專利名稱：大豆異黃酮提取物、其制備方法和包含它的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一和大豆異黃酮提取物、其制備方法以及包含所述大豆異黃酮提取物的藥物組合物。
背景技術(shù)：
異黃酮類化合物存在于多種植物體內(nèi)，是植物提取物領(lǐng)域中公認(rèn)的一類重要物質(zhì)。大豆尤其是異黃酮的重要資源。大豆為豆科植物大豆Glycine max(L.)merr.的成熟種子，其藥用價(jià)值始載于“神農(nóng)本草經(jīng)”。大豆異黃酮是大豆生長(zhǎng)中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，主要為3種甙元和由它們形成的9種糖苷。大豆中，異黃酮只有少量以游離形式存在，大部分以β-葡萄糖苷的形式存在。在異黃酮葡萄糖苷中，有一部分是葡萄糖上的C-6羥基被丙二?；〈€有一部分是葡萄糖上的C-6羥基被乙?；〈?2種成份見下表1和化學(xué)式1。
表1大豆異黃酮化合物的結(jié)構(gòu)式

化學(xué)式I目前大豆異黃酮通常使用乙醇水溶液提取，通過(guò)常規(guī)的分離方法如過(guò)濾、離心等進(jìn)行分離，通過(guò)溶劑萃取法、吸附法、超濾法、柱層析法、沉淀法、重結(jié)晶法、逆流色譜法和高壓液相色譜法等多種方法進(jìn)行純化。
CN1422855A和CN1422856A中公開了對(duì)大豆豆粕進(jìn)行乙醇提取并通過(guò)大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附來(lái)純化大豆異黃酮的方法，這些方法的缺點(diǎn)是(1)樹脂殘留；(2)解吸帶來(lái)有機(jī)溶劑殘留；(3)樹脂需要反復(fù)處理和再生。
CN1448394A中公開了一種純化大豆異黃酮的方法，包括將過(guò)80～100目篩的粉狀豆粕用具酸性的萃取劑食用酒精提取，減壓蒸餾法進(jìn)行濃縮，并將濃縮液用柱層析法。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，效率高，時(shí)間效率尤為明顯，單產(chǎn)效率大為提高，能耗大幅降低，有著顯著的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。但缺點(diǎn)是(1)硅膠柱層析不易工業(yè)化；(2)大量使用硅膠存在環(huán)保問(wèn)題；(3)產(chǎn)品成本高。
CN1449763A中公開了一種提取大豆異黃酮苷組合物的方法，包括將大豆用乙醇提取，經(jīng)濃縮，再用石油醚萃取，經(jīng)真空干燥得到干粉，再將干粉溶解后通過(guò)大孔吸附樹脂柱，得到洗脫液，經(jīng)真空干燥得干粉，再將干粉經(jīng)硅膠拌樣，硅膠柱層析，洗脫液濃縮，真空干燥得組合物。該法的缺點(diǎn)是(1)樹脂殘留；(2)有機(jī)溶劑殘留；(3)樹脂需要反復(fù)處理和再生；(4)硅膠柱層析不易工業(yè)化；(5)大量使用硅膠存在環(huán)保問(wèn)題；(6)生產(chǎn)周期長(zhǎng)，操作煩瑣；(7)產(chǎn)品成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種大豆異黃酮提取物、其制備方法以及包含所述大豆異黃酮提取物的藥物組合物。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面中，提供了一種大豆異黃酮提取物，其含有三種異黃酮苷化合物染料木苷、大豆苷、大豆黃苷，三種異黃酮苷化合物總量占提取物總重量的30～89重量％，其中染料木苷占提取物總重量的25～74重量％，大豆苷占提取物總重量的4～15重量％，大豆黃苷占提取物總重量的2.5重量％以下。
在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，其中染料木苷、大豆苷和大豆黃苷的總量占提取物總重量的50～89重量％，其中染料木苷優(yōu)選占提取物總重量的42～74重量％，大豆苷優(yōu)選占提取物總重量的8～15重量％，大豆黃苷優(yōu)選占提取物總重量的1.5重量％以下。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，本發(fā)明提供了包含前述大豆異黃酮提取物的藥物組合物。在該藥物組合物中，所述大豆異黃酮提取物可以單獨(dú)使用，或者和本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的有類似活性的成分聯(lián)合使用。另外，本發(fā)明的藥物組合物也可以包含藥學(xué)上可接受的載體。這些載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物配制成口服給藥、腔腸給藥、噴霧給藥、注射制劑、輸液制劑和透皮吸收的藥物制劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述口服給藥的藥物制劑選自片劑、膠囊、粉末、顆粒、晶體、溶液、懸液、湯、糖漿、酏劑、茶和咀嚼劑。這些藥物制劑均可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)來(lái)制備。
在本發(fā)明的第三個(gè)方面中，提供了一種制備前述的大豆異黃酮提取物的方法，包括下列步驟(a)將豆粕用乙醇提取，以得到乙醇提取液；(b)將乙醇提取液濃縮至比重為1.10～1.30，以得到流浸膏；(c)用水將流浸膏稀釋至含固形物濃度為20～40％(w/v)；(d)加入葡萄糖-δ-內(nèi)酯至濃度為0.05～0.3％(w/v)，并加熱至75～95℃持續(xù)30～90min以得到大豆異黃酮提取物。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，其中所用葡萄糖-δ-內(nèi)酯濃度為0.15％(w/v)。在本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(d)中的加熱是90℃持續(xù)60min。
在本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，還包括在步驟(d)后將沉淀用水洗滌的步驟。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將沉淀用水洗滌1～4次。
根據(jù)本發(fā)明的上述方面，本發(fā)明的一個(gè)有利之處是有效成分含量高。大豆中的異黃酮主要有游離型的苷元和結(jié)合型的糖苷兩類，而苷元在大豆中含量很少，主要是以苷的形式存在，有丙二酰染料木苷、丙二酰大豆苷、丙二酰大豆黃苷、乙酰染料木苷、乙酰大豆苷、乙酰大豆黃苷、染料木苷、大豆苷和大豆黃苷等。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道顯示染料木苷、大豆苷和大豆黃苷為主要有效成份，而丙二酰和乙酰苷的研究報(bào)道很少。本發(fā)明在絮凝的同時(shí)進(jìn)行加熱，并控制加熱條件使丙二酰基和乙?；能杖哭D(zhuǎn)化為各自相應(yīng)的苷。因此，在本發(fā)明的大豆異黃酮提取物中，染料木苷、大豆苷和大豆黃苷的總量占提取物總重量的最高為89重量％，其中染料木苷占提取物總重量的最高為74重量％，大豆苷占提取物總重量的最高為15重量％，大豆黃苷占提取物總重量的2.5重量％以下。
本發(fā)明的另一個(gè)有利之處是使用葡萄糖-δ-內(nèi)酯作為絮凝劑，一次絮凝就使大豆異黃酮的含量提高到30重量％以上。
本發(fā)明的又一有利之處是通過(guò)水洗可以使葡萄糖-δ-內(nèi)酯幾乎不殘留在大豆異黃酮中，并且更重要的是可以逐步提高沉淀物中大豆異黃酮苷的含量，水洗次數(shù)越多大豆異黃酮苷的純度越高。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)優(yōu)選實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明的各個(gè)方面和特征。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，這些實(shí)施例只是用于說(shuō)明目的，而不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍只受權(quán)利要求書的限制。在不背離權(quán)利要求書范圍的條件下。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面進(jìn)行各種修改和改進(jìn)，這些修改和改進(jìn)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
另外，需要注意的是，除非特別指明，下面實(shí)施例中所用的各種材料和試劑都是本領(lǐng)域中常用的材料和試劑，可以通過(guò)常規(guī)的商業(yè)途徑獲得；所用方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法。另外，除非特別指明，物質(zhì)的百分含量均為重量/重量百分比，即％(w/w)。
實(shí)施例1.轉(zhuǎn)化對(duì)三種異黃酮總含量的影響大豆中的異黃酮主要有游離型的苷元和結(jié)合型的糖苷兩類，而苷元在大豆中含量很少，主要是以苷的形式存在，有丙二酰染料木苷、丙二酰大豆苷、丙二酰大豆黃苷、乙酰染料木苷、乙酰大豆苷、乙酰大豆黃苷、染料木苷、大豆苷和大豆黃苷等。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道顯示染料木苷、大豆苷和大豆黃苷為主要有效成份，而丙二酰和乙酰苷的研究報(bào)道很少。我們?cè)诠に囇芯恐邪l(fā)現(xiàn)加熱可使丙二酰和乙酰苷分別轉(zhuǎn)化成各自的苷，因此我們采取在絮凝加熱過(guò)程中，控制加熱條件使丙二?；鸵阴；能杖哭D(zhuǎn)化為各自相應(yīng)的苷，從而提高有效成分的含量。
取大豆異黃酮浸膏200g(含固形物72％)，加水280g使含固形物為30％。另稱取葡萄糖-δ-內(nèi)酯0.75g，加10ml水，加熱使溶解，在不斷攪拌下緩緩加入浸膏液中，放置30分鐘，離心(3500rpm/min)，棄去上清液，得沉淀(濕)8.64g。在60℃下減壓干燥后得干浸膏2.16g。測(cè)定大豆異黃酮含量為染料木苷18.5％，大豆苷5.6％，大豆黃苷1.5％，三種異黃酮苷總含量為25.6％。
取大豆異黃酮浸膏200g(含固形物72％)，加水280g使含固形物為30％。另稱取葡萄糖-δ-內(nèi)酯(食品添加劑GB7657-87，購(gòu)于浙江仙居?xùn)|興化工廠)0.75g，加10ml水，加熱使溶解，在不斷攪拌下緩緩加入浸膏中，在90℃下保溫60分鐘后，放置到室溫，離心(3500rpm/min)，棄去上清液，得沉淀(濕)9.02g。在60℃下減壓干燥后得干浸膏2.35g。測(cè)定大豆異黃酮含量為染料木苷24.5％，大豆苷7.5％，大豆黃苷1.8％，三種異黃酮苷總含量為33.8％。
從上面可以看出不進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，絮凝后沉淀中三種異黃酮苷總含量為25.6％；在絮凝的同時(shí)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，絮凝后沉淀中三種異黃酮苷總含量為33.8％?？梢钥闯鼋?jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后三種異黃酮總含量提高了約32％。
實(shí)施例2水洗次數(shù)對(duì)純度的影響絮凝后得到的大豆總異黃酮沉淀含量在30％左右，經(jīng)過(guò)深入研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)水洗可以逐步提高沉淀物中大豆異黃酮苷的含量。水洗次數(shù)越多大豆異黃酮苷的純度越高。
稱取按前述條件進(jìn)行絮凝后得到大豆異黃酮粗提物，每次加10倍量的水洗滌，離心(3500r/min)，沉淀60℃減壓干燥，測(cè)定大豆異黃酮含量，結(jié)果如下(表2)
表2水洗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2(續(xù))水洗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，三次平行試驗(yàn)表明，絮凝后沉淀大豆異黃酮總含量約30％左右，水洗一次大豆異黃酮總含量約45％左右，水洗二次后大豆異黃酮總含量約65％左右，水洗三次大豆異黃酮總含量約72％左右，水洗四次大豆異黃酮總含量約84％左右，水洗五次大豆異黃酮總含量約86％左右。第五次水洗純度基本不再上升多少，但樣品損失卻較多，所以本發(fā)明制備工藝以水洗四次以內(nèi)為宜，可以根據(jù)需求大豆異黃酮純度為多少，確定水洗幾次來(lái)獲得不同級(jí)別的大豆異黃酮產(chǎn)品，比如，需要30％純度的大豆異黃酮產(chǎn)品，可以直接絮凝后干燥即可；需要40％純度的大豆異黃酮產(chǎn)品，可以水洗一次后干燥即可；需要50％純度的大豆異黃酮產(chǎn)品，可以用水洗二次的產(chǎn)品和水洗一次的產(chǎn)品勾兌；需要60％純度的大豆異黃酮產(chǎn)品，可以水洗二次后干燥即可；需要70％純度的大豆異黃酮產(chǎn)品，可以水洗三次后干燥即可；需要80％純度的大豆異黃酮產(chǎn)品，可以水洗四次后干燥即可。
實(shí)施例3制備方案1取東北大豆30.4噸，提取大豆油后，得大豆粕約24噸。連續(xù)進(jìn)樣，每小時(shí)1噸，用80％食用酒精36噸，酒精加入量為每小時(shí)1.5噸，使用環(huán)型浸出器，65℃連續(xù)提取。提取液過(guò)濾后，連續(xù)通過(guò)兩級(jí)60m2/L的膜式蒸發(fā)器后進(jìn)入10m3的釜式減壓濃縮罐，進(jìn)一步濃縮至比重約1.20。
取絮凝劑約9kg溶于15L去離子水中，加入釜式濃縮罐中，進(jìn)行攪拌混勻，然后加入去離子水調(diào)固形物含量為30％，進(jìn)一步攪拌混勻后加熱至90℃，保溫30分鐘后放置降溫。
降溫至15℃以下，使用SS-800型離心機(jī)進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)速1600rpm，離心20分鐘，得沉淀A，放置冷藏。上清液作為進(jìn)一步提取大豆皂甙和大豆低聚糖的原料，具體操作和方法略。
取沉淀A五份(濕重1200kg)，加入10倍體積的去離子水，攪勻10分鐘，使用SS-800型離心機(jī)進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為1600rpm，離心20分鐘，沉淀再用10倍體積的去離子水洗滌一次，得沉淀B(濕重360kg)。
取沉淀B，加入5倍量去離子水，攪拌混勻，過(guò)150目篩，濾液放入1.5m3的罐中進(jìn)行滅菌(90℃，30分鐘)，滅菌后進(jìn)行噴霧干燥，得粉末過(guò)100目篩。最后裝入藥品包裝用聚乙烯膜的袋中，稱重為84kg，提取率為0.055％。含量測(cè)定三種異黃酮苷化合物約占提取物的65％，其中染料木苷約占提取物的54％，大豆苷約占提取物的10％，大豆黃苷約占提取物的1％。
實(shí)施例4制備方案2取東北大豆30.4噸，提取大豆油后，得大豆粕約24噸。連續(xù)進(jìn)樣，每小時(shí)1噸，用60％食用酒精36噸，酒精加入量為每小時(shí)1.5噸，使用環(huán)型浸出器，45℃連續(xù)提取。提取液過(guò)濾后，連續(xù)通過(guò)兩級(jí)60m2/L的膜式蒸發(fā)器后進(jìn)入10m3的釜式減壓濃縮罐，進(jìn)一步濃縮至比重約1.10。
取絮凝劑約4kg溶于7L去離子水中，加入釜式濃縮罐中，進(jìn)行攪拌混勻，然后加入去離子水調(diào)固形物含量為40％，進(jìn)一步攪拌混勻后加熱至75℃，保溫60分鐘后放置降溫。
降溫至15℃以下，使用SS-800型離心機(jī)進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)速1600rpm，離心20分鐘，得沉淀A(濕重200kg)，取沉淀A，加入5倍量去離子水，攪拌混勻，過(guò)150目篩，濾液放入1.5m3的罐中進(jìn)行滅菌(90℃，30分鐘)，滅菌后進(jìn)行噴霧干燥，得粉末過(guò)100目篩。最后裝入藥品包裝用聚乙烯膜的袋中，稱重為50kg，提取率為0.164％。含量測(cè)定三種異黃酮苷化合物約占提取物的30％，其中染料木苷約占提取物的25％，大豆苷約占提取物的4％，大豆黃苷約占提取物的2％。
實(shí)施例5制備方案3取東北大豆30.4噸，提取大豆油后，得大豆粕約24噸。連續(xù)進(jìn)樣，每小時(shí)1噸，用80％食用酒精36噸，酒精加入量為每小時(shí)1.5噸，使用環(huán)型浸出器，室溫連續(xù)提取。提取液過(guò)濾后，連續(xù)通過(guò)兩級(jí)60m2/L的膜式蒸發(fā)器后進(jìn)入10m3的釜式減壓濃縮罐，進(jìn)一步濃縮至比重約1.30。
取絮凝劑約18kg溶于30L去離子水中，加入釜式濃縮罐中，進(jìn)行攪拌混勻，然后加入去離子水調(diào)固形物含量為20％，進(jìn)一步攪拌混勻后加熱至95℃，保溫90分鐘后放置降溫。
降溫至15℃以下，使用SS-800型離心機(jī)進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)速1600rpm，離心20分鐘，得沉淀A，放置冷藏。上清液作為進(jìn)一步提取大豆皂甙和大豆低聚糖的原料，具體操作和方法略。
取沉淀A三份(濕重750kg)，加入10倍體積的去離子水，攪勻10分鐘，使用SS-800型離心機(jī)進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為1600rpm，離心20分鐘，沉淀再用5倍體積的去離子水洗滌一次，得沉淀B(濕重280kg)。
取沉淀B，加入5倍量去離子水，攪拌混勻，過(guò)150目篩，濾液放入1.5m3的罐中進(jìn)行滅菌(90℃，30分鐘)，滅菌后進(jìn)行噴霧干燥，得粉末過(guò)100目篩。最后裝入藥品包裝用聚乙烯膜的袋中，稱重為68kg，提取率為0.075％。含量測(cè)定三種異黃酮苷化合物約占提取物的50％，其中染料木苷約占提取物的42％，大豆苷約占提取物的8％，大豆黃苷約占提取物的1％。
實(shí)施例6制備方案4取東北大豆30.4噸，提取大豆油后，得大豆粕約24噸。連續(xù)進(jìn)樣，每小時(shí)1噸，用90％食用酒精36噸，酒精加入量為每小時(shí)1.5噸，使用環(huán)型浸出器，室溫連續(xù)提取。提取液過(guò)濾后，連續(xù)通過(guò)兩級(jí)60m2/L的膜式蒸發(fā)器后進(jìn)入10m3的釜式減壓濃縮罐，進(jìn)一步濃縮至比重約1.20。
取絮凝劑約9kg溶于15L去離子水中，加入釜式濃縮罐中，進(jìn)行攪拌混勻，然后加入去離子水調(diào)固形物含量為30％，進(jìn)一步攪拌混勻后加熱至95℃，保溫30分鐘后放置降溫。
降溫至15℃以下，使用SS-800型離心機(jī)進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)速1600rpm，離心20分鐘，得沉淀A，放置冷藏。上清液作為進(jìn)一步提取大豆皂甙和大豆低聚糖的原料，具體操作和方法略。
取沉淀A五份(濕重1300kg)，加入10倍體積的去離子水，攪勻10分鐘，使用SS-800型離心機(jī)進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為1600rpm，離心20分鐘，沉淀再用10倍體積的去離子水洗滌二次，得沉淀B(濕重220kg)。
取沉淀B，加入5倍量去離子水，攪拌混勻，過(guò)150目篩，濾液放入1.5m3的罐中進(jìn)行滅菌(90℃，30分鐘)，滅菌后進(jìn)行噴霧干燥，得粉末過(guò)100目篩。最后裝入藥品包裝用聚乙烯膜的袋中，稱重為55kg，提取率為0.036％。含量測(cè)定三種異黃酮苷化合物約占提取物的72％，其中染料木苷約占提取物的60％，大豆苷約占提取物的11％，大豆黃苷約占提取物的1％。
實(shí)施例7制備方案5取東北大豆30.4噸，提取大豆油后，得大豆粕約24噸。連續(xù)進(jìn)樣，每小時(shí)1噸，用80％食用酒精36噸，酒精加入量為每小時(shí)1.5噸，使用環(huán)型浸出器，室溫連續(xù)提取。提取液過(guò)濾后，連續(xù)通過(guò)兩級(jí)60m2/L的膜式蒸發(fā)器后進(jìn)入10m3的釜式減壓濃縮罐，進(jìn)一步濃縮至比重約1.20。
取絮凝劑約9kg溶于15L去離子水中，加入釜式濃縮罐中，進(jìn)行攪拌混勻，然后加入去離子水調(diào)固形物含量為30％，進(jìn)一步攪拌混勻后加熱至90℃，保溫30分鐘后放置降溫。
降溫至15℃以下，使用SS-800型離心機(jī)進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)速1600rpm，離心20分鐘，得沉淀A，放置冷藏。上清液作為進(jìn)一步提取大豆皂甙和大豆低聚糖的原料，具體操作和方法略。
取沉淀A五份(濕重1100kg)，加入10倍體積的去離子水，攪勻10分鐘，使用SS-800型離心機(jī)進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為1600rpm，離心20分鐘，沉淀再用10倍體積的去離子水洗滌三次，得沉淀B(濕重130kg)。
取沉淀B，加入5倍量去離子水，攪拌混勻，過(guò)150目篩，濾液放入1.5m3的罐中進(jìn)行滅菌(90℃，30分鐘)，滅菌后進(jìn)行噴霧干燥，得粉末過(guò)100目篩。最后裝入藥品包裝用聚乙烯膜的袋中，稱重為33kg，提取率為0.022％。含量測(cè)定三種異黃酮苷化合物約占提取物的85％，其中染料木苷約占提取物的70％，大豆苷約占提取物的14％，大豆黃苷約占提取物的1％。
實(shí)施例8制備方案6取東北大豆30.4噸，提取大豆油后，得大豆粕約24噸。連續(xù)進(jìn)樣，每小時(shí)1噸，用80％食用酒精36噸，酒精加入量為每小時(shí)1.5噸，使用環(huán)型浸出器，室溫連續(xù)提取。提取液過(guò)濾后，連續(xù)通過(guò)兩級(jí)60m2/L的膜式蒸發(fā)器后進(jìn)入10m3的釜式減壓濃縮罐，進(jìn)一步濃縮至比重約1.20。
取絮凝劑約9kg溶于15L去離子水中，加入釜式濃縮罐中，進(jìn)行攪拌混勻，然后加入去離子水調(diào)固形物含量為30％，進(jìn)一步攪拌混勻后加熱至90℃，保溫30分鐘后放置降溫。
降溫至15℃以下，使用SS-800型離心機(jī)進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)速1600rpm，離心20分鐘，得沉淀A，放置冷藏。上清液作為進(jìn)一步提取大豆皂甙和大豆低聚糖的原料，具體操作和方法略。
取沉淀A五份(濕重1260kg)，加入10倍體積的去離子水，攪勻10分鐘，使用SS-800型離心機(jī)進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為1600rpm，離心20分鐘，沉淀再用10倍體積的去離子水洗滌四次，得沉淀B(濕重90kg)。
取沉淀B，加入5倍量去離子水，攪拌混勻，過(guò)150目篩，濾液放入1.5m3的罐中進(jìn)行滅菌(90℃，30分鐘)，滅菌后進(jìn)行噴霧干燥，得粉末過(guò)100目篩。最后裝入藥品包裝用聚乙烯膜的袋中，稱重為22kg，提取率為0.014％。含量測(cè)定三種異黃酮苷化合物約占提取物的87％，其中染料木苷約占提取物的71％，大豆苷約占提取物的15％，大豆黃苷約占提取物的1％。
實(shí)施例9含大豆異黃酮的片劑的制備配方每1000片配方組成如下大豆異黃酮提取物 140.0g預(yù)膠化淀粉 155.0g交聯(lián)聚維酮 80.0g羧甲基淀粉鈉 20.0g5％PVP(w/v) 適量微粉硅膠 3.0g硬脂酸鎂 5.0g歐巴代 適量按選定配方、工藝進(jìn)行中試，取大豆異黃酮原料1400g；預(yù)膠化淀粉1550g；交聯(lián)聚維酮800g；羧甲基淀粉鈉200g，分別過(guò)100目篩，準(zhǔn)確稱量后過(guò)80目篩混合三遍，用5％PVP(w/v，50％乙醇配制)制軟材，16目篩制粒，在55℃烘箱內(nèi)干燥，整粒(控制顆粒水分含量在3％左右)，將硬脂酸鎂50g與微粉硅膠30g過(guò)80目篩，與顆?；靹蚝螅瑝浩?，理論投藥量為10000片，成品為9600片，包水溶性白色薄膜衣。包衣材料歐巴代購(gòu)于上海卡樂(lè)康包衣技術(shù)有限公司(產(chǎn)品代號(hào)為85G68918)。
實(shí)施例10大豆異黃酮提取物預(yù)防給藥對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型的影響采用去卵巢大鼠作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，60只10月齡雌性Wistar大鼠，隨機(jī)取出10只為假手術(shù)對(duì)照組(SH)，其余大鼠摘除雙側(cè)卵巢并隨機(jī)分為5組，每組10只切除卵巢組(OVX)、切除卵巢加大豆異黃酮提取物低劑量組(L，20mg·kg-1·d-1)、切除卵巢加大豆異黃酮提取物中劑量組(M，40mg·kg-1·d-1)、切除卵巢加大豆異黃酮提取物高劑量組(H，80mg·kg-1·d-1)和切除卵巢加尼爾雌醇組(NE，30μg·kg-1·d-1)。灌胃給藥12周后處死并檢測(cè)指標(biāo)。
結(jié)果表明，與SH組相比，OVX第4腰椎骨、股骨骨密度及骨小梁面積和數(shù)目明顯下降(P＜0.05)，而骨小梁分隔距離、血清骨鈣素(BGP)含量及堿性磷酸酶(AKP)活性明顯升高(P＜0.05)，與OVX組相比，大豆異黃酮各劑量組及NE組以上各指標(biāo)均無(wú)顯著差異，但有明顯改善，與SH組相比無(wú)顯著差異(P＜0.05)；與SH組比較，OVX組大鼠24h空腹尿鈣、尿磷值均明顯升高(P＜0.05)，大豆異黃酮中、高劑量及NE給藥可顯著降低OVX大鼠尿鈣值(P＜0.05)；去卵巢后大鼠體重明顯增加，其中OVX組顯著高于SH組(P＜0.05)；與OVX組相比，大豆異黃酮各劑量組子宮濕重?zé)o明顯升高(P＞0.05)，而NE組明顯增加(P＜0.05)；與OVX組相比，大豆異黃酮L組及NE組腹部脂肪濕重?zé)o明顯變化，但M、H組顯著低于NE組(P＜0.05)因此，本發(fā)明的大豆異黃酮提取物可有效抑制去卵巢引起的骨量丟失和骨小梁面積減少；有效抑制去卵巢引起的骨轉(zhuǎn)換，且不表現(xiàn)出明顯的子宮效應(yīng)。本發(fā)明的大豆異黃酮提取物拮抗去卵巢大鼠骨丟失的有效劑量為40mg·kg-1·d-1，依據(jù)大鼠與人體表面積折算系數(shù)，推薦臨床有效劑量為6.4mg·kg-1·d-1。
實(shí)施例11大豆異黃酮提取物治療給藥對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的影響。
為了觀察本發(fā)明的大豆異黃酮提取物(SI)治療給藥對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型的作用，為其用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的臨床研究提供科學(xué)、合理的依據(jù)，通過(guò)摘除6月齡成年大鼠雙側(cè)卵巢建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，通過(guò)骨密度(BMD)、骨生物力學(xué)、骨組織形態(tài)學(xué)等骨治療指標(biāo)、血清及尿的骨代謝指標(biāo)以及體重及子宮系數(shù)指標(biāo)，分別以仙靈骨葆膠囊(GB)和尼爾雌醇片(NE)作為中、西藥對(duì)照，對(duì)大豆異黃酮提取物20、40、80mg·kg-1·d-1三個(gè)劑量組的治療作用進(jìn)行研究。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OVX組大鼠腰椎、股骨GMD、股骨Wash及Ca、Pi含量與SH組相比明顯降低(P＜0.05)，SI中、高劑量可顯著提高此5項(xiàng)指標(biāo)(P＜0.05或P＜0.01)。生物力學(xué)三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OVX組大鼠股骨最大載荷比SH組有顯著降低(P＜0.05)，與OVX組相比，SI中、高劑量顯著升高(P＜0.05)。故形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)中，OVX大鼠股骨骨小梁面積百分比(Tb.Tr(％))(P＜0.05)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)比SH組顯著降低(P＜0.01)，而骨小梁間距(Tb.Sp)明顯升高(P＜0.01)，SI高、中劑量可顯著改善上述3指標(biāo)(P＜0.05)。血清骨代謝指標(biāo)顯示，OVX組血清BGP含量與SH組相比未有顯著性變化(P＞0.05)，而血清1，25-(OH)2D3、Ca和Pi含量明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，與OVX相比，SI高、中劑量可顯著提高血清BGP、Ca和1，25-(OH)2D3含量(P＜0.05或P＜0.01)，高劑量組升高1，25-(OH)2D3含量的作用強(qiáng)于GB組和NE組(P＜0.05)。與SH組相比，OVX組尿DPD/Cr有顯著性升高(P＜0.01)，SI中、高劑量、GB組和NE組可使該比值顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，SI高劑量組尿DPD/Cr顯著低于GB組(P＜0.05)。體重與子宮系數(shù)結(jié)果分析表明，相比于SH組，OVX組大鼠的體重顯著增加(P＜0.05)，而子宮系數(shù)顯著下降(P＜0.01)，與OVX組相比，SI高、中劑量可使大鼠體重明顯降低，而不顯著升高子宮系數(shù)(P＞0.05)，SI三個(gè)劑量組的子宮系數(shù)顯著低于NE組(P＜0.05)。
因此，本發(fā)明的大豆異黃酮提取物可拮抗大鼠去卵巢引起的骨丟失，顯著升高去卵巢大鼠的股骨最大載荷，改善去卵巢大鼠骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸鈣吸收，并有效抑制骨吸收，同時(shí)無(wú)明顯子宮效應(yīng)。本發(fā)明的大豆異黃酮提取物拮抗去卵巢大鼠骨丟失的有效劑量為40mg·kg-1·d-1，依據(jù)大鼠與人體表面積折算系數(shù)，推薦臨床有效劑量為6.4mg·kg-1·d-1。
實(shí)施例12大豆異黃酮提取物治療給藥對(duì)維甲酸致大鼠骨質(zhì)疏松模型的影響為了觀察本發(fā)明的大豆異黃酮提取物(SI)對(duì)維甲酸致大鼠實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松癥的治療效果，為其用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的臨床研究提供科學(xué)、合理的依據(jù)，用70mg/kg維甲酸誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松癥，通過(guò)骨密度(BMD)、骨生物力學(xué)、骨組織形態(tài)學(xué)等骨治療指標(biāo)、血清及尿的骨代謝指標(biāo)以及體重及子宮系數(shù)指標(biāo)，分別以仙靈骨葆膠囊(GB)和尼爾雌醇片(NE)作為中、西藥對(duì)照，對(duì)大豆異黃酮提取物20、40、80mg·kg-1·d-1三個(gè)劑量組的治療作用進(jìn)行研究。
模型組(RA)大鼠腰椎BMD明顯低于正常對(duì)照組(CON)，SI高、中劑量可顯著提高該指標(biāo)(P＜0.05)。生物力學(xué)三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RA組大鼠股骨最大載荷與其他各組比較，雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均小于其他各組。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)中，大鼠股骨骨小梁面積百分比(Tb.Tr(％))(P＜0.05)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)比SH組顯著降低(P＜0.01)，而骨小梁間距(Tb.Sp)明顯升高(P＜0.01)，SI高、中劑量可顯著改善上述3指標(biāo)(P＜0.05)。血清骨代謝指標(biāo)中，RA組血清BGP含量及AKP活性均比CON組顯著升高(P＜0.01)，而血清1，25-(OH)2D3、Ca和Pi含量明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，SI高、中劑量可使BGP含量及AKP活性顯著回降，同時(shí)顯著提高血清1，25-(OH)2D3含量(P＜0.01)，作用強(qiáng)于GB和NE組(P＜0.05)。與CON組相比，RA組尿DPD/Cr有顯著性升高(P＜0.01)，SI中、高劑量可使該比值顯著降低(P＜0.05)，高劑量作用效果優(yōu)于GB和NE組(P＜0.05)。
因此，本發(fā)明的大豆異黃酮提取物可拮抗維甲酸所致的骨丟失，改善實(shí)驗(yàn)大鼠骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)大鼠腸鈣吸收，并有效抑制維甲酸誘導(dǎo)的骨鈣高轉(zhuǎn)化態(tài)。本發(fā)明的大豆異黃酮提取物拮抗去卵巢大鼠骨丟失的有效劑量為40mg·kg-1·d-1，依據(jù)大鼠與人體表面積折算系數(shù)，推薦臨床有效劑量為6.4mg·kg-1·d-1。
實(shí)施例13毒性研究犬及大鼠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)及一般藥理學(xué)研究結(jié)果均提示本發(fā)明的大豆異黃酮提取物安全范圍較寬，犬長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的安全劑量為100mg·kg-1·d-1，依據(jù)犬與人體表面積折算系數(shù)，推算臨床安全劑量最大為30mg·kg-1·d-1。
權(quán)利要求
1.一種大豆異黃酮提取物，其含有染料木苷、大豆苷和大豆黃苷，三者總量占提取物總重量的30～89重量％，其中染料木苷占提取物總重量的25～74重量％，大豆苷占提取物總重量的4～15重量％，大豆黃苷占提取物總重量的2.5重量％以下。
2.權(quán)利要求1的大豆異黃酮提取物，其中染料木苷、大豆苷和大豆黃苷總量占提取物總重量的50～89重量％。
3.權(quán)利要求1或2的大豆異黃酮提取物，其中染料木苷占提取物總重量的42～74重量％。
4.權(quán)利要求1或2的大豆異黃酮提取物，其中大豆苷占提取物總重量的8～15重量％。
5.權(quán)利要求1或2的大豆異黃酮提取物，其中大豆黃苷占提取物總重量的1.5重量％以下。
6.包含前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的大豆異黃酮提取物的藥物組合物。
7.權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其配制成口服給藥、腔腸給藥、噴霧給藥、注射制劑、輸液制劑和透皮吸收的藥物制劑。
8.權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中口服給藥的藥物制劑選自片劑、膠囊、粉末、顆粒、晶體、溶液、懸液、湯、糖漿、酏劑、茶和咀嚼劑。
9.一種制備權(quán)利要求1所述的大豆異黃酮提取物的方法，包括下列步驟(a)將豆粕用乙醇提取，以得到乙醇提取液；(b)將乙醇提取液濃縮至比重為1.10～1.30，以得到流浸膏；(c)用水將流浸膏稀釋至含固形物濃度為20～40％(w/w)；(d)加入葡萄糖-δ-內(nèi)酯至濃度為0.05～0.3％(w/v)，并加熱至75～95℃持續(xù)30～90min以得到大豆異黃酮提取物。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所用葡萄糖-δ-內(nèi)酯濃度為0.15％(w/v)。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中步驟(d)中的加熱是90℃持續(xù)60min。
12.權(quán)利要求9-11中任意一項(xiàng)的方法，還包括在步驟(d)后將沉淀用水洗滌的步驟。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中將沉淀用水洗滌1～4次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大豆異黃酮提取物，其含有三種異黃酮苷化合物染料木苷、大豆苷、大豆黃苷，三種異黃酮苷化合物總量占提取物總重量的30～89重量％，其中染料木苷占提取物總重量的25～74重量％，大豆苷占提取物總重量的4～15重量％，大豆黃苷占提取物總重量的2.5重量％以下。此外，本發(fā)明還涉及包含該大豆異黃酮提取物的藥物組合物，以及該大豆異黃酮提取物的制備方法。
文檔編號(hào)A61K36/185GK1876671SQ20061009935
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月17日
發(fā)明者廖幼鳴, 王海燕, 劉林, 劉曄, 趙穎濤, 王紅, 楊福艷 申請(qǐng)人:北京寶泰寧堂生物技術(shù)有限公司