專利名稱：Tlr4和tlr9激動劑復方在抑制腫瘤轉移中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及TLR4和TLR9激動劑復方在抑制腫瘤轉移中的應用。
技術背景腫瘤轉移是造成腫瘤難以根治的最根本原因，據(jù)統(tǒng)計60%以上的 惡性腫瘤患者于初次診斷時已發(fā)現(xiàn)有轉移。如美國每年診斷約80萬實 體癌患者，最初診斷時發(fā)現(xiàn)有腫瘤轉移者約50萬，臨床腫瘤患者卯％ 以上死于腫瘤轉移。我國每年平均癌發(fā)人數(shù)約180萬到200萬，約有 800/ ^90°/。上死于腫瘤轉移，如果不加以控制，20年后癌癥死亡人數(shù)將 翻一番。先天性免疫反應和獲得性免疫反應直接參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā) 展。免疫系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起雙重作用[l. Karin E. de Visser， Alexandra Eichten and Li幼M. Coussens. Paradoxical roles of the immune system during cancer development. Nature reviews/ cancer. 2006; 6: 24-37.]。 一方面，免疫系統(tǒng)可通過慢性炎癥反應等損傷DNA，釋放細 胞因子、趨化因子、生長因子、MMPs等促進新血管生成和組織重構， 抑制抗腫瘤免疫，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展；另一方面，免疫系統(tǒng)可產(chǎn) 生抗腫瘤T細胞應答和細胞因子介導地腫瘤細胞裂解作用，從而抑制 腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，在抗腫瘤免疫中，免疫系統(tǒng)的促腫瘤生長 和抗腫瘤生長作用存在著平衡，炎癥反應的性質和強度決定了腫瘤的 發(fā)展方向[2. Lisa M. Coussens, Zena Werb. Inflammation and cancer. NATURE. 2002; 420(19): 860-867. 3.]。產(chǎn)生少量細胞因子或很多的抗炎 細胞因子，則會產(chǎn)生有限的炎癥和新血管生成反應，限制腫瘤生長 很強的炎癥反應可以抑制腫瘤新血管生長，使腫瘤消退；大量的趨化因子，適度炎癥，可使大量新血管生成，腫瘤快速生長。TLRs是體內(nèi)先天性免疫的重要組成部分，主要在巨噬細胞和樹 突細胞上表達，通過活化DCs，啟動特異性獲得性免疫應答[l.KarinE. de Visser， Alexandra Eichten and Lisa M. Co咖ens. Paradoxical roles of the immune system during cancer development. Nature reviews/ cancer. 2006; 6: 24-37.]。 TLR的配基是一類免疫性佐劑[3. Pulendr紐B. Modulating vaccine responses with dendritic cells and Toll-like receptors. Immunol Rev. 2004; 199:227-50.]，佐劑的性質決定了下游免疫應答的獨 特類型，以此為基礎調節(jié)免疫反應趨向于CTL應答、抗體應答、特異 類型的Th應答或抗體同等型應答，如CpG激活TLR9，產(chǎn)生強Thl 型和CTL應答，LPS活化TLR4，產(chǎn)生Thl型應答，PG激活TLR2使 免疫平衡趨向于Th2/Treg方向。已有研究表明，50%的腫瘤患者，在 外科手術切除原發(fā)腫瘤后，由于手術過程中接觸LPS，促進了腫瘤轉 移進程。CpG可產(chǎn)生抑制Th2型反應、增強Thl型反應的作用，是通 過促進IFN-y和IL-10的表達產(chǎn)生的；同時IL-10的表達可抑制Thl型 反應過度。CpG單獨使用時不能產(chǎn)生明顯的抗腫瘤轉移作用，作為佐 劑與腫瘤抗原或抗腫瘤藥物合用，可產(chǎn)生較明顯的抗腫瘤生長和轉移 作用[4. Mark M. Whi加ore， et,al. Synergistic Activation of Innate Immunity by Double-Stranded RNA and CpG DNA Promotes Enhanced Antitumor Activity. CANCER RESEARCH. 2004; 64: 5850~5860.5. Kunihiko Kitagaki， 汰al. Immunomodulatory Effects of CpG Oligodeoxynucleotides on Established Th2 Responses. CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY. 2002; 1260~1269.6. Lucia Sfondrini， et.al. CpG-Oligodeoxynucleotides activate tyrosi鵬e-related protein 2~specific T lymphocytes but do not lead to a protective tumor-specific memory response. Cancer Immunol Immunother. 2004; 53: 697—704.7. Pratesi G et.al. Therapeutic syneigism of gemcitabine and CpG國oligodeoxynucleotides in an orthotopic human pancreatic carcinoma xenograft. Cancer Res. 2005; 65(14):6388-93.]
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的要解決的技術問題是，提供一種新的抑制腫瘤轉移的方法，即TLR4激動劑和TLR9激動劑復方在制備預防腫瘤轉移藥物中的 應用。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的TLR4激動劑是LPS fr6m Po/p/i"( /mwKW根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的的TLR9激動劑五.co/z' 0111:B4 LPS。 根據(jù)本發(fā)明TLR4激動劑和TLR9激動劑復方預防轉移的腫瘤優(yōu)選 是肺腫瘤。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包括TLR4激動劑和TLR9激動 劑和藥劑學上常用的載體。為了解決本發(fā)明的技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案 發(fā)明人通過在腫瘤產(chǎn)生前或產(chǎn)生后激活不同的TLR模式識別受 體，增強先天性免疫應答，改變炎癥反應的性質和強度，觀察對腫瘤 生長和轉移的影響，從而研究利用炎癥反應中抗腫瘤的活性部分，抑 制它的促腫瘤的活性，在此基礎上開發(fā)抗腫瘤的免疫性佐劑和治療性 疫苗。換而言之，本發(fā)明的發(fā)明人通過對Toll樣受體(TLRs)激動劑 對腫瘤生長和轉移的影響的系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)TLR4+TLR9激動劑合劑提 前給藥顯著抑制黑色素瘤所致小鼠肺腫瘤的轉移。具體而言，C57BL/6純系小鼠尾靜脈注射黑色素瘤B16F10造成 小鼠肺腫瘤高轉移模型，分別于造模前和造模后腹聘注射TLR2激動 劑(LPS-PG)或TLR4 (LPS-EC) +TLR9 (CpG)激動劑合劑，陽性 對照藥為環(huán)磷酰胺。造模2周后，處死小鼠取小鼠肺計數(shù)肺結節(jié)數(shù)和 RT-PCR檢測Thl、 Th2和Treg細胞因子mRNA表達水平。實驗結果發(fā)現(xiàn)TLR4+TLR9激動劑合劑提前給藥顯著降低黑色素 瘤所致小鼠肺結節(jié)數(shù)和肺指數(shù)，效果與環(huán)磷酰胺相當，而造模后給藥 對肺結節(jié)數(shù)和肺指數(shù)無作用。TLR2激動劑預防和治療給藥肺結節(jié)數(shù)和 肺指數(shù)均無作用。RT-PCR結果表明，TLR4+TLR9激動劑合劑顯著增 加IFNy/IL-13、 IFNy/TGFP和MMP2/TIMP1比值，而顯著降低IL-4的 表達。說明TLR4+TLR9激動劑合劑提前給藥顯著抑制黑色素瘤所致小 鼠肺腫瘤的轉移，使Thl/Th2、Thl/Treg平衡朝向Thl偏移。TLR4+TLR9 激動劑合劑醫(yī)治腫瘤轉移的作用可能與預先升高小鼠體內(nèi)炎癥水平， 抑制腫瘤產(chǎn)生免疫炎癥反應有關。


Sham:假手術組 Mod:模型組； CTX:環(huán)磷酰胺組； TLR2bef: TLR2提前給藥組；(TLR4+TLR9) bef: (TLR4+TLR9)提前給藥組； TLR2aft: TLR2治療給藥組；(TLR4+TLR9) aft: (TLR4+TLR9)治療給藥組。 #P<0,05， **P<0.01， ###P<0.001 vs Sham; *P<0.05 ， * *P<0.05 ， * * *P<0.001 vs Mod 。圖l. TLRs激動劑對肺轉移結節(jié)數(shù)和肺指數(shù)的影響。 圖A:小鼠肺照片； 圖B:肺指數(shù)； 圖C:肺結節(jié)數(shù)。圖2.圖2-A TLRs激動劑對IFNyiL-13比值的影響。圖2-B TLRs激動劑對IFNy/TGFp比值的影響。圖2-C TLRs激動劑對IL-4比值的影響。
圖2-D TLRs激動劑對MMP2mMPl比值的影響。
具體實施方式
下面的實施例是的本發(fā)明的具體說明，不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例11.試驗材料和方法 1.1材料TLR2激動劑LPS-PG (Pgz'wgi'vfl/&LPS，ultrapure)、 TLR4激動劑 LPS-EC (￡. co/z0111:B4LPS，ultrapure)均購自InvivoGen公司。TLR9 激動劑CpG-ODN1826由北京賽百盛基因技術有限公司合成(序列5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'，全程硫代修飾，訂單號0404-230)。 1.2薷色素癯小鼠肺轉移模型的制備1.2.1動物選擇C57BL/6純系小鼠，5~6周齡，雌性，14畫16g;1.2.2瘤株高轉移的黑素瘤B16F10細胞株；1.2.3瘤細胞的培養(yǎng)B16細胞置于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng) (10。/。FBS+青霉素+鏈霉素)，37'C， 5%C02;1.2.4瘤液的制備用EDTA消化對數(shù)生長期B16細扭，PBS沖洗 兩遍，重新混懸于PBS中制成2.5xl()S個/ml瘤細胞懸液。1.2.5腫瘤接種方法將制備好的瘤液300nL置于EP管內(nèi)，無菌 條件下尾靜脈注射200pL于C57BL/6小鼠，相當于每只小鼠接種5>< 105 個瘤細胞。 1.3試驗方法1.3.1試驗分組C57BL/6純系小鼠分為7組，每組15只。模型組，小鼠尾靜脈黑 色素瘤混懸液200nL/只；假手術組，尾靜脈注射PBS200nL/只；TLR2 提前給藥組，于小鼠造模前第7、 4、 1天腹腔注射LPS-PG 25jig/kg; TLR2治療組，于小鼠造模后第l、 4、 7天腹腔注射LPS-PG 25ng/kg; TLR4+TLR9合劑提前給藥組，于小鼠造模前第7、 4、 1天腹腔注射 12.5Mg/kg LPS-EC +250ng/kg CpG-ODN1826; TLR4+TLR9合劑治療 組，于小鼠造模后第l、 4、 7天腹腔注射12.5pg/kgLPS-EC+25(Vg/kg CpG-ODN1826;環(huán)磷酰胺(CTX)治療組，于小鼠造模后每天給予CTX 20mg/kg，連續(xù)給藥2周。造模2周后，處死小鼠。取脾臟、肺臟及血 清，保存待檢測。 1.3.2檢測指標1.3.2.1腫瘤轉移情況(n-10):在末次給藥24小時之后，斷髄處死， 稱肺量，4%多聚甲醛固定，在解剖顯微鏡下(10倍)記數(shù)肺表面瘤結 節(jié)數(shù)。1.3.2.2小鼠肺免疫環(huán)境監(jiān)測 先天性免疫情況RT-PCR檢測TLR2、 TLR4、 TLR9表達水平。 獲得性免疫情況 Thl: RT-PCR和ELISA檢測IFN個IL-8、 IL-6、 TNF-a、 IL-12、 IL-18細胞因子表達水平； Th2: RT-PCR和ELISA檢測IL-4、 IL-5、 IL-13表達水平； Treg: RT-PCR檢測TGF-P、 IL-IO、 Foxp3表達水平。2.結果2.1 TLRs激動劑對腫瘤肺轉移的影響TLR4+TLR9激動劑合劑提前給藥顯著降低小鼠肺結節(jié)數(shù)(P0.001vs模型組)和肺指數(shù)(PO.001 vs模型組)，而TLR4+TLR9激動劑合 劑治療給藥對小鼠肺結節(jié)數(shù)和肺指數(shù)無作用。TLR2受體激動劑無論提 前給藥還是治療給藥對小鼠肺結節(jié)數(shù)均無作用。陽性對照藥顯著降低
小鼠肺結節(jié)數(shù)(P<0.001 vs模型組)和肺指數(shù)(P<0.05 vs模型組)(圖 1)。2.2TLRs激動劑對Thl、 Th2和Treg細胞因子表達的影響TLR4+TLR9激動劑合劑提前給藥顯著增力QIFN下/IL-13比值(P0.05 vs模型組)(圖2A)、 IFNyA"GFp比值(P<0.01 vs模型組)(圖2C)和 MMP2/TIMP1比值(PO.05vs模型組)(圖2D)，而顯著降低IL-4的表 達(PO.01vs模型組)(圖2B)。 探討TLRs激動劑對腫瘤轉移抑制作用的免疫學機制。討論TLR4+TLR9激動劑提前給藥顯著增加IFNy/IL-13比值和IL-4的表 達水平，說明TLR4+TLR9激動劑提前給藥可能預先改變小鼠肺微環(huán)境 Thl/Th2細胞因子的平衡，使Thl/Th2平衡朝向Thl免疫應答偏移。 TLR4+TLR9激動劑提前給藥也顯著增加IFNY/TGF卩比值，使Thl/Treg 平衡也朝向Thl免疫應答偏移。這種預先提高體內(nèi)炎癥水平的作用可能 是TLR4+TLR9激動劑抑制腫瘤轉移的機制之一?？傊琓LR4+TLR9激動劑合劑提前給藥顯著抑制黑色素瘤所致小 鼠肺腫瘤的轉移，使Thl/Th2、 Thl/Treg平衡朝向Thl偏移。TLR4+TLR9 激動劑合劑醫(yī)治腫瘤轉移的作用可能與預先升高小鼠體內(nèi)炎癥水平， 抑制腫瘤產(chǎn)生免疫炎癥反應有關。TLR4+TLR9激動劑合劑為預防腫瘤 轉移提供了新的治療方法。
權利要求
1.TLR4激動劑和TLR9激動劑復方在制備預防腫瘤轉移藥物中的應用。
2. 根據(jù)權利要求l的應用，其特征在于，所述的TLR4激動劑是LPS from尸or/ /^ra附owa51 g/"g/voto 。
3. 根據(jù)權利要求l的應用，其特征在于，所述的TLR9激動劑是E co// 0111:B4 LPS。
4. 根據(jù)權利要求l的應用，其特征在于，所述的腫瘤是肺腫瘤。
5. —種藥物組合物，其特征在于，包括TLR4激動劑和TLR9激動劑 和藥劑學上常用的載體。
6. —種藥物組合物，其特征在于，包括LPS from戶w7^,cw70"os g/wg/rafo和E co// 0111:B4 LPS和藥劑學上常用的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了TLR4激動劑和TLR9激動劑復方在制備預防腫瘤轉移藥物中的應用，尤其是TLR4激動劑是LPS from Porphyromonas gingivalis和TLR9激動劑E.coli 0111B4 LPS在抑制肺腫瘤轉移中的應用。本發(fā)明還公開了一種藥物組合物，包括TLR4激動劑和TLR9激動劑和藥劑學上常用的載體。本發(fā)明通過小鼠肺腫瘤高轉移模型，分別于造模前腹腔注射TLR2激動劑(LPS-PG)或TLR4(LPS-EC)+TLR9(CpG)激動劑合劑，發(fā)現(xiàn)TLR4+TLR9激動劑合劑提前給藥顯著降低黑色素瘤所致小鼠肺結節(jié)數(shù)和肺指數(shù)，顯著增加IFNγ/IL-13、IFNγ/TGFβ和MMP2/TIMP1比值，而顯著降低IL-4的表達。使Th1/Th2、Th1/Treg平衡朝向Th1偏移。TLR4+TLR9激動劑合劑提前給藥顯著抑制黑色素瘤所致小鼠肺腫瘤的轉移。
文檔編號A61K31/739GK101134046SQ200610112299
公開日2008年3月5日 申請日期2006年9月1日 優(yōu)先權日2006年9月1日
發(fā)明者君 嚴, 何令帥, 劉含智, 冰 崔, 李平平, 楊紅振, 王青青, 胡卓偉, 謝文杰, 辛冰牧, 閆慧敏 申請人:中國醫(yī)學科學院藥物研究所