDNA，將它們分別插入到具有編碼人抗體的CH和CL的DNA的動物細(xì)胞用表達(dá)載體中，構(gòu)建人嵌合抗體表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入動物細(xì)胞中，由此進(jìn)行表達(dá)，從而制造人嵌合抗體。
[0114]人源化抗體是指將非人動物抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗體的VH和VL的對應(yīng)的CDR中而得到的抗體。將VH和VL的CDR以外的區(qū)域稱為框架區(qū)(以下記作FR)。
[0115]人源化抗體可以通過如下方法進(jìn)行制造:構(gòu)建編碼VH的氨基酸序列的cDNA和編碼VL的氨基酸序列的 cDNA，所述VH的氨基酸序列包含非人動物抗體的VH的CDR的氨基酸序列和任意的人抗體的VH的FR的氨基酸序列，所述VL的氨基酸序列包含非人動物抗體的VL的CDR的氨基酸序列和任意的人抗體的VL的FR的氨基酸序列，將上述cDNA分別插入到具有編碼人抗體的CH和CL的DNA的動物細(xì)胞用表達(dá)載體中，構(gòu)建人源化抗體表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入動物細(xì)胞中，由此進(jìn)行表達(dá)，從而制造人源化抗體。
[0116]人抗體原本是指人體內(nèi)天然存在的抗體，也包括由利用最近的基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)育工程的技術(shù)進(jìn)步制作的人抗體噬菌體文庫及產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物得到的抗體
坐寸o
[0117]人抗體可以通過用期望的抗原對保有人免疫球蛋白基因的小鼠(TomizukaK.et.al.,Proc Natl Acad Sci USA.97，722-7，2000.)進(jìn)行免疫而獲得。另外，可以通過使用對抗體基因進(jìn)行擴增而得到的噬菌體展示文庫從來源于人類的B細(xì)胞中選擇具有期望的結(jié)合活性的人抗體而在不進(jìn)行免疫的情況下獲得人抗體(Winter G.et.al., Annu Rev Immunol.12:433-55.1994)。此外，可以通過使用ElB病毒使人B細(xì)胞永生化而制作生產(chǎn)具有期望的結(jié)合活性的人抗體的細(xì)胞，從而獲得人抗體(Rosen A.et.al., Nature267, 52-54.1977)。
[0118]人體內(nèi)存在的抗體例如可以如下獲得:使由人外周血分離出的淋巴細(xì)胞感染EB病毒等，由此使其永生化，然后進(jìn)行克隆，由此可以培養(yǎng)出產(chǎn)生該抗體的淋巴細(xì)胞，并可以從培養(yǎng)物中純化出該抗體。
[0119]人抗體噬菌體文庫是通過將由人B細(xì)胞制備的抗體基因插入到噬菌體基因中而使Fab、scFv等抗體片段在表面進(jìn)行表達(dá)而得到的噬菌體的文庫?？梢砸钥贵w片段對固定有抗原的底物的結(jié)合活性為指標(biāo)，從該文庫中回收表達(dá)具有期望的抗原結(jié)合活性的抗體片段的噬菌體。該抗體片段還可以進(jìn)一步通過基因工程的方法轉(zhuǎn)變?yōu)榘瑑蓷l完整的H鏈和兩條完整的L鏈的人抗體分 子。
[0120]產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物是指宿主動物的染色體內(nèi)重組有人抗體基因的動物。具體而言，將人抗體基因?qū)胄∈驟S細(xì)胞中，將該ES細(xì)胞移植到其他小鼠的早期胚胎中，然后使其發(fā)育，由此，能夠制作產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物。由產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物制作人抗體的方法中，利用通常的在人以外的哺乳動物中實施的雜交瘤制作方法獲取產(chǎn)生人抗體的雜交瘤并進(jìn)行培養(yǎng)，由此，能夠在培養(yǎng)物中產(chǎn)生并蓄積人抗體。
[0121]作為本發(fā)明的抗體的VH及VL的氨基酸序列，可以是人抗體的VH及VL的氨基酸序列、非人動物抗體的VH及VL的氨基酸序列、或者將非人動物抗體的CDR移植到人抗體的框架中而得到的人源化抗體的氨基酸序列中的任何一種氨基酸序列。具體而言，可以列舉例如:雜交瘤所產(chǎn)生的非人動物抗體的VH及VL的氨基酸序列、人源化抗體的VH及VL的氨基酸序列以及人抗體的VH及VL的氨基酸序列等。
[0122]作為本發(fā)明的抗體的CL的氨基酸序列，可以是人抗體的氨基酸序列或非人動物抗體的氨基酸序列中的任何一種氨基酸序列，優(yōu)選人抗體的氨基酸序列的c K或C入。
[0123]作為本發(fā)明的抗體的CH，只要屬于免疫球蛋白則可以是任何一種CH，可以優(yōu)選使用屬于IgG類的亞類Y I (IgGl) > y 2(IgG2) > y 3(IgG3)或y 4(IgG4)中的任何一種。
[0124]效應(yīng)活性是指抗體的Fe段介導(dǎo)產(chǎn)生的抗體依賴性的活性，已知抗體依賴性細(xì)胞毒活性(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity activity ;ADCC 活性)、補體依賴性細(xì)胞毒活性(Complement-Dependent cytotoxicity activity ;CDC 活性)或者巨曬細(xì)胞或樹狀細(xì)胞等吞曬細(xì)胞的抗體依賴性吞曬作用(Antibody-dependent phagocytosisactivity ;ADP活性)等。本發(fā)明中,ADCC活性及⑶C活性可以使用公知的測定方法[CancerImmunol.1mmunother., 36, 373(1993)]進(jìn)行測定。
[0125]ADCC活性是指與靶細(xì)胞上的抗原結(jié)合的抗體通過抗體的Fe段介導(dǎo)與免疫細(xì)胞的Fe受體結(jié)合、由此使免疫細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞等)活化而殺傷靶細(xì)胞的活性。
[0126]Fe受體(以下有時也記作FcR)是與抗體的Fe段結(jié)合的受體，其通過抗體的結(jié)合來誘導(dǎo)各種效應(yīng)活性。FcR與抗體的亞類對應(yīng)，IgG、IgE、IgA、IgM分別與Fe Y R> Fe e R、Fe a R、Fcii R特異性結(jié)合。
[0127]此外，F(xiàn)e￥1?存在卩(^1?1(0)64)、卩(^1?11(0)32)和 Fe Y RIII (CD16)各亞型，并分別存在 Fe y RIA,Fe y RIB,Fe y RIC,Fe y RIIA,Fe y RUB,Fe y RIIC,Fe y RIIIA,Fe y RIIIB各同種型。上述不同的Fe y R存在于不同的細(xì)胞上(Annu.Rev.1mmunol.9:457-492 (1991)。
[0128]對于人類而言，F(xiàn)e Y RIIIB在中性粒細(xì)胞上特異性地表達(dá)，F(xiàn)e Y RIIIA在單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)及一部分T細(xì)胞上表達(dá)。Fe Y RIIIA介導(dǎo)的抗體的結(jié)合誘導(dǎo)NK細(xì)胞依賴性的ADCC活性。
[0129]CDC活性是指與靶細(xì)胞上的抗原結(jié)合的抗體使血液中的包含補體相關(guān)蛋白族的一連串級聯(lián)反應(yīng)(補體活化途徑)活化、從而殺傷靶細(xì)胞的活性。另外，利用由補體活化產(chǎn)生的蛋白質(zhì)片段，可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的游走和活化。CDC活性的級聯(lián)反應(yīng)通過下述反應(yīng)開始:具有與抗體的Fe段結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的Clq與Fe段結(jié)合，并與兩種絲氨酸蛋白酶Clr和Cls結(jié)合，由此形成Cl復(fù)合物。
[0130]作為本發(fā)明的抗體，具體可以列舉:含有包含序列號57所示的氨基酸序列的VH及包含序列號58所示的氨基酸序列的VL的抗體、含有包含序列號69所示的氨基酸序列的VH及包含序列號70所示的氨基酸序列的VL的抗體、含有包含序列號81所示的氨基酸序列的VH及包含序列號82所示的氨基酸序列的VL的抗體、以及含有包含序列號93所示的氨基酸序列的VH及包含序列號94所不的氨基酸序列的VL的抗體、含有分別包含序列號59~61所示的氨基酸序列的H鏈CDRl~3及 分別包含序列號62~64所示的氨基酸序列的L鏈⑶Rl~3的抗體、含有分別包含序列號71~73所示的氨基酸序列的H鏈⑶Rl~3及分別包含序列號74~76所不的氨基酸序列的L鏈⑶Rl~3的抗體、含有分別包含序列號83~85所示的氨基酸序列的H鏈⑶Rl~3及分別包含序列號86~88所示的氨基酸序列的L鏈⑶Rl~3的抗體、以及含有分別包含序列號95~97所示的氨基酸序列的H鏈⑶Rl~3及分別包含序列號98~100所示的氨基酸序列的L鏈⑶Rl~3的抗體等。
[0131]作為本發(fā)明的抗體，可以列舉:含有分別包含序列號59~61所不的氨基酸序列的H鏈⑶Rl~3及分別包含序列號62~64所不的氨基酸序列的L鏈⑶Rl~3的1153抗體克隆、含有分別包含序列號71~73表不的氨基酸序列的H鏈⑶Rl~3及分別包含序列號74~76所示的氨基酸序列的L鏈⑶Rl~3的920104抗體克隆、含有分別包含序列號83~85所示的氨基酸序列的H鏈⑶Rl~3及分別包含序列號86~88所示的氨基酸序列的L鏈⑶Rl~3的1126抗體克隆、以及含有分別包含序列號95~97所示的氨基酸序列的H鏈⑶Rl~3及分別包含序列號98~100所示的氨基酸序列的L鏈⑶Rl~3的12511抗體克隆。
[0132]作為本發(fā)明的基因重組抗體，可以列舉:含有分別包含序列號59~61所示的氨基酸序列的H鏈⑶Rl~3及分別包含序列號62~64所示的氨基酸序列的L鏈⑶Rl~3的抗體、含有分別包含序列號71~73所不的氨基酸序列的H鏈⑶Rl~3及分別包含序列號74~76所示的氨基酸序列的L鏈⑶Rl~3的抗體、含有分別包含序列號83~85所示的氨基酸序列的H鏈⑶Rl~3及分別包含序列號86~88所示的氨基酸序列的L鏈⑶Rl~3的抗體、以及含有分別包含序列號95~97所示的氨基酸序列的H鏈⑶Rl~3及分別包含序列號98~100所示的氨基酸序列的L鏈⑶Rl~3的抗體等。
[0133]作為本發(fā)明的抗體，可以列舉下述(a)~(C)所述的抗體。
[0134](a)與選自1153抗體克隆、12511抗體克隆、920104抗體克隆及1126抗體克隆中的任何一個抗體克隆發(fā)生競爭反應(yīng)的抗體及該抗體片段。
[0135](b)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段，所述表位包含與選自1153抗體克隆、12511抗體克隆、920104抗體克隆及1126抗體克隆中的任何一個抗體克隆反應(yīng)的表位。
[0136](c)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段，所述表位和與選自1153抗體克隆、12511抗體克隆、920104抗體克隆及1126抗體克隆中的任何一個抗體克隆反應(yīng)的表位相同。
[0137]另外，作為本發(fā)明的抗體，可以列舉:和上述抗體競爭地與erbB3的胞外域結(jié)合的抗體、與包含與上述抗體反應(yīng)且存在于erbB3的胞外域的表位的表位反應(yīng)的抗體、以及與和與上述抗體反應(yīng)且存在于erbB3的胞外域的表位相同的表位反應(yīng)的抗體。
[0138]本發(fā)明中，“與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段，所述表位包含與選自1153抗體克隆、12511抗體克隆、920104抗體克隆及1126抗體克隆中的任何一個抗體克隆反應(yīng)的表位”是指，與包含與選自1153抗體克隆、12511抗體克隆、920104抗體克隆及1126抗體克隆中的第一抗體反應(yīng)的第一表位的第二表位結(jié)合的第二抗體。
[0139]作為本發(fā)明的抗體，F(xiàn)e與抗體片段結(jié)合而成的Fe融合蛋白、Fe與天然存在的配體或受體結(jié)合而成的Fe融合蛋白(也稱為免疫粘附素)、多個Fe段融合而成的Fe融合蛋白等也包括在本發(fā)明中。另外，為了使抗體的效應(yīng)活性增強或產(chǎn)生缺陷、為了使抗體穩(wěn)定化及控制血中半衰期而進(jìn)行了氨基酸殘基`修飾的包含氨基酸殘基修飾的Fe段也可以用作本發(fā)明的抗體。
[0140]作為本發(fā)明的抗體，可以列舉與選自包含序列號3所示的氨基酸序列的erbB3的胞外域的結(jié)構(gòu)域I~結(jié)構(gòu)域4中的至少2個結(jié)構(gòu)域反應(yīng)的抗體及該抗體片段。具體而言，可以列舉與選自結(jié)構(gòu)域I與結(jié)構(gòu)域2、結(jié)構(gòu)域I與結(jié)構(gòu)域3、結(jié)構(gòu)域I與結(jié)構(gòu)域4、結(jié)構(gòu)域2與結(jié)構(gòu)域3、結(jié)構(gòu)域2與結(jié)構(gòu)域4及結(jié)構(gòu)域3與結(jié)構(gòu)域4中的任何一種組合反應(yīng)的抗體。上述抗體中，優(yōu)選與選自結(jié)構(gòu)域I與結(jié)構(gòu)域2、結(jié)構(gòu)域I與結(jié)構(gòu)域4、結(jié)構(gòu)域2與結(jié)構(gòu)域3及結(jié)構(gòu)域3與結(jié)構(gòu)域4中的任何一種組合反應(yīng)的抗體，更優(yōu)選與結(jié)構(gòu)域I和結(jié)構(gòu)域4反應(yīng)的抗體。
[0141]與erbB3的胞外域的2個結(jié)構(gòu)域反應(yīng)的抗體可以通過現(xiàn)有的雙特異性抗體、多價抗體(multivalent ant ibody> poly valent antibody)制作技術(shù)(國際公開第 1998/050431號、國際公開第2001/7734號、國際公開第2002/002773號、國際公開第2009/131239號)來制作。
[0142]本發(fā)明中，作為抗體片段，可以列舉:Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、雙價抗體(Diabody)、dsFv、包含 Q)R 的肽等。
[0143]Fab是將IgG抗體用蛋白分解酶木瓜蛋白酶進(jìn)行處理而得到的片段中(在H鏈的第224位的氨基酸殘基處切斷)N端側(cè)約一半的H鏈與整個L鏈通過二硫鍵(S-S鍵)結(jié)合而成的分子量約為5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。
[0144]F(ab’)2是將IgG用蛋白分解酶胃蛋白酶進(jìn)行處理而得到的片段中(在H鏈的第234位的氨基酸殘基處切斷)比Fab通過鉸鏈區(qū)的S-S鍵結(jié)合而成的片段稍大的分子量約為10萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。
[0145]Fab’是將上述F(ab’ )2的鉸鏈區(qū)的S-S鍵切斷而得到的分子量約為5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。
[0146]scFv是使用12個殘基以上的適當(dāng)?shù)碾慕宇^(P)將一條VH與一條VL連接而形成的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。
[0147]雙價抗體是抗原結(jié)合特異性相同或不同的scFv形成二聚體而得到的抗體片段，是對相同的抗原具有二價抗原結(jié)合活性或者對不同的兩種抗原具有雙特異性抗原結(jié)合活性的抗體片段。
[0148]dsFv是指使VH和VL中的各一個氨基酸殘基取代成半胱氨酸殘基的多肽通過該半胱氨酸殘基之間的S-S鍵結(jié)合而得到的抗體片段。
[0149]包含⑶R的肽包含VH或VL的⑶R中的至少一個以上的區(qū)域而構(gòu)成。包含多個CDR的肽可以使CDR之間直接結(jié)合或者通過適當(dāng)?shù)碾慕宇^進(jìn)行結(jié)合。
[0150]包含⑶R的肽可以如下制造:構(gòu)建編碼本發(fā)明的修飾抗體的VH及VL的⑶R的DNA,將該DNA插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，并將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物中，由此使其進(jìn)行表達(dá)，從而制造包含CDR的肽。另外，包含CDR的肽也可以通過Fmoc法或tBoc法等化學(xué)合成法來制造。
[0151]作為本發(fā)明的抗體組合物，可以列舉含有兩種以上的上述中記載的抗體或該抗體片段的抗體組合物(或混合物)等。具體而言，可以列舉含有與含有選自包含序列號I所示的氨基酸序列的erbB3的胞外域的結(jié)構(gòu)域I~結(jié)構(gòu)域4中的至少一個結(jié)構(gòu)域的胞外域反應(yīng)的第一抗體或該抗體片段和與不同于第一抗體的結(jié)構(gòu)域反應(yīng)的第二抗體或該抗體片段的抗體組合物等。其中，優(yōu)選第一抗體為與erbB3的結(jié)構(gòu)域4或結(jié)構(gòu)域2反應(yīng)的抗體且第二抗體為與erbB3的結(jié)構(gòu)域I或結(jié)構(gòu)域3反應(yīng)的抗體的抗體組合物，更優(yōu)選第一抗體為與erbB3的結(jié)構(gòu)域4反應(yīng)的抗體且第二抗體為與erbB3的結(jié)構(gòu)域I反應(yīng)的抗體的抗體組合物
等o
[0152]上述第一抗體優(yōu)選為選自下述(a)~(C)中的抗體或該抗體片段。
[0153](a)與1126抗體克隆發(fā)生競爭反應(yīng)的抗體及該抗體片段。
[0154](b)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段，所述表位包含與1126抗體克隆反應(yīng)的表位。
[0155](c)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段，所述表位和與1126抗體克隆反應(yīng)的表位相同。
[0156]另外，上述第二抗體優(yōu)選為選自下述(a)~(C)中的抗體或該抗體片段。
[0157](a)與1153抗體克隆發(fā)生競爭反應(yīng)的抗體及該抗體片段。
[0158](b)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段，所述表位包含與1153抗體克隆反應(yīng)的表位。
[0159](c)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段，所述表位和與1153抗體克隆反應(yīng)的表位相同。[0160]本發(fā)明的抗體組合物能夠抑制erbB3特異性配體向erbB3上的結(jié)合，同時能夠抑制erb3與erbB家族的二聚體化(同二聚體及異二聚體)。
[0161]本發(fā)明的抗體包括:利用化學(xué)方法或基因工程方法在本發(fā)明的特異性地識別erbB3的胞外域且抑制依賴于EGF樣配體的erbB3的磷酸化的抗體或該抗體片段上結(jié)合放射性同位素、低分子藥劑、高分子藥劑、蛋白質(zhì)或抗體藥物等而得到的抗體的衍生物。
[0162]本發(fā)明中的抗體的衍生物可以通過利用化學(xué)方法[抗體工學(xué)入門(抗體工程入門)，地人書館(1994)]在本發(fā)明的特異性地識別erbB3的胞外域且抑制依賴于EGF樣配體的erbB3的磷酸化的抗體或該抗體片段的H鏈或L鏈的N端側(cè)或C端側(cè)、抗體或該抗體片段中的適當(dāng)?shù)娜〈騻?cè)鏈以及抗體或該抗體片段中的糖鏈等上結(jié)合放射性同位素、低分子藥劑、高分子藥劑、免疫刺激劑、蛋白質(zhì)或抗體藥物等來制造。
[0163]另外，本發(fā)明中的抗體的衍生物可以通過下述基因工程方法來制造:使編碼本發(fā)明的特異性地識別erbB3的胞外域且抑制依賴于EGF樣配體的erbB3的磷酸化的抗體或抗體片段的DNA與編碼要結(jié)合的蛋白質(zhì)或抗體藥物的DNA連接后將其插入表達(dá)載體中，并將該表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。
[0164]作為放射性同位素，可以列舉例如:mIn、1311、1251、9°Y、64Cu、99TC、77Lu或211At等。放射性同位素可以通過氯胺T法等直接與抗體進(jìn)行結(jié)合。另外，也可以在抗體上結(jié)合用于螯合放射性同位素的物質(zhì)。作為螯合劑，可以列舉例如1-異硫氰酸芐酯基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。
[0165]作為低分子藥劑，可以列舉例如:烷化劑、亞硝基脲劑、代謝拮抗劑、抗生素、植物生物堿、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制 劑、激素療法制劑、激素拮抗劑、芳香化酶抑制劑、P糖蛋白抑制劑、鉬絡(luò)合物衍生物、M期抑制劑或激酶抑制劑等抗癌劑[臨床腫瘤學(xué)，癌癥與化學(xué)療法出版社(1996)]、氫化可的松或潑尼松龍等留體制劑，阿司匹林或吲哚美辛等非留體制劑，硫代蘋果酸金、青霉胺等免疫調(diào)節(jié)劑，環(huán)磷酰胺或硫唑嘌呤等免疫抑制劑、馬來酸氯苯那敏或氯馬斯汀等抗組胺劑等抗炎劑[炎癥與抗炎療法，醫(yī)齒藥出版株式會社(1982)]等。
[0166]作為抗癌劑，可以列舉例如:阿米福汀(氨磷汀)、順鉬、達(dá)卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、鏈脲霉素、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、吉西他濱(健擇)、柔紅霉素、丙卡巴肼、絲裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、長春堿、長春新堿、博來霉素、道諾霉素、培洛霉素、雌莫司汀、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(多西他奇)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡鉬、奧沙利鉬、奈達(dá)鉬、克拉屈濱、喜樹堿、10-羥基-7-乙基-喜樹堿(SN38)、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、羥基脲、異環(huán)磷酰胺、伊達(dá)比星、美司那、依立替康(CPT-1l)、拓?fù)涮婵怠⒚淄休祯?、托泊替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、羥基脲、普卡霉素、密妥坦、培門冬酶、噴司他丁、哌泊溴烷、鏈脲霉素、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睪內(nèi)酯、硫鳥嘌呤、塞替派、烏拉莫司汀、長春瑞濱、苯丁酸氮芥、氫化可的松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、長春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他濱、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奧沙利鉬、吉非替尼(易瑞沙)、伊馬替尼(STI571)、厄洛替尼、FMS樣酪氨酸激酶3 (FMS-1iketyrosine kinase3 ；Flt3)抑制劑、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)抑制劑、成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR)抑制劑、易瑞沙、特羅凱等表皮生長因子受體(epidermal growthfactor receptor ；EGFR)抑制劑、根赤殼菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格爾德霉素、雷帕霉素、安吖啶、全反式維甲酸、沙利度胺、來那度胺、阿那曲唑、法曲唑、來曲唑、依西美坦、硫代蘋果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立賓、環(huán)孢素、雷帕霉素、氫化可的松、蓓薩羅丁(塔革雷汀)、他莫昔芬、地寒米松、孕激素類、雌激素類、阿那曲唑(瑞寧德)、利普安、阿司匹林、吲哚美辛、塞來昔布、硫唑嘌呤、青霉胺、硫代蘋果酸金、馬來酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯馬斯汀、維甲酸、蓓薩羅丁、砷、硼替佐米、別嘌呤醇、卡奇霉素、替伊莫單抗、塔革雷汀、奧唑米星、克拉霉素、瘤可維、異環(huán)磷酰胺、酮康唑、氨魯米特、蘇拉明、甲氨蝶呤、類美登醇或其衍生物等。
[0167]作為使低分子藥劑與抗體結(jié)合的方法，可以列舉例如:通過戊二醛使藥劑與抗體的氨基之間結(jié)合的方法、或通過水溶性碳二亞胺使藥劑的氨基與抗體的羧基結(jié)合的方法
坐寸o
[0168]作為高分子藥劑，可以列舉例如:聚乙二醇(以下記作PEG)、白蛋白、右旋糖酐、聚環(huán)氧乙烷、苯乙烯馬來酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物或羥丙基甲基丙烯酰胺等。
[0169]通過使這些高分子化合物與抗體或抗體片段結(jié)合，可以期待如下效果:(I)提高對化學(xué)性、物理性或生物性的各種因素的穩(wěn)定性；(2)顯著延長血中半衰期；(3)抑制免疫原性消失或抑制抗體產(chǎn)生；等[才- 二欠'一卜醫(yī)薬品，廣川書店(1993)]。
[0170]作為使PEG與抗體結(jié)合的方法，可以列舉例如與PEG化修飾試劑進(jìn)行反應(yīng)的方法等[K 4才- >夕二 —卜醫(yī)薬品，廣川書店(1993)]。作為PEG化修飾試劑，可以列舉例如:賴氨酸的e -氨基的修飾劑(日本特開昭61-178926號公報)、天冬氨酸及谷氨酸的羧基的修飾劑(日本特開昭56-23587號公報)或精氨酸的胍基的修飾劑(日本特開平2-117920號公報)等。
[0171 ] 作為免疫刺激劑,可以是作為免疫佐劑已知的天然物，作為具體例，例如，使免疫亢進(jìn)的藥劑可以列舉4 (1 — 3)葡聚糖(香菇多糖、西佐糖)或a-半乳糖神經(jīng)酰胺(KRN7000)等。
[0172]作為蛋白質(zhì)，可以列舉例如:激活NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或中性粒細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞的細(xì)胞因子或增殖因子或者毒素蛋白等。
[0173]作為細(xì)胞因子或增殖因子，可以列舉例如:干擾素(以下記作IFN)-a、INF-^、INF-Y、白細(xì)胞介素(以下記作IL)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)或巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)等。作為毒素蛋白，可以列舉例如:蓖麻毒素、白喉毒素或ONTAK等，還包括為調(diào)節(jié)毒性而向蛋白質(zhì)中引入突變而得到的蛋白毒素。
[0174]作為抗體藥物，可以列舉例如抗下述抗原的抗體:通過抗體的結(jié)合誘導(dǎo)凋亡的抗原、與腫瘤的病態(tài)形成相關(guān)的抗原或調(diào)節(jié)免疫功能的抗原、與病變部位的血管新生相關(guān)的抗原。
[0175]作為通過抗體的結(jié)合誘導(dǎo)凋亡的抗原，可以列舉例如:分化抗原(以下記作CD) 19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86 (B7.2)、人類白細(xì)胞抗原(HLA) II 類或表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor ；EGFR)等。
[0176]作為與腫瘤的病態(tài)形成相關(guān)的抗原或調(diào)節(jié)免疫功能的抗體的抗原，可以列舉例如:CD4、CD40、CD40 配體、B7 家族分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7_H3 或 B7-H4)、B7 家族分子的配體(CD28、CTLA-4、I COS, PD-1 或 BTLA)、0X-40、0X-40 配體、CD137、腫瘤壞死因子(TNF)受體家族分子(DR4、DR5、TNFRl或TNFR2)、TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體受體(TNF-related apoptosis-1nducing ligand receptor ；TRAIL)家方矣分子、TRAIL 家方矣分子的受體家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3或TRAIL-R4)、核因子k B受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand ;RANK)、RANK配體、CD25、葉酸受體 4、細(xì)胞因子[IL-1 a、IL-1 P、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF) ^或TNF a等]、上述細(xì)胞因子的受體、趨化因子(SLC、ELC、1-309、TARC、MDC或CTACK等)或上述趨化因子的受體。
[0177]作為抑制病變部位的血管新生的抗體的抗原，可以列舉例如:血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor ;VEGF)、血管生成素(angiopoietin)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor ;FGF)、EGF、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growthfactor ；HGF)、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor ；PDGF)、膜島素樣生長因子(insulin-like growth factor ;IGF)、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin ;EP0)、TGFP、IL-8、Ephilin、SDF-1 或它們的受體等。
[0178]與蛋白質(zhì)或抗體藥物的融合抗體可以如下制造:使編碼蛋白質(zhì)的cDNA與編碼單克隆抗體或抗體片段的cDNA連接，構(gòu)建編碼融合抗體的DNA，將該DNA插入原核生物或真核生物用表達(dá)載體中，并將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物中，由此進(jìn)行表達(dá)而制造融合抗體。
[0179]將上述抗體的衍生物作為檢測方法、定量方法、檢測用試劑、定量用試劑或診斷劑使用的情況下，作為與本發(fā)明的特異性識別erbB3的胞外域的天然型立體結(jié)構(gòu)且與該胞外域結(jié)合的單克隆抗體或 該抗體片段結(jié)合的藥劑，可以列舉例如通常的免疫學(xué)檢測或測定方法中使用的標(biāo)記物。
[0180]作為標(biāo)記物，可以列舉例如:堿性磷酸酶、過氧化物酶或熒光素酶等酶；吖啶酯或洛酚堿等發(fā)光物質(zhì)；或者異硫氰酸熒光素(FITC)或三甲基羅丹明(RITC)等熒光物質(zhì)等。
[0181]本發(fā)明中，作為腫瘤、惡性腫瘤及癌，可以列舉選自由大腸癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、腦腫瘤、黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、白血病、淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、皮膚癌、尿道癌、前列腺癌、絨癌、咽癌、喉癌、胸膜瘤、男性細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜異位癥、胚胎瘤、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、成血管細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、橫紋肌肉瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤、甲狀腺肉瘤及腎母細(xì)胞瘤組成的組中的任何一種。
[0182]以下，對本發(fā)明的抗體的制作方法、使用抗體的erb3的測定方法、診斷方法及治療方法進(jìn)行具體說明。
[0183]1.抗體的制作方法
[0184]本發(fā)明中，單克隆抗體的制造時，包括下述操作步驟。
[0185]即，(I)作為免疫原使用的生物高分子的純化和/或在細(xì)胞表面過量表達(dá)抗原蛋白的細(xì)胞的制作；(2)通過對動物注射抗原而進(jìn)行免疫后，采集血液檢測其抗體效價而決定脾臟等的摘除時期，然后制備抗體產(chǎn)生細(xì)胞的步驟；(3)骨髓瘤細(xì)胞(以下稱為骨髓瘤)的制備；(4)抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤的細(xì)胞融合；(5)產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交瘤群的篩選；(6)向單一細(xì)胞克隆的分割(克隆)；(7)根據(jù)情況，用于大量制造單克隆抗體的雜交瘤的培養(yǎng)或移植雜交瘤后的動物的飼養(yǎng)；(8)以這種方式制造的單克隆抗體的生理活性及其識別特異性的研究或作為標(biāo)記試劑的特性的檢測；等。
[0186]以下，沿上述步驟詳述本發(fā)明的抗erbB3抗體的制作方法，但該抗體的制作法方不限于此，例如也可以使用脾細(xì)胞以外的抗體產(chǎn)生細(xì)胞及骨髓瘤。另外，也可以使用來源于產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物血清的抗體。
[0187](I)抗原的純化
[0188]作為抗原的erbB3或表達(dá)erbB3的細(xì)胞可以通過將包含編碼全長或部分長度erbB3的cDNA的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或動物細(xì)胞等中而得到。另外，可以從大量表達(dá)erbB3的各種人類腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞、人類組織等中純化得到erbB3。另外，也可以直接使用該腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞或該組織等作為抗原。此外，也可以通過Fmoc法或tBoc法等化學(xué)合成方法制備具有erbB3的部分序列的合成肽來作為抗原使用。
[0189]本發(fā)明中使用的erbB3 可以通過使用 Molecular Cloning, ALaboratory Manual,第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)或 Current Protocols in Molecular Biology,約翰威立父子出版公司(1987-1997)等中記載的方法等，例如利用以下的方法，使編碼該erbB3的DNA在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)來制造。
[0190]將包含編碼erbB3的全長cDNA插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體的啟動子的下游，由此制作重組載體。也可以代替上述全長cDNA使用基于全長cDNA制備的編碼部分多肽的適當(dāng)長度的DNA片段。接著，將所得到的該重組載體導(dǎo)入適合于該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞中，由此能夠得到生產(chǎn)erbB3的轉(zhuǎn)化體。
[0191]作為表達(dá)載體，只要是能夠在使用的宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制或者能夠整合到染色體中并且在能夠轉(zhuǎn)錄編碼erbB3的DNA的位置含有適當(dāng)?shù)膯幼拥谋磉_(dá)載體，則均可以使用。
[0192]作為宿主細(xì)胞，只要是大腸桿菌等屬于埃希氏菌屬的微生物、酵母、昆蟲細(xì)胞或動物細(xì)胞等能夠表達(dá)目的基因的宿主細(xì)胞，則均可以使用。
[0193]在使用大腸桿菌等原核生物作為宿主細(xì)胞的情況下，重組載體優(yōu)選為能夠在原核生物中自主復(fù)制并且包含啟動子、核糖體結(jié)合序列、編碼erbB3的DNA及轉(zhuǎn)錄終止序列的載體。另外，該重組載體不一定必須包含轉(zhuǎn)錄終止序列，但優(yōu)選在緊接結(jié)構(gòu)基因的下游配置轉(zhuǎn)錄終止序列。該重組載體可以進(jìn)一步含有調(diào)控啟動子的基因。
[0194]作為該重組載體，優(yōu)選使用將作為核糖體結(jié)合序列的夏因-達(dá)爾加諾序列與起始密碼子的間隔調(diào)節(jié)至適當(dāng)距離(例如6~18個堿基)而得到的質(zhì)粒。
[0195]另外，作為該編碼erbB3的DNA的堿基序列，可以對堿基進(jìn)行取代以形成最適于在宿主內(nèi)表達(dá)的密碼子，由此，能夠提高目標(biāo)erbB3的生產(chǎn)率。
[0196]作為表達(dá)載體，只要是能夠在使用的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的表達(dá)載體，則均可以使用，可以列舉例如:pBTrp2、pBTacl、pBTac2 (以上為羅氏診斷公司制造)、pKK233_2 (法瑪西亞公司制造)、pSE280 (Invitrogen公司制造)、pGEMEX-1 (Promega公司制造)、pQE-8(凱杰公司制造)、pKYP10(日本特開昭 58-110600 號公報)、pKYP200 [AgriculturalBiological Chemistry, 48，669(1984) ]、pLSAl [Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGELl[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82, 4306(1985)]、pBlue scriptll SK(-)(Stratagene公司制造)、pTrs30 [由大腸桿菌 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)制備]、pTrs32 [由大腸桿菌 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制備]、pGHA2[由大腸桿菌 IGHA2 (FERM BP-400)制備，日本特開昭60-221091號公報]、pGKA2[由大腸桿菌IGKA2 (FERM BP-6798)制備，日本特開昭60-221091號公報]、pTerm2(美國專利第4686191號說明書、美國專利第4939094 號說明書、美國 5160735 號說明書)、pSupex、pUBllO、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol., 172, 2392 (1990) ]、pGEX(法瑪西亞公司制造)、pET 系統(tǒng)(Novagen 公司制造)和 pME18SFL3 等。
[0197]作為啟動子，只要是能夠在使用的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動子，則均可以使用。可以列舉例如:trp啟動子(Ptrp)、Iac啟動子、PL啟動子、PR啟動子或17啟動子等來源于大腸桿菌或噬菌體等的啟動子。另外，也可以使用兩個Ptrp串聯(lián)而成的串聯(lián)啟動子、tac啟動子、lac T7啟動子或let I啟動子等人工設(shè)計修飾后的啟動子等。
[0198]作為宿主細(xì)胞，可以列舉例如:大腸桿菌XLl-Blue、大腸桿菌XL2_Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌N0.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49和大腸桿菌DH5 a等。
[0199]作為向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入重組載體的方法，只要是向使用的宿主細(xì)胞中導(dǎo)入DNA的方法，則均可以使用，可以列舉例如:使用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 69，2110 (1972) ；Gene, 17，107 (1982) ；Molecular&GeneralGenetics, 168，111(1979)]。
[0200]在使用動物細(xì)胞作為宿主的情況下，作為表達(dá)載體，只要是能夠在動物細(xì)胞中發(fā)揮功能的表達(dá)載體，則均可以使用。可以列舉例如:pcDNA1、pcDM8 ( 7 f - *公司制造)、pAGE107[日本特開平 3-22979 號公報；Cytotechnology, 3，133，(1990) ]、pAS3_3 (日本特開平 2-227075 號公報)、pCDM8 [Nature, 329，840，(1987)]、pcDNAI/Amp (Invitrogen 公司制造)、pcDNA3.1 (Invitrogen 公司制造)、pREP4 (Invitrogen 公司制造)、pAGE103 [J.Biochemistry, 101，1307 (1987) ]、pAGE210、pME18SFL3 或 pKANTEX93 [國際公開第 97/10354號]等。
[0201]作為啟動子，只要是能夠在動物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動子，則均可以使用?？梢粤信e例如:巨細(xì)胞病毒(CMV)的即刻早期(IE)基因的啟動子、SV40的早期啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRa啟動子或莫洛尼小鼠白血病病毒的啟動子或增強子等。另外，也可以將人CMV的IE基因的增強子與啟動子一同使用。
[0202]作為宿主細(xì)胞，可以列舉例如:作為人類細(xì)胞的那馬瓦細(xì)胞、作為猿細(xì)胞的COS細(xì)胞、作為中國倉鼠細(xì)胞的CHO細(xì)胞或HBT5637(日本特開昭63-000299號公報)等。
[0203]作為向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入重組載體的方法，只要是向動物細(xì)胞中導(dǎo)入DNA的方法，則均可以使用?？梢粤信e例如:電穿孔法[Cytotechnology, 3，133 (1990)]、磷酸鈣法(日本特開平 2-227075 號公報)或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 84，7413 (1987)]
坐寸o
[0204]將以上述方式 得到的包含重組有編碼erbB3的DNA的重組載體的來源于微生物或動物細(xì)胞等的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)物中生成并蓄積該erbB3，并從該培養(yǎng)物中進(jìn)行收集，由此能夠制造erbB3。將該轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法可以根據(jù)宿主的培養(yǎng)中使用的通常的方法來進(jìn)行。[0205]在來源于真核生物的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)時，能夠得到附加有糖或糖鏈的erbB3。對用使用誘導(dǎo)性啟動子的重組載體轉(zhuǎn)化后的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時，可以根據(jù)需要向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物。例如，對用使用Iac啟動子的重組載體轉(zhuǎn)化后的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時，可以向培養(yǎng)基中添加異丙基-PD-硫代吡喃半乳糖苷等，對用使用trp啟動子的重組載體轉(zhuǎn)化后的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時，可以向培養(yǎng)基中添加吲哚丙烯酸等。
[0206]作為用于培養(yǎng)以動物細(xì)胞為宿主而得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，可以使用例如普遍使用的 RPMI1640 培養(yǎng)基[The Journal of the American MedicalAssociation, 199，519 (1967)]、伊戈爾(Eagle)的 MEM 培養(yǎng)基[Science, 122，501 (1952)]、杜爾貝科(Dulbecco)改良 MEM 培養(yǎng)基[Virology, 8，396 (1959) ]、199 培養(yǎng)基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，73，I (1950)]、伊思考夫(Iscove)改良的杜爾貝科培養(yǎng)基(IMDM)或向這些培養(yǎng)基中添加胎牛血清(FBS)等而得到的培養(yǎng)基等。培養(yǎng)通常在pH6~8、30~40°C、5%C02存在下等條件下進(jìn)行I~7天。另外，培養(yǎng)中可以根據(jù)需要向培養(yǎng)基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
[0207]作為編碼erbB3的基因的表達(dá)方法，除了直接表達(dá)以外，還可以列舉例如分泌生產(chǎn)或融合蛋白表達(dá)等方法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版,冷泉港實驗室出版社(1989)]。
[0208]作為erbB3的生產(chǎn)方法，可以列舉例如:在宿主細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)的方法、分泌到宿主細(xì)胞外的方法或在宿主細(xì)胞外膜上生產(chǎn)的方法，可以通過改變使用的宿主細(xì)胞或生產(chǎn)的erbB3的結(jié)構(gòu)來選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā?br> [0209]例如，可以通過制作在編碼胞外域的氨基酸序列的DNA上連接有編碼抗體的Fe段的DNA、編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的DNA、編碼FLAG標(biāo)簽的DNA或編碼組氨酸標(biāo)簽的DNA等的DNA并進(jìn)行表達(dá) 、純化來制作抗原融合蛋白。
[0210]具體而言，可以列舉:erbB3的胞外域與人IgG的Fe段結(jié)合而成的Fe融合蛋白(以下記作erbB3-hFc)、erbB3的胞外域與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白(以下記作 erbB3-GST)。
[0211]在宿主細(xì)胞內(nèi)或宿主細(xì)胞外膜上生產(chǎn)erbB3的情況下，通過使用鮑爾森等人的方法[J.Biol.Chem.，264，17619 (1989)]、羅等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sc1., USA, 86，8227(1989) ；Genes Develop.，4，1288(1990)]、日本特開平 05-336963 號公報或國際公開第94/23021號等中記載的方法，能夠使erbB3主動地分泌到宿主細(xì)胞外。
[0212]另外，還可以利用使用二氫葉酸還原酶基因等的基因擴增系統(tǒng)(日本特開平2-227075號公報)來提高erbB3的生產(chǎn)量。
[0213]所得到的erbB3例如可以如下進(jìn)行分離、純化。
[0214]erbB3在細(xì)胞內(nèi)以溶解狀態(tài)表達(dá)的情況下，培養(yǎng)結(jié)束后通過離心分離回收細(xì)胞，懸浮于水系緩沖液中后，利用超聲波破碎機、法式壓濾壺、MANT0N-GULIN勻漿器或臥式砂磨機等將細(xì)胞破碎，得到無細(xì)胞提取液。從將該無細(xì)胞提取液離心分離而得到的上清中利用通常的蛋白質(zhì)的分離純化方法，即，單獨使用或者組合使用溶劑提取法、利用硫酸銨等的鹽析法、脫鹽法、利用有機溶劑的沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAE)-瓊脂糖、DIAIONHPA-75(三菱化學(xué)公司制造)等樹脂的陰離子交換層析法、使用S-瓊脂糖FF(法瑪西亞公司制造)等樹脂的陽離子交換層析法、使用丁基瓊脂糖、苯基瓊脂糖等樹脂的疏水層析法、使用分子篩的凝膠過濾法、親和層析法、聚焦層析法或等電點電泳等電泳法等方法，能夠得到純化制備品。
[0215]erbB3在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體而進(jìn)行表達(dá)的情況下，與上述同樣地回收細(xì)胞后將其破碎，并進(jìn)行離心分離，由此，以沉淀組分的形式回收該erbB3的包涵體。利用蛋白變性劑使回收的該erbB3的包涵體可溶化。對該可溶化液進(jìn)行稀釋或透析，由此，使該erbB3恢復(fù)至正常的立體結(jié)構(gòu)，然后，通過與上述同樣的分離純化方法，能夠得到多肽的純化制備品。
[0216]erbB3或其糖基化物等衍生物被分泌到細(xì)胞外的情況下，可以在培養(yǎng)上清中回收該erbB3或其糖基化物等衍生物。將該培養(yǎng)物與上述同樣地利用離心分離等方法進(jìn)行處理，由此得到可溶性組分，使用與上述同樣的分離純化方法，由此能夠從該可溶性組分中得到純化制備品。
[0217]另外，本發(fā)明中使用的erbB3也可以通過Fmoc法或tBoc法等化學(xué)合成法來制造。此外，erbB3的一級結(jié)構(gòu)是公知的(Kraus, M.H.et al., Proc.Nat.Acad.Sc1.86，9193-9197，1989.)，因此，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制作肽等，也可以利用Advanced ChemTech公司、拍金埃爾默公司、法瑪西亞公司、Protein Technology
Instrument公司、Synthecell-Vega公司、--b 7°千7''公司或島津制作所公司制造等的
肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。
[0218](2)抗體產(chǎn)生細(xì)胞的制備步驟
[0219]對3~20周齡的小鼠、大鼠或倉鼠等動物免疫(I)中得到的抗原，采集該動物的脾臟、淋巴結(jié)、外周血中的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。另外，也可以使用富塚等人的文獻(xiàn)(Tomizuka.etal.,Proc Natl Acad Sci USA., Vol97:722,2000)中記載的具有產(chǎn)生來源于人類的抗體的能力的轉(zhuǎn)基因小鼠作為動物或者為了提高免疫原性而使用erbB3條件性基因敲除小鼠作為被免疫動物。
[0220]免疫通過將抗原與完全弗氏佐劑或者氫氧化鋁凝膠和百日咳菌疫苗等適當(dāng)?shù)淖魟┮煌┯脕磉M(jìn)行。小鼠免疫時的免疫原施用法可以為皮下注射、腹腔內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射或足底注射等中的任何一種，優(yōu)選腹腔內(nèi)注射、足底注射或靜脈內(nèi)注射。在抗原為部分肽的情況下，與牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔蜮血藍(lán)蛋白(KLH)等載體蛋白制作結(jié)合物，將其作為免疫原使用。
[0221]抗原的施用在第一次施用之后每隔I~2周進(jìn)行5~10次。各次施用后第3~7天從眼底靜脈叢采血,利用酶免疫測定法[Antibodies-A Laboratory Manual,冷泉港實驗室(1988)]等測定其血清的抗體效價。將其血清對免疫所用的抗原顯示出充分的抗體效價的動物作為融合用抗體產(chǎn)生細(xì)胞的供給源時，能夠提高后續(xù)操作的效果。
[0222]在抗原的末次施用后第3~7天，從免疫后的動物中摘除脾臟等含有抗體產(chǎn)生細(xì)胞的組織，采集抗體產(chǎn)生細(xì)胞?？贵w產(chǎn)生細(xì)胞為衆(zhòng)細(xì)胞及作為其前體細(xì)胞的淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞可以從個體的任何部位獲得，一般可以從脾臟、淋巴結(jié)、骨髓、扁桃體或外周血或者它們的適當(dāng)組合等中獲得，但最普遍使用脾臟細(xì)胞。在使用脾臟細(xì)胞的情況下，將脾臟細(xì)切、攪散后離心分離，進(jìn)而除去紅細(xì)胞，獲得融合用抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
[0223](3)骨髓瘤的制備步驟
[0224]作為骨髓瘤，可以使用來源于小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔或人類等哺乳動物的自身不具有抗體產(chǎn)生能力的細(xì)胞。一般使用由小鼠得到的細(xì)胞系，例如，作為骨髓瘤細(xì)胞，使用由小鼠得到的細(xì)胞系，例如，使用8-氮雜鳥嘌呤抗性小鼠(來源于BALB/c)骨髓瘤細(xì)胞系P3-X63Ag8-Ul(P3-U1)[Current Topicsin Microbiology and Immunology, 18, I(1978)]>P3-NSl/l-Ag41(NS-1)[European J.1mmunology, 6，511 (1976)]、SP2/0_Agl4(SP-2)[Nature, 276，269 (1978) ]、P3_X63_Ag8653 (653) [J.1mmunology, 123，1548 (1979)]或P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256，495 (1975)]等。
[0225]這些細(xì)胞系在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基例如8-氮雜鳥嘌呤培養(yǎng)基[向添加有谷氨酰胺、2-巰基乙醇、慶大霉素及胎牛血清(以下稱為“FCS”)的RPM1-1640培養(yǎng)基中添加8-氮雜鳥嘌呤而得到的培養(yǎng)基]、伊思考夫改良的杜爾貝科培養(yǎng)基(Iscove’ s Modified Dulbecco’ sMedium ;以下稱為“頂DM”)或杜爾貝科改良的伊戈爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified EagleMedium ；以下稱為“DMEM”)等培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，細(xì)胞融合的3~4天前在正常培養(yǎng)基(例如含有10%FCS的DMEM培養(yǎng)基)中傳代培養(yǎng)，從而在融合當(dāng)天確保2 X IO7以上的細(xì)胞數(shù)。
[0226](4)細(xì)胞融合
[0227]將⑵中得到的融合用抗體產(chǎn)生細(xì)胞和(3)中得到的骨髓瘤細(xì)胞用最低必需培養(yǎng)基(MEM)或PBS (磷酸氫二鈉1.83g、磷酸二氫鉀0.21g、氯化鈉7.65g、蒸餾水I升、pH7.2)充分清洗，以使細(xì)胞數(shù)達(dá)到融合用抗體產(chǎn)生細(xì)胞:骨髓瘤細(xì)胞=5:1~10:1的方式混合，離心分離后，除去上清。
[0228]將沉淀的細(xì)胞群充分?jǐn)嚿⒑?，?7 °C下攪拌的同時加入聚乙二醇-1000 (PEG-1000)、MEM培養(yǎng)基及二甲亞砜的混合液。進(jìn)而，每I~2分鐘加入I~2mL的MEM培養(yǎng)基，重復(fù)數(shù)次后，加入MEM培養(yǎng)基使總量達(dá)到50mL。離心分離后，除去上清。將沉淀的細(xì)胞群輕輕攪散后，將融合用抗體產(chǎn)生細(xì)胞輕輕地懸浮于添加有次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷及氨基蝶呤的正常培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)中。將該懸浮液在5%C02的孵箱中在37°C下培養(yǎng)7~14天。
[0229]另外，也可以通過以下的方法進(jìn)行細(xì)胞融合。將脾細(xì)胞和骨髓瘤用無血清培養(yǎng)基(例如DMEM)或磷酸緩沖生理鹽水(以下稱為“磷酸緩沖液”)充分清洗，以使脾細(xì)胞與骨髓瘤的細(xì)胞數(shù)之比為約5:1~約10:1的方式混合，并離心分離。
[0230]除去上清，將沉淀的細(xì)胞群充分?jǐn)嚿⒑?，在攪拌的同時滴加ImL含有50%(w/v)聚乙二醇(分子量1000~4000)的無血清培養(yǎng)基。然后，緩慢加入IOmL的無血清培養(yǎng)基后，離心分離。
[0231]再次棄去上清，將沉淀的細(xì)胞懸浮于適量的含有HAT液及人白介素-2 (以下稱為“IL-2”)的HAT培養(yǎng)基中并分注到培養(yǎng)用板(以下稱為“板“)的各孔中，在5%C02存在下在37°C下培養(yǎng)約2周。其間適當(dāng)補充HAT培養(yǎng)基。
[0232](5)雜交瘤群的選擇
[0233]在上述骨髓瘤細(xì)胞為8-氮雜鳥嘌呤抗性株的情況下，即為次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺陷株的情況下，未融合的該骨髓瘤細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞之間的融合細(xì)胞不能在含有HAT的培養(yǎng)基中存活。另一方面，抗體產(chǎn)生細(xì)胞之間的融合細(xì)胞或抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤能夠存活，但抗體產(chǎn)生細(xì)胞之間的融合細(xì)胞壽命有限。因此，通過在含有HAT的培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)，僅抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤存活下來，結(jié)果能夠選擇出雜交瘤。
[0234]對于以集落狀生長的雜交瘤，進(jìn)行由HAT培養(yǎng)基向除去氨基蝶呤后的培養(yǎng)基(以下稱為“HT培養(yǎng)基”)的培養(yǎng)基更換。然后，采集一部分培養(yǎng)上清，使用后述的抗體效價測定法,能夠選擇出生產(chǎn)抗體的雜交瘤。
[0235]作為抗體效價的測定方法，可以列舉例如放射性同位素免疫定量法(以下稱為“RIA法”)、固相酶聯(lián)免疫定量法(以下稱為“ELISA法”)、熒光抗體法及被動血細(xì)胞凝集反應(yīng)法等各種公知技術(shù)。其中，從檢測靈敏度、迅速性、準(zhǔn)確性及操作自動化的可能性等觀點出發(fā)，優(yōu)選RIA法或ELISA法。
[0236]將通過測定抗體效價判明產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤轉(zhuǎn)移到另一板中進(jìn)行克隆。作為該克隆法，可以列舉例如:以使板的I個孔中含有I個雜交瘤的方式稀釋而培養(yǎng)的有限稀釋法、在軟瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)并回收集落的軟瓊脂法、通過顯微操縱器將細(xì)胞逐個取出并培養(yǎng)的方法及利用細(xì)胞分選儀分離I個細(xì)胞的“分選儀克隆”等，有限稀釋法較為簡便，因此經(jīng)常使用。
[0237]對于確認(rèn)了抗體效價的孔，重復(fù)2~4次例如利用有限稀釋法的克隆，選擇出穩(wěn)定確認(rèn)抗體效價的雜交瘤株作為抗人erbB3單克隆抗體產(chǎn)生雜交瘤株。
[0238](6)單克隆抗體的制備
[0239]對姥鮫烷處理[腹腔內(nèi)施用0.5mL的2，6，10，14-四甲基十五碳烷(姥鮫烷)并飼養(yǎng)2周]后的8~10周齡的小鼠或裸鼠腹腔內(nèi)注射(5)中得到的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。在10~21天內(nèi)雜交瘤產(chǎn)生癌性腹水。
[0240]從上述小鼠中采集腹水，離心分離除去固體成分后，用40~50%的硫酸銨鹽析，利用辛酸沉淀法、DEAE-瓊脂糖柱、蛋白A柱或凝膠過濾柱進(jìn)行純化，收集IgG或IgM組分，得到純化單克隆抗體。另外，使該雜交瘤在相同系統(tǒng)的小鼠(例如BALB/c)或Nu/Nu小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠或兔等的腹腔內(nèi)增殖，由此，能夠得到大量含有本發(fā)明的抗erbB3抗體的腹水。
[0241]將(5)中得到的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤在添加有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基等中進(jìn)行培養(yǎng)，然后，通過離心分離除去上清，懸浮于GIT培養(yǎng)基、添加有5%夕' ^ 3 GF21的雜交瘤SFM培養(yǎng)基等中，通過燒瓶培養(yǎng)、搖床培養(yǎng)、袋培養(yǎng)等培養(yǎng)3~7天。
[0242]將所得到的細(xì)胞懸浮液離心分離，由所得到的上清進(jìn)行利用蛋白A柱或蛋白G柱的純化，收集IgG組分，也能夠得到純化單克隆抗體。作為純化的簡便方法，也可以利用市售的單克隆抗體純化試劑盒(例如,MAbTrap GII試劑盒；Amersham Pharmacia Biotech公司制造)等。
[0243]抗體亞類的確定使用亞類分型試劑盒通過酶免疫測定法來進(jìn)行。蛋白量的定量可以通過勞里法及由280nm下的吸光度[1.4 (0D280)=免疫球蛋白lmg/mL]計算的方法進(jìn)行。
[0244](7)抗erbB3單克隆抗體的結(jié)合分析
[0245] 本發(fā)明的抗erbB3單克隆抗體的結(jié)合活性可以通過Ouchterlony法、ELISA法、RIA法、流式細(xì)胞術(shù)法(FCM)或表面等離子體共振法(SPR)等結(jié)合分析系統(tǒng)來確認(rèn)。Ouchterlony法較為簡便,但在抗體濃度低的情況下需要進(jìn)行濃縮操作。
[0246]另一方面，在使用ELISA法或RIA法的情況下，通過使培養(yǎng)上清直接與抗原吸附固相反應(yīng)、進(jìn)而使用與各種免疫球蛋白同種型、亞類對應(yīng)的抗體作為二次抗體，能夠鑒定抗體的同種型、亞類。
[0247]使純化或部分純化后的重組人erbB3吸附到ELISA用96孔板等固相表面上，進(jìn)而，使用與抗原無關(guān)的蛋白例如牛血清白蛋白(以下記作“BSA”)對未吸附抗原的固相表面進(jìn)行封閉。
[0248]將ELISA板用含有0.05%Tween20的磷酸鹽緩沖液(以下簡記為PBS)(以下簡記為Tween-PBS)等清洗后，使連續(xù)稀釋的一次抗體(例如小鼠血清、培養(yǎng)上清等)反應(yīng)，使抗體結(jié)合到固定在板上的抗原上。
[0249]接著，分注由生物素、酶(horse radish peroxidase;HRP, alkalinephosphatase;ALP等)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或放射性化合物等標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體作為第二抗體，使二次抗體與板上結(jié)合的一次抗體反應(yīng)。用Tween-PBS充分清洗后，進(jìn)行與第二抗體的標(biāo)記物質(zhì)對應(yīng)的反應(yīng)，選擇出對免疫原發(fā)生特異性反應(yīng)的單克隆抗體。
[0250]FCM法可以測定目標(biāo)抗體對抗原表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合活性[Cancer Immunol. 1mmunother.，36，373(1993)]。目標(biāo)抗體與表達(dá)在細(xì)胞膜上的膜蛋白結(jié)合時,可以說目標(biāo)抗體為識別天然存在的抗原的立體結(jié)構(gòu)的抗體。
[0251]SPR法可以列舉利用Biacore (注冊商標(biāo))的動力學(xué)分析。例如,使用Biacore (注冊商標(biāo))T100，測定抗原與被測物之間的結(jié)合的動力學(xué)，使用設(shè)備附帶的分析軟件對其結(jié)果進(jìn)行分析。
[0252]通過胺偶聯(lián)法將抗小鼠IgG抗體固定在傳感器芯片CM5上，然后，使雜交瘤培養(yǎng)上清或純化單克隆抗體等被測物質(zhì)流過，使其以適當(dāng)量結(jié)合，再使?jié)舛纫阎亩鄠€濃度的抗原流過，測定結(jié)合、解離。使用設(shè)備附帶的軟件利用1:1結(jié)合模型對所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行動力學(xué)分析，獲得各種參數(shù)。
[0253]或者，通過例如胺偶聯(lián)法將人erbB3蛋白固定在傳感器芯片上，然后，使?jié)舛纫阎亩鄠€濃度的純化單克隆抗體流過，測定結(jié)合、解離。使用設(shè)備附帶的軟件利用雙價結(jié)合模型對所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行動力學(xué)分析，獲得各種參數(shù)。
[0254]另外，與本發(fā)明的抗erbB3抗體競爭地與erbB3結(jié)合的抗體可以通過向上述的結(jié)合分析系統(tǒng)中添加被測抗體使其反應(yīng)而獲得。即，通過篩選添加被測抗體時抗體的結(jié)合受到抑制的抗體，能夠獲得在與erbB3胞外域的結(jié)合中與獲得的抗體競爭的抗體。
[0255](8)抗erbB3單克隆抗體的表位的鑒定
[0256]本發(fā)明中，抗體的識別表位的鑒定可以如下進(jìn)行。例如，制作抗原的部分缺陷體、休息因種差異而不同的氨基酸殘基后的氨基酸修飾體或修飾結(jié)構(gòu)域后的修飾體，如果目標(biāo)抗體對該缺陷體或氨基酸修飾體的反應(yīng)性降低，則可知缺陷部位或氨基酸修飾部位為目標(biāo)抗體的表位?？乖牟糠秩毕蒹w及氨基酸修飾體可以使用適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(大腸桿菌、酵母、植物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞等)以分泌蛋白的形式獲得，也可以在宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)而制作抗原表達(dá)細(xì)胞。在膜型抗原的情況下，為了在保持抗原的立體結(jié)構(gòu)的狀態(tài)下進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)選在宿主細(xì)胞膜上表達(dá)。另外，也可以制作模仿抗原的一級結(jié)構(gòu)或立體結(jié)構(gòu)的合成肽來確認(rèn)目標(biāo)抗體的反應(yīng)性。關(guān)于合成肽，可以列舉使用公知的肽合成技術(shù)制作該分子的各種部分肽的方法等。
[0257]對于本發(fā)明的抗erbB3抗體，可以通過針對人類及小鼠erbB3的胞外域制作分別組合有各結(jié)構(gòu)域I~4的嵌合蛋白并確認(rèn)目標(biāo)抗體的反應(yīng)性來鑒定抗體的表位。
[0258]然后，可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的寡肽合成技術(shù)進(jìn)一步詳細(xì)地合成各種其對應(yīng)部分的寡肽或該肽的突變體等并確認(rèn)目標(biāo)抗體對該肽的反應(yīng)性來限定表位。作為用于得到多種寡肽的簡便的方法，也可以利用市售的試劑盒[例如，SPOTs試劑盒(GenosysBiotechnologies公司制造)、使用多針合成法的一系列多針肽合成試劑盒(力4 口 >公司制造)等]。
[0259]與和本發(fā)明的與erbB3的胞外域結(jié)合的抗體所識別的表位相同的表位結(jié)合的抗體可以通過如下方法獲得:對利用上述的結(jié)合分析系統(tǒng)獲得的抗體的表位進(jìn)行鑒定，制作鑒定出的表位的部分合成肽、模擬表位的立體結(jié)構(gòu)的合成肽或重組蛋白等，進(jìn)行免疫。
[0260]例如，如果為膜蛋白，則通過制作使全部胞外域或一部分胞外域與適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽(FLAG標(biāo)簽、組氨酸標(biāo)簽、GST蛋白、抗體Fe段等)連接而成的重組蛋白并用該重組蛋白進(jìn)行免疫，能夠制作更高效的表位特異性抗體。
[0261]2.基因重組抗體的制作
[0262]作為基因重組抗體的制作例，在P.J.Delves.,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIALTECHNIQUES.，1997WILEY、P.Shepherd and C.Dean.Monoclonal Antibodies.，20000XF0RDUNIVERSITY PRESS 及 J.ff.Goding., Monoclonal Antibodies: principles andpractice., 1993ACADEMIC PRESS等中進(jìn)行了概述，以下示出了人嵌合抗體、人源化抗體及人抗體的制作方法。
[0263](I)基因重組抗體表達(dá)用載體的構(gòu)建
[0264]基因重組抗體表達(dá)用載體是重組有編碼人抗體的CH及CL的DNA的動物細(xì)胞用表達(dá)載體，可以通過將編碼人抗體的CH及CL的DNA分別克隆到動物細(xì)胞用表達(dá)載體中來進(jìn)行構(gòu)建。
[0265]人抗體的C區(qū)可以使用任意的人抗體的CH及CL。例如，使用人抗體的Y I亞類的CH及K類的CL等。作為編碼人抗體的CH及CL的DNA，使用cDNA，也可以使用包含外顯子和內(nèi)含子的染色體DNA。作為動物細(xì)胞用表達(dá)載體，只要是能夠重組并表達(dá)編碼人抗體的C區(qū)的基因的載體，則均可以使 用。。
[0266]例如使用pAGE107 [Cytotechnol.，3，133 (1990) ]、pAGE103 [J.Biochem.，101，1307(1987)]、pHSG274[Gene, 27, 223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 78，1527 (1981) ]、pSGlbd2_4 [Cytotechnol.，4，173 (1990)]或 pSElUKlSedl-3 [Cytotechnol.，13，79 (1993) ]、INPEP4, (Biogen-1DEC 公司制造)、N5KGlval (美國專利第 6001358號說明書)、轉(zhuǎn)座子載體(國際公開第2010/143698號)等。作為動物細(xì)胞用表達(dá)載體中的啟動子和增強子，使用SV40的早期啟動子[J.Biochem.，101，1307 (1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒的 LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.，149，960(1987)]、CMV 啟動子(美國專利第5168062號說明書)或免疫球蛋白H鏈的啟動子[Cell，41，479 (1985)]和增強子[Cell, 33，717(1983)]等。
[0267]從基因重組抗體表達(dá)載體的構(gòu)建的容易度、向動物細(xì)胞中導(dǎo)入的容易度、抗體H鏈及L鏈在動物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量的平衡均衡等觀點出發(fā)，基因重組抗體表達(dá)用載體使用抗體H鏈及L鏈存在于同一載體上的類型(串聯(lián)型)的基因重組抗體表達(dá)用載體[J.1mmunol.Methods, 167，271 (1994)]，但也可以使用抗體H鏈及L鏈存在于不同載體上的類型。作為串聯(lián)型基因重組抗體表達(dá)用載體，使用pKANTEX93(國際公開第97/10354號)、pEE18 [Hybridoma, 17，559 (1998) ]、N5KGlval (美國專利第 6001358 號說明書)、轉(zhuǎn)座子載體(國際公開第2010/143698號)等。[0268](2)編碼來源于人類以外的動物的抗體的V區(qū)的cDNA的獲得及氨基酸序列的分析
[0269]編碼非人抗體的VH及VL的cDNA的獲得及氨基酸序列的分析可以如下進(jìn)行。
[0270]從產(chǎn)生非人抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取mRNA，并合成cDNA。將合成的cDNA克隆到噬菌體或質(zhì)粒等載體中，制作cDNA文庫。使用編碼小鼠抗體的C區(qū)部分或V區(qū)部分的DNA作為探針，從該文庫中分別分離出具有編碼VH或VL的cDNA的重組噬菌體或重組質(zhì)粒。分別確定重組噬菌體或重組質(zhì)粒上的目標(biāo)小鼠抗體的VH或VL的全部堿基序列，由堿基序列分別推測出VH或VL的全部氨基酸序列。
[0271]作為制作產(chǎn)生非人抗體的雜交瘤細(xì)胞的人類以外的動物，使用小鼠、大鼠、倉鼠或兔等，只要能夠制作雜交瘤細(xì)胞，則任何動物均可以使用。 [0272]由雜交瘤細(xì)胞制備總RNA時，使用異硫氰酸胍三氟乙酸銫法[Methods inEnzymol., 154, 3 (1987)]或RNA easy (注冊商標(biāo))試劑盒(凱杰公司制造)等試劑盒等。
[0273]由總RNA制備mRNA時，使用固定有寡聚(dT)的纖維素柱法[MolecularCloning, A Laboratory Manual,第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)]或者使用01igo-dT30〈Super> (注冊商標(biāo))mRNA純化試劑盒(Takarabio公司制造)等試劑盒等。另外，也可以使用Fast Track(注冊商標(biāo))mRNA分離試劑盒(Invitrogen公司制造)或QuickPrep (注冊商標(biāo))mRNA純化試劑盒(法瑪西亞公司制造)等試劑盒從雜交瘤細(xì)胞中制備 mRNA。
[0274]cDNA的合成及cDNA文庫的制作時，使用公知的方法[Molecular Cloning, ALaboratory Manual,第二版，冷泉港實驗室出版社(1989) ；Current Protocols inMolecular Biology,附錄I,約翰威立父子出版公司(1987-1997)]、用于cDNA合成和質(zhì)粒克隆的SuperScript質(zhì)粒系統(tǒng)(Invitrogen公司制造)或ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagene公司制造)等試劑盒等。
[0275]cDNA文庫的制作時，用于重組以由雜交瘤細(xì)胞提取的mRNA為模板而合成的cDNA的載體只要是能夠重組該cDNA的載體，則均可以使用?？梢粤信e例如:ZAP Express[Strategies,5,58 (1992)]> pBluescript 11 SK (+) [Nucleic AcidsResearch, 17, 9494 (1989) ] > A ZAPII (Stratagene 公司制造)、A gtlO> Xgtll [DNACloning: A Practical Approach (DNA 克隆實用方法)，I, 49 (1985) ]、A BlueMid (夕口一> r 夕公司制造)、入ExCell、pT7T3_18U (法瑪西亞公司制造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.，3，280 (1983)]或 pUC18 [Gene, 33，103 (1985)]等。
[0276]作為用于導(dǎo)入由噬菌體或質(zhì)粒載體構(gòu)建的cDNA文庫的大腸桿菌，只要是能夠?qū)?、表達(dá)及維持該cDNA文庫的大腸桿菌，則均可以使用。可以列舉例如:XLl-Blue MRF，[Strategies,5，81 (1992)]、C600[Genetics, 39，440 (1954)]、Y1088、Y1090[Science, 222，778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.，166，I (1983)]、K802[J.Mol.Biol.，16，118(1966)]或 JM105[Gene, 38，275(1985)]等。
[0277]從cDNA文庫中選擇編碼非人抗體的VH或VL的cDNA克隆時，使用利用同位素或熒光標(biāo)記的探針的集落雜交法或卩遼菌斑雜交法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)]等。
[0278]另外，也可以通過如下方法制備編碼VH或VL的cDNA:制備引物，將由mRNA合成的cDNA或cDNA文庫作為模板來進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法[以下記作PCR法；Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)、CurrentProtocolsin Molecular Biology,附錄 1，約翰威立父子出版公司(1987-1997)]。
[0279]將選擇出的cDNA用適當(dāng)?shù)南拗泼傅惹懈詈螅寺〉絧Bluescript SK(-)(Stratagene公司制造)等質(zhì)粒中，利用通常使用的堿基序列分析方法等確定該cDNA的堿基序列。作為堿基序列分析方法，進(jìn)行例如雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 74，5463 (1977)]等的反應(yīng)后，使用A.L.F.DNA測序儀(法瑪西亞公司制造)等堿基序列自動分析裝置等。
[0280]由確定的堿基序列分別推測出VH及VL的全部氨基酸序列，并與已知的抗體的VH及 VL 的全部氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部(1991)]進(jìn)行比較，由此，分別確認(rèn)所獲得的cDNA是否編碼包含分泌信號序列的抗體的VH及VL的完整氨基酸序列。
[0281]關(guān)于包含分泌信號序列的抗體的VH及VL的完整氨基酸序列，通過與已知的抗體的 VH 及 VL 的全部氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部(1991)]進(jìn)行比較，能夠推測出分泌信號序列的長度及N端氨基酸序列。進(jìn)而能夠獲知它們所屬的亞類。
[0282]另外，關(guān)于VH及VL的各⑶R的氨基酸序列，也可以通過與已知的抗體的VH及VL的氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部(1991)]進(jìn)行比較來找出。
[0283]另外，使用所得到的VH及VL的完整氨基酸序列，對例如SWISS-PROT或PIR-Protein等任意的數(shù)據(jù)庫利用BLAST法[J.Mol.Biol.，215，403 (1990)]等進(jìn)行同源性檢索，可以確認(rèn)VH及VL的完整氨基酸序列的新穎性。
[0284](3)人嵌合抗體表達(dá)載體的構(gòu)建
[0285]將分別編碼非人抗體的VH或VL的cDNA分別克隆到(I)中得到的基因重組抗體表達(dá)用載體的編碼人抗體的CH或CL的各基因的上游，由此，可以構(gòu)建人嵌合抗體表達(dá)載體。
[0286]為了使編碼非人抗體的VH或VL的cDNA的3’末端側(cè)與人抗體的CH或CL的5’末端側(cè)連接，制作以如下方式設(shè)計的VH及VL的cDNA:連接部分的堿基序列編碼適當(dāng)?shù)陌被崆页蔀檫m當(dāng)?shù)南拗泼缸R別序列。將所制作的VH及VL的cDNA分別克隆到(I)中得到的人源化抗體表達(dá)用載體的編碼人抗體的CH或CL的各基因的上游，以使它們以適當(dāng)?shù)男问竭M(jìn)行表達(dá)，從而構(gòu)建人嵌合抗體表達(dá)載體。
[0287]另外，也可以使用在兩端具有適當(dāng)?shù)南拗泼傅淖R別序列的合成DNA，通過PCR法對編碼非人抗體VH或VL的cDNA分別進(jìn)行擴增，并將它們克隆到(I)中得到的基因重組抗體表達(dá)用載體中。
[0288](4)編碼人源化抗體的V區(qū)的cDNA的構(gòu)建
[0289]編碼人源化抗體的VH或VL的cDNA可以如下構(gòu)建。
[0290]分別選擇用于移植非人抗體的VH或VL的CDR的氨基酸序列的人抗體的VH或VL的框架區(qū)(以下記作FR)的氨基酸序列。選擇的FR的氨基酸序列只要是人抗體來源的氨基酸序列，則均可以使用。
[0291]例如，使用蛋白數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)等數(shù)據(jù)庫中登記的人抗體的FR的氨基酸序列或人抗體的FR的各亞類的共有氨基酸序列[Sequences of Proteins ofImmunological Interest,美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部(1991)]等。為了抑制抗體的結(jié)合活性的降低，選擇與原來的抗體的VH或VL的FR的氨基酸序列具有盡量高的同源性(至少60%以上)的FR的氨基酸序列。
[0292]接著，向選擇好的人抗體的VH或VL的FR的氨基酸序列中分別移植原抗體的CDR的氨基酸序列，從而分別設(shè)計出人源化抗體的VH或VL的氨基酸序列。通過考慮在抗體基因的堿基序列中出現(xiàn)的密碼子的使用頻率[Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部(1991)]而將設(shè)計好的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成DNA序列，從而分別設(shè)計出編碼人源化抗體的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。
[0293]基于設(shè)計好的DNA序列，合成多條包含約100~150個堿基的長度的合成DNA，使用這些合成DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。這種情況下，從PCR反應(yīng)中的反應(yīng)效率及能夠合成的DNA的長度考慮，優(yōu)選對于H鏈、L鏈均設(shè)計4~6條合成DNA。另外，也可以合成可變區(qū)全長的合成DNA來使用。
[0294]另外，通過在位于兩端的合成DNA的5’末端導(dǎo)入適當(dāng)?shù)南拗泼傅淖R別序列，可以容易地將編碼人源化抗體的VH或VL的cDNA克隆到(I)中得到的人源化抗體表達(dá)用載體中。
[0295]PCR反應(yīng)后,將擴增產(chǎn)物分別克隆到pBluescript SK (-) (Stratagene公司制造)等質(zhì)粒中，通過與(2)中記載的方法同樣的方法來確定堿基序列，從而獲得具有編碼期望的人源化抗體的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列的質(zhì)粒。
[0296](5)人源化抗體的V區(qū)的氨基酸序列的修飾
[0297]僅將非人抗體的VH及VL的⑶R移植到人抗體的VH及VL的FR中時，人源化抗體的抗原結(jié)合活性與原來的非人抗體相比降低[B10/TECHN0L0GY，9，266(1991)]。在人源化抗體中，鑒定出人抗體的VH及VL的FR的氨基酸序列中直接與抗原的結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基、與CDR的氨基酸殘基相互作用`的氨基酸殘基以及維持抗體的立體結(jié)構(gòu)并間接與抗原的結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基，并將這些氨基酸殘基取代為原來的非人抗體的氨基酸殘基，由此能夠使降低的抗原結(jié)合活性升高。
[0298]為了鑒定出與抗原結(jié)合活性相關(guān)的FR的氨基酸殘基，可以通過使用X射線晶體分析[J.Mol.Biol.，112，535(1977)]或計算機模擬分析[ProteinEngineering, 7，1501 (1994)]等來進(jìn)行抗體的立體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建及分析。另外,通過針對各個抗體制作多種修飾體并反復(fù)研究它們與抗原結(jié)合活性的相關(guān)性來進(jìn)行各種嘗試，能夠獲得具有所需抗原結(jié)合活性的修飾人源化抗體。
[0299]人抗體的VH及VL的FR的氨基酸殘基可以通過使用修飾用合成DNA進(jìn)行(4)中記載的PCR反應(yīng)來進(jìn)行修飾。對于PCR反應(yīng)后的擴增產(chǎn)物，通過⑵中記載的方法來確定堿基序列，從而確認(rèn)已實施了目標(biāo)修飾。
[0300](6)人源化抗體表達(dá)載體的構(gòu)建
[0301]將構(gòu)建好的編碼基因重組抗體的VH或VL的cDNA分別克隆到(I)中得到的基因重組抗體表達(dá)用載體的編碼人抗體的CH或CL的各基因的上游，從而可以構(gòu)建人源化抗體表達(dá)載體。
[0302]例如，通過向⑷及(5)中得到的構(gòu)建人源化抗體的VH或VL時使用的合成DNA中位于兩端的合成DNA的5’末端導(dǎo)入適當(dāng)?shù)南拗泼傅淖R別序列，將構(gòu)建好的VH或VL的cDNA分別克隆到(I)中得到的人源化抗體表達(dá)用載體的編碼人抗體的CH或CL的各基因的上游，以使它們以適當(dāng)?shù)男问竭M(jìn)行表達(dá)。
[0303](7)基因重組抗體的瞬時表達(dá)
[0304]使用(3)及(6)中得到的基因重組抗體表達(dá)載體或者對上述載體進(jìn)行修飾后的表達(dá)載體來進(jìn)行基因重組抗體的瞬時表達(dá)，從而可以有效地評價所制作的多種人源化抗體的抗原結(jié)合活性。
[0305]用于導(dǎo)入表達(dá)載體的宿主細(xì)胞只要是能夠表達(dá)基因重組抗體的宿主細(xì)胞，則均可以使用。例如使用C0S-7細(xì)胞[美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)編號:CRL1651] [Methodsin Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)]。向 C0S-7 細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)載體時，使用DEAE-右旋糖酐法[Methods in Nucleic Acids Res.，CRC 出版社，283 (1991)]或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 84，7413 (1987)]等。
[0306]導(dǎo)入表達(dá)載體后，培養(yǎng)上清中的基因重組抗體的表達(dá)量及抗原結(jié)合活性使用ELISA 法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,第三版,美國學(xué)術(shù)出版社(1996) ；Antibodies-A Laboratory Manual,冷泉港實驗室(1988);単夕口一 >抗體実験7二二 7 ;匕講談社寸i r ^ y ^ ^ >7 (1987)]等進(jìn)行測定。
[0307](8)穩(wěn)定表達(dá)基因重組抗體的轉(zhuǎn)化株的獲得和基因重組抗體的制備
[0308]通過將(3)及(6)中得到的基因重組抗體表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，能夠得到穩(wěn)定表達(dá)基因重組抗體的轉(zhuǎn)化株。
[0309]向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)載體時，可以列舉:電穿孔法[日本特開平2-257891號公報、Cytotechnology, 3，133 (1990) ]、|丐離子方法、電穿孔法、原生質(zhì)體法、醋酸鋰法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等)。另外，作為將基因?qū)牒笫龅膭游镏械姆椒ǎ梢粤信e:顯微注射法、使用電穿孔或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將基因?qū)隕S細(xì)胞中的方法或核移植法等。
[0310]用于導(dǎo)入表達(dá)載體的宿主細(xì)胞只要是能夠表達(dá)基因重組抗體的宿主細(xì)胞，則可以使用任何細(xì)胞。例如，使用小鼠SP2/0-Agl4細(xì)胞(ATCC編號:CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細(xì)胞(ATCC編號:CRL1580)、二氫葉酸還原酶基因(以下記作dhfr)缺陷的 CHO 細(xì)胞[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 77，4216 (1980)]、獲得了凝集素抗性的Lecl3 [Somatic Cell and Molecular genetics, 12，55 (1986) ]、a 1，6_ 巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因缺陷的CHO細(xì)胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)、大鼠YB2/3HL.P2.Gil.16Ag.20 細(xì)胞(ATCC 編號:CRL1662)等。
[0311]另外，還可以使用與細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶等蛋白質(zhì)或與在N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈的還原末端的N-乙酰葡糖胺的6位上使巖藻糖的I位進(jìn)行a連接的糖鏈修飾相關(guān)的酶等蛋白質(zhì)或者與細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖向高爾基體的轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白質(zhì)等的活性降低或缺失的宿主細(xì)胞(國際公開第2003/85102號)，例如a 1，6_巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因缺陷的CHO細(xì)胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)等o
[0312]導(dǎo)入表達(dá)載體后，通過在含有G418硫酸鹽(以下記作G418)等藥劑的動物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來選擇穩(wěn)定表達(dá)基因重組抗體的轉(zhuǎn)化株(日本特開平2-257891號公報)。
[0313]作為動物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，可以列舉例如:RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司制造)、GIT培養(yǎng)基(日本制藥公司制造)、EX-CELL301培養(yǎng)基、EX-CELL302培養(yǎng)基、EX-CELL325培養(yǎng)基(JRH公司制造)UMDM培養(yǎng)基(Invitrogen公司制造)、雜交瘤-SFM培養(yǎng)基(Invitrogen公司制造)或者在這些培養(yǎng)基中添加有FBS等各種添加物的培養(yǎng)基等。
[0314]通過將所得到的轉(zhuǎn)化株在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)上清中表達(dá)并蓄積基因重組抗體。培養(yǎng)上清中的基因重組抗體的表達(dá)量及抗原結(jié)合活性可以通過ELISA法等來測定。另外，可以利用DHFR擴增系統(tǒng)(日本特開平2-257891號公報)等使轉(zhuǎn)化株的基因重組抗體的表達(dá)量升高。
[0315]基因重組抗體使用蛋白A柱從轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)上清中進(jìn)行純化[MonoclonalAntibodies-Principles and practice,第三版，美國學(xué)術(shù)出版社(1996) ；Antibodies-ALaboratory Manual,冷泉港實驗室(1988)]。另外，也可以將凝膠過濾、離子交換層析及超濾等蛋白質(zhì)純化中使用的方法進(jìn)行組合。
[0316]純化后的基因重組抗體的H鏈、L鏈或整個抗體分子的分子量可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳法[Nature, 227，680 (1970)]或蛋白免疫印跡法[MonoclonalAntibodies-Principles and practice,第三版，美國學(xué)術(shù)出版社(1996) ；Antibodies-ALaboratory Manual,冷泉港實驗室(1988)]等來測定。
[0317]3.純化單克隆抗體或該抗體片段的活性評價
[0318]純化后的本發(fā)明的單克隆抗體或該抗體片段的活性評價可以如下進(jìn)行。
[0319]對erbB3表達(dá)細(xì)胞系的結(jié)合活性可以使用上述1_(7)中記載的結(jié)合分析來測定。對抗原陽性細(xì)胞系的⑶C活性或ADCC活性可以使用公知的測定方法[Cancer Immunol.1mmunother., 36, 373 (1993)]來測定。
[0320]依賴于EGF樣配體的erbB3的磷酸化及依賴于erbB3特異性配體的erbB3的磷酸化可以如下測定。
[0321]將erbB3表達(dá)細(xì)胞用PBS或無血清培養(yǎng)基等進(jìn)行清洗，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)約24小時。接著,使用在含有數(shù)ng/mL~數(shù)十ng/mL的erbB3受體配體的培養(yǎng)基中添加有目標(biāo)抗體的培養(yǎng)基將erbB3表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)分鐘~數(shù)十分細(xì)胞分鐘后，制備該細(xì)胞提取液，使用erbB3特異性抗體及管家基因(肌動蛋白等)特異性抗體對各蛋白進(jìn)行免疫沉淀。
[0322]將上述沉淀蛋白在SDS-PAGE中電泳后，使用erbB3特異性抗體及磷酸化酪氨酸特異性抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡，由此能夠測定erbB3的磷酸化抑制活性。
[0323]另外，利用甲醛及皂素對添加抗體后的培養(yǎng)細(xì)胞蛋白進(jìn)行固定及細(xì)胞膜透過處理，通過進(jìn)行使用erbB3特異性抗體及磷酸化酪氨酸特異性抗體的FCM分析，能夠確認(rèn)erbB3的磷酸化。
[0324]另外，對于erbB3的二聚體化，與上述磷酸化檢測實驗同樣地進(jìn)行培養(yǎng)、細(xì)胞提取液的制備后，使用抗erbB3抗體進(jìn)行erbB3蛋白的免疫沉淀,使用抗各erbB家族蛋白的抗體檢測該沉淀蛋白，由此能夠以對erbB3的二聚體化或異二聚體化進(jìn)行檢測。
[0325]4.控制抗體的效應(yīng)活性的方法
[0326]作為控制本發(fā)明的抗erbB3抗體的效應(yīng)活性的方法，可以列舉:對抗體的Fe段的第297位的天冬酰胺(Asn)上結(jié)合的N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈的還原末端上存在的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上以a-1，6糖苷鍵結(jié)合的巖藻糖(也稱為核心巖藻糖)的量進(jìn)行控制的方法(國際公開第2005/035586號、國際公開第2003/85102號、國際公開第2002/31140號、國際公開第00/61739號)或修飾抗體的Fe段的氨基酸殘基的方法等。本發(fā)明的抗erbB3抗體使用任何一種方法均能夠控制效應(yīng)活性。
[0327]效應(yīng)活性是指抗體的Fe段介導(dǎo)產(chǎn)生的抗體依賴性的活性，已知抗體依賴性細(xì)胞毒活性(ADCC活性)、活性(CDC活性)或者巨噬細(xì)胞或樹狀細(xì)胞等吞噬細(xì)胞的抗體依賴性吞曬作用(Antibody-dependent phagocytosis, ADP 活性)等。
[0328]可以通過控制抗體的Fe的N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈的核心巖藻糖的含量而使抗體的效應(yīng)活性增加或降低。作為使抗體的Fe上結(jié)合的N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈上結(jié)合的巖藻糖的含量降低的方法，通過使用a 1，6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因缺陷的CHO細(xì)胞表達(dá)抗體，能夠獲得未結(jié)合巖藻糖的抗體。未結(jié)合巖藻糖的抗體具有高的ADCC活性。
[0329]另一方面，作為使抗體的Fe上結(jié)合的N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈上結(jié)合的巖藻糖的含量增加的方法，通過使用導(dǎo)入有a 1，6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因的宿主細(xì)胞表達(dá)抗體，能夠獲得結(jié)合有巖藻糖的抗體。結(jié)合有巖藻糖的抗體具有比未結(jié)合巖藻糖的抗體低的ADCC活性。
[0330]另外，可以通過修飾抗體的Fe段的氨基酸殘基而使ADCC活性或⑶C活性增加或降低。通過進(jìn)行Fe段的氨基酸殘基修飾，使對Fe Y R的結(jié)合活性增加或降低，由此能夠控制ADCC活性，通過進(jìn)行Fe段的氨基酸殘基修飾，使補體的結(jié)合活性增加或降低，由此能夠控制CDC活性。
[0331]例如，通過使用美國專利申請公開第2007/0148165號說明書中記載的Fe段的氨基酸序列，能夠使抗體的CDC活性。另外，通過進(jìn)行美國專利第6737056號說明書、美國專利第7297775號說明書、美國專利第7317091號說明書或國際公開第2005/070963號中記載的氨基酸修飾，能夠使ADCC活性或CDC活性增加或降低。
[0332]此外，通過將上述的控制糖鏈的方法與進(jìn)行Fe段的氨基酸殘基修飾的方法組合，能夠獲得抗體的效應(yīng)活性經(jīng)過控制的抗體。
[0333]5.使用本發(fā)明的抗erbB3抗體或該抗體片段的疾病的治療方法
[0334]本發(fā)明的特異性識別erbB3的胞外域且抑制依賴于EGF樣配體的erbB3的磷酸化的抗體或該抗體片段能夠用于治療erbB3相關(guān)癌癥等過度增殖性疾病(hyperproliferative diseases)的治療。
[0335]作為erbB3相關(guān)疾病，可以列舉例如:大腸癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性黑色素瘤(黑色素瘤)、甲狀腺癌、腎細(xì)胞癌、白血病、淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、皮膚癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、絨癌、咽癌、喉癌、胸膜瘤、男性細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜癥、胚胎瘤、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、成血管細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、橫紋肌肉瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤、甲狀腺肉瘤及腎母細(xì)胞瘤等。
[0336]另外，可以使用至少兩種以上的本發(fā)明的抗erbB3抗體進(jìn)行上述疾病的治療。具體而言，可以列舉將erbB3的結(jié)構(gòu)域I~4的各結(jié)構(gòu)域的抗體組合使用的治療方法，優(yōu)選包括施用與erbB3的結(jié)構(gòu)域I或3結(jié)合的抗體和與結(jié)構(gòu)域2或4結(jié)合的抗體的治療方法，最優(yōu)選包括施用與erbB3的結(jié)構(gòu)域I結(jié)合的抗體和與結(jié)構(gòu)域4結(jié)合的抗體的治療方法。
[0337]含有本發(fā)明的抗體或該抗體片段或者它們的衍生物的治療劑可以僅含有作為有效成分的該抗體或該抗體片段或者它們的衍生物，通常優(yōu)選以與藥理學(xué)上可容許的一種以上的載體一起混合并通過制劑學(xué)的【技術(shù)領(lǐng)域】中公知的方法制造而成的醫(yī)藥制劑的形式來提供。
[0338]作為給藥途徑，可以列舉例如:口服給藥或者口腔內(nèi)、氣管內(nèi)、直腸內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)等非口服給藥。作為給藥形態(tài)，可以列舉例如:噴霧劑、膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏或膠帶劑等。
[0339]各種制劑可以使用通常使用的賦形劑、增量劑、粘合劑、浸潤劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、分散劑、緩沖劑、保存劑、助溶劑、防腐劑、著色料、香味劑或穩(wěn)定劑等通過常規(guī)方法制造。
[0340]作為賦形劑，可以列舉例如:乳糖、果糖、葡萄糖、玉米淀粉、山梨醇、結(jié)晶纖維素、無菌水、乙醇、甘油、生理鹽水及緩沖液等。作為崩解劑，可以列舉例如:淀粉、海藻酸鈉、明膠、碳酸鈣、枸櫞酸鉀、糊精、碳酸鎂及合成硅酸鎂等。
[0341]作為粘合劑，可以列舉例如:甲基纖維素或其鹽、乙基纖維素、阿拉伯膠、明膠、羥丙基纖維素及聚乙烯基吡咯烷酮等。作為潤滑劑，可以列舉例如:滑石、硬脂酸鎂、聚乙二醇及硬化植物油等。
[0342]作為穩(wěn)定劑，可以列舉例如:精氨酸、組氨酸、賴氨酸、蛋氨酸等氨基酸、人血清白蛋白、明膠、葡聚糖40、甲基纖維素、亞硫酸鈉、偏亞硫酸鈉等。
[0343]作為其他添加劑，可以列舉例如:糖漿、凡士林、甘油、乙醇、丙二醇、檸檬酸、氯化
鈉、亞硝酸鈉及磷酸鈉等。
[0344]適于口服給藥的制劑為乳劑、糖漿劑、膠囊劑、片劑、散劑或顆粒劑等。
[0345]乳劑或糖漿劑等液體制備物使`用如下成分作為添加劑來制造:水，蔗糖、山梨醇或
果糖等糖類，聚乙二醇或聚丙二醇等二醇類，芝麻油、橄欖油或大豆油等油類，對羥基苯甲酸酯等防腐劑或者草莓香料或薄荷等香料類等。
[0346]膠囊劑、片劑、散劑或顆粒劑等使用如下成分作為添加劑來制造:乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇等賦形劑，淀粉或海藻酸鈉等崩解劑，硬脂酸鎂或滑石等潤滑劑，聚乙烯醇、羥丙基纖維素或明膠等粘合劑、脂肪酸酯等表面活性劑或甘油等增塑劑等。
[0347]作為適于非口服給藥的制劑，可以列舉例如:注射劑、栓劑或噴霧劑等。
[0348]注射劑使用包含食鹽溶液、葡萄糖溶液或者這兩者的混合物的載體等來制造。
[0349]栓劑使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體來制造。
[0350]噴霧劑使用不刺激接受者的口腔及氣管粘膜并且使本發(fā)明的單克隆抗體或該抗體片段以微細(xì)粒子的形式分散從而容易吸收的載體等來制造。作為載體，使用例如乳糖或甘油等。另外，也可以以氣溶膠或干粉的形式制造。
[0351]此外，也可以向上述非經(jīng)口劑中添加在適于口服給藥的制劑中作為添加劑而例示的成分。
[0352]本發(fā)明的抗體的有效量和作為與適當(dāng)?shù)南♂寗┘八幚韺W(xué)上能夠使用的載體的組合而施用的有效量為每次每Ikg體重0.0OOlmg~IOOmg,以2天至8周的間隔給藥。
[0353]6.使用本發(fā)明的抗erbB3單克隆抗體或該抗體片段的疾病的診斷方法
[0354]通過使用本發(fā)明的抗體或該抗體片段來檢測或測定erbB3或表達(dá)erbB3的細(xì)胞，能夠?qū)rbB3相關(guān)疾病進(jìn)行診斷。
[0355]作為erbB3相關(guān)疾病之一的癌癥的診斷，例如可以通過如下檢測或測定erbB3來進(jìn)行。
[0356]首先，對于從多名健康人的體內(nèi)采集的生物試樣，使用本發(fā)明的單克隆抗體或該抗體片段或者它們的衍生物，利用下述免疫學(xué)方法進(jìn)行erbB3的檢測或測定，考察erbB3在健康人的生物試樣中的存在量。接著,對受試者的生物試樣也同樣地考察erbB3的存在量，并將其存在量與健康人的存在量進(jìn)行比較。當(dāng)受試者的該多肽的存在量與健康人相比增加時，診斷癌為陽性。
[0357]免疫學(xué)方法是指使用實施標(biāo)記后的抗原或抗體來檢測或測定抗體量或抗原量的方法?？梢粤信e例如:放射性物質(zhì)標(biāo)記免疫抗體法、酶免疫測定法、熒光免疫測定法、發(fā)光免疫測定法、蛋白免疫印跡法或物理化學(xué)方法等。
[0358]放射性物質(zhì)標(biāo)記免疫抗體法中，例如，使本發(fā)明的抗體或該抗體片段與抗原或表達(dá)抗原的細(xì)胞等反應(yīng)，進(jìn)而，使實施放射性標(biāo)記后的抗免疫球蛋白抗體或結(jié)合片段進(jìn)行反應(yīng)，然后，利用閃爍計數(shù)儀等進(jìn)行測定。
[0359]酶免疫測定法中，例如，使本發(fā)明的抗體或該抗體片段與抗原或表達(dá)抗原的細(xì)胞等反應(yīng)，進(jìn)而，使實施標(biāo)記后的抗免疫球蛋白抗體或結(jié)合片段進(jìn)行反應(yīng)，然后，利用吸光光度計測定顯色色素?？梢粤信e例如夾心ELISA法等。
[0360]作為酶免疫測定法中使用的標(biāo)記物，可以使用公知[酶免疫測定法，醫(yī)學(xué)書院(1987)]的酶標(biāo)記?？梢粤信e例如:堿性磷酸酶標(biāo)記、過氧化物酶標(biāo)記、熒光素酶標(biāo)記或生物素標(biāo)記等。
[0361]夾心ELISA法是使抗體結(jié)合在固相上后使其捕獲作為檢測或測定對象的抗原并使第二抗體 與被捕獲的抗原反應(yīng)的方法。該ELISA法中，準(zhǔn)備兩種識別要檢測或測定的抗原的、抗原識別部位不同的抗體或抗體片段，預(yù)先使其中的第一抗體或抗體片段吸附到板(例如96孔板)上，接著，將第二抗體或抗體片段用FITC等熒光物質(zhì)、過氧化物酶等酶或生物素等進(jìn)行標(biāo)記。
[0362]在吸附有上述抗體的板上使從生物體內(nèi)分離的細(xì)胞或其破碎液、組織或其破碎液、細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、胸水、腹水或眼液等進(jìn)行反應(yīng)，然后，使標(biāo)記后的單克隆抗體或抗體片段反應(yīng)，并進(jìn)行與標(biāo)記物質(zhì)相對應(yīng)的檢測反應(yīng)。利用將濃度已知的抗原進(jìn)行連續(xù)稀釋而制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算受試樣品中的抗原濃度。
[0363]作為夾心ELISA法中使用的抗體，可以使用多克隆抗體或單克隆抗體中的任何一種，也可以使用Fab、Fab’或F(ab’)2等抗體片段。作為夾心ELISA法中使用的兩種抗體的組合，可以是識別不同表位的單克隆抗體或抗體片段的組合，也可以是多克隆抗體與單克隆抗體或抗體片段的組合。
[0364]突光免疫測定法通過文獻(xiàn)[MonoclonalAntibodies-Principles and practice,第三版，美國學(xué)術(shù)出版社(1996);単夕口一 >抗體実験7 二二 7 >，講談社寸
B ” (1987)]等中記載的方法進(jìn)行測定。作為熒光免疫測定法中使用的標(biāo)記物，可以使用公知[熒光抗體法，、n卜寸^ 二 > ^公司(1983)]的熒光標(biāo)記?？梢粤信e例如FITC或RITC等。
[0365]發(fā)光免疫測定法通過文獻(xiàn)[生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光，臨床檢查42，廣川書店(1998)]等中記載的方法進(jìn)行測定。作為發(fā)光免疫測定法中使用的標(biāo)記物，可以列舉公知的發(fā)光體標(biāo)記，可以列舉例如吖啶酯標(biāo)記或洛酚堿標(biāo)記等。[0366]蛋白免疫印跡法中，將抗原或表達(dá)抗原的細(xì)胞等利用SDS(十二烷基硫酸鈉)-PAGE[Antibodies-A Laboratory Manual,冷泉港實驗室(1988)]分級后,將該凝膠印跡到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或硝酸纖維素膜上，
[0367]并使識別抗原的抗體或抗體片段與該膜進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)而，使實施FITC等熒光物質(zhì)、過氧化物酶等酶標(biāo)記或生物素標(biāo)記等后的抗小鼠IgG抗體或結(jié)合片段進(jìn)行反應(yīng)，然后，使該標(biāo)記可見化，由此進(jìn)行測定。以下示出一例。
[0368]使表達(dá)具有序列號2所示的氨基酸序列的多肽的細(xì)胞或組織溶解，在還原條件下使每個泳道的蛋白量為0.1~30 ii g，通過SDS-PAGE法進(jìn)行電泳。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，在含有I~10%BSA的PBS (以下記作BSA-PBS)中在室溫下反應(yīng)30分鐘，進(jìn)行封閉操作。
[0369]在此，使本發(fā)明的單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)，用含有0.05~0.l%Tween-20的PBS (以下記作Tween-PBS)清洗,并使過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG在室溫下反應(yīng)2小時。用Tween-PBS清洗，使用ECL(注冊商標(biāo))蛋白免疫印跡檢測試劑(安瑪西亞公司制造)等對結(jié)合有單克隆抗體的條帶進(jìn)行檢測，由此，檢測出具有序列號2所示的氨基酸序列的多肽。
[0370]作為蛋白免疫印跡法的檢測中使用的抗體，使用能夠與未保持天然型立體結(jié)構(gòu)的多肽結(jié)合的抗體。
[0371]作為物理化學(xué)方法，可以列舉例如:使作為抗原的erbB3與本發(fā)明的單克隆抗體或該抗體片段結(jié)合、由此形成凝集體并對該凝集體進(jìn)行檢測的方法。此外，作為物理化學(xué)方法，還可以列舉例如:毛細(xì)管法、一維免疫擴散法、免疫比濁法或乳膠免疫比濁法[臨床檢查法提要，金原出版(1998)]等。
[0372]乳膠免疫比濁法中，使用以抗體或抗原致敏的粒徑約0.1 ii m~約I ii m的聚苯乙烯乳膠等載體，利用對應(yīng)的抗原或抗體引起抗原抗體反應(yīng)時，反應(yīng)液中的散射光增加，透射光減少。將該變化以吸光度或積分球濁度的形式進(jìn)行檢測，由此測定受試樣品中的抗原濃
/又寸。
[0373]另一方面，表達(dá)erbB3的細(xì)胞的檢測或測定可以使用公知的免疫學(xué)檢測方法，優(yōu)選使用免疫沉淀法、免疫細(xì)胞染色法、免疫組織染色法或熒光抗體染色法等。
[0374]免疫沉淀法中，使表達(dá)erbB3的細(xì)胞等與本發(fā)明的單克隆抗體或該抗體片段反應(yīng)后，加入對蛋白G-瓊脂糖等免疫球蛋白具有特異性結(jié)合能力的載體而使抗原抗體復(fù)合物沉淀。
[0375]或者，也可以通過如下方法來進(jìn)行。使上述本發(fā)明的單克隆抗體或該抗體片段固相化于ELISA用96孔板上后，利用BSA-PBS進(jìn)行封閉。
[0376]在抗體為例如雜交瘤培養(yǎng)上清等未純化的狀態(tài)的情況下，使抗小鼠免疫球蛋白、抗大鼠免疫球蛋白、蛋白A或蛋白G等預(yù)先固相化于ELISA用96孔板上，用BSA-PBS封閉后，分注雜交瘤培養(yǎng)上清而使其進(jìn)行結(jié)合。
[0377]接著，棄去BSA-PBS并用PBS充分清洗，然后，使表達(dá)erbB3的細(xì)胞或組織的溶解液進(jìn)行反應(yīng)。用SDS-PAG E用樣品緩沖液從充分清洗后的板上提取免疫沉淀物，通過上述蛋白免疫印跡法進(jìn)行檢測。
[0378]免疫細(xì)胞染色法或免疫組織染色法為如下方法:將表達(dá)抗原的細(xì)胞或組織等根據(jù)情況用表面活性劑或甲醇等進(jìn)行處理以增加抗體的透過性，然后，與本發(fā)明的單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)而，與實施FITC等熒光標(biāo)記、過氧化物酶等酶標(biāo)記或生物素標(biāo)記等后的抗免疫球蛋白抗體或其結(jié)合片段反應(yīng)，然后，使該標(biāo)記可見化并利用顯微鏡進(jìn)行顯微觀察。
[0379]另外，可以通過使細(xì)胞與熒光標(biāo)記的抗體反應(yīng)并使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析的熒光抗體染色法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,第三版，美國學(xué)術(shù)出版社(1996);単夕口一 >抗體実験7 二二 7 >，講談社寸^ r ^ ^ >? (1987)]進(jìn)行檢測。特別地，本發(fā)明的與erbB3的胞外域結(jié)合的單克隆抗體或該抗體片段可以通過熒光抗體染色法來檢測表達(dá)在細(xì)胞膜上的erbB3。
[0380]另外，熒光抗體染色法中，在使用FMAT8100HTS系統(tǒng)(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制造)等的情況下，可以在不對形成的抗體-抗原復(fù)合物與未參與抗體-抗原復(fù)合物形成的游離抗體或抗原進(jìn)行分離的情況下測定抗原量或抗體量。 [0381]實施例
[0382]以下，通過實施例更具體地對本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明不受下述實施例的限定。
[0383][實施例1]erbB3抗原的制作
[0384]1.人erbB3_Fc蛋白表達(dá)載體
[0385]在人erbB3的胞外域(序列號3)上結(jié)合有人IgGl-Fc段的Fe融合蛋白(以下記作erbB3-Fc)的cDNA片段如下制作。編碼人erbB3的胞外域的氨基酸序列的DNA片段通過使用序列號7及序列號8的引物，以人肺Marathon Ready cDNA(Clontech公司)作為模板，使用KOD plus (注冊商標(biāo))DNA聚合酶(東洋紡織公司制造)，進(jìn)行94°C 15秒鐘、60°C 30秒鐘、68°C 2分鐘、35個循環(huán)的PCR反應(yīng)來進(jìn)行擴增。將該erbB3基因片段用限制酶KpnI及XbaI消化，插入到含有人IgG的Fe段的INPEP4載體(Biogen-1DEC公司制造)的適當(dāng)位點，制作erbB3-Fc表達(dá)載體。
[0386]2.人erbB3_GST蛋白表達(dá)載體的制作
[0387]以下的實驗中，只要沒有另外記載，則進(jìn)行1.的PCR條件及限制酶處理，制作各表達(dá)載體。
[0388]人erbB3的胞外域(序列號3)與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(以下記作GST)結(jié)合而成的GST融合蛋白(以下記作herbB3-GST)的cDNA片段如下制作。
[0389]人erbB3胞外域的cDNA片段通過使用序列號9的引物及序列號10的引物，以人肺Marathon Ready cDNA(Clontech公司制造)作為模板，進(jìn)行94°C 15秒鐘、60°C 15秒鐘、680C 2分鐘、35個循環(huán)的PCR反應(yīng)來進(jìn)行擴增。將該基因片段用限制酶KpnI及BglII消化，插入到含有GST的INPEP4載體(Biogen-1DEC公司制造)的適當(dāng)位點，制作herbB3_GST表達(dá)載體。
[0390]3.小鼠erbB3_GST蛋白表達(dá)載體的制作
[0391]在小鼠erbB3的胞外域(序列號6)上結(jié)合有GST的GST融合蛋白(以下記作merbB3-GST)的cDNA片段通過以小鼠肺Marathon Ready cDNA(Clontech公司制造)作為模板，使用序列號11的引物及序列號12的引物進(jìn)行94°C 30秒鐘、65°C 15秒鐘、68°C 2分鐘、35個循環(huán)的PCR反應(yīng)來進(jìn)行擴增。擴增得到的cDNA片段使用限制酶MuI及BglII消化。以下的操作與[實施例1] 1.同樣地制作小鼠erbB3-GST表達(dá)載體。
[0392]4.人-小鼠嵌合erbB3_Fc蛋白表達(dá)載體的制作
[0393]為了考察抗erbB3抗體的結(jié)合區(qū)域，如下制作將人erbB3的胞外域的結(jié)構(gòu)域2~4置換成小鼠erbB3的結(jié)構(gòu)域2~4的嵌合蛋白(以下記作hDl/mD234)、將人erbB3的胞外域的結(jié)構(gòu)域3~4置換成小鼠erbB3的結(jié)構(gòu)域3~4的嵌合蛋白(以下記作hD12/mD34)及將人erbB3的胞外域的結(jié)構(gòu)域4置換成小鼠erbB3的結(jié)構(gòu)域4的嵌合蛋白(以下記作hD123/mD4)的表達(dá)載體。
[0394](I) hDl/mD234表達(dá)載體的制作
[0395]人erbB3_Dl的cDNA片段通過以人erbB3cDNA作為模板，使用序列號13的引物和序列號14的引物，進(jìn)行94°C 30秒鐘、65°C 15秒鐘、68°C 30秒鐘、35個循環(huán)的PCR反應(yīng)來進(jìn)行擴增。另一方面，小鼠erbB3-D234的cDNA片段通過以小鼠erbB3cDNA作為模板，使用序列號15的引物和序列號16的引物，進(jìn)行94°C 30秒鐘、65°C 15秒鐘、68°C 90秒鐘、35個循環(huán)的PCR來進(jìn)行擴增。
[0396]hDl/mD234的cDNA片段通過純化人erbB3_Dl的cDNA片段及小鼠erbB3_D234的cDNA片段，將其混合物作為模板，進(jìn)行94°C 30秒鐘、65°C 15秒鐘、68°C 2分鐘、5個循環(huán)的PCR反應(yīng)后，添加序列號17的引物及序列號18的引物，再進(jìn)行94°C 30秒鐘、65°C 15秒鐘、680C 2分鐘、35個循環(huán)的PCR反應(yīng)來進(jìn)行擴增。將該基因片段用限制酶MluI及BglII消化，插入到含有GST的INPEP4載體(Biogen-1DEC公司制造)中，制作hDl/mD234表達(dá)載體。
[0397](2) hD12/mD34表達(dá)載體的制作
[0398]人erbB3_D12的cDNA片段通過以人erbB3cDNA作為模板，使用序列號19的引物及序列號20的引物，進(jìn)行94°C 30秒鐘、65°C 15秒鐘、68°C I分鐘、35個循環(huán)的PCR來進(jìn)行擴增。
[0399]另一方面，小鼠erbB3_D34的cDNA片段通過以小鼠erbB3cDNA作為模板，使用序列號21的引物及序列號22的引物，進(jìn)行94°C 30秒鐘、65°C 15秒鐘、68°C 90秒鐘、35個循環(huán)的PCR反應(yīng)而進(jìn)行擴增。使用上述擴增得到的2個cDNA片段和序列號23的引物及序列號24的引物，與上述(a)同樣地制作hD12/mD34表達(dá)載體。
[0400](3) hD123/mD4表達(dá)載體的制作
[0401]人erbB2-D123的cDNA片段通過以人erbB3cDNA作為模板，使用序列號25的引物及序列號26的引物，進(jìn)行94°C 30秒鐘、65°C 15秒鐘、68°C 2分鐘、35個循環(huán)的PCR來進(jìn)行擴增。
[0402]另一方面，小鼠erbB3_D4的cDNA片段通過以小鼠erbB3cDNA作為模板，使用序列號27的引物及序列號28的引物，進(jìn)行94°C 30秒鐘、65°C 15秒鐘、68°C 90秒鐘、35個循環(huán)的PCR反應(yīng)來進(jìn)行擴增。使用上述擴增得到的2個cDNA片段和序列號29的引物及序列號30的引物，與上述(a)同樣地制作hD123/mD4表達(dá)載體。
[0403]5.erbB3-Fc 蛋白及 erbB3_GST 蛋白的制作
[0404]使用FreeStyle293表達(dá)試劑盒(Invitrogen公司)，按照附帶的說明書將上述1.~4.中制作的erbB3-Fc蛋白表達(dá)載體及erbB3-GST蛋白表達(dá)載體分別導(dǎo)入FreeStyle293F細(xì)胞中?；厥蛰d體導(dǎo)入后第5天的培養(yǎng)上清，進(jìn)行0.2 y m的過濾器(密理博公司制造)處理。
[0405]erbB3_Fc蛋白使用Protein A樹脂(MabSelect (注冊商標(biāo))，安瑪西亞公司制造)進(jìn)行親和純化。使用磷酸緩沖液(PBS)作為清洗液，使用20mM檸檬酸鈉、50mM NaCl緩沖液(pH2.7)作為洗脫緩沖液。洗脫組分通過添加200mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)而調(diào)節(jié)至pH6.0附近。
[0406]對于erbB3-GST蛋白，向125mL培養(yǎng)上清中添加ImL谷胱甘肽瓊脂糖4B (安瑪西亞公司制造)樹脂懸浮液，在4°C下反應(yīng)4小時。然后，用磷酸緩沖液清洗，使用IOmM谷胱甘肽的50mM Tris-HCl (pH8.0)溶液作為洗脫緩沖液對各結(jié)構(gòu)域肽進(jìn)行親和純化。
[0407]對于洗脫后的融合蛋白溶液，使用透析膜(截留分子量10000, SpectrumLaboratories公司制造)置換成磷酸緩沖液，用孔徑0.22 u m的膜濾器MILLEX_GV(密理博公司制造)過濾滅菌，制作erbB3-Fc蛋白及erbB3_GST蛋白。
[0408]erbB3-Fc蛋白及erbB3-GST蛋白的濃度通過測定280nm的吸光度，將顯示0.86最適密度的融合蛋白溶液的濃度作為lmg/mL進(jìn)行計算。
[0409][實施例2]抗人erbB3抗體的制作
[0410]本實施例中的單克隆抗體的制作按照單克隆抗體實驗操作入門(安東民衛(wèi)等著、講談社發(fā)行、1991年)等中記載的一般的方法制備。被免疫動物使用日本SLC公司銷售的C3H/Hej jms Slc-lpr/lpr 小鼠。
[0411]將erbB3-Fc等抗原蛋白與MPL+TDM乳劑(RiBi ；Sigma公司制造，目錄號52-0177-00)以1:1混合，以20 ii g/只對小鼠的右腹腔內(nèi)進(jìn)行初次免疫。初次免疫以后，將10~20 y g/只的抗原以7-9天的間隔對小鼠進(jìn)行多次免疫。進(jìn)而，為了進(jìn)行細(xì)胞融合，在獲取脾臟及淋巴結(jié)的3天前，將該抗原免疫到右腹腔內(nèi)。從第2次抗原免疫后開始測定抗體效價，之后隨時間推移進(jìn)行抗體效價的測定，判斷脾臟等的摘除時期。
[0412]向通過外科方法由免疫抗原后的小鼠切除的脾臟及淋巴結(jié)中加入IOmL含有350mg/mL碳酸氫鈉、50單位/mL青霉素及50 u g/mL鏈霉素的無血清DMEM培養(yǎng)基(GIB⑶BRL公司制造)(以下記作無血清DMEM培養(yǎng)基)，使用刮刀在篩網(wǎng)(Cell Strainer ；Falcon公司制造)上壓碎。對通過 篩網(wǎng)后的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行離心分離使細(xì)胞沉淀后，將細(xì)胞用無血清DMEM培養(yǎng)基清洗2次，然后懸浮在無血清DMEM培養(yǎng)基中測定細(xì)胞數(shù)。
[0413]另一方面，使用含有10%胎牛血清(以下簡記作FCS) (Sigma公司制造)及L-Glu的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL公司制造)(以下記作含血清DMEM培養(yǎng)基)，在37°C、5%C02存在下將8-氮雜鳥嘌呤抗性小鼠骨髓瘤P3X63Ag8U.1 (P3-U1)以I X IO8細(xì)胞/mL以下的細(xì)胞濃度進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0414]培養(yǎng)得到的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與上述同樣地用無血清DMEM培養(yǎng)基清洗，懸浮在無血清DMEM培養(yǎng)基中測定細(xì)胞數(shù)?；厥盏膩碓从谛∈笃⑴K及淋巴結(jié)的細(xì)胞懸浮液與小鼠骨髓瘤懸浮液以細(xì)胞數(shù)為5:1的比例進(jìn)行混合。將該細(xì)胞混合液離心分離，然后完全除去上清。
[0415]用移液器的尖端攪拌團(tuán)塊的同時緩慢地向該團(tuán)塊中添加ImL作為融合劑的50% (w/v)聚乙二醇1500 (Boehringer Mannheim公司制造)，然后，分2次緩慢地添加ImL預(yù)先加熱至37°C的無血清DMEM培養(yǎng)基，再添加7mL的無血清DMEM培養(yǎng)基。離心分離后，除去上清，將所得到的融合細(xì)胞供于以下記載的利用有限稀釋法的篩選。
[0416]雜交瘤通過在含有10%FCS、次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)以及胸腺嘧啶核苷(T)(以下稱為“HAT” ；Sigma公司制造)的DMEM培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)中培養(yǎng)來選擇。
[0417]進(jìn)而，通過使用含有HT (Sigam公司制造)的DMEM培養(yǎng)基(HT培養(yǎng)基)的有限稀釋法對雜交瘤進(jìn)行單克隆。培養(yǎng)在96孔微量滴定板(BD公司制造)中進(jìn)行。[0418]產(chǎn)生抗人erbB3單克隆抗體的雜交瘤篩選及各雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體的反應(yīng)特異性分析通過后述的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)及熒光活化細(xì)胞分選儀(FACS)分析進(jìn)行。
[0419]結(jié)果，確立了產(chǎn)生抗人erbB3單克隆抗體的雜交瘤1126、1153、920104及12511。
[0420][實施例3]抗erbB3抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的確定
[0421]本發(fā)明中獲得的抗人erbB3單克隆抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過對使erbB3的胞外域與GST融合而得到的GST融合蛋白的結(jié)合ELISA確定。
[0422]將用50mM碳酸緩沖液(pH9)(以下記作包被緩沖液)制備成I U g/mL的抗谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-日本血吸蟲(山羊)(Rockland公司制造，目錄號16979)(以下記作抗GST)以50 ii L/孔添加到Max1-Sorb板(NUNC ;目錄號442404)中，在37°C、1小時(或4°C、開啟)的條件下孵育，使其固相化。
[0423]棄去緩沖液后，向各孔中以250~300 ii L/孔加入封閉試劑(SuperBlock (注冊商標(biāo))封閉緩沖液，PIERCE公司制造)，在室溫下孵育5~10分鐘，進(jìn)行封閉。棄去封閉試劑后，向各抗原的板中分別以50 y L/孔添加用含有10%Block Ace (注冊商標(biāo))(大日本住友制藥公司制造)、0.1%tween20的Tris緩沖液生理鹽水(以下記作分析稀釋液)稀釋至5 u g/mL 的 herbB3-GST 融合蛋白、merbB3_GST 融合蛋白、hDl/mD234 融合蛋白、hD12/mD34融合蛋白及hD123/mD4融合蛋白，在室溫下孵育I小時使其固相化。
[0424]棄去抗原溶液，將板用含有0.1% tween20的Tris緩沖液生理鹽水(以下記作洗滌緩沖液)清洗3次后，以50 y L/孔添加應(yīng)用分析稀釋液稀釋后的免疫血清樣品(終濃度100、1000、10000倍稀釋)、小鼠血清樣品(終濃度100、1000、10000倍稀釋)、作為陽性對照的抗c_ErbB3小鼠單克隆抗體(Ab_4) (Calbiochem公司制造，目錄號OPl 19)(終濃度I~1000ng / mL)及作為陰性對照的小鼠IgGl k同種型對照(Southern Biotech公司制造,目錄號010201)(終濃度I~1000ng/mL)`。`添加一次抗體后，在室溫下孵育30分鐘。
[0425]用洗滌緩沖液清洗3次后，向各孔內(nèi)加入50pL用分析稀釋液稀釋后的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體(southern biotech公司制造，目錄號1030—05)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體(CALTAG公司制造，目錄號M30107)及HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgM抗體(southernbiotech公司制造，目錄號1020-05)，在室溫下反應(yīng)30分鐘。
[0426]用洗滌緩沖液清洗4次后，向各孔內(nèi)加入50UL的3，3’，5，5’ 一四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色底物液(DAK0公司制造)，在暗處在室溫下孵育，使其顯色(約3分鐘)。觀察顯色的進(jìn)行情況的同時加入0.5M硫酸(50pL /孔)，使反應(yīng)停止。
[0427]使用酶標(biāo)儀(MTP-300 ; -口 f電氣公司制造)測定波長450nm(參考波長570nm)下的吸光度。作為結(jié)合ELISA的結(jié)果，將各克隆對各種抗原的反應(yīng)性示于表1中。
[0428]表1
【權(quán)利要求】
1.一種抗體及該抗體片段，其與erbB3的胞外域特異性結(jié)合且抑制依賴于表皮生長因子(EGF)樣配體的erbB3的磷酸化。
2.一種抗體，其與erbB3的胞外域特異性結(jié)合且抑制依賴于erbB3特異性配體的erbB3的磷酸化及不依賴于erbB3特異性配體的erbB3的磷酸化這兩種磷酸化。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗體及該抗體片段，其中，erbB3的磷酸化為依賴于選自表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子a (TGF-a)、雙調(diào)蛋白、P細(xì)胞素、表皮調(diào)節(jié)素、肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)及調(diào)蛋白中的至少兩種配體的erbB3的磷酸化。
4.如權(quán)利要求1~3中任一項所述的抗體及該抗體片段，其中，erbB3的胞外域為包含選自由序列號3所示的氨基酸序列的第20位至第179位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域1、由序列號3所示的氨基酸序列的第180位至第328位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域2、由序列號3所示的氨基酸序列的第329位至第487位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域3及由序列號3所示的氨基酸序列的第488位至第643位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域4中的至少一個結(jié)構(gòu)域的胞外域。
5.如權(quán)利要求1~4中任一項所述的抗體及該抗體片段，其中，抗體為選自下述(a)~(C)中的抗體， (a)與選自1153抗體克隆、12511抗體克隆、920104抗體克隆及1126抗體克隆中的任何一個抗體克隆發(fā)生競爭反應(yīng)的抗體及該抗體片段， (b)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段，所述表位包含與選自1153抗體克隆、12511抗體克隆、920104抗體克隆及1126抗體克隆中的任何一個抗體克隆反應(yīng)的表位， (c)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段，所述表位和與選自1153抗體克隆、12511抗體克隆、920104抗體克隆及1126抗體克隆中的任何一個抗體克隆反應(yīng)的表位相同。
6.如權(quán)利要求1~5中任一項所述的抗體及該抗體片段，其中，抗體為選自包含含有序列號57所示的氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)及含有序列號58所示的氨基酸序列的抗體輕鏈可變區(qū)的抗體、包含含有序列號69所示的氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)及含有序列號70所示的氨基酸序列的抗體輕鏈可變區(qū)的抗體、包含含有序列號81所示的氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)及含有序列號82所示的氨基酸序列的抗體輕鏈可變區(qū)的抗體、以及包含含有序列號93所示的氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)及含有序列號94所示的氨基酸序列的抗體輕鏈可變區(qū)的抗體中的任何一種抗體。
7.一種編碼權(quán)利要求1~6中任一項所述的抗體及該抗體片段的DNA。
8.—種制造權(quán)利要求1~6中任一項所述的抗體及該抗體片段的方法，其特征在于，在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)將包含權(quán)利要求7所述的DNA的載體導(dǎo)入細(xì)胞而得到的轉(zhuǎn)化體，使權(quán)利要求I~6中任一項所述的抗體及該抗體片段在培養(yǎng)液中生成并蓄積，并從培養(yǎng)液純化抗體及該抗體片段。
9.一種抗體組合物，其包含: 第一抗體或該抗體片段，其與erbB3的胞外域的選自由序列號3所示的氨基酸序列的第20位至第179位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域1、由序列號3所示的氨基酸序列的第180位至第328位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域2、由序列號3所示的氨基酸序列的第329位至第487位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域3及由序列號3所示的氨基酸序列的第488位至第643位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域4中的至少一個結(jié)構(gòu)域反應(yīng)；以及第二抗體或該抗體片段，其與不同于與第一抗體反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域反應(yīng)。
10.如權(quán)利要求9所述的抗體組合物，其中，第一抗體或該抗體片段為與erbB3的胞外域的結(jié)構(gòu)域2或結(jié)構(gòu)域4反應(yīng)的抗體或該抗體片段。
11.如權(quán)利要求9或10所述的抗體組合物，其中，第二抗體或該抗體片段為與erbB3的胞外域的結(jié)構(gòu)域I或結(jié)構(gòu)域3反應(yīng)的抗體或該抗體片段。
12.如權(quán)利要求9~11中任一項所述的抗體組合物，其中，第一抗體或該抗體片段為選自下述(a)~(c)中的抗體或該抗體片段， (a)與1126抗體克隆發(fā)生競爭反應(yīng)的抗體及該抗體片段， (b)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段,所述表位包含與1126抗體克隆反應(yīng)的表位， (c)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段,所述表位和與1126抗體克隆反應(yīng)的表位相同。
13.如權(quán)利要求9~12中任一項所述的抗體組合物，其中，第二抗體或該抗體片段為選自下述(a)~(c)中的抗體或該抗體片段， (a)與1153抗體克隆發(fā)生競爭反應(yīng)的抗體及該抗體片段， (b)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段,所述表位包含與1153抗體克隆反應(yīng)的表`位， (c)與如下表位反應(yīng)的抗體及該抗體片段,所述表位和與1153抗體克隆反應(yīng)的表位相同。
14.一種erbB3表達(dá)細(xì)胞相關(guān)疾病的治療方法，其使用權(quán)利要求9~13中任一項所述的抗體組合物。
15.如權(quán)利要求14所述的治療方法，其中，erbB3表達(dá)細(xì)胞相關(guān)疾病為癌癥。
16.一種erbB3表達(dá)細(xì)胞相關(guān)疾病的治療藥，其含有權(quán)利要求9~13中任一項所述的抗體組合物。
【文檔編號】A61K39/395GK103781800SQ201280030600
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月20日
【發(fā)明者】高橋信明 申請人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會社