專利名稱：：Q型非病毒載體以及包含其的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因治療藥物領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明提供了一種靶向性腫瘤基因治療藥物組合物qmlL2-SON2/iy/BS-Mz'm'CMF-i^////m^。具體而言，該組合物由蛋白質(zhì)非病毒載體qmlL2-SON2和具有腫瘤組織特異性的殺傷(毒素)基因真核表達(dá)型質(zhì)粒A^RS-i^'m'CMF-組成。蛋白非病毒載體由細(xì)胞結(jié)合肽qmlL2和DNA結(jié)合多肽SON2兩部分組成，并經(jīng)DNA重組與表達(dá)而成的耙向融合蛋白非病毒載體qmlL2-SON2。該融合蛋白中的DNA結(jié)合多肽SON2富含陽性氨基酸，帶正電，因而可以結(jié)合帶負(fù)電的DNA;本發(fā)明中使用SON2結(jié)合殺傷基因表達(dá)型重組質(zhì)粒iy/aS-M/w/CMF-/^///w""從而形成復(fù)合藥物。該融合蛋白中的qmlL2可與表面富集有IL2受體的腫瘤細(xì)胞及少數(shù)表面也有IL2受體的正常細(xì)胞結(jié)合，并將這種DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物導(dǎo)入上述細(xì)胞。本發(fā)明還提供一種腫瘤組織特異性的調(diào)控序列iV,5-Mz'm'CMF/^o膨^，該調(diào)控序列含有Nf-kB蛋白結(jié)合位點(diǎn)的編碼序列與削短的miniCMB啟動(dòng)子，它只能在特定類型腫瘤細(xì)胞內(nèi)含有的組成型Nf-kB蛋白特異性地調(diào)控并激活下才能驅(qū)動(dòng)其下游的殺傷基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而殺滅該類型的腫瘤細(xì)胞。但因正常細(xì)胞內(nèi)不存在組成型的Nf-kB蛋白，因此即使上述復(fù)合物被導(dǎo)入正常細(xì)胞，也因該正常細(xì)胞內(nèi)無殺傷蛋白質(zhì)的表達(dá)而不會(huì)被殺傷。該設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確耙向殺滅一類腫瘤的目標(biāo)。本發(fā)明還提供了全部相關(guān)研究的結(jié)果，以及該非病毒載體與殺傷基因重組體組裝而成的復(fù)合物qmIL2-SON2/iy^S-M'm'CMr-P￡///mW用于特異殺傷并致死IL2R富集腫瘤細(xì)胞、且不殺傷正常細(xì)胞的準(zhǔn)確靶向生物學(xué)活性的用途等研究結(jié)果。
背景技術(shù)：
：己知存在著上千種具有抗腫瘤或抗病毒活性的人體異源蛋白質(zhì)，但在付之臨床應(yīng)用時(shí)存在兩個(gè)問題一是無特異性(或靶向性)地對(duì)所有細(xì)胞的殺傷作用導(dǎo)致的嚴(yán)重毒副作用問題；二是作為人體異源蛋白質(zhì)，在導(dǎo)入人體血循環(huán)時(shí)出現(xiàn)的嚴(yán)重免疫原性問題。為解決上述問題，上個(gè)世紀(jì)80年代曾出現(xiàn)過利用腫瘤細(xì)胞表面的受體的配體基因、或可結(jié)合抗原的抗體基因與綠膿毒素基因II、III功能域編碼基因、或其他毒素基因的殺細(xì)胞功能域構(gòu)建成融合基因，并表達(dá)研制出其導(dǎo)向融合蛋白。但臨床研究表明，這類導(dǎo)向融合蛋白雖能在一定程度上增強(qiáng)了毒素蛋白質(zhì)的導(dǎo)向性與特異性，但不完全。與此同時(shí)，毒素蛋白質(zhì)在這種情況下，其強(qiáng)烈的免疫原性問題依然存在。在臨床應(yīng)用時(shí)，雖初期有良好療效，但在4周后，因抗體形成，從而發(fā)生中和效應(yīng)而完全失效。雖然通過多種嘗試來修飾或封閉毒素的抗原決定簇，如PEG修飾和點(diǎn)突變改造毒素的氨基酸組成，但均因修飾而導(dǎo)致毒素失活，或不能完全消除毒素蛋白的免疫原性，最終還是導(dǎo)致了毒素的失效。例如，IL2受體出現(xiàn)在多種血液腫瘤細(xì)胞的表面，如成人T細(xì)胞性白血病/淋巴瘤，毛細(xì)胞性白血病，Reed—Sternberg細(xì)胞(何杰金氏病)，退行性大細(xì)胞淋巴瘤，還包括一些B細(xì)胞來源的惡性血液腫瘤。如使用可以同IL2受體特異性結(jié)合的配體IL2作為靶向蛋白，將具有殺傷作用的綠膿桿菌毒素(PE)以IL2-PE融合蛋白形式導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，可望殺傷腫瘤細(xì)胞。這一設(shè)計(jì)雖然實(shí)現(xiàn)了靶向性藥物投放，但是，毒素蛋白直接出現(xiàn)在血循環(huán)中，必然會(huì)帶來毒素本身具有的毒副作用。包括肝、腎毒性，中樞神經(jīng)毒性，溶血性血尿綜合征，血管滲漏綜合征等。而且，毒素蛋白是一種異源蛋白，這樣的蛋白出現(xiàn)在血循環(huán)中，會(huì)導(dǎo)致其抗體形成，從而使毒素的殺傷活性被中和失效。因此，尋找一種安全、有效地應(yīng)用人體外源毒素殺滅腫瘤耙細(xì)胞而又避免毒素蛋白對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用與免疫原性的方法，是必要的。針對(duì)應(yīng)用毒素治療腫瘤中存在的上述障礙，新的技術(shù)路線不僅需要完全避免毒素蛋白的免疫原性和毒副作用，而且必須保留毒素蛋白質(zhì)的殺細(xì)胞活性，而且，只特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，而不殺傷正常細(xì)胞?；虬邢蛲斗藕捅磉_(dá)的設(shè)計(jì)可確?；蛸|(zhì)粒導(dǎo)入人體后的安全性，而且雙鏈DNA無免疫原性，不會(huì)導(dǎo)致其抗體形成。將治療基因特異性地轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞或在腫瘤細(xì)胞內(nèi)種特異表達(dá)，可有效避免對(duì)正常細(xì)胞的傷害，同時(shí)亦可實(shí)現(xiàn)基因的靶向性治療。實(shí)現(xiàn)基因的靶向性(限制性、組織特異性)表達(dá)，可使用具有轉(zhuǎn)錄因子功能的癌基因蛋白的轉(zhuǎn)錄結(jié)合區(qū)。因腫瘤細(xì)胞中此類轉(zhuǎn)錄因子常處于組成型活性狀態(tài)，可結(jié)合到各自的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)并誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)。因此可使用該順式反應(yīng)元件，與相應(yīng)的目的基因(殺傷基因)構(gòu)建成真核表達(dá)框架，形成真核基因表達(dá)型重組體。這樣，該目的基因表達(dá)與否直接受腫瘤細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)誘導(dǎo)因子(某轉(zhuǎn)錄因子處于組成型活性)的控制。同時(shí)，正常細(xì)胞內(nèi)無此特異調(diào)控蛋白，上述毒素基因限制性表達(dá)重組體即使被導(dǎo)入正常細(xì)胞，也不會(huì)表達(dá)出毒素蛋白質(zhì)，因此正常細(xì)胞不會(huì)被殺傷。根據(jù)上述原理，我們所設(shè)計(jì)并實(shí)施的第一個(gè)此類由非病毒載體與毒素基因的限制性表達(dá)重組體組裝而成的復(fù)合藥物便是qmll^-SONZM^-MzmCMF-
發(fā)明內(nèi)容在第一方面，本發(fā)明提供了一種非病毒載體，一種靶向性融合蛋白qmlL2-SON2。所述融合蛋白由受體配體多肽qmlL2與富含陽性氨基酸的多肽SON2組成。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的非病毒載體由受體配體多肽wtlL2與富含陽性氨基酸的多肽SONl組成。根據(jù)本發(fā)明，所述受體配體多肽是能夠同IL2受體特異性結(jié)合的IL2或相關(guān)片段、類似物或突變體;qmlL2是IL2經(jīng)58位及125位Cys》Ser的突變體，保留其結(jié)合活性而去除其生物活性；所述wtlL2是IL2經(jīng)125位Cys->Ser的突變體，保留其生物活性及結(jié)合活性。所述富含陽性氨基酸多肽是DNA結(jié)合蛋白SON或其片段；S0N1和SON2為SON蛋白序列中相互不重疊的兩個(gè)氨基酸片段。由于使用qmlL2作為導(dǎo)向分子，故將本發(fā)明的非病毒載體稱為Q型非病毒載體。本發(fā)明的非病毒載體的相關(guān)編碼基因片段均來自人源染色體DNA，故對(duì)人體無免疫原性。優(yōu)選地，通過基因工程方法在體外重組獲得融合基因，并在原核細(xì)胞表達(dá)該融合基因而獲得本發(fā)明的非病毒載體(融合蛋白)。因此，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的非病毒載體的融合基因。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的非病毒載體和一種限制性表達(dá)型DNA重組體的復(fù)合物的藥物組合物qmll^-SONZ/Ty/BS-MZm'CMF-P￡///wW，以用于對(duì)惡性腫瘤的靶向性基因治療。所述限制性或組織特異性表達(dá)型重組體包含表達(dá)對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的毒素蛋白質(zhì)的基因，如可為綠膿桿菌毒素、白喉毒素、商陸、蓖麻毒素，或其他一切對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的來自人體、動(dòng)植物或微生物的蛋白，或是他們的活性功能區(qū)域、突變體或類似物；以及根據(jù)人工合成的對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白或多肽的編碼基因。在其應(yīng)用設(shè)計(jì)中，只能使用它們相應(yīng)的編碼基因，以避免直接使用毒素蛋白質(zhì)所出現(xiàn)的其毒副作用與免疫原性。優(yōu)選地，其中所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌毒素，或者是其第二和第三結(jié)構(gòu)域；更優(yōu)選地，所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)是綠膿桿菌毒素的第三結(jié)構(gòu)域或其突變體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述突變體為綠膿桿菌第m功能域突變體(C端的REDLK突變?yōu)镵DEL)，稱為pE///mw《。它能夠產(chǎn)生殺傷力更強(qiáng)的毒素蛋白，其氨基酸序列SEQIDN0.8所示。優(yōu)選地，其中所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)還可為商陸毒素PAP，其氨基酸序列如SEQIDNO.11所示。本發(fā)明將毒素蛋白質(zhì)耙向?qū)爰?xì)胞的方式改為將毒素蛋白編碼基因靶向?qū)爰?xì)胞，在完全避免毒素蛋白免疫原性和毒副作用的同時(shí)，保留毒素蛋白活性從而特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明設(shè)計(jì)使得所述非病毒載體與只能在Nf-kB蛋白組成型活性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的毒素基因表達(dá)型重組體構(gòu)成復(fù)合物，從而靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。利用非病毒載體將編碼對(duì)細(xì)胞有強(qiáng)烈殺傷作用的并受Nf-kB蛋白調(diào)控表達(dá)的;^///^(綠膿毒素第三區(qū)段的突變基因片段)或B4P基因以表達(dá)型重組體，即A^S-Mz'm'CMK-P￡////nMf或A^BS-Mz'm'CMF-/^尸的形式耙向?qū)肽[瘤細(xì)胞，致使/^///附",或^^尸僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，從而殺滅該細(xì)胞。同時(shí)，這種利用腫瘤細(xì)胞特有的Nf-kB蛋白組成型活性的特點(diǎn)，而應(yīng)用Nf-kB蛋白結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)成的腫瘤特異性啟動(dòng)子的調(diào)控下的毒素基因組織特異性表達(dá)重組體，即使被導(dǎo)入正常細(xì)胞，因該細(xì)胞為Nf-kB蛋白活性陰性細(xì)胞，則毒素基因/^////^或賴尸不能表達(dá)，細(xì)胞也不致于被殺傷。這樣，既避免了毒素蛋白的免疫原性，也避免了對(duì)任何正常細(xì)胞的殺傷作用，即毒副作用?；谏鲜鲈O(shè)計(jì)原理，此類復(fù)合藥物已成為一類特效藥物，具有準(zhǔn)確靶向殺傷一類腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，形成了其特有的抗瘤譜。它是IL2受體陽性與NF-kB蛋白陽性的一類惡性腫瘤，如成人T細(xì)胞性白血病/淋巴瘤，兒童T細(xì)胞性淋巴瘤，毛細(xì)胞性白血病，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，B系慢性淋巴細(xì)胞性白血病，退行性大細(xì)胞性淋巴瘤，外周T細(xì)胞性淋巴瘤等。同時(shí)，自身免疫病的主要原因是T細(xì)胞被活化，亦具有IL2受體陽性與NF-kB蛋白陽性的特征。因此上述復(fù)合藥物也適用于對(duì)自家免疫病的治療。顯然，對(duì)于正確應(yīng)用上述復(fù)合藥物對(duì)疾病的治療，實(shí)施"個(gè)體化診斷與個(gè)體化治療"的的原則，是必要的。因?yàn)樯鲜鰪?fù)合藥物只對(duì)同時(shí)是IL2受體陽性與Nf-kB蛋白陽性的疾病有效，對(duì)其他類型的疾病無效。這就是此類智能藥物的新特點(diǎn)。其優(yōu)點(diǎn)還在于其免疫原性與毒副作用已經(jīng)被最小化。圖l.本發(fā)明的藥物組合物的總體設(shè)計(jì)圖圖2.本發(fā)明的試驗(yàn)流程圖圖3.qmlL2-SON2克隆過程4.pLSD-qmlL2-SON2酶切鑒定，其中14分別代表l:DL2000plusMarker(5000;3000;2000;1000;750;500;250;100)2，3:pLSD-qmlL2-SON2編el十BamHI(4886;609)圖5.pLSD-wtlL2SON2酶切鑒定，其中12分別代表1:pLSD-wtlL2SON2/NdelBamHI(4886;645)2:DL2000plusMarker(5000;3000;2000;1000;750;500;250;100)圖6.qmlL2-SON2蛋白在pLSD表達(dá)系統(tǒng)中熱誘導(dǎo)表達(dá)情況，其中序號(hào)13分別代表1.pLSD-qmlL2-SON2，未誘導(dǎo)樣品2.pLSD-qmlL2-SON2，誘導(dǎo)樣品，qmlL2-SON2蛋白預(yù)測(cè)分子量未23kD3.蛋白Marker(97KD，66KD，43KD，31KD,20KD，14KD)圖7.qmlL2-SON2蛋白包涵體及凝膠密度掃描結(jié)果，其中序號(hào)14分別代表1.蛋白Marker(97KD，66KD，43KD,31KD,20KD，14KD)2，3，4qmlL2-SON2-CW包涵體樣品。凝膠密度掃描(見右側(cè)圖)顯示qmlL2-SON2蛋白包涵體占總蛋白的50.7%圖8.wtlL2SONl蛋白在在pLSD表達(dá)系統(tǒng)中熱誘導(dǎo)表達(dá)情況，其中序號(hào)17分別代表1,3樣品為pLSD-wtlL2SONl未誘導(dǎo)樣品；2，4樣品為pLSD-wtlL2SONl，誘導(dǎo)表達(dá)樣品。wtlL2SONl預(yù)測(cè)分子量25.5kD5.蛋白Marker(97KD，66KD，43KD，31KD，20KD，14KD)6.大瓶培養(yǎng)樣品，全菌蛋白。7.wtlL2SONl包涵體圖9.qmlL2-SON2蛋白反相柱純化圖10.qmlL2-SON2蛋白反相柱純化效果，其中序號(hào)16分別代表1.qmlL2-SON2-pET32未誘導(dǎo)樣品2.qmlL2SON2-pET32誘導(dǎo)樣品3.蛋白Marker(97KD，66KD，43KD,31KD，20KD，14KD)4.qmlL2SON2-CW大瓶培養(yǎng)樣品，全菌蛋白。5.qmlL2SON2包涵體，鹽酸胍溶解樣品。6.qmlL2-SON2蛋白經(jīng)反相柱純化，洗脫峰收集樣品。經(jīng)凝膠密度掃描(右側(cè)圖)，蛋白純度為73.1%。箭頭所指為目的蛋白qmlL2-SON2所對(duì)應(yīng)的條帶和凝膠掃描所對(duì)應(yīng)的峰，純化后蛋白的純度為73.1%。圖ll.wtlL2SON2蛋白反相柱純化效果，其中序號(hào)16分別代表1,2wtlL2SONl蛋白經(jīng)反相柱純化，洗脫峰收集樣品。經(jīng)凝膠密度掃描(右側(cè)圖)，蛋白純度為65.9%。3.蛋白Marker(97KD，66KD，43KD,31KD，20KD，14KD)4，5，6，7qmlL2SON2蛋白經(jīng)反相柱純化，洗脫峰收集樣品。箭頭所指為目的蛋白wtlL2SONl所對(duì)應(yīng)的凝膠掃描峰。圖12.qmlL2-SON2蛋白氨基酸序列測(cè)定圖13.，^^"^^^_;五///7^的構(gòu)建克隆過程14.在Nf-kB陽性/陰性細(xì)胞中，NffiS-MiniCMVpromoter的表達(dá)強(qiáng)度的差異。其中序號(hào)14分別代表1.pGL3Control,2.pGL3Basic,3.NfflS-MiniCMV-Luc，4.NffiS-MiniCMV-Luc-SV40Enhancer圖15.，S-M/m'CMF-;￡///酶切鑒定其中序號(hào)13分別代表1DL2000plusMarker(5000;3000;2000;1000:750;500;250;100)2.NfBS-MiniCMV--pEIIImut/NcoI+Xbal(3371;667)3.NffiS-MiniCMV--pEIIImut/Kpnl+XhoI(3829;209)圖16.QmlL2-S0N2蛋白結(jié)合DNA的凝膠阻滯試驗(yàn)。圖示說明左側(cè)膠反映qmlL2-S0N2蛋白結(jié)合DNA的情況。最小蛋白/DNA比例為3:1時(shí)，出現(xiàn)凝膠阻滯現(xiàn)象。l至4號(hào)孔及6至9號(hào)孔，分別對(duì)應(yīng)1:1直到8:1的蛋白/DNA比例，比例逐漸增大。從3:1的蛋白/DNA比例開始(3號(hào)孔)，3:1直到8:1的蛋白/DNA比例均發(fā)生了凝膠阻滯現(xiàn)象。5號(hào)孔為單純的毒素質(zhì)粒，濃度0.2ug/uL，上樣lttL，無凝膠阻滯現(xiàn)象。右側(cè)膠為BSA蛋白對(duì)照組，在該組中，無論BSA蛋白/DNA的比例如何，都無法發(fā)生凝膠阻滯。10至13號(hào)孔及15至18號(hào)孔，分別對(duì)應(yīng)1:1直到8:1的BSA蛋白/DNA比例，比例逐漸增大。14號(hào)孔，DL2000plusMarker(5k，3k,2k,1000bp，750bp,500bp，250bp，100bp)圖17.wtlL2S0Nl蛋白結(jié)合DNA的凝膠阻滯試驗(yàn)左側(cè)膠反映wtlL2S0Nl蛋白結(jié)合DNA的情況。最小蛋白/DNA比例為4:1時(shí)，出現(xiàn)凝膠阻滯現(xiàn)象。1至4號(hào)孔及6至9號(hào)孔，分別對(duì)應(yīng)1:1直到8:1的蛋白/DNA比例，比例逐漸增大。從4:1的蛋白/DNA比例開始(4號(hào)孔)，4:1直到8:1的蛋白/DNA比例均發(fā)生了凝膠阻滯現(xiàn)象。5號(hào)孔為DL2000plusMarker(5k,3k，2k，1000bp,750bp，500bp,250bp，100bp)。圖18.qmlL2-SON2/pGL3Control質(zhì)粒復(fù)合物及脂質(zhì)體/pGL3Control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及螢光檢測(cè)圖19.qmlL2-SON2蛋白/毒素復(fù)合物對(duì)于Hut78(IL2Rf-kB+)細(xì)胞的殺傷，其中序號(hào)15分別代表1qmlL2-SON2ASW0j9rawo^"-;^///mw,-1SW0￡w/w"cer2qmIL2-SON2/iVoe-/￡//J3qmIL2-SON2/，1S-M/#CMr-/^Jr//>"f4qmlL2-SON2ASFW-iM戶5qmlU-SONZ/iy/aS-MiViiCMF-ZMi*陰性對(duì)照復(fù)合物(2)對(duì)Hut78(IL2R"Nf-kB+)無殺傷作用。強(qiáng)陽性對(duì)照復(fù)合物(1，4)對(duì)Hut78有殺傷作用，殺傷具劑量依賴性；調(diào)控毒素復(fù)合物(3,5)對(duì)Hut78有殺傷作用，殺傷具劑量依賴性。圖20.qmlL2-S0N2蛋白/毒素復(fù)合物對(duì)于K562(IL2R+Nf-kB—)細(xì)胞的殺傷，其中序號(hào)12分別代表1.qmlL2-S0N2/5yWproM^er-/￡77/Myt-5y必f/7力a/cer2.qmlL2-S0N2/5T必-M戶強(qiáng)陽性對(duì)照復(fù)合物(1，2)對(duì)K562(IL2R+Nf-kB—)有殺傷作用，殺傷具劑量依賴性。其余qmlL2-S0N2蛋白/毒素復(fù)合物形式對(duì)于K562無殺傷作用。圖21.wtlL2SONl蛋白/毒素復(fù)合物對(duì)于Hut78細(xì)胞的殺傷其中序號(hào)13代表1.wtlL2SONlASK40/raOToferp￡7//ww,-5T^E"Aawcer2wtIL2SONl/W/B51-Mim'CMF-;^:///wMf3單獨(dú)的wtlL2SONl蛋白。單獨(dú)的wtlL2SONl蛋白(3)可Hut78(IL2Rf-kB+)具有促增生作用。強(qiáng)陽性對(duì)照復(fù)合物(1)對(duì)Hut78有殺傷作用，殺傷具劑量依賴性；調(diào)控毒素復(fù)合物(2)對(duì)Hut78有殺傷作用，殺傷具劑量依賴性。圖22.wtlL2SONl蛋白/毒素復(fù)合物對(duì)于HL-60細(xì)胞的殺傷。其中序號(hào)13代表1wtlL2SONlASFW/jra/wofer/^Z/TrnMrSFWEw/w"cer2wtIL2SONlM^W-M/m'CMF-;￡///mwf3單獨(dú)wtlL2SONl蛋白。單獨(dú)wtlL2SONl蛋白(3)可HL-60(IL2R—Nf-kB+)具有促增生作用。強(qiáng)陽性對(duì)照復(fù)合物(1)對(duì)HL-60有殺傷作用，殺傷具劑量依賴性；調(diào)控毒素復(fù)合物(2)對(duì)HL-60有殺傷作用，殺傷具劑量依賴性。圖23.，S-Mz'mCMrpromoter構(gòu)建示意圖。MiniCMVpromoter序列為gtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatc59bp;箭頭表示Nf-kB蛋白結(jié)合位點(diǎn)核心序列GGGACTTTCC。白色矩形方塊表示Nf-kB蛋白結(jié)合位點(diǎn)的側(cè)翼序列具體實(shí)施方式本發(fā)明的總體設(shè)計(jì)即試驗(yàn)流程見圖1和圖2所示。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種非病毒載體，其本質(zhì)式一種耙向性融合蛋白，所述融合蛋白由受體配體多肽qmlL2與富含陽性氨基酸的多肽SON2組成。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的非病毒載體有受體配體多肽wtlL2與富含陽性氨基酸的多肽SONl組成。根據(jù)本發(fā)明，所述受體配體多肽是能夠同IL2受體特異性結(jié)合的IL2或相關(guān)片段、類似物或突變體；qmlL2是IL2經(jīng)58位及125位Cys》Ser的突變體，保留其結(jié)合活性而去除其生物活性；所述wtlL2是IL2經(jīng)125位Cys->Ser的突變體，保留其生物活性及結(jié)合活性。所述富含陽性氨基酸多肽是DNA結(jié)合蛋白SON或其片段；S0N1和SON2為SON蛋白序列中相互不重疊的兩個(gè)氨基酸片段。由于使用qmlL2作為導(dǎo)向分子，所以本發(fā)明人將本發(fā)明的非病毒載體稱為Q型非病毒載體。本發(fā)明的非病毒載體對(duì)人體無免疫原性。優(yōu)選的，上述受體多肽編碼基因是經(jīng)突變的IL2(白細(xì)胞介素2)序列，如SEQIDNO.4或SEQIDN0.5，或者也可以是其野生型DNA序列。優(yōu)選的，所述的非病毒載體中的富含陽性氨基^的多肽是來自DNA結(jié)合蛋白SON蛋白的片斷SONl，序列如SEQIDN0.3所示；及SON2序列如SEQIDNO.l所示；或者也可采用其野生型氨基酸序列。優(yōu)選的，通過基因工程方法在體外重組獲得融合基因，并在原核細(xì)胞中表達(dá)該融合基因而獲得本發(fā)明的非病毒載體(融合蛋白)。特別優(yōu)選的，所述病毒載體是qmlL2-SON2，即從N端至C端依次由qmlL2多肽、SON2多肽組成，其氨基酸序列如SEQIDN0.12所示。特別優(yōu)選的，所述病毒載體是wtlL2SONl，即從N端至C端依次由wtlL2多肽、SON1多肽組成，其氨基酸序列如SEQIDN0.13所示。優(yōu)選的，通過基因工程方法在體外重組獲得融合基因，并在原核細(xì)胞中表達(dá)該融合基因而獲得本發(fā)明的非病毒載體(融合蛋白)。例如本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合基因DNA序列分別如SEQIDNO.4所示(編碼qmlL2-SON2)或SEQIDN0.5(編碼wtlL2SONl)。它們分別編碼融合蛋白qmlL2-SON2和wtlL2SONl。qmlL2-SON2和wtlL2SONl的氨基酸序列分別如SEQIDN0.12和SEQIDNO.13所示。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合基因分別與溫度誘導(dǎo)表達(dá)型載體pLSD(J.Bacteriology,171(6)1989，3427-3432)重組，分別命名為pLSD曙qmlL2-SON2禾口pLSD-wtlL2SONl。用上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得可表達(dá)融合蛋白的工程菌。另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的非病毒載體和一種表達(dá)型DNA重組體的復(fù)合物的藥物組合物，以用于靶向性惡性腫瘤的基因治療，所述表達(dá)型重組體包含表達(dá)對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)的基因。所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷作用的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌毒素、白喉毒素、商陸、蓖麻毒素，或其他一切對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的來自人體、動(dòng)植物或微生物的蛋白，或是他們的活性功能區(qū)域、突變體或類似物；以及根據(jù)人工合成的對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白或多肽，以及相應(yīng)的編碼基因。優(yōu)選的，其中所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌毒素，或者是其第二或第三功能結(jié)構(gòu)域。綠膿桿菌毒素(PE)是由綠膿桿菌分泌的一種毒素，其是一種極毒的毒素。對(duì)一個(gè)細(xì)胞而言，幾個(gè)分子的毒素的導(dǎo)入即可使這個(gè)細(xì)胞死亡。由于PE這種獨(dú)特的性能，使其作為一種很有前途的毒素被應(yīng)用于腫瘤的基因治療中去。PE具有三個(gè)結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域Ia(AA1—252)為細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域III(AA400—613)為ADP糖基化區(qū)域，結(jié)構(gòu)域II和結(jié)構(gòu)域III又合稱PE40，而結(jié)構(gòu)域Ib(AA365一399)無明顯的生物學(xué)功能。為增強(qiáng)毒力，本發(fā)明人將綠膿桿菌毒素第III結(jié)構(gòu)域C端的5個(gè)氨基酸殘基RDELK的密碼子突變?yōu)镵DEL的密碼子，重而得到DNA序列PEIIImut。為增加毒素基因PEIIImut在人體內(nèi)表達(dá)的安全性，減少毒副作用，本發(fā)明另外設(shè)計(jì)了腫瘤組織特異性的NfBS-MiniCMVpromoter接入毒素基因的上游，以期通過腫瘤細(xì)胞內(nèi)組成型Nf-kB蛋白的調(diào)控，將毒素基因的表達(dá)現(xiàn)在具有組成型Nf-kB蛋白活性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)。商陸毒素亦通過阻斷蛋白合成，而造成細(xì)胞的死亡。商陸毒素具有N-糖苷酶的活性,可催化核糖體組成成分28SRNA的特定位點(diǎn)脫嘌呤，從而失活核糖體60S亞基，由于商陸蛋白具有酶的特性，1個(gè)PAP分子每分鐘可以催化失活1500個(gè)核糖體,在短時(shí)間內(nèi)可以抑制全部蛋白質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡因此優(yōu)選的，所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)是綠膿桿菌毒素的第三結(jié)構(gòu)域或其突變體，其中所述突變體PEIIImut的氨基酸序列如SEQIDN0.8所示，其核苷酸序列如SEQIDN0.9所示。優(yōu)選地，所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為商陸毒素蛋白PAP。商陸毒素蛋白PAP氨基酸序列如SEQIDNO.ll，核酸序列如SEQIDNO.10所示。優(yōu)選的，PEIIImut可根據(jù)本領(lǐng)域的公知的技術(shù)引入各種表達(dá)載體以用于構(gòu)建表達(dá)型重組體，從而表達(dá)毒素蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)型重組體為基于pGL3而構(gòu)建的表達(dá)型重組體NfBS-MiniCMVpEIIImut和NffiS-MiniCMVPAP。特別優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合包括I組qmlL2-SON2/NfflS-MiniCMVpEIIImut，qmlL2-SON2/NfflS-MiniCMVPAP;II組wtlL2SON1/NfflS-MiniCMVpEIIImut的復(fù)合物。本發(fā)明的I組藥物可以有效地介導(dǎo)毒素基因進(jìn)入表面富含IL2R的腫瘤細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)組成型活性的Nf-kB蛋白的調(diào)控下表達(dá)毒素蛋白，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，即使進(jìn)入正常細(xì)胞，因細(xì)胞內(nèi)Nf-kB蛋白為無活性狀態(tài)，腫瘤組織特異性啟動(dòng)子NfflS-MiniCMVpromoter無活性，不會(huì)轉(zhuǎn)錄下游毒素表達(dá)，即不會(huì)殺傷正常細(xì)胞。這樣的設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)一類腫瘤細(xì)胞準(zhǔn)確靶向準(zhǔn)確殺傷的目的，確保了毒素使用的靶向性和安全性。本發(fā)明II組藥物可以誘導(dǎo)某些血液腫瘤細(xì)胞表達(dá)IL2受體，而后通過該受體將毒素表達(dá)質(zhì)粒送入細(xì)胞并殺傷靶細(xì)胞。但該組復(fù)合物中的蛋白部分(wtlL2SONl蛋白)對(duì)細(xì)胞具有增生作用，因此要謹(jǐn)慎評(píng)估和使用這一"誘導(dǎo)激活——?dú)?的策略。在本發(fā)明的這種用于靶向性基因治療的藥物的應(yīng)用種，包含PEIIImut的表達(dá)型重組體與融合蛋白可結(jié)合DNA的部分即SON蛋白片斷緊密結(jié)合，融合蛋白中的導(dǎo)向組分突變型IL2同細(xì)胞表面的IL2受體結(jié)合并將復(fù)合物導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，毒素表達(dá)型重組體進(jìn)入胞核后表達(dá)毒素蛋白，從而將腫瘤細(xì)胞殺死。具體地說，由于本發(fā)明的藥物組合物是將毒素基因?qū)隝L2受體陽性的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，因此，就不需要毒素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域。正是由于這種原因，本發(fā)明的毒素基因PEIIImut中僅含有綠膿桿菌毒素的具有ADP糖基化沒活性的第III結(jié)構(gòu)域的編碼序列。該編碼序列在靶細(xì)胞中表達(dá)出的蛋白可作為殺死靶細(xì)胞的毒素。另外，本發(fā)明人利用白喉毒素C端4個(gè)氨基酸KDEL替代了PE毒素C端的5個(gè)氨基酸殘基REDLK，由此大大增強(qiáng)毒素的殺細(xì)胞能力。另外，由于毒素蛋白是在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，且表達(dá)數(shù)個(gè)分子后即可殺死細(xì)胞，這就徹底避免了毒素蛋白的免疫原性問題。即使在靶細(xì)胞崩解后，其中的毒素蛋白(量極少)即使被機(jī)體免疫系統(tǒng)捕獲和識(shí)別，并產(chǎn)生抗體，但這些抗體既無法清除細(xì)胞內(nèi)的毒素蛋白，也不會(huì)和作為毒素蛋白表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA發(fā)生反應(yīng)。事實(shí)上，這類被殺滅的細(xì)胞將迅速被機(jī)體的內(nèi)皮吞噬系統(tǒng)所清除。本發(fā)明的另一種毒素基因?yàn)樯剃懚舅氐腜AP編碼基因，其編碼蛋白高效催化失活真核核糖體60S亞基，阻斷細(xì)胞蛋白合成并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本發(fā)明的融合蛋白中利用人體內(nèi)正常存在的DNA結(jié)合蛋白SON分子中的一部分作為結(jié)合DNA的功能區(qū)。所采用的片斷含有大量陽性氨基酸，如賴氨酸和精氨酸，該多肽片斷在一定PH條件下帶正電荷，能通過靜電作用同帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合。SON蛋白的自然形態(tài)本身就在真核生物基因組DNA的折疊、濃聚方面有重要的作用。這樣設(shè)計(jì)可以保證DNA分子從犯濃聚的基礎(chǔ)上保證了低免疫原性，且可以被靶細(xì)胞內(nèi)吞。以下通過實(shí)例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例1融合基因重組體qmlL2-SON2和wtlL2SONl的構(gòu)建1.1qmlL2-SON2序列的構(gòu)建使用本試驗(yàn)室陳偉京博士含IL2序列的CW120擴(kuò)增IL2片斷，并經(jīng)過測(cè)序發(fā)現(xiàn)，同野生型相比，IL2模板序列中還存在兩個(gè)影響氨基酸編碼的突變，需要對(duì)這些突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)突變引物，進(jìn)行回復(fù)突變。最終將IL2序列的58位及125位Cys編碼密碼子突變?yōu)镾er編碼密碼子，其余序列同野生型序列相同。在對(duì)IL2序列進(jìn)行突變的同時(shí)，通過上游和下游的全長(zhǎng)引物FF和RF，分別在IL2序列的5'端引入克隆需要的酶切位點(diǎn)EcoRI和NdeI;在IL2序列的3'端引入凝血酶切割位點(diǎn)作為融合蛋白內(nèi)部的Linker序列；并在IL2序列的3'端引入克隆需要的酶切位點(diǎn)KpnI和BamHI。測(cè)序證實(shí)同設(shè)計(jì)完全正確后，將完成突變的qmlL2片斷通過EcoRI及BamHI酶切位點(diǎn)，接入pGEM-7Z載體，命名為qmlL2—pG。S0N-2片斷為S0N蛋白DNA結(jié)合區(qū)中，含有核定位序號(hào)的氨基酸序列，長(zhǎng)53個(gè)氨基酸。SON-IDNA序列由本實(shí)驗(yàn)室的申景平博士構(gòu)建，SON-2片斷由本實(shí)驗(yàn)室的盧麗博士構(gòu)建。使用pSON-l和pSON-2引物，使用本室盧麗博士構(gòu)建的pL2S2質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增SON-2片斷，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，接入pGEM-T載體，得到pT-SON2克隆。通過使用Kpnl和BamHI酶切位點(diǎn)，將SON-2片斷從pT-SONB中切出，并接入具有相同酶切末端的qmlL2—pG質(zhì)粒中，構(gòu)建成pGEM-qmSON2重組體。通過使用NedI和BamHI酶切位點(diǎn)，將qmlL2-SONB片斷從pGEM-QmSON2質(zhì)粒中切出，并接入具有相同酶切末端的pLSD質(zhì)粒中，構(gòu)建成pLSD-qmlL2-SON2重組體。1.2wtlL2SONl序列的構(gòu)建使用IL2的突變引物E及E'，以及兩側(cè)的全長(zhǎng)引物A及A';使用qmlL2-pG質(zhì)粒為模板，對(duì)IL2的58位氨基酸進(jìn)行回復(fù)突變，恢復(fù)原來的核酸及氨基酸序列，得到的IL2序列含126位Cys突變，其余序列同野生型相同。命名為wtlL2序列，使用EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)，接入pGEM-7Z載體，命名為wtIL2-pG.。SON-l片斷來自本實(shí)驗(yàn)室楊奎博士構(gòu)建的含SON-l片斷的GTTS質(zhì)粒，通過kpnl和BamHI酶切位點(diǎn)切出，準(zhǔn)備同wtlL2片斷連接。SON-l片斷是SON蛋白DNA結(jié)合區(qū)中的一段，富含陽性氨基酸(R、K共32個(gè))、位于SON蛋白氨基酸編碼序列的第788-859位氨基酸，SON-l長(zhǎng)度為72個(gè)氨基酸，將用作融合蛋白中DNA結(jié)合區(qū)。通過使用KpnI和BamHI酶切位點(diǎn)，將SON-l片斷從GTTS中切出，并接入具有相同酶切末端的wtlL2-pG質(zhì)粒中，構(gòu)建成pGEM-wtlL2SONl重組體。wtlL2SONl全序列為(645bp)通過使用NedI和BamHI酶切位點(diǎn)，將wtlL2-SONl片斷從pGEM-wtlL2SONl質(zhì)粒中切出，并接入具有相同酶切末端的pLSD質(zhì)粒中，構(gòu)建成pLSD-wtlL2SONl重組體。實(shí)施例2融合基因qmlL2-SON2或wtlL2SONl的誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體提取和檢測(cè)2.1溫度誘導(dǎo)及包涵體的提取2丄1大體積培養(yǎng)將所構(gòu)建的表達(dá)型重組體轉(zhuǎn)化攜有大腸桿菌DH5a，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB平皿上，32。C下培養(yǎng)過夜。在受體菌株的平板中取出幾個(gè)2-3mm單菌落，移至含5mlLB(含適當(dāng)?shù)目股?培養(yǎng)液的試管中，37'C強(qiáng)烈振蕩培養(yǎng)過夜，直至混濁。第二天，將過夜菌也按1-2%的比例轉(zhuǎn)接于中瓶(150-200ml含適當(dāng)?shù)目股?的LB培養(yǎng)液中，30-32'C強(qiáng)烈振蕩培養(yǎng)過夜，直至混濁。第三天，將過夜菌按1-2M的比例轉(zhuǎn)接于6個(gè)大瓶的LB培養(yǎng)液中(500-700ml/瓶，含適量抗生素)，在30-32'C培養(yǎng)3-4小時(shí)，使培養(yǎng)液的OD600達(dá)到0.4-0.6，迅速使溫度升至42'C繼續(xù)培養(yǎng)3-5小時(shí)。將上述培養(yǎng)夜離心6000轉(zhuǎn)，10分鐘，棄上清，收集沉淀。2.1.2洗滌細(xì)胞6000gxl5分鐘離心收集細(xì)菌，稱重濕菌體。用3。/。TritonX-100洗滌菌體，攪拌器上攪勻30分鐘，6000g，15分鐘離心收集用量為10ml-50ml緩沖液/lg濕菌體(包括下列各種洗滌緩沖液)。2丄3溶菌酶破細(xì)胞用緩沖液將細(xì)胞懸浮，緩沖液配制50mmol/LTris.Cl(pH8.5-9.0)，2mmol/LEDTA，100mmol/LNaCl，0.5%TritonX-IOO，溶菌酶lmg/ml)。用攪拌器在室溫下攪拌，使得懸浮液因溶菌酶的作用而粘稠。2丄4超聲破細(xì)胞每次超打10秒,間隔15秒，20-50次作用(視菌體濃度而定)，至菌體不再粘稠為止。然后離心收集，6000gxl5分鐘。上述操作應(yīng)在冰水中進(jìn)行，為防止炭化，超聲功率不宜過大，在玻璃燒杯中進(jìn)行較好，超聲波探頭深入液面大于3厘米，距杯底2厘米位好。2.1.55%TritonX-100洗滌用緩沖液徹底懸浮沉淀，攪拌并超聲波處理30次，參見上述步驟2.3。緩沖液為50mmol/LTris.Cl(pH8.0)，2mmol/LEDTA，5%TritonX-100。離心收集沉淀，6000g，15分鐘。2.2蛋白鑒定2.2.1SDS-PAGE蛋白電泳采用Tris-甘氨酸-SDS-PAGE。使用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，分離膠濃度為15%或12%,濃縮膠為5%或3%。樣品加入3X上樣緩沖液，99。C變性610分鐘。離心，取上清上樣。在Tris-甘氨酸電泳緩沖液中先以8mA電泳至樣品進(jìn)入分離膠，再以15mA電泳至溴酚藍(lán)剛泳出分離膠。試劑15%分離膠12%分離膠5%濃縮膠分離膠緩沖液5.0ml5.0ml濃縮膠緩沖液1.5ml30%丙烯酰胺8.0ml10.0ml1.2mlAP100|al100^130^1TEMED118|ilD2H206.9ml5.0ml3.5ml2.2.2考馬斯亮藍(lán)染色電泳后用至少5倍于凝膠體積的考馬斯亮藍(lán)染色液浸泡凝膠，室溫下染色4小時(shí)以上，回收染液，凝膠浸泡于脫色液中數(shù)小時(shí)，其間更換幾次脫色液，直至蛋白條帶清晰可見。脫色后，凝膠保存于20%甘油水溶液中。2.2.3蛋白質(zhì)含量的測(cè)定試劑盒蛋白濃度測(cè)定(BCAproteinAssayKit)首先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。將BSA原液分別稀釋配制2mg/ml，1.5mg/ml，1.0mg/ml，0.75mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.025mg/ml及Omg/ml濃度的樣品。再將待檢測(cè)的蛋白質(zhì)干粉溶于lml無菌水中。取試劑盒中的A液5ml與B液lOOpl混勻。在9個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品與25^il待測(cè)蛋白溶液中各加入200W的A、B混合液。輕混勻后將所有樣品置于37'C反應(yīng)30分鐘。然后用酶標(biāo)儀在490nm與630nm的波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度及OD值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蛋白質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)作圖。再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)曲線上査出待測(cè)樣品OD值相應(yīng)的蛋白濃度，測(cè)定范圍為0.01-2.0mg/ml。實(shí)施例3從大腸桿菌包涵體中純化蛋白qmlL2-SON2或wtlL2SONl1.包涵體按每克20ml比例。用包涵體溶解液(50mMTris-HCl，2mMEDTA，100mMNaCL，10mMDTT，7M鹽酸胍，PH9.0)溶解包涵體，過0.45wm孑L徑的濾膜。2.反相柱使用AKTA中壓液相層析系統(tǒng)，層析柱WatersAP1柱填料SOURCE15RPC，流速3ml/min。緩沖液起始緩沖液A溶液10%乙腈，0.05%TFA，起始緩沖液B溶液90%乙腈，0.05%TFA。梯度100%A液保持3柱體積，洗脫未結(jié)合的蛋白和雜質(zhì)；在15分鐘內(nèi)B液濃度升至100%，保持2柱體積。8ml收集洗脫蛋白。qmlL2-SON2經(jīng)反相柱純化后，蛋白的純度為73.1%,凍干備用。wtlL2S0Nl經(jīng)反相柱純化后，蛋白的純度為65.9%，凍干備用。實(shí)施例4腫瘤組織特異性啟動(dòng)子NffiS-MiniCMVpromoter的構(gòu)建本發(fā)明中，構(gòu)建了含6個(gè)Nf-kB蛋白結(jié)合位點(diǎn)的，受Nf-kB蛋白調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子。該構(gòu)建形式為<5X/y/^55z'm/z>jgAfeiAf/m'CMF/ramo^"，簡(jiǎn)稱為iy/RS-Mz'"/CMr啟動(dòng)子。根據(jù)(1988PNAS851482-1486;JAC200249745-755)等研究結(jié)果，Nf-kB蛋白結(jié)合位點(diǎn)的不同構(gòu)建形式，可以達(dá)到基本型啟動(dòng)子(例如TATAbox)幾十到幾百倍的表達(dá)水平。這些構(gòu)建方式中，Nf-kB蛋白結(jié)合位點(diǎn)通向重復(fù)數(shù)次或反向相對(duì)，都可以構(gòu)建出強(qiáng)的、受Nf-kB蛋白調(diào)控的啟動(dòng)子。Nf-kB蛋白結(jié)合位點(diǎn)的核心序列為GGGACTTTCC。在iy/BS-MWCMr啟動(dòng)子中，該序列首先正向重復(fù)3次，而后又反向重復(fù)3次。每個(gè)核心結(jié)合序列兩偵IJ,都伴隨有該序列在天然啟動(dòng)子或增強(qiáng)子(如SV40增強(qiáng)子)中出現(xiàn)時(shí)的側(cè)翼序列。為了給該啟動(dòng)子增加K4Z4to;c等基本啟動(dòng)子元件，在6X7V/A5蛋白結(jié)合位點(diǎn)的下游，設(shè)計(jì)了m/m'CMF啟動(dòng)子。(脂'm'CMF是基本型啟動(dòng)子，只有本底水平的轉(zhuǎn)錄活性。)該啟動(dòng)子構(gòu)建方式見圖23。通過重疊延伸PCR設(shè)計(jì)，將AA/BS-Mz'm'CMF序列拆分，并合成數(shù)條大引物。而后使用TouchDownPCR程序，擴(kuò)增得到，&Mz'm'CMr片斷全長(zhǎng)。PCR得到的，S-M'm'CMr片段，經(jīng)純化后接入pGEM-T載體，經(jīng)測(cè)序證實(shí)同設(shè)計(jì)序列一致，命名為pr-，S-M/m'CMF。通過kpnI禾nXhoI酶切位點(diǎn)，將NfflS-MiniCMV片段從pT-N氾S-MiniCMV質(zhì)粒上切出，并接入pGL3-Basic質(zhì)粒。命名為NfflS-MiniCMV-Luc，Luc是Luciferase(螢光素酶基因)的縮寫。在NffiS-MiniCMV-Luc質(zhì)粒中，報(bào)告基因Luc的表達(dá)受腫瘤特異性啟動(dòng)子NfBS-MiniCMV啟動(dòng)子的調(diào)控。實(shí)例4N氾S-MiniCMVpromoter的表達(dá)強(qiáng)度及組織特異性4.1.1細(xì)胞株表型使用了四株細(xì)胞株，對(duì)N氾S-MiniCMV啟動(dòng)子—Luc報(bào)告基因質(zhì)粒，以及用于對(duì)照的數(shù)種報(bào)告基因質(zhì)粒的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行了檢測(cè)。其中K562細(xì)胞的Nf-kB蛋白陰性(Nf-kB-)，Hut78、JurkatE6—1、HL-60細(xì)胞的Nf-kB蛋白陽性(Nf-kB+)。4丄2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞1.試驗(yàn)前一日，以無RNase和無DNaase的無菌水溶解脂質(zhì)體TransFast，-20'C凍存過夜。2.試驗(yàn)當(dāng)日，計(jì)數(shù)細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量需達(dá)到10"mL級(jí)，準(zhǔn)備鋪板。細(xì)胞板培養(yǎng)面積<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3.準(zhǔn)備TnasFast/DNA混合物。TransFast.解凍。在無菌試管中依次加入需要]的無血清培養(yǎng)基、DNA、最后加入TransFast試劑。立即渦旋混勻1分鐘,典型的轉(zhuǎn)染DNA量和轉(zhuǎn)染溶液體積<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>以不同電荷比配制TransFast/DNA混合物時(shí)，需加入的TransFast量。試驗(yàn)通采用1:1比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>4.TransRast/DNA混合物置室溫10—15分鐘。5.鋪板24孔板50(^1細(xì)胞懸液，含細(xì)胞2—3X1()S個(gè)細(xì)胞。96孔板IOOW細(xì)胞懸液，含細(xì)胞0.4—0.6乂105個(gè)細(xì)胞。6.向培養(yǎng)板孔中逐滴加入TransFast/DNA混合物。24孔板每孔200^1，96孔每孔50nl，平移振搖培養(yǎng)板十次，混勻。將培養(yǎng)板放回37"C細(xì)胞培養(yǎng)箱，孵育1小時(shí)。7.孵育1小時(shí)后，向培養(yǎng)孔中加入含血清的完全培養(yǎng)基。24孔板每孔50(Hd，96孔每孔100pl。將培養(yǎng)板放回37'C細(xì)胞培養(yǎng)箱，48小時(shí)后檢測(cè)螢光強(qiáng)度。4.2試驗(yàn)結(jié)果NffiS-MiniCMVpromoter具有腫瘤組織特異性pGL3Basic質(zhì)粒是Luc報(bào)告基因陰性對(duì)照，該質(zhì)粒上有Luc基因，但無任何啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列。使用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞，只能檢測(cè)到本底水平的螢光強(qiáng)度。pGL3Control質(zhì)粒是Luc報(bào)告基因強(qiáng)陽性對(duì)照，Luc報(bào)告基因受SV40啟動(dòng)子和SV40增強(qiáng)子調(diào)控。使用pGL3Control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞，可以觀測(cè)到高水平的螢光強(qiáng)度。NffiS-MiniCMV-Luc質(zhì)粒是試驗(yàn)質(zhì)粒，Luc報(bào)告基因受NffiS-MiniCMV啟動(dòng)子的調(diào)控。試驗(yàn)中主要關(guān)注的問題，是該質(zhì)粒表達(dá)Luc報(bào)告基因的強(qiáng)度是否受細(xì)胞內(nèi)Nf-kB蛋白狀態(tài)的調(diào)控。NfBS-MiniCMV-Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Nf-kB蛋白有活性的細(xì)胞株Hut78、JurkatE6-l、HL-60,都檢測(cè)到較高水平的螢光強(qiáng)度。NffiS-MiniCMV-Luc的螢光強(qiáng)度同pGL3Control相比，可達(dá)到后者的70%、54%和211%(詳細(xì)數(shù)據(jù)見后文圖表)。而NffiS-MiniCMV-Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Nf-kB蛋白無活性的細(xì)胞株k562，只可檢測(cè)到接近本底水平的表達(dá)。綜合NffiS-MiniCMV-Luc質(zhì)粒在Nf-kB蛋白有活性與無活性細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)度的差異，可以說明NffiS-MiniCMV啟動(dòng)子受到細(xì)胞內(nèi)Nf-kB蛋白的調(diào)控。在Nf-kB蛋白有活性的細(xì)胞中，NffiS-MiniCMV啟動(dòng)子有較強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)其下游基因表達(dá)的活性；而在Nf-kB蛋白無活性的細(xì)胞中，NffiS-MiniCMV啟動(dòng)子下游基因無表達(dá)活性。NffiS-MiniCMV-Luc-EN質(zhì)粒是另一個(gè)試驗(yàn)質(zhì)粒，該質(zhì)粒在NffiS-MiniCMV-Luc質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，增加了SV40Enhancer序列，其Luc報(bào)告基因受pFA和SV40增強(qiáng)子的雙重調(diào)控。試驗(yàn)中關(guān)注的問題，是這種雙重調(diào)控是否會(huì)增強(qiáng)報(bào)告基因的表達(dá)，以及這種雙重調(diào)控是否還受細(xì)胞內(nèi)Nf-kB蛋白活性狀態(tài)的調(diào)控。使用NffiS-MiniCMV-Luc-EN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Nf-kB蛋白有活性的細(xì)胞株Hut78、JurkatE6-l、HL-60,發(fā)現(xiàn)都可以檢測(cè)到較高水平的螢光強(qiáng)度，且螢光強(qiáng)度都超出pGL3Control的水平，達(dá)到后者的約146%、246%禾口249%。而NffiS-MiniCMV-Luc-EN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Nf-kB蛋白無活性的細(xì)胞株k562，報(bào)告基因表達(dá)水平比本底略高，約為pGL3Control的14%。綜合NffiS-MiniCMV-Luc-EN質(zhì)粒在Nf-kB蛋白有活性與無活性細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)度的差異，可以說明NffiS-MiniCMV啟動(dòng)子+SV40增強(qiáng)子形式的調(diào)控序列，受細(xì)胞內(nèi)Nf-kB蛋白的調(diào)控，其下游的報(bào)告基因獲得高表達(dá)。而在Nf-kB蛋白無活性的細(xì)胞中，NffiS-MiniCMV啟動(dòng)子+SV40增強(qiáng)子的調(diào)控形式，有一定的表達(dá)強(qiáng)度。上述結(jié)果說明NffiS-MiniCMV啟動(dòng)子+SV40增強(qiáng)子的調(diào)控序列構(gòu)建方式，雖然增加了表達(dá)強(qiáng)度，但特異性下降，對(duì)于組織特異性表達(dá)的要求而言，NffiS-MiniCMV啟動(dòng)子+SV40增強(qiáng)子是不可取的設(shè)計(jì)。實(shí)施例5受NffiS-MiniCMV組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控的毒素表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建5.1NfflS-MiniCMV-PEIIImut的構(gòu)建通過Ncol禾nXbal酶切位點(diǎn)，將/^///wW序列(pEIIIMutant667bp)從p￡///mw^G上切出，并通過相同的酶切位點(diǎn)聯(lián)入，S-Mz'm'CMF-i^c。以p￡///Am^取代丄wcriMc!/mw"656bp)序列，構(gòu)建成受，S-M!'m'CMF啟動(dòng)子(209bp)調(diào)控的W表達(dá)質(zhì)粒，命名為。PEIIImut的核苷酸序列如SEQIDN0.9所示，氨基酸序列如SEQIDN0.8所示。5.2NffiS-MiniCMV-PAP的構(gòu)建7V/RS-M/m'CMr-i^尸:通過iVco/、^&a/酶切位點(diǎn)，將商陸毒素/MP基因序列(792bp)從盧麗博士構(gòu)建的中切出，并使用相同的酶切位點(diǎn)，接入，5-^>0#^\^"￡-;^///附^質(zhì)粒，命名為A^BS-A/zm'CMr-;^/M尸。該質(zhì)粒上帶有商陸毒素PAP片斷，并受，S-Mz'm'CMK啟動(dòng)子的調(diào)控。是，5-Mz'm'CMF啟動(dòng)子調(diào)控的真核表達(dá)框基礎(chǔ)上的另一種毒素表達(dá)重組體。實(shí)施例6非病毒載體蛋白/毒素真核表達(dá)DNA復(fù)合物的制備I組qmlL2-SON2/NffiS-MiniCMV-PEIIImut及qmlL2-SON2/NfflS-MiniCMV-PAP，II組wtlL2SON2/NfflS-MiniCMV-PEIIImut6.1非病毒載體融合蛋白和質(zhì)粒DNA復(fù)合物的制備[ErbacherP，1996;1997;XuB,1998]蛋白復(fù)性。將蛋白干粉溶于層析用去離子水中。4'C，輕柔攪拌混勻狀態(tài)下，將蛋白溶液逐滴加入等體積的0.2XPBS溶液中。紫外法或BCA法測(cè)定蛋白濃度，以0.1XPBS調(diào)整蛋白溶液濃度為0.2yg/u1，4'C保存?zhèn)溆?。分別將非病毒載體融合蛋白和待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA溶解于適量的無血清RPMI1640培養(yǎng)基中，蛋白溶液經(jīng)0.2pM膜過濾除菌。將復(fù)性后的蛋白溶液混勻后，逐滴加至質(zhì)粒DNA溶液中。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)DNA-蛋白復(fù)合物達(dá)到充分復(fù)合時(shí)，DNA-蛋白復(fù)合物將在電場(chǎng)持續(xù)作用下一直滯留在上樣孔中。混合液于室溫放置15-45min，可進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)及用于細(xì)胞試驗(yàn)。6.2凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)不同比例的DNA與蛋白復(fù)合物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可觀察復(fù)合物中DNA的遷移率不同。其原理是當(dāng)DNA結(jié)合蛋白與DNA或寡核苷酸結(jié)合形成DNA蛋白復(fù)合物后，使DNA片段分子量及電荷發(fā)生改變，因此在凝膠電泳中它的遷移率發(fā)生改變。6.3純化后非病毒載體融合蛋白QmlL2-S0N2和wtlL2S0Nl蛋白與毒素重組體的^口n理論預(yù)測(cè)電荷數(shù)根據(jù)理論預(yù)測(cè)[Hart,SL.，1998]，電荷數(shù)相等時(shí)，DNA同qmlL2-S0N2蛋白和wtlL2S0Nl非病毒載體蛋白質(zhì)的質(zhì)量比分別為1:1.1和1:1.6。通過凝膠阻滯試驗(yàn)可以證實(shí)蛋白對(duì)DNA的結(jié)合能力，而對(duì)照的BSA對(duì)DNA沒有任何結(jié)合能力(典型的試驗(yàn)條件為W瓊脂糖凝膠，穩(wěn)壓60伏特，電泳40分鐘)。實(shí)際試驗(yàn)中，每批次的蛋白都同DNA以不同比例混合(DNA/蛋白比例范圍1:1直到1:8，根據(jù)凝膠阻滯電泳的結(jié)果，決定本次試驗(yàn)DNA/蛋白復(fù)合物中DNA和蛋白的比例。試驗(yàn)中實(shí)際所確定的比例為QmlL2-S0N2蛋白同DNA結(jié)合的質(zhì)量比為3:1，wtlL2S0Nl同DNA的結(jié)合質(zhì)量比為4:1。實(shí)施例7qmlL2-SON2/報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率同脂質(zhì)體/報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的比較Hut78及K562細(xì)胞1X105/24孔板單孔，鋪板。TransFast同pGL3Control質(zhì)粒電荷比1:1方案，每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA1yg。qmlL2-SON2蛋白同pGL3Control質(zhì)粒電荷比l:l方案(質(zhì)量比為3:1)，每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA2ug。單獨(dú)質(zhì)粒處理細(xì)胞作對(duì)照(每孔1HgpGL3Control質(zhì)粒)。每種處理均重復(fù)3孔。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集并裂解細(xì)胞，螢光光度計(jì)檢測(cè)螢光強(qiáng)度。在Hut78和K562細(xì)胞中，蛋白/DNA復(fù)合物的螢光值均低于脂質(zhì)體/DNA轉(zhuǎn)染組，為后者的60~70%。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率要高于qmlL2-SON2/DNA復(fù)合物。單獨(dú)DNA處理細(xì)胞檢測(cè)不到螢光表達(dá)。實(shí)施例8I組復(fù)合物qmlL2-SON2/NfflS-MiniCMV-PEinmut及qmlL2-SON2/NfBS-MiniCMV-PAP兩種復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的殺傷8.1所使用細(xì)胞株、靶向性蛋白及毒素表達(dá)質(zhì)粒8丄1所用細(xì)胞株蛋白一DNA對(duì)細(xì)胞的殺傷試驗(yàn)采用4個(gè)細(xì)胞系，細(xì)胞的IL2受體及Nf-kB蛋白的表型見下表。IL2R(白介二受體)NfkBHut78++HL-60—+K562+一Hela—一8.1.2所用毒素表達(dá)質(zhì)粒所使用的毒素表達(dá)質(zhì)粒有5種，其中SV40promoter-pEIIImut-SV40Enhancer是強(qiáng)陽性毒素對(duì)照質(zhì)粒；None-pEIIImut是無啟動(dòng)子增強(qiáng)子調(diào)控的、陰性毒素對(duì)照質(zhì)粒；NfBS-MiniCMV-pEIIImut和NfBS-MiniCMV-PAP是受Nf-kB蛋白調(diào)控的調(diào)控表達(dá)毒素質(zhì)粒。質(zhì)粒質(zhì)粒全稱啟動(dòng)子/增強(qiáng)子效應(yīng)基因說明代號(hào)SV40SV40啟動(dòng)子pEIIImut綠膿毒素promoter-pEIIImut-SV40/SV40增強(qiáng)子pEIIImut強(qiáng)陽性Enhancer對(duì)照bNone-pEIIImut無啟動(dòng)子、增強(qiáng)子pEIIImut綠膿毒素pEIIImut陰性對(duì)照cNffiS-MiniCMV-pElIImut應(yīng)S-MiniCMV啟動(dòng)子pEIIImutpEin受鵬S-MiniCMV啟動(dòng)子調(diào)控dSV40PAPSV40啟動(dòng)子/SV40增強(qiáng)子PAP商陸毒素PAP強(qiáng)陽性對(duì)照cN仿S-MiniCMV-PAPNfflS-MiniCMV啟動(dòng)子PAPPAP受NfflS-MiniCMV啟動(dòng)子調(diào)控8.1.3所用非病毒載體(融合蛋白)所使用的蛋白QmlL2-S0N2蛋白。_配體部分DNA結(jié)合部分說明qmlL2-S0N258位及125位Cys突變SON2片斷qralL2無生物活性，有結(jié)合受的IL2體能力8.2復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞及MTT法檢測(cè)非病毒載體蛋白/毒素表達(dá)型重組體DNA復(fù)合物對(duì)相關(guān)細(xì)胞的殺傷試驗(yàn)1.在96孔培養(yǎng)板上孵育細(xì)胞，每孔lx104細(xì)胞/100u1，37。C孵育18-24小時(shí)。2.棄去培養(yǎng)液，加入不同濃度的DNA-蛋白復(fù)合物100yl，每個(gè)樣品3復(fù)孔為一組，37。C孵育36-48小時(shí)。3.細(xì)胞殺傷檢測(cè)(MTT法)每孔加入20ul5mg/mlMTT，孵育2-4小時(shí)。加入終止液(20%SDS，50%二甲基甲酰胺)100ul，37'C孵育1小時(shí)。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490nm檢測(cè)OD值。殺傷率的計(jì)算-殺傷率=((空白對(duì)照組OD值一處理組OD值)/空白組OD值)X100%8.3I組復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的殺傷作用使用qmlL2-S0N2蛋白和上述的毒素質(zhì)粒構(gòu)成的蛋白/DNA復(fù)合物，對(duì)四株細(xì)胞進(jìn)行了殺傷試驗(yàn)(Hut78，K562，HL-69，Hela)。qmlL2-S0N2蛋白是針對(duì)表面具有IL2R的耙細(xì)胞而設(shè)計(jì)的非病毒載體蛋白。本發(fā)明首先關(guān)心的是這種蛋白是否可以將毒素質(zhì)粒送入IL2R陽性的靶細(xì)胞。對(duì)于IL2受體陽性的細(xì)胞(Hut78和K562),用毒素強(qiáng)陽性對(duì)照質(zhì)粒(5T^pro歷oter-pfi7/孤t一5y必e/7/朋cor，和5T必/^尸)的蛋白復(fù)合物處理的各劑量組同對(duì)照組的OD值相比，P<0.05，均有顯著性差異，說明均有不同程度的殺傷作用。而IL2受體陰性的細(xì)胞(HL-60和Hela)，毒素強(qiáng)陽性對(duì)照質(zhì)粒(5Y必pro卿fer-/^i7i/w/t—5T必e/j/朋cer，和5y必W尸)的蛋白復(fù)合物處理的各梯度劑量組同對(duì)照組的OD值相比，P〉0.05，該蛋白復(fù)合物對(duì)這些細(xì)胞無殺傷作用。以上試驗(yàn)結(jié)果說明qmlL2-S0N2蛋白具有很好的導(dǎo)向作用，該蛋白可以將毒素表達(dá)質(zhì)粒送入表面具有IL2受體的耙細(xì)胞。但是K562(IL2R+Nf-kB—)細(xì)胞內(nèi)的Nf-kB蛋白為陰性，也同樣會(huì)被殺傷。這也說明這樣的毒素構(gòu)建方式的組成型表達(dá)模式的副作用。一旦qmlL2S0NB/5T必pr娜oter-p^7i7/m^—^5T^e"/朋cei"或qmlL2-S0N2/5T必-W尸進(jìn)入表面具有IL2R的正常細(xì)胞，也同樣可以造成殺傷。本發(fā)明關(guān)心的另一個(gè)問題是兩種Nf-kB蛋白調(diào)控表達(dá)毒素復(fù)合物qmIL2-SON2/，S-Mz'mCMF-/^////nw和qmIL2-SON2/，S-M!mCMF-/MP是否會(huì)只進(jìn)入IL2R陽性的細(xì)胞，且只有在細(xì)胞內(nèi)Nf-kB蛋白為陽性時(shí)，才對(duì)細(xì)胞造成殺傷。對(duì)于IL2受體陽性、Nf-kB蛋白活性陽性的細(xì)胞Hut78，用含有Nf-kB蛋白調(diào)控的毒素質(zhì)粒(iy/BS-MzVn'CMK/^//JmW，iy/RS-Mz'm'CMF-7MP)的蛋白復(fù)合物處理，其各梯度劑量組同對(duì)照組的OD值相比，P<0.05，均有顯著性差異，說明該毒素表達(dá)質(zhì)?？蛇_(dá)到不同程度的殺傷作用。對(duì)于IL2受體陽性、Nf-kB蛋白活性陰性的細(xì)胞K562，用受Nf-kB蛋白調(diào)控的毒素質(zhì)粒(NffiS-MiniCMV-pEIIImut,NfBS-MiniCMV-PAP)的蛋白復(fù)合物處理，其各梯度劑量組同對(duì)照組的OD值相比，P>0.05，該毒素表達(dá)質(zhì)粒對(duì)于K562細(xì)胞沒有殺傷作用。結(jié)合本論文第三部分的報(bào)告基因活性試驗(yàn)，說明NffiS-MiniCMV-pEIIImut和NfBS-MiniCMV-PAP毒素的殺傷作用，受細(xì)胞內(nèi)部Nf-kB蛋白活性的調(diào)控。1.在IL2受體陽性的細(xì)胞(Hut78和K562)，用強(qiáng)陽性對(duì)照表達(dá)毒素復(fù)合物qmlL2-S0N2/5T必/r湖"er-^a57i7歷"f-5T必^/朋cer和qmlL2-S0N2/SK^-州戶處理，同空白對(duì)照組的OD值相比，P〈0.05，均有顯著性差異。這兩種強(qiáng)陽性對(duì)照表達(dá)毒素復(fù)合物表現(xiàn)出明顯的受體靶向性。對(duì)于Hut78(IL2Rf-kB+)細(xì)胞，2ug/ml，4ug/ml，8yg/ml劑量的qmlL2-SON2ASF卵/wwwW^￡J7i>ii/nSW0五"Aa"cer復(fù)合物對(duì)Hut78細(xì)胞的殺傷率分別為23.572%，34.494%和54.552%。2ug/ml，4ug/ml，8yg/ml劑量的qmlL2-SON2ASF^WMP復(fù)合物的殺傷率分別為14.375%，20.073%和51.268%。對(duì)于K562(IL2Rf-kB—)細(xì)胞，2ug/ml，4ug/ml，8Ug/ml劑量的qmlL2-SON2ASWtf/wwwWe#"-/^////w'-tSWtf復(fù)合物處理K562細(xì)胞，殺傷率分別為12.576%，36.364%，48.121%。2ug/ml，4ug/ml，g/ml劑量的qmIL2-SON2/SF^-/Mi復(fù)合物的殺傷率分別為16.697%，44.818%和54.394%。而這兩種復(fù)合物對(duì)于IL2受體陰性細(xì)胞HL-60和Hela細(xì)胞沒有表現(xiàn)出殺傷作用(P>0.05)。由此說明了qmlL2-SON2蛋白作為"導(dǎo)向頭"，可以同細(xì)胞表面IL2受體特異性結(jié)合，并將毒素表達(dá)質(zhì)粒送入細(xì)胞。2.對(duì)于IL2受體陽性、Nf-kB蛋白活性陽性的細(xì)胞Hut78，用受Nf-kB蛋白調(diào)控的毒素復(fù)合物(qmIL2-SON2/^aW-iW/'CWy-/^/Hiw"/和qmlL2-SON2/AyaS-MVu'CMK-iMiO的蛋白復(fù)合物處理，其各劑量組同對(duì)照組的OD值相比，P<0.05，均有顯著性差異，說明該毒素表達(dá)質(zhì)?？蛇_(dá)到不同程度的殺傷作用，殺傷效應(yīng)具劑量依賴性。對(duì)于Hut78細(xì)胞，2ug/ml，4ug/ml，8ug/ml齊U量的9加化2-802/;\!/5-3"''<:3/「-/>1/^"/復(fù)合物，Hut78細(xì)胞的殺傷率分別為13.795%、22.579%和42.484%。對(duì)于Hut78細(xì)胞，2ug/ml，4ug/ml，8ug/ml齊U量的911111^-80~2/^!/5-3"1'0/^//1復(fù)合物，殺傷率分別為14.375%，21.066%和30.706%。3.對(duì)于IL2受體陽性、Nf-kB蛋白活性陰性的細(xì)胞K562，用受Nf-kB蛋白調(diào)控的毒素復(fù)合物(qmlL2-SON2/iy/RS-iW/irt7MK-p五/J/mW和qmIL2-SON2/iV/BS-Mi>X:MF-iM/)處理，其各梯度劑量組同對(duì)照組的OD值相比，P>0.05，該種形式的毒素復(fù)合物對(duì)于K562細(xì)胞沒有殺傷作用。結(jié)合本論文第三部分的報(bào)告基因活性試驗(yàn)，說明qmIL2-SON2W/RS-3/'CMF-/￡/J/i"r和qmlL2-SON2W/RS-Mi'",'CMr-WP毒素復(fù)合物的殺傷作用，受細(xì)胞內(nèi)部Nf-kB蛋白活性的調(diào)控。表1MTT法檢測(cè)qmlL2-SON2/毒素DNA復(fù)合物處理各細(xì)胞后的殺傷作用(用光密度表示)，并計(jì)算殺傷率(n=3,5±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>_IL2R(白介二受體)NfltBHut78:i=HL-60—+9.1.2所用毒素表達(dá)質(zhì)粒所使用的毒素表達(dá)質(zhì)粒有2種，其中SV40promoter-pEIIImut-SV40Enhancer是強(qiáng)陽性毒素對(duì)照質(zhì)粒；NfBS-MiniCMV-pEIIImut是受Nf-kB蛋白調(diào)控的調(diào)控表達(dá)毒素質(zhì)粒。質(zhì)粒質(zhì)粒全稱啟動(dòng)子/增強(qiáng)子效應(yīng)基因說明代號(hào)SV40SV40啟動(dòng)子pEIIImut綠膿毒素promoter-pEIIImut-SV40/SV40增強(qiáng)子pEIIImut強(qiáng)陽性Enhancer對(duì)照cNffiS-MiniCMV-pEIIImutNfflS-MiniCMVpEIIImutpEin受啟動(dòng)子NffiS-MiniCMV啟動(dòng)子調(diào)控8.1.3所用非病毒載體(融合蛋白)wtlL2S0Nl蛋白配體部分DNA結(jié)合部分說明wtlL2S0Nl只有125位Cys突變的SON1片斷wtlL2生物活性及結(jié)合能力IL2同野生型相同9.2復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞及MTT法檢測(cè)非病毒載體蛋白/毒素表達(dá)型重組體DNA復(fù)合物對(duì)相關(guān)細(xì)胞的殺傷試驗(yàn)1.在96孔培養(yǎng)板上孵育細(xì)胞，每孔lxl(^細(xì)胞/100ul,37。C孵育18-24小時(shí)。2.棄去培養(yǎng)液，加入不同濃度的DNA-蛋白復(fù)合物100lU，每個(gè)樣品3復(fù)孔為一組，37。C孵育36-48小時(shí)。3.細(xì)胞殺傷檢測(cè)(MTT法)每孔加入20ul5mg/mlMTT，孵育2-4小時(shí)。加入終止液(20%SDS，50%二甲基甲酰胺)100lU，37'C孵育1小時(shí)。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490nm檢測(cè)OD值。殺傷率的計(jì)算殺傷率=((空白對(duì)照組OD值一處理組OD值)/空白組OD值)X100%用毒素強(qiáng)陽性對(duì)照表達(dá)復(fù)合物wtlL2SONl/W0"戰(zhàn)她"￡///附""兩，或受Nf-kB蛋白調(diào)控的調(diào)控表達(dá)毒素復(fù)合物(wtIL2SONl/7V/aS-M/m'CMF-/;￡///wf)處理IL2受體陽性的細(xì)胞(Hut78)，發(fā)現(xiàn)各梯度劑量組同對(duì)照組的OD值相比，P<0.05，均有顯著性差異，說明均有不同程度的殺傷作用。單純的wtlL2SONl蛋白有促Hut78細(xì)胞增值的作用，表現(xiàn)為殺傷率為負(fù)值，說明單純蛋白處理組同對(duì)照組相比，細(xì)胞數(shù)目增加(P<0.05)。wtlL2SONl蛋白對(duì)于IL2R陽性的細(xì)胞具有促增生作用。單純蛋白處理的IL2受體陰性的細(xì)胞(HL-60)，也觀察到細(xì)胞數(shù)目增加的現(xiàn)象(P<0.05)。說明wtlL2SONl蛋白可以誘導(dǎo)HL-60增生。HL-60細(xì)胞經(jīng)毒素強(qiáng)陽性對(duì)照表達(dá)復(fù)合物(wtIL2SONlASKM/wiWe~/^//7/""1SFW￡"Aace/0，或受Nf-kB蛋白調(diào)控的調(diào)控表達(dá)毒素復(fù)合物("111^2801\1/;/&5-3/,'"^3/^/>￡///1-)處理，各梯度劑量組同對(duì)照組的OD值相比，PO.05,說明兩種wtlL2SONl蛋白復(fù)合物均可對(duì)該細(xì)胞造成殺傷。結(jié)果分析1.單獨(dú)的wtlL2SONl蛋白有促Hut78細(xì)胞增值的作用，表現(xiàn)為殺傷率為負(fù)值。說明單獨(dú)蛋白處理組同對(duì)照組相比，細(xì)胞數(shù)目增加(P<0.05)。對(duì)于經(jīng)8ug/ml、16pg/ml、32ug/ml的單獨(dú)wtlL2SONl蛋白(因?yàn)樵摰鞍淄珼NA形成復(fù)合物時(shí)，蛋白/DNA比例為4:1，因此對(duì)應(yīng)的蛋白終濃度為8ug/ml、16yg/ml和32yg/ml)處理的組，細(xì)胞的殺傷率均為負(fù)值，表示細(xì)胞有增生；同對(duì)照組相比，增生比例分別為12.085%、14.003%和27.692%。單獨(dú)蛋白處理的IL2受體陰性的細(xì)胞(HL-60)，也觀察到細(xì)胞數(shù)目增加的現(xiàn)象(P<0.05)。對(duì)于經(jīng)8ug/ml、16ug/ml、32yg/ml的單獨(dú)wtlL2SONl蛋白處理的組，細(xì)胞的殺傷率均為負(fù)值，表示細(xì)胞有增生；同對(duì)照組相比，增生比例分別為6.069%，8.261%，10.698%。2.蛋白/毒素表達(dá)質(zhì)粒復(fù)合物對(duì)Hut78細(xì)胞的殺傷。用毒素強(qiáng)陽性對(duì)照表達(dá)復(fù)合物(wtlL2SONl/SFW/wwiWo/wE7/i)iiiif-SF^五"A"wce;"，或是用受Nf-kB蛋白調(diào)控的調(diào)控表達(dá)毒素復(fù)合物(wtIL2SONl/7y/aS-M//i/CMK-/i￡#//M"f)的蛋白復(fù)合物處理IL2受體陽性的細(xì)胞(Hut78)，發(fā)現(xiàn)各梯度劑量組同對(duì)照組的OD值相比，P<0.05，均有顯著性差異，說明均有不同程度的殺傷作用。對(duì)于經(jīng)2X、4X禾卩8X的wtIL2SONl/SV40promoter-pEIIImut-SV40Enhancer復(fù)合物處理的組，Hut78細(xì)胞的殺傷率分別為9.278%,14.233%，30.727%。X寸于經(jīng)2X、4X禾卩8X的wtlL2SONl/N氾S-MiniCMV-pEIIImut復(fù)合物處理的組，Hut78細(xì)胞的殺傷率分別為6.100%,10.166%和18.614%。3.HL-60細(xì)胞的殺傷。HL-60細(xì)胞經(jīng)毒素強(qiáng)陽性對(duì)照質(zhì)粒(SV40promoter-pEIIImut_SV40enhancer)的蛋白復(fù)合物，或是受Nf-kB蛋白調(diào)控的毒素質(zhì)粒(NfflS-MiniCMV-pEIIImut)的蛋白復(fù)合物處理，各梯度劑量組同對(duì)照組的OD值相比，PO.05,說明wtlL2SONl蛋白復(fù)合物可以對(duì)該細(xì)胞造成殺傷。對(duì)于經(jīng)2Pg/ml、4ug/ml和8ug/ml的wtlL2SONlASK40/>>鵬^^;￡///附《"5^^復(fù)合物處理的組，HL-60細(xì)胞的殺傷率分別為7.996%，10.720%和24.075%。對(duì)于經(jīng)2ug/ml、4ug/ml和8ug/ml的wttL2SONl/i\yaS-M/M/0/r-/^////iiW復(fù)合物處理的組，HL-60細(xì)胞的殺傷率分別為10.963%，13.821%和25.537%。HL-60細(xì)胞本來為IL2受體陰性，但是在多種誘導(dǎo)因素，例如經(jīng)TNF，PHA，以及IL2本身的處理，可以表達(dá)IL2受體[JImmunol1987138:185-91]。wtlL2SONl蛋白復(fù)合物可以對(duì)該細(xì)胞造成殺傷，單純wtlL2SONl蛋白可以誘導(dǎo)該細(xì)胞增生，說明HL-60細(xì)胞被該蛋白誘導(dǎo)表達(dá)IL2受體，并借該受體實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的殺傷作用。以上試驗(yàn)結(jié)果說明wtlL2SONl蛋白具有IL2的生物活性，因此誘導(dǎo)IL2受體陽性的細(xì)胞(Hut78)增生；并可以誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞表達(dá)IL2受體和細(xì)胞增生。同時(shí)wtlL2SONl蛋白復(fù)合物借助IL2受體的內(nèi)吞作用，將毒素質(zhì)粒帶入耙細(xì)胞，發(fā)揮殺傷作用。因此觀察到的殺傷作用是促細(xì)胞增生和殺傷細(xì)胞作用的綜合效應(yīng)?？傮w上，wtlL2SONl蛋白凍素復(fù)合物表現(xiàn)出對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。wtlL2SONl蛋白對(duì)于IL2受體陽性細(xì)胞，及可被IL2誘導(dǎo)的細(xì)胞都具有促增生作用。最后的殺傷效應(yīng)是增生和殺傷綜合作用的結(jié)果。因此，對(duì)于這種蛋白復(fù)合物需要謹(jǐn)慎評(píng)估，以免在應(yīng)用中出現(xiàn)促腫瘤細(xì)胞增生的作用(表格見下頁)。表2wtlL2SONl蛋白/毒素表達(dá)質(zhì)粒復(fù)合物對(duì)Hut78、HL-60細(xì)胞的殺傷作用<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>*分組代號(hào)說明例如Bc8,指B組——蛋白/DNA復(fù)合物處理組，使用毒素質(zhì)粒為c質(zhì)粒，即N氾S-MiniCMV-pEIIImut，使用劑量為8ug/ml毒素質(zhì)粒。**各處理組與空白對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05，均有顯著性差異；O內(nèi)的數(shù)值為進(jìn)一步計(jì)算殺傷率的結(jié)果。DNA代號(hào)a、c分別表示aSV40promoter-pEIIImut-SV40Enhancer;cNfBS-MiniCMV-pEIIImut。序列表SEQIDNO.lSON2蛋白氨基酸序列khrsksrerkrkrsssrdnrktvrarsrtpsrrsrshtpsnrrsrsvgrrrsSEQIDNO.2qmlL2的氨基酸序列PRSEQIDNO.3SON1蛋白氨基酸序列kvkdthekskknknrdkgekekkrdsslrsrskrskssehksrkrtsesrsrarkrsskskshrsqtrsrsrSE(3IDN0.4qmlL2-SON2核苷酸序列:/t"^T/M(t7ccc|GGGGTTCGTGGTCCGCGTlGGTAd^AAACATCGTAGCAAATCTCGCGAACTTGGTCGTCGCCGGAGCTGATAA(;GATCCSEqIDN0.5wtlL2-SONl核苷酸序列<t《7《7ccc|ggggttcgtggtccgcg1ggta6^aaagttaaagacactcacgaaaaatccaaaaACG丌CCAMTC丌CTGMCACAAATCCCGTAAACGTAC丌CCGMTCTCGTTCTCGTGCTCGTAMCGTTCCTCTAAATCCAAATCTCACCGTTCTCAGACCCGTTCCCGTTCCCGTr<Mr/l>A|GGATd^SEQIDN0.6MiniCMVPromoter序列g(shù)taggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagate59bpSEQIDN0.7NffiS-MiniCMVPromoter序列GAATTCGGTACCGCCTGGGGACTTTGCGAGAGCAGAGGdGACTTTCCGAGAGCAGAGGGGACTTTCCACACCCCACACCTTTCAGGGGAGACGAGAGCCTTTCAGGGGAGACGAGAGCCTTTCAGGGGTCCGCTGCAGgtaggcgtgtacggtgggaggtct3t3t33gcag3gctcgtttagtgaaccgtcag3tcCTCGAGGGATCCSEQIDNO.8pEIIImut的氨基酸序列KPPKDEIaSEQIDNO.9pEIIImut的核苷酸序列:GAATTC^:CATG(ctacgccagccagcccggcaaaccgccgIaaggacgaactgItaaireTAGAAAGCTi]Aseqidno.10商陸毒素核苷酸序列GCCACTTTTCTGGATAATCTTCGTAATGAAGCGAAAGATCCAAGTTTAAAATGCTATGGCTATTCTGATCCCTTTGATACCAATAAGTGTCGTTACCATATCTTTAGTGATATCTCAGGTCTTAAACTACGTTGGTGGGAGCTGCCAAACAACTTGATAATCTAGAAAGCTTSEQIDNO.ll商陸毒素氨基酸序列(262aa)MVNTHYNVGSTTISKYATFLDNLRNEAKDPSLKCYGIPMLPNTNPNPKYVLVELQGSNKKTITLMLRRNNLYVMGYSDPFDTNKCRYHIFSDISGTERQDVETTLCPNPNSRASKN匿DSRYPTLESKAGVKSRSQVQLGIQILDSNIGKISGVTSFTEKTEAEFLLVAIQMVSEAARFKYIENGVKTNFNRAFNPNPKVLNLEETWGKISTAIHDAKNGVLPKPLELVDASGAKWIVLRVDDIKPDVALLNYVGGSCQTTSEQIDN0.12qmlL2-SON2蛋白氨基酸序列APTSSSTICEHIjI^D，IIjNGINNYKNPKLTRMIjTFKFYMPKKATE]jKH]jQSIjEEEIjKPIjEEVIjNLAQSKNFHLiRPRDIjISNINVIVLjEIjKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTTiTPGWGPRGTKHRSKSRERKRKRSSSRDNRKTVRARSRTPSRRSRSHTPSRRRRSRSVGRRRSSEQIDNO.13wtlL2SONl蛋白氨基酸序列APTSSSTKKTQLiQIiEHLiliDIjQMIIjNGINNYKNPKLTRMIjTFKFYMPKKATEIjKHIjQCLEEELKPKEEVIjNLAQSKNFHIjRPRDIjISNINVIVLiEIiKGSETTFMCEYADETATIVEF1jNRWITFSQSIISTIjTPGVRGPRGTKVKDTHEKSKKNKNRDKGEKEKKRDSS:LRSRSKRSKSSEHKSRKRTSESRSRARKRSSKSKSHRSQTRSRSR權(quán)利要求1.一種靶向性腫瘤基因治療藥物組合物qmIL2-SON2/NfBS-MiniCMVpromoter-PEIIImut。該組合物由蛋白質(zhì)非病毒載體qmIL2-SON2和具有腫瘤組織特異性的殺傷(毒素)基因真核表達(dá)型質(zhì)粒NfBS-MiniCMV-PEIIImut組成。蛋白非病毒載體由細(xì)胞結(jié)合肽qmIL2和DNA結(jié)合多肽SON2兩部分組成。該融合蛋白中的DNA結(jié)合多肽SON2可以結(jié)合殺傷基因表達(dá)型重組質(zhì)粒NfBS-MiniCMV-PEIIImut從而形成復(fù)合藥物；該融合蛋白中的qmIL2可與表面富集有IL2受體的腫瘤細(xì)胞及某些其表面也有IL2受體的正常細(xì)胞結(jié)合，并將這種DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物導(dǎo)入上述細(xì)胞。本發(fā)明還提供一種腫瘤組織特異性的調(diào)控序列NfkB-MiniCMVpromoter，該調(diào)控序列含有Nf-kB蛋白結(jié)合位點(diǎn)的編碼序列與削短的miniCMB啟動(dòng)子，它只能在特定類型腫瘤細(xì)胞內(nèi)含有的組成型Nf-kB蛋白特異性地調(diào)控并激活下才能驅(qū)動(dòng)其下游的殺傷基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而殺滅該類型的腫瘤細(xì)胞。但因正常細(xì)胞內(nèi)不存在組成型的Nf-kB蛋白，因此即使上述復(fù)合物被導(dǎo)入正常細(xì)胞，也因該正常細(xì)胞內(nèi)無殺傷蛋白質(zhì)的表達(dá)而不會(huì)被殺傷。2.如權(quán)利要求l所述融合蛋白qmlL2-S0N2，其從N端至C端依次為白細(xì)胞介素2突變體(qmlL2)，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。S0N2為DNA結(jié)合蛋白SON的1896—1948位氨基酸(53個(gè)氨基酸)，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。融合蛋白qmlL2-S0N2全長(zhǎng)氨基酸序列如SEQIDN0:12所示。3.如權(quán)利要求1與2所述融合蛋白全長(zhǎng)編碼基因是OziZiHS"m么且具有SEQIDN0:4的DNA序列。4.如權(quán)利要求1、2、3所述融合蛋白非病毒載體，其中細(xì)胞結(jié)合肽可以是IL2的突變體qmlL2，也可以是IL2本身或IL2的其它突變體。其中DNA結(jié)合多肽可以是DNA結(jié)合蛋白SON或其片段，或其他DNA結(jié)合肽。5.由權(quán)利要求3的重組體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞的工程菌。它們可以是原核系統(tǒng)的、也可以是真核系統(tǒng)的。6.如權(quán)利要求1所述靶向性腫瘤基因治療藥物組合物，其中AYK5"-奶V7/a^pro/^^r為腫瘤細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子，其核苷酸序列由5'至3'方向依次為3次正向重復(fù)連接的Nf-kBbindingsite(即Nf-kB蛋白結(jié)合區(qū)，序列為GGGACTTTCC)及其側(cè)翼序列、3次反向重復(fù)連接的Nf-kBbindingsite及其側(cè)翼序列、以及削短的核心啟動(dòng)子序列MiniCMVpromoter。其具有SEQIDNO.7的核苷酸序列。7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其中表達(dá)型重組體的腫瘤細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子序列中的核心啟動(dòng)子可選用W/h'a/K/^o歷"er，且具有SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，還可選用任何只含核心啟動(dòng)子元件(例如TATAbox)的核心啟動(dòng)子序列。8.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其中表達(dá)型重組體的腫瘤細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子序列中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域選用Nf-kB蛋白結(jié)合域，還可以從任何腫瘤細(xì)胞中有組成型活性、正常組織中無活性或一過性活性的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控結(jié)合域中進(jìn)行選擇，如myc、myb、fos、jun等轉(zhuǎn)錄因子對(duì)應(yīng)的調(diào)控結(jié)合域。9.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述毒素表型重組體為基于pGL3構(gòu)建的表達(dá)型重組體，W/SS-必'/7/0^-;^i77歷"或A^/a5h^zV^a^-尸/!尸。其中所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)是綠膿桿菌毒素的第三功能結(jié)構(gòu)域或其突變體/^iT7M/t所述突變體的氨基酸序列如SEQIDN0.8，核苷酸序列如SEQIDNO.9。10.如權(quán)利要求1與9述的藥物組合物，其中所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)也可以是商陸毒素蛋白PAP。其氨基酸序列如SEQIDNO.11，其核酸序列如SEQIDNO.10所示。11.如權(quán)利要求l、9、IO所述的藥物組合物，其中所述對(duì)細(xì)胞具有殺傷作用的蛋白質(zhì)還可以是綠膿桿菌毒素、白喉毒素、商陸、蓖麻毒素，或其他一切對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的來自人體、動(dòng)植物或微生物的蛋白，或是他們的活性功能區(qū)域、突變體或類似物；以及根據(jù)人工合成的對(duì)細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白或多肽的編碼基因。12.如權(quán)利要求1、9、10、11所述的藥物組合物，如qmlL2-S0N2/AK^-必'/^O/Kp/ym"ei"-/^/////wt與qmlL2-SON2/mlL2-SON2/W/KS1-M/^'0^/xr哪"ar-W尸等對(duì)同時(shí)是IL2受體陽性與Nf-kB蛋白活性陽性細(xì)胞，包括此類腫瘤細(xì)胞與被活化的T細(xì)胞的準(zhǔn)確靶向特異殺傷作用，而不殺傷其他類型的細(xì)胞、包括正常細(xì)胞。13.如權(quán)利要求1、9、10、11、12所述，此類藥物組合物對(duì)一類IL2受體陽性與Nf-kB蛋白活性陽性的惡性腫瘤的殺傷作用及其對(duì)此類惡性腫瘤的治療作用，其中包括成人T細(xì)胞性白血病/淋巴瘤，兒童T細(xì)胞性淋巴瘤，毛細(xì)胞性白血病，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，B系慢性淋巴細(xì)胞性白血病，退行性大細(xì)胞性淋巴瘤，外周T細(xì)胞性淋巴瘤等等。14.如權(quán)利要求l、9、10、11、12所述，此類藥物組合物對(duì)一類IL2受體陽性與Nf-kB蛋白活性陽性的、被活化的細(xì)胞(NF-KB+)T細(xì)胞的殺傷作用，及其對(duì)自身免疫病的治療作用。全文摘要本發(fā)明涉及基因治療藥物領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種靶向性腫瘤基因治療藥物組合物qmIL2-SON2/NfBS-MiniCMV-PEIIImut。具體而言，該組合物由蛋白質(zhì)非病毒載體qmIL2-SON2和具有腫瘤組織特異性的殺傷(毒素)基因真核表達(dá)型質(zhì)粒NfBS-MiniCMV-PEIIImut組成。蛋白非病毒載體由細(xì)胞結(jié)合肽qmIL2和DNA結(jié)合多肽SON2兩部分組成，并經(jīng)DNA重組與表達(dá)而成的靶向融合蛋白非病毒載體qmIL2-SON2。該融合蛋白中的DNA結(jié)合多肽SON2富含陽性氨基酸，帶正電，因而可以結(jié)合帶負(fù)電的DNA；本發(fā)明中使用SON2結(jié)合殺傷基因表達(dá)型重組質(zhì)粒NfBS-MiniCMV-PEIIImut，從而形成復(fù)合藥物。該融合蛋白中的qmIL2可與表面富集有IL2受體的腫瘤細(xì)胞及某些其表面也有IL2受體的正常細(xì)胞結(jié)合，并將這種DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物導(dǎo)入上述細(xì)胞。本發(fā)明還提供一種腫瘤組織特異性的調(diào)控序列NfkB-MiniCMVpromoter，該調(diào)控序列含有Nf-kB蛋白結(jié)合位點(diǎn)的編碼序列與削短的miniCMB啟動(dòng)子，它只能在特定類型腫瘤細(xì)胞內(nèi)含有的組成型活性的Nf-kB蛋白特異性地調(diào)控并激活下，才能驅(qū)動(dòng)其下游的殺傷基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而殺滅該類型的腫瘤細(xì)胞。但因正常細(xì)胞內(nèi)不存在組成型活性的Nf-kB蛋白，因此即使上述復(fù)合物被導(dǎo)入正常細(xì)胞，也因該正常細(xì)胞內(nèi)無殺傷蛋白質(zhì)(毒素)的表達(dá)而不會(huì)被殺傷。該設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確靶向殺滅一類腫瘤的目標(biāo)。本發(fā)明還提供了全部相關(guān)研究的結(jié)果，以及該非病毒載體與殺傷基因重組體組裝而成的復(fù)合物qmIL2-SON2/NfBS-MiniCMV-PEIIImut用于特異殺傷并致死IL2R富集腫瘤細(xì)胞、且不殺傷正常細(xì)胞的準(zhǔn)確靶向生物學(xué)活性的用途等研究結(jié)果。文檔編號(hào)A61K48/00GK101134110SQ20061011233公開日2008年3月5日申請(qǐng)日期2006年9月1日優(yōu)先權(quán)日2006年9月1日發(fā)明者盧圣棟,濤李,杜延平,湛王,路金芝,陳偉京申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所