專(zhuān)利名稱(chēng)：人造血管絲素蛋白預(yù)凝涂層的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可用來(lái)置換、旁路移植或分流人體血管系統(tǒng)任一部分的人造血管假體的預(yù)凝涂層方法，尤其是使用混有增塑劑的絲素蛋白溶液涂層人造血管假體，使其不漏血從而免除手術(shù)過(guò)程中預(yù)凝血操作的方法。
背景技術(shù)：
使用人造血管假體置換人體病變血管是一項(xiàng)成熟的外科技術(shù)。人造血管有許多不同的類(lèi)型，并可由不同的材料構(gòu)成。可以植入人體的人造血管假體通常是由生物相容性材料構(gòu)成，同時(shí)血管假體植入后能保持開(kāi)放的管形結(jié)構(gòu)并允許血流通暢無(wú)阻運(yùn)行其中。血管假體可以由生物相容性纖維材料構(gòu)成，如滌綸或聚四氟乙烯，通過(guò)針織或機(jī)織而成，可以是單層或雙層結(jié)構(gòu)。
人造血管的基底層是由多孔的纖維壁構(gòu)成，多孔的結(jié)構(gòu)非常重要，因?yàn)檫@能使人造血管對(duì)血液保持足夠的密封性避免在手術(shù)過(guò)程中失血過(guò)多，同時(shí)保持足夠的孔隙允許成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞侵入生長(zhǎng)，使得受體組織包裹愈合血管假體。合成的人造血管假體在U.S.Pat.Nos.3,805,301 and No.4,047,252描述為滌綸編織的可延伸的彈性管狀結(jié)構(gòu)體。這些血管假體具備足夠的孔隙允許受體組織侵入生長(zhǎng)。但此類(lèi)型人造血管在植入體內(nèi)時(shí)需預(yù)凝血操作。預(yù)凝后的血管植入體內(nèi)后便不再漏血同時(shí)也不妨礙自身組織的侵入生長(zhǎng)。然而，外科手術(shù)尤其是急診手術(shù)時(shí)希望能在植入人造血管時(shí)省缺預(yù)凝步驟從而節(jié)省寶貴的手術(shù)時(shí)間。
為了免除人造血管假體手術(shù)過(guò)程中預(yù)凝血操作，又保持足夠的孔隙便于受體組織的侵入生長(zhǎng)并包裹愈合人造血管。許多實(shí)驗(yàn)在研究提高人造血管植入時(shí)對(duì)血液的密封性，通常的辦法使用可降解的生物材料(如纖維蛋白，白蛋白，明膠或膠原(R.A.Jonas，F(xiàn).J.Schoen，R.J.Levy and A.R.Castaneda，“Biologicalsealants and knitted DacronPorosity and histological comparisons ofvascular graft materials with and without collagen and fibrin gluepretreatments，”Ann.Thorac.Surg.，41，657-663(1986)；K.Kottke-Marchant，J.M.Anderson，Y.Umemura，and R.E.Marchant，“Effectof albumin coating on the in vitro blood compatibility of Dacron arterialprostheses，”Biomaterials，10，147-155，(1989)；R.Guidoin，D.Marceau，and J.Couture，“Collagen coating as biological sealants for textilearterial prostheses，”Biomaterials，10，156-165，(1989)))涂層浸漬多孔隙人造血管假體，涂層浸漬的人造血管在植入人體時(shí)不再漏血(United StatesPatent 4,747,848，United States Patent 5108424)。但上述涂層材料不穩(wěn)定，且獲得困難，價(jià)格昂貴(J.H.Lee，W.G.Kim，and S.S.Kim，“Development andcharacteri zation of an alginate impregnated polyester vascular graft，”J Biomed Mater Res 36，200-208，(1997))，同時(shí)運(yùn)用牛膠原，明膠為涂層材料研制的人造血管不能植入對(duì)牛豬布魯氏桿菌抗原過(guò)敏的病人體內(nèi)。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述困難，本發(fā)明采用可降解的生物材料絲素蛋白溶液涂層人造血管假體，同樣達(dá)到免除手術(shù)過(guò)程中預(yù)凝血操作，節(jié)省手術(shù)時(shí)間的目的。該人造血管由具生物相容性的纖維材料構(gòu)成的多孔隙管狀合成血管假體與混有增塑劑的絲素蛋白液交聯(lián)而成，使得人造血管假體不漏血從而免除手術(shù)過(guò)程中的預(yù)凝血操作。這管狀血管假體的多孔隙基底層可以是由滌綸構(gòu)成，可以是針織或機(jī)織而成。
從柞蠶絲提煉并通過(guò)透析的方法得到高純度的絲素蛋白纖維分散液。將高純度的絲素蛋白溶液均勻覆蓋于合成血管假體基底層的內(nèi)面，使人造血管結(jié)構(gòu)充滿彈性而具備較好的操控性和縱向伸展能力。至少運(yùn)用絲素蛋白液涂層5遍，干燥后將其暴露于甲醛蒸汽中交聯(lián)。
為了保持人造血管假體在干燥的狀態(tài)下保持足夠柔軟而具彈性，在使用絲素蛋白溶液涂層人造血管假體前須混合甘油、山梨醇或其它具生物相容性的增塑劑?；旌贤繉硬牧现薪z素蛋白5-50％，增塑劑濃度6-15％(重量比)。同時(shí)加入10-25％的乙醇促進(jìn)水分的蒸發(fā)。
合成針織或機(jī)織型的人造血管依照本發(fā)明的方法使用絲素蛋白和增塑劑的混合液涂層后獲得最重要的特征是使得原先多孔隙結(jié)構(gòu)的血管基質(zhì)的滲水率約降至零。作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)取未涂層的20根合成機(jī)織型的滌綸血管，平均滲水率為379.3±11.8ml/min*cm2，按照本發(fā)明涂層后滲水率降至零。
由此，本發(fā)明一個(gè)目的是提供一種制備不漏血人造血管假體的方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一種制備絲素蛋白溶液涂層合成血管假體并使其不漏血的方法。
本發(fā)明其它的目的和益處將在以下的實(shí)例說(shuō)明中得到清晰的顯現(xiàn)。
本發(fā)明包含的特征、性質(zhì)以及相關(guān)原理和操作步驟和各步驟之間的關(guān)系將在以下具體實(shí)例中的細(xì)節(jié)逐一闡述，而本發(fā)明的范圍將在權(quán)利要求中說(shuō)明。


為更好的理解本發(fā)明，須參考說(shuō)明書(shū)附圖及說(shuō)明圖1是按照本發(fā)明的方法制備的絲素蛋白溶液涂層的直線型人造血管假體部分的橫斷面；圖2是按照本發(fā)明的方法制備的絲素蛋白溶液涂層的分叉型人造血管假體的部分橫斷面；圖3表示人造血管假體的滲水率隨著按照本發(fā)明的方法運(yùn)用絲素蛋白溶液涂層次數(shù)增多逐步降低。
具體實(shí)施例方式
按照本發(fā)明制備的合成人造血管假體如圖1所示包括管狀結(jié)構(gòu)主體01，它是由具生物相容性的纖維合成材料，尤其是聚對(duì)苯二甲酸乙酯(如滌綸)針織或機(jī)織而成的基質(zhì)02構(gòu)成的多孔隙結(jié)構(gòu)體?；|(zhì)02具內(nèi)外側(cè)兩層絨面04。除滌綸外，管狀結(jié)構(gòu)主體01也可以由其它具生物相容性纖維材料針織或機(jī)織而成，只要使其具備多孔隙的結(jié)構(gòu)允許受體的組織侵入生長(zhǎng)同時(shí)保持開(kāi)放的管腔結(jié)構(gòu)允許血流順暢通過(guò)。在絨面04內(nèi)側(cè)面覆有絲素蛋白溶液涂層06，絲素蛋白溶液涂層06需至少運(yùn)用絲素蛋白和增塑劑的混合液體材料涂層5遍并通過(guò)暴露于甲醛蒸汽中交聯(lián)而成。
圖2演示一分叉形絲素蛋白溶液涂層的人造血管假體12，血管假體12包括主管狀結(jié)構(gòu)體14和兩個(gè)分枝管狀體16。主管狀結(jié)構(gòu)體14和分枝管狀體16由滌綸針織或機(jī)織而成的基質(zhì)18構(gòu)成，基質(zhì)18內(nèi)側(cè)絨面覆有絲素蛋白溶液涂層20，至少運(yùn)用絲素蛋白溶液涂層5遍。
依據(jù)本發(fā)明多孔隙結(jié)構(gòu)的人造血管假體基質(zhì)由滌綸通過(guò)針織或機(jī)織而成最優(yōu)。通常通過(guò)滌綸基質(zhì)編織而成的人造血管假體滲水率范圍在2000到3000ml/min*cm2(清潔過(guò)濾的水，120mmHg條件下)之間，而由滌綸機(jī)織而成的滲水率在300到400ml/min*cm2(清潔過(guò)濾的水，120mmHg條件下)之間。交聯(lián)絲素蛋白溶液的方法是將絲素蛋白和增塑劑的混合液均勻涂布人造血管假體基質(zhì)內(nèi)，去除多余的涂層材料并放置干燥后暴露于甲醛蒸汽中交聯(lián)，置入真空干燥箱中去除多余的濕氣和甲醛。按照本發(fā)明制備的絲素蛋白溶液涂層的人造血管的滲水率(單位ml/min*cm2)接近于零。
以下實(shí)例將說(shuō)明絲素蛋白從柞蠶絲中提取和純化以及依據(jù)發(fā)明制備絲素蛋白溶液涂層人造血管假體的過(guò)程。列舉實(shí)例的目的是闡述專(zhuān)利而不是來(lái)限制它的范圍。
實(shí)例1絲素蛋白提取方法柞蠶蠶絲在0.5％(重量比)Na2CO3溶液中煮1-1.5h以脫去絲膠蛋白(蠶絲重量(g)與Na2CO3溶液體積(ml)比在1/80-1/67之間)，使用蒸餾水反復(fù)清洗脫去絲膠蛋白的蠶絲直至完全潔凈。將脫去絲膠的潔凈蠶絲置入CaCl2/H2O/C2H5OH＝1∶8∶2(摩爾比)溶劑中(脫去絲膠的蠶絲重量(g)與H2O、C2H5OH體積(ml)和之比在1/10-1/15之間，然后推算出CaCl2的質(zhì)量)，于70-80℃下溶解30-45分鐘后冷卻裝入透析袋，用蒸餾水透析3天后過(guò)濾得到高純度絲素蛋白水溶液，然后通過(guò)加溫磁力攪拌的辦法濃縮絲素蛋白溶液達(dá)到制備涂層材料的濃度(磁力攪拌儀的溫度控制在45-55℃)。
實(shí)例2絲素蛋白液涂層人造血管將含有絲素蛋白(按照實(shí)例1從柞蠶絲提純)濃度為12％的絲素蛋白混合液注滿50ml的注射器內(nèi)，該絲素蛋白混合液同時(shí)含有10％的甘油，18％的乙醇和蒸餾水，粘度約28,000厘泊。注射器與合成的機(jī)織人造血管一端相連，絲素蛋白混合液被推注入人造血管管腔并使涂層液均勻涂布于管腔內(nèi)壁，多余的絲素蛋白混合液從人造血管另一端去除。涂層后的人造血管室溫下干燥1/2小時(shí)，涂層干燥至少反復(fù)操作5次。
第5次涂層后，使人造血管暴露于甲醛蒸汽中交聯(lián)，交聯(lián)后置于室溫下干燥15分鐘后置入真空箱中干燥24小時(shí)去除血管假體濕氣和多余的甲醛。
實(shí)例3涂層前后人造血管假體血液滲透率比較按照實(shí)例2的方法制備不漏血的絲素蛋白溶液涂層的人造血管檢測(cè)如下，隨機(jī)抽取5根直徑為8mm長(zhǎng)度為12cm涂層后的合成機(jī)織人造血管并與儲(chǔ)血器相連，在120mmHg的壓力下，使肝素化的血液在血管內(nèi)通過(guò)，收集滲漏的血液并計(jì)量(單位ml/min*cm2)。檢測(cè)結(jié)果5根人造血管的血液滲出率分別是0.05，0.0，0.03，0.04和0.0，平均血液滲出率為0.023ml/min*cm2，接近于零。
為與未涂層的機(jī)織人造血管比較，選取未涂層的人造血管重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，測(cè)得平均血液滲出率為27.6ml/min*cm2。
實(shí)例4涂層前后人造血管假體滲水率比較人造血管經(jīng)絲素蛋白液涂層5次后滲水率降至1％以下。標(biāo)準(zhǔn)的滲水率實(shí)驗(yàn)(R.Guidoin，M.King，D.Marceau，and A.Cardou，“Textile arterial prosthesesIswater permeability equivalent to porosity？”J.Biomed.Mater.Res.，21，65-87(1987))測(cè)定如下。相當(dāng)于120mmHg的水柱壓力通過(guò)2.44cm2面積的圓孔，將人造血管假體的樣品固定于圓孔上1min，收集并測(cè)定滲漏水量。每個(gè)樣品分別測(cè)定數(shù)次，測(cè)定結(jié)果如下表示滲水率(porosity)＝ml/min*cm2合成的機(jī)織人造血管的滲水率是400ml/min*cm2經(jīng)過(guò)不同次數(shù)涂層后的滲水率變化如下

在上述實(shí)驗(yàn)的每一次涂層使用的絲素蛋白溶液均從柞蠶絲按照實(shí)例1描述提純，涂層方法均按照實(shí)例2描述操作。結(jié)果如附圖3所示?；诖耍苽湟唤z素蛋白溶液涂層人造血管至少需5次涂層絲素蛋白混合液，甚至6次。并且在每次涂層之間需待其干燥，最后交聯(lián)固定絲素蛋白于人造血管基質(zhì)內(nèi)。
與未涂層的人造血管相比，絲素蛋白溶液涂層的人造血管不僅降低了滲水率，而且減少了血栓生成。以下的實(shí)例證明與對(duì)照組相比絲素蛋白溶液涂層人造血管假體顯著的減少了血栓的生成。
實(shí)例5涂層前后人造血管血栓生成比較實(shí)驗(yàn)(體外)采用體外實(shí)驗(yàn)(Imai Y，Nose Y.“A new method for evaluation ofantithrombogenicity of materials.”J Biomed Mater Res 6(3)165-72，(1972))來(lái)評(píng)價(jià)涂層前后人造血管假體的抗血栓生成能力。將0.25ml的枸櫞酸血混合0.1mmol/L的CaCl225μl注入按照實(shí)例2制備的絲素蛋白溶液涂層的人造血管假體管腔內(nèi)壁，同樣體積的上述血液注入未涂層的人造血管假體管腔內(nèi)壁作為對(duì)照。分別在5，10和15分鐘時(shí)點(diǎn)將5ml蒸餾水傾倒在實(shí)驗(yàn)樣本上終止凝血反應(yīng)，并觀測(cè)各血管假體標(biāo)本血栓形成情況。結(jié)果顯示兩組樣本血栓形成有顯著差異。以下表格中數(shù)據(jù)是實(shí)驗(yàn)得到的半定量參數(shù)結(jié)果。

如表格所示，絲素蛋白溶液涂層組在5min時(shí)點(diǎn)無(wú)纖維蛋白凝塊形成，在15min時(shí)點(diǎn)絲素蛋白涂層組纖維蛋白凝塊形成同樣顯著少于對(duì)照組。在與血液接觸時(shí)未涂層的人造血管假體幾乎是疏水的，需12到16秒血液才浸濕機(jī)織的人造血管的纖維，而血液浸濕絲素蛋白涂層的人造血管基質(zhì)平衡而迅速。
基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在體外無(wú)血流的情況下，絲素蛋白涂層的滌綸血管假體血液浸濕迅速，在5分鐘內(nèi)無(wú)血栓形成。在同一時(shí)點(diǎn)對(duì)照組血管假體顯示血栓形成。在10和15分鐘時(shí)點(diǎn)絲素蛋白涂層組血管假體形成的血栓數(shù)量明顯少于空白對(duì)照組。
實(shí)例6涂層前后人造血管血栓生成比較實(shí)驗(yàn)(體內(nèi))絲素蛋白涂層人造血管假體體內(nèi)(雜種犬)實(shí)驗(yàn)如下。全麻下在犬股動(dòng)靜脈之間植入分流管(使用5cm長(zhǎng)兩短為圓錐形的穿刺管，便于插入連接人造血管假體)。血管假體連接完成后，先緩慢松開(kāi)靜脈端的血管阻斷鉗，然后再緩慢松開(kāi)動(dòng)脈端的阻斷鉗。使血流在血管假體中運(yùn)行10分鐘和30分鐘后阻斷分流管兩端，取下血管假體。將血管假體腔內(nèi)多余的血液流出后稱(chēng)重，肉眼觀測(cè)管腔內(nèi)壁形成的血栓，然后使用足夠的蒸餾水沖洗血管假體(3次)并再次稱(chēng)重。
對(duì)照組使用的標(biāo)準(zhǔn)的8mm直徑的滌綸血管，在與股動(dòng)靜脈分流管連接前行預(yù)凝血操作。如此可提供血管假體體內(nèi)實(shí)驗(yàn)血栓形成的視覺(jué)證據(jù)和客觀重量數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中從血管假體壁泄漏的血液同樣被收集并稱(chēng)重進(jìn)行比較。
絲素蛋白涂層的人造血管無(wú)血液滲漏。而預(yù)凝組血管與股動(dòng)靜脈分流管連接后，第一個(gè)5分鐘內(nèi)，每5cm血管假體平均滲漏28ml血液。第二個(gè)5分鐘約3-6ml。在對(duì)照組一例預(yù)凝血管連續(xù)測(cè)試30分鐘，平均每5cm人造血管每分鐘滲漏約1.5ml血液。
絲素涂層人造血管假體植入分流管10和30分鐘肉眼觀測(cè)均無(wú)血栓形成。在實(shí)驗(yàn)組血管假體絲素涂層表面覆蓋一光滑白色有光澤薄纖維蛋白層，經(jīng)蒸餾水反復(fù)沖洗和后在多數(shù)血管假體內(nèi)壁能觀察到一連續(xù)的纖維蛋白薄膜，無(wú)典型的血凝塊發(fā)現(xiàn)。
在預(yù)凝血操作組5例血管假體內(nèi)壁中，有4例觀測(cè)到明顯的典型血凝塊形成，血凝塊多位于血流方向的橫斷面，約占血管假體管周的1/3到1/2。另1例假體內(nèi)壁形成類(lèi)似纖維蛋白膜結(jié)構(gòu)?？赡苡捎谘鼙诔掷m(xù)的血液滲漏，在對(duì)照組每例血管假體外壁均有大的血凝塊形成。
基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，絲素蛋白涂層的滌綸人造血管血栓生成顯著少于預(yù)凝組，這可能與絲素蛋白抗凝減少血栓生成有關(guān)，同時(shí)可能是預(yù)凝血操作目的即是需要血凝來(lái)防止血管壁漏血的緣故。但血凝塊參與細(xì)胞過(guò)度反應(yīng)增生并將被纖維細(xì)胞替代，所以減少滌綸人造血管基質(zhì)血凝塊形成對(duì)降低血管血栓和栓塞的發(fā)生是有益的。
對(duì)于植入人體替代病變血管的人造血管假體，按照本發(fā)明的方法運(yùn)用絲素蛋白和增塑劑的混合液涂層合成針織或機(jī)織具多孔隙結(jié)構(gòu)的人造血管假體至少5次，可使血管假體特征獲得明顯的改善。預(yù)期的益處不僅是免除了手術(shù)過(guò)程中的預(yù)凝血操作。盡管許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)多孔隙結(jié)構(gòu)對(duì)保持人造血管植入人體后長(zhǎng)期通暢是必要的，但同時(shí)在手術(shù)過(guò)程中必須使用患者的血液行預(yù)凝血操作來(lái)防止術(shù)中和術(shù)后大量的血液滲漏丟失。事實(shí)上，預(yù)凝血操作比較耗時(shí)并需要一定的技巧和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。另外如患者需急診手術(shù)或有凝血疾患則使得預(yù)凝血變得困難或無(wú)法操作。
綜上所述，絲素蛋白和增塑劑的混合液涂層合成機(jī)織具多孔隙結(jié)構(gòu)的人造血管假體免除了手術(shù)過(guò)程中的預(yù)凝血操作同時(shí)提供了理想的基質(zhì)便于受體組織的侵入和包裹生長(zhǎng)，另外，絲素蛋白溶液涂層后的血管假體血栓生成明顯減少?gòu)亩档土巳嗽煅苤踩牒笏ㄈl(fā)生的危險(xiǎn)。合成的針織或機(jī)織滌綸人造血管按照本發(fā)明使用絲素蛋白溶液涂層后使其柔軟有彈性具備較好的操作性。
由此依據(jù)以上闡述的方法操作，本發(fā)明目的能客觀有效實(shí)現(xiàn)。但在不背離本發(fā)明精神和范圍情況下，上述的操作具體步驟和某些條款可以有一定改變，因此上述實(shí)例描述和附圖描繪所涉及的方法和使用的某些物質(zhì)材料是用來(lái)演示闡述發(fā)明，而不應(yīng)理解為限制發(fā)明所涵蓋的范圍。
權(quán)利要求
1.一種制備預(yù)凝涂層的人造血管假體的方法，所述具有涂層的人造血管假體包括人造血管假體和涂在人造血管假體上的涂層，其特征在于所述涂層含有絲素蛋白，增塑劑和促蒸發(fā)劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備人造血管假體的方法，特征在于將含有絲素蛋白、增塑劑和促蒸發(fā)劑的涂層溶液均勻涂覆于人造血管假體內(nèi)壁，干燥，然后暴露于甲醛蒸汽進(jìn)行交聯(lián)，獲得所述人造血管假體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備人造血管假體的方法，其特征在于增塑劑選自甘油和山梨醇，促蒸發(fā)劑選自乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備人造血管假體的方法，其特征在于人造血管假體由生物相容性材料制成，其為具由彈性多孔隙管型結(jié)構(gòu)的合成織物，可以是針織型或機(jī)織型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備人造血管假體的方法，其特征在于絲素蛋白的濃度為5-50％，增塑劑濃度為6-15％，促蒸發(fā)劑為10-25％，以上濃度均為重量百分比。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備人造血管假體的方法，其中涂覆涂層溶液至少5次。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人造血管絲素蛋白浸漬涂層的方法，由一機(jī)織或編織彈性多孔隙管型結(jié)構(gòu)的合成血管假體，通過(guò)至少使用絲素蛋白混合液涂層5遍而成。絲素蛋白液涂層血管假體前需混合增塑劑，通過(guò)傾注并使其均勻涂布于血管假體的基底層內(nèi)，干燥后通過(guò)暴露于甲醛蒸汽中交聯(lián)固定。
文檔編號(hào)A61L27/56GK1919356SQ20061011221
公開(kāi)日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2006年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月30日
發(fā)明者黃福華, 鄭軍, 孫立忠 申請(qǐng)人:黃福華, 鄭軍, 孫立忠