專利名稱：磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白納米囊及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種采用納米材料包裹內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白的納米囊及其制備方法技術領域。
背景技術：
血液是人體的重要組成部分，大量失血會造成代謝嚴重障礙乃至危及生命，輸血已經(jīng)成為不可缺少的臨床急救措施和醫(yī)療手段。近年來，全世界對輸血需求量日益增加，但是由于人類血液血型復雜，輸血反應難以克服；天然血液的保存期短，加之目前輸血傳播傳染病威脅及獻血員數(shù)量不足，安全有效的血源日益緊缺。因此，人血液代用品已成為國際關注的研究熱點而被列為二十一世紀的重大研究開發(fā)領域。
血紅蛋白衍生物類紅細胞代用品包括化學修飾血紅蛋白(Hb)，基因重組Hb和脂質體包囊Hb等幾種類型，而化學修飾Hb又分成內(nèi)交聯(lián)Hb、多聚Hb和高分子化合物共軛Hb。
內(nèi)交聯(lián)Hb由于該制品容易與血管內(nèi)皮細胞分泌的一氧化氮(NO)結合引起血壓上升，因此該類制品已停止臨床應用。例如，Baxter公司的產(chǎn)品DCLHb(采用雙阿司匹林內(nèi)交聯(lián)Hb)和Haemosol公司的Haemolink(采用棉籽糖內(nèi)外交聯(lián)Hb，內(nèi)含較高濃度的分子量為64000的血紅蛋白單體)。
基因重組Hb由于該制品可以解決Hb來源問題，不受輸血相關傳染病的影響，因此具有較好的前景。但由于目前技術水平的限制，重組Hb在細菌或真核細胞中的有效表達率較低，因此造成Hb純化的費用過大，影響了該制品的研發(fā)。Baxter公司開發(fā)的產(chǎn)品Optro(rHb2.0)，通過基因突變方法改變了Hb空間結構，使重組Hb不容易與NO結合，目前該公司停止了該產(chǎn)品的臨床應用，對此還未作任何說明。
多聚Hb在目前所有的紅細胞代用品中該類制品是最有希望獲得FDA批準的產(chǎn)品，Northfield公司產(chǎn)品Polyheme(多聚人Hb)已完成了III期臨床，Biopure公司的產(chǎn)品Hemopure(多聚牛Hb)正在美國申報生物制品市場準入執(zhí)照(BLA)，該制品已經(jīng)獲得批準用于動物治療以及在南非獲得批準用于外科手術治療。隨著對紅細胞代用品研究的進一步深入，該制品也將面臨一些新的挑戰(zhàn)。
高分子化合物共軛Hb該制品與同類產(chǎn)品比較具有較長的血漿半衰期(48小時)，低P50值(血紅蛋白氧飽和度達到50％時溶液中的氧分壓值)和高粘度等特點。Apex公司產(chǎn)品PHP(聚氧乙烯共軛人Hb)已開展治療敗血癥的III期臨床。Sangart公司的產(chǎn)品Hemospan(MP4)，雖然還處于臨床前研究，但已引起人們的廣泛關注。
雖然經(jīng)過不斷的努力，第一代血紅蛋白代用品的研發(fā)已經(jīng)取得了令人矚目的進展，但所有這些制品都未克服血紅蛋白在血漿中容易發(fā)生自氧化的缺陷。因此國外已將研究重點轉移到微囊包裹血紅蛋白技術開發(fā)，特別是加強了對生物降解納米材料包囊血紅蛋白(人工紅細胞)的研發(fā)。與傳統(tǒng)紅細胞代用品相比，生物可降解多聚物包裹的血紅蛋白納米囊具有以下特點①采用的新型納米材料在體內(nèi)可降解成水和二氧化碳，降解速率可以通過改變多聚物的種類，聚合物分子量和分子形狀進行調(diào)節(jié)；②多聚物比脂質體牢固、通透性好、膜的用量少，具有透過葡萄糖和其他親水小分子能力；③血紅蛋白納米囊的直徑控制在80～150納米，只有天然紅細胞的1/60左右大小，在發(fā)生血管梗阻等循環(huán)障礙時，可以輸送生命賴以生存的氧；④不容易通過血管內(nèi)皮的縫隙進入組織間質，克服了無基質血紅蛋白分子與NO結合造成的血管收縮，血壓上升的危害；⑤可以將超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、高鐵血紅蛋白還原酶等影響血紅蛋白攜氧能力的酶包含在納米囊中；⑥可將血紅蛋白納米囊制備成冷凍干粉，便于儲存和運輸。
目前已有一些文獻報道了采用生物可降解材料包囊血紅蛋白的方法，但這些方法由于需要特殊的設備，操作復雜，成本昂貴而無法進一步推廣到工業(yè)化制備包囊血紅蛋白制品。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，本發(fā)明的目的在于提供一種采用生物可降解材料殼聚糖和海藻酸鈉包裹磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白的納米囊。
本發(fā)明還有一個目的就是提供一種簡單、快速制備上述納米囊的方法。
殼聚糖(chitosan)是通過甲殼素chitin脫乙?；苽涠傻奶烊桓叻肿又辨湺嗵?，化學名稱為(1-4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖。海藻酸鈉(sodium alginate)是存在于褐藻類中的天然高分子，從其結構上看是由β-1，4結構的D型甘露糖醛酸的鈉鹽(M)和α-1，4結構的L型古羅糖醛酸的鈉鹽(G)共聚而成。不同種類的海藻酸鈉所含的(M)和(G)片段比例不同，通常M/G比介于0.4～1.9。
由于殼聚糖分子鏈上有大量的伯氨基，在一定pH條件下有如下平衡存在
當pH＜pKa時，分子鏈上的主要以-NH3+形式存在，帶正電荷。
當pH＞pKa時，分子鏈上的主要以-NH2形式存在，不帶電荷。
海藻酸鈉的分子鏈上有大量的羧基，在一定pH條件下有如下平衡存在
當pH＜pKa時，分子鏈上的主要以-COOH形式存在，不帶電荷。
當pH＞pKa時，分子鏈上的主要以-COO-形式存在，帶負電荷。
所以在合適的pH條件下殼聚糖和海藻酸鈉可以通過正、負電荷吸引結合。由于這種靜電相互作用不涉及熱交聯(lián)過程中的高溫及化學交聯(lián)過程中的共價鍵形成，不會影響包載物的性質，因此特別適于大分子蛋白或細胞的包載。
本發(fā)明所述的磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白的納米囊，包括納米殼聚糖和海藻酸鈉包裹材料及磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白。
所述的用于包囊的血紅蛋白經(jīng)過磷酸吡哆醛修飾，具有良好的釋氧能力，P50值在28～32mmHg之間。
所述的包裹有磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白的納米囊直徑為60-120nm，只有天然紅細胞的幾十分之一左右大小，在發(fā)生血管梗阻等循環(huán)障礙時，可以輸送生命賴以生存的氧。
磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白納米囊的制備方法，其步驟是將磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白加入到含氯化鈣的海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻后再加入殼聚糖溶液，繼續(xù)攪拌均勻后采用濾膜去除未形成包囊的殼聚糖、海藻酸鈉和血紅蛋白，并進一步濃縮、洗滌，最后獲得的包囊血紅蛋白溶液用除菌過濾器過濾。
所述的磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白的濃度為0.1～0.5g/L，血紅蛋白濃度越高，形成的包囊粒經(jīng)越大，當然血紅蛋白濃度太低也會使包囊效率降低。
采取用殼聚糖滴入海藻酸鈉的方式形成納米囊，磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白與海藻酸鈉的質量比為1∶(2～10)，最佳的質量比為1∶5；海藻酸鈉和殼聚糖質量比為5∶1～1∶1，優(yōu)選為2∶1；氯化鈣在溶液中的最終濃度在0.001～0.01g/L之間。在上述配比下可形成穩(wěn)定的血紅蛋白納米囊，否則會使直徑增大，甚至形成凝膠。為了控制包囊血紅蛋白的直徑，本發(fā)明所有反應溶液pH控制在3.0～5.5之間，當pH增大時，所形成的微囊粒經(jīng)也相應變大，考慮到血紅蛋白在酸性環(huán)境下容易生成高鐵血紅蛋白，因此pH也不能過低。
本發(fā)明去除未形成包囊的殼聚糖、海藻酸鈉、血紅蛋白時根據(jù)最后需要的包囊粒徑進行選擇，最好采用膜孔徑為10kD的超濾膜；洗滌液采用醫(yī)用乳酸林格氏液或其它常用的洗滌液，最后獲得的包囊血紅蛋白溶液用0.22μm除菌過濾器過濾即可。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明所述的磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白納米囊直徑為60-120nm，具有良好的攜氧能力和生物相容性，對各種血液成分無不良影響；制備時沒有使用有機溶劑，無任何毒性，并且所用的納米包裹材料易分解。本發(fā)明的制備方法簡單、快速，可望大規(guī)模實際應用。


圖1是純化血紅蛋白高效液相檢測圖，橫坐標是時間(分鐘)，縱坐標是蛋白吸光度圖2是磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白納米囊電鏡掃描3是磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白納米囊原子力顯微鏡圖具體實施方式
以下將通過具體實施方式
的形式再對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅局限于以下的具體實施方式
。
1.血紅蛋白的純化取庫存過期全血一袋，分裝在50ml塑料離心管內(nèi)，3500rpm離心10min。用玻璃滴管吸去血漿部分，并且加入等體積生理鹽水混勻后3500rpm離心10min，重復上述步驟3次。將上述所得洗滌紅細胞按體積比1∶9加入水，混勻后置于4℃冰箱內(nèi)過夜。上述溶血液以10000rpm(8600g)離心50min。取上清血紅蛋白溶液，棄去沉淀物。上清溶液0.22μm除菌過濾后存于4℃冰箱。將上述所得血紅蛋白溶液以體積比1∶2加入0.1M Tris-HCl(pH8.00)調(diào)整pH后上離子交換柱。并以含0.1M NaCl Tris-HCl(pH8.00)梯度洗脫。收集洗脫液，棄去前后3％體積溶液。血紅蛋白收集液進行30kD膜超濾，加入0.1M Tris-HCl(pH7.40)循環(huán)收取膜上溶液，采用HiCN法測定血紅蛋白濃度。
2.血紅蛋白磷酸吡哆醛修飾血紅蛋白摩爾比1∶4加入5’-磷酸吡哆醛(溶于0.1M Tris-HCl pH7.40)，持續(xù)通入氮氣5h，摩爾比1∶4加入新鮮配置的NaBH4溶液(溶于0.001M NaOH)，繼續(xù)通入氮氣30min完成反應。修飾后溶液加入0.1M Tris-HCl pH7.40以低溫離心30kD膜超濾3500rpm 20min，重復多次去除多余NaBH4。
3.包囊血紅蛋白為了減少生物毒性，不使用有機溶劑，本發(fā)明采用水溶液直接滴加法，以恒流泵控制勻速滴加，并在磁力攪拌下進行。在4℃條件下將濃度為0.3g/L(溶于0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH3.8)的磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白以1ml/min的速度滴加到等體積含0.004g/L氯化鈣的海藻酸鈉溶液，海藻酸鈉溶液的濃度為1.5g/L(溶于0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH3.8)，攪拌均勻后再以1ml/min的速度滴加等體積濃度為0.75g/L的殼聚糖溶液(溶于0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH3.8)，為了使所形成的粒徑更均一，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌30min。用膜孔徑為10kD的超濾膜去除未形成包囊的殼聚糖、海藻酸鈉、血紅蛋白，并進一步濃縮，洗滌液采用醫(yī)用乳酸林格氏液，最后獲得的包囊血紅蛋白溶液用0.22μm除菌過濾器過濾。
磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白納米囊原子力顯微鏡圖(見圖3)顯示其直徑為60.627nm。
采取用殼聚糖滴入海藻酸鈉的方式形成納米囊，氯化鈣的濃度低于0.01g/L。
此方法為一種簡單、快速、可大規(guī)模應用的包囊血紅蛋白的新方法，包囊血紅蛋白直徑為60-120nm，具有良好的攜氧能力和生物相容性，對各種血液成分無不良影響。
權利要求
1.一種磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白納米囊，其包括納米殼聚糖和海藻酸鈉包裹材料及磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白。
2.如權利要求1所述的磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白納米囊，其特征在于納米囊的直徑為60-120nm。
3.如權利要求2所述的磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白納米囊，其特征在于磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白的P50值在28～32mmHg之間。
4.權利要求1～3所述的任一磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白納米囊的制備方法，其步驟是將磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白加入到含氯化鈣的海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻后再加入殼聚糖溶液，繼續(xù)攪拌均勻后采用濾膜去除未形成包囊的殼聚糖、海藻酸鈉和血紅蛋白，并進一步濃縮、洗滌，最后獲得的包囊血紅蛋白溶液用除菌過濾器過濾。
5.如權利要求4所述的磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白納米囊的制備方法，其特征在于磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白與海藻酸鈉的質量比為1∶(2～10)，海藻酸鈉和殼聚糖質量比為5∶1～1∶1，氯化鈣在溶液中的最終濃度在0.001～0.01g/L之間。
6.如權利要求4所述的磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白納米囊的制備方法，其特征在于磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白的濃度為0.1～0.5g/L。
7.如權利要求4所述的磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白納米囊的制備方法，其特征在于反應溶液pH為3.0～5.5。
8.如權利要求4所述的磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白納米囊的制備方法，其特征在于所說的濾膜是膜孔徑為10kD的超濾膜。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用納米材料包裹內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白的納米囊及其制備方法技術領域。本發(fā)明所述的磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白的納米囊，包括納米殼聚糖和海藻酸鈉包裹材料及磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白。本發(fā)明所述的磷酸吡哆醛內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白納米囊直徑為60－120nm，具有良好的攜氧能力和生物相容性，對各種血液成分無不良影響；制備時沒有使用有機溶劑，無任何毒性，并且所用的納米包裹材料易分解。本發(fā)明的制備方法簡單、快速，可望大規(guī)模實際應用。
文檔編號A61K9/50GK1857721SQ20061002538
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月31日 優(yōu)先權日2006年3月31日
發(fā)明者范華驊 申請人:上海市血液中心