專利名稱：一種抗腫瘤生物藥物PTD4－GFP－Apoptin融合蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)藥物，特別是用于治療腫瘤的生物技術(shù)藥物。
背景技術(shù)：
癌癥對人類健康和生命的威脅很大，全世界每年約有700萬人新患癌癥，每年約有500多萬人死于癌癥。我國目前每年平均約有150萬人新患癥，每年約有80萬人死于癌癥。癌癥是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一。癌癥與心腦血管疾病和意外事故一起，構(gòu)成當(dāng)今世界所有國家三大死亡原因。因此，世界衛(wèi)生組織和各國政府衛(wèi)生部門都把攻克癌癥列為一項(xiàng)首要任務(wù)。尋找新的安全有效的治療腫瘤的藥物和方法，是當(dāng)前醫(yī)藥領(lǐng)域面臨的重要課題。
來源于雞貧血病毒(chicken anemia virus，CAV)的VP3蛋白(亦稱凋亡素，Apoptin)因其腫瘤特異性凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)而引起了人們的關(guān)注。體內(nèi)外研究結(jié)果均表明，VP3(本文中的VP3均指雞貧血病毒的VP3蛋白，即CAV VP3，亦稱凋亡素，即Apoptin)能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[1]，其誘導(dǎo)的凋亡效應(yīng)為非p53依賴性[2]、不受抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL的抑制[3]。更有意義的是，VP3僅誘導(dǎo)具有致瘤表型細(xì)胞或轉(zhuǎn)化表型細(xì)胞的凋亡，而對正常細(xì)胞無凋亡效應(yīng)、無細(xì)胞毒性[4]，VP3轉(zhuǎn)基因小鼠能正常生長發(fā)育[5]。人們?yōu)槔肰P3治療腫瘤進(jìn)行了積極的探索目前，直接導(dǎo)入外源性vp3基因進(jìn)行基因治療仍是人們采取的主要策略；同時，針對不同腫瘤嘗試了不同策略以實(shí)現(xiàn)靶向性治療[6-7]，如我們在國際上首次報道了通過受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移技術(shù)實(shí)現(xiàn)vp3基因體內(nèi)肝細(xì)胞定向轉(zhuǎn)移和表達(dá)，特異性誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，取得了良好的抑瘤效果[8-9]。但是，如何充分發(fā)揮VP3“腫瘤細(xì)胞特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡”的特性，避免外源基因?qū)塍w內(nèi)后可能出現(xiàn)的潛在風(fēng)險如過度表達(dá)等，進(jìn)一步擴(kuò)展VP3治療腫瘤的應(yīng)用范圍，仍是亟待解決的問題。
蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)(protein transduction technology)是近年來新興的一種大分子轉(zhuǎn)移策略利用一些具有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain，PTD)的蛋白質(zhì)或多肽，直接將具有治療作用的生物大分子“送”入細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[10]。這種具有穿過細(xì)胞膜的能力的多肽稱為細(xì)胞透膜肽(Cell-Penetrating Peptides，CPPs)，長度一般不超過30個氨基酸且富含堿性氨基酸，如TAT(11肽、13肽)、Antp(16肽)、VP22(34肽)、Transportan(28肽)、MAP(18肽)。CPP可傳送的物質(zhì)范圍很廣泛，如蛋白質(zhì)、DNA、抗體、顯像試劑、毒素、納米藥物顆粒、脂質(zhì)體等[11]。CPP傳送系統(tǒng)既是一個很好的研究細(xì)胞內(nèi)生物過程的工具，也是一個在生物藥物傳送方面具有潛在價值的研究對象。這一技術(shù)正成為腫瘤生物治療的新思路——利用它可直接將治療物導(dǎo)入癌細(xì)胞，使治療作用更加可控[10]。目前相關(guān)研究多集中在HIV-TAT(trans-activator of transcription)多肽上。TAT蛋白(86肽)是一種轉(zhuǎn)錄激活蛋白，1988年Green[11]和Frankel[12]各自獨(dú)立發(fā)現(xiàn)HIV-TAT蛋白具有穿透生物膜的能力[12-13]；隨后發(fā)現(xiàn)這一透膜能力是由47-57(或48-60)氨基酸殘基之間的肽段所介導(dǎo)，而且TAT多肽與其他蛋白形成的融合蛋白也能透過細(xì)胞膜，并能發(fā)揮這些蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能[14-16]。Ho等人[17]利用化學(xué)合成法對TAT進(jìn)行改造，通過氨基酸替換得到了一系列的TAT-PTD多肽，其中PTD4的二級結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高，可使目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)成功率幾乎達(dá)到100％，且單個細(xì)胞的蛋白質(zhì)導(dǎo)入量是TAT導(dǎo)入量的33倍，但PTD4能否通過生物合成而實(shí)現(xiàn)融合蛋白的跨膜運(yùn)輸目前尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種抗腫瘤生物藥物，使其具有能直接進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且能夠發(fā)出熒光，便于觀察其在細(xì)胞內(nèi)的分布情況等特點(diǎn)。
本發(fā)明提供的抗腫瘤生物藥物是蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域4-綠色熒光蛋白-凋亡素融合蛋白(PTD4-GFP-Apoptin，或PTD4-GFP-VP3)，具有序列表中序列8或序列9所示的氨基酸序列，其制備方法，包括以下步驟a.構(gòu)建含PTD4序列的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4；b.構(gòu)建含GFP基因的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4-GFP；c.構(gòu)建含Apoptin基因的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4-GFP-Apoptin；d.PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白的表達(dá)及純化。
構(gòu)建含PTD4序列的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4的方法是根據(jù)PTD4多肽氨基酸組成設(shè)計其堿基序列，合成兩條寡核苷酸片段，將兩條寡核苷酸片段等摩爾混合，95℃10min，然后室溫放置1h復(fù)性，形成編碼PTD4的雙鏈DNA；將該雙鏈插入到pET28a的Nhe I處，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)酶切鑒定、PCR、測序，證明構(gòu)建成pET28a-PTD4重組質(zhì)粒。
構(gòu)建含GFP基因的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4-GFP的方法是利用PCR方法擴(kuò)增綠色熒光蛋白的GFP基因，將PCR擴(kuò)增片段GFP和pET28a-PTD4重組質(zhì)粒分別經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切，回收目的片斷，連接、轉(zhuǎn)化DH5α，擴(kuò)增提取質(zhì)粒，獲重組體pET28a-PTD4-GFP。
構(gòu)建含Apoptin基因的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4-GFP-Apoptin的方法是利用PCR方法擴(kuò)增雞貧血病毒的Apoptin基因，將PCR擴(kuò)增片段Apoptin和pET28a-PTD4-GFP重組質(zhì)粒分別經(jīng)經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切，回收目的片段，連接、轉(zhuǎn)化DH5α，擴(kuò)增提取質(zhì)粒，獲重組體pET28a-PTD4-GFP-Apoptin。
PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白的表達(dá)及純化的方法是將重組質(zhì)粒pET28a-PTD4-GFP-Apoptin轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)PlysS，在5ml含0.05mg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)，到A600＝0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度1.0mM誘導(dǎo)8小時，超聲破菌，離心收集包涵體，以未誘導(dǎo)菌作對照，經(jīng)12.5％SDS-PAGE鑒定；將包涵體溶于含8mol/l尿素的上樣緩沖液中，經(jīng)鎳親和層析柱純化，操作步驟按試劑盒要求進(jìn)行。SDS-PAGE鑒定洗脫蛋白，合并含目的蛋白的洗脫液，透析、濃縮、過濾除菌，BCA法測定蛋白含量，-80℃保存。
本發(fā)明重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖見圖1。
本發(fā)明提供的抗腫瘤生物藥物PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白，利用合成的PTD4直接將Apoptin蛋白導(dǎo)入細(xì)胞，繼而利用Apoptin特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)腫瘤凋亡、抑制腫瘤生長的目的，同時利用GFP(綠色熒光蛋白)能發(fā)出綠色熒光的特點(diǎn)，能夠在熒光顯微鏡下觀察到該融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布，顯示藥物在靶部位的聚集情況，從而能夠?qū)崿F(xiàn)對治療過程的有效監(jiān)控和適時調(diào)整。通過蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明PTD4-GFP及PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白能穿透生物膜，通過TUNEL法及DAPI染色證實(shí)本發(fā)明PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，顯示本發(fā)明以人工方法制備和純化得到的PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白具有良好的穿透生物膜效應(yīng)且能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對腫瘤細(xì)胞具有極大的殺傷能力，且不損傷正常細(xì)胞，不會發(fā)生導(dǎo)入外源基因的危險，能用于對腫瘤的治療。
以本發(fā)明提供的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域4-綠色熒光蛋白-凋亡素融合蛋白(PTD4-GFP-Apoptin)為活性成分，加上制藥學(xué)上可接受的載體和/或添加劑，按常規(guī)方法制備成抗腫瘤藥物制劑，施于腫瘤部位即可對腫瘤進(jìn)行治療，所述的藥用載體可以是PBS(磷酸鹽緩沖液)、甘油或尿素等。


圖1為本發(fā)明重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
圖2為重組體pET28a-PTD4鑒定結(jié)果，圖中標(biāo)示分別為M1Mraker，分子量標(biāo)準(zhǔn)，從大到小依次為7000，5500，3500，2000，1000，500bp；ApET28a-PTD4經(jīng)Nhe I酶切后結(jié)果；B由步驟1所獲得的PTD4片段；
CpET28a-PTD4 PCR結(jié)果；M2Mraker，分子量標(biāo)準(zhǔn)，從大到小依次為600，500，400，300，200，100bp。
圖3為重組體pET28a-PTD4-GFP鑒定結(jié)果，圖中標(biāo)示分別為M1Marker，分子量標(biāo)準(zhǔn)，從大到小依次為7000，5500，3500，2000，1000，500bp；A步驟1所獲得的GFP片段；BpET-28a-PTD4-GFP經(jīng)BamHI和EcoRI酶切；CpET-28a-PTD4-GFP經(jīng)BamHI酶切。
圖4為重組體pET28a-PTD4-GFP-VP3鑒定結(jié)果，圖中標(biāo)示分別為M3Mraker，分子量標(biāo)準(zhǔn)，從大到小依次為1500，1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100bp；ApcDNA-vp3的PCR結(jié)果；BpET28a-PTD4-GFP-VP3經(jīng)EcoR I和Sal I酶切的結(jié)果；CpET28a-PTD4-GFP-VP3經(jīng)EcoR I酶切的結(jié)果；M1Marker，分子量標(biāo)準(zhǔn)，從大到小依次為7000，5500，3500，2000，1000，500bp。
圖5為PTD4-GFP融合蛋白PAGE結(jié)果，圖中標(biāo)示分別為M蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下依次為116.0kDa，66.2kDa，45.0kDa，35.0kDa，25.0kDa，18.4kDa，14.4kDa；1未誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌總蛋白；2IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌總蛋白；3純化的PTD4-GFP融合蛋白。
圖6為PTD4-GFP-VP3融合蛋白PAGE結(jié)果，圖中標(biāo)示分別為M蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下依次為116.0kDa，66.2kDa，45.0kDa，35.0kDa，25.0kDa，18.4kDa，14.4kDa；4包涵體中的細(xì)菌蛋白；5未誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌總蛋白；6IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌總蛋白；7純化的PTD4-GFP-VP3融合蛋白。
圖7為PTD4-GFP融合蛋白的透膜效應(yīng)實(shí)驗(yàn)的熒光顯微鏡觀察的結(jié)果；圖8為PTD4-GFP融合蛋白的透膜效應(yīng)實(shí)驗(yàn)的光學(xué)顯微鏡觀察的結(jié)果；圖9為PTD4-GFP-VP3融合蛋白的透膜效應(yīng)實(shí)驗(yàn)的熒光顯微鏡觀察的結(jié)果；
圖10為PTD4-GFP-VP3融合蛋白的透膜效應(yīng)實(shí)驗(yàn)的光學(xué)顯微鏡觀察的結(jié)果；圖11為PTD4-GFP-VP3融合蛋白誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的激光共聚焦顯微鏡觀察FITC激發(fā)結(jié)果；圖12為PTD4-GFP-VP3融合蛋白誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的激光共聚焦顯微鏡觀察DAPI激發(fā)結(jié)果；圖13為PTD4-GFP-VP3融合蛋白誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的激光共聚焦顯微鏡觀察FITC和DAPI共激發(fā)結(jié)果；圖14為PTD4-GFP-VP3融合蛋白誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的激光共聚焦顯微鏡光鏡下結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1構(gòu)建含PTD4序列的原核表達(dá)載體pET28a-PTD41.利用人工合成的寡核苷酸片段退火法制備PTD4序列(1)根據(jù)Ho的報道[17]，PTD4多肽由11個氨基酸組成，按照原核生物密碼子的特點(diǎn)自主設(shè)計其堿基序列如下S15′-CTAGTTATGCCCGCGCGGCAGCACGACAAGCTCGAGCCC-3′S25′-CTAGGGGCTCGAGCTTGTCGTGCTGCCGCGCGGGCATAA-3′兩條寡核苷酸片段由上海生物工程公司合成。
將兩條寡核苷酸片段等摩爾混合，95℃10min，然后室溫放置1h復(fù)性，形成編碼PTD4的雙鏈DNA。
2.構(gòu)建重組體pET28a-PTD4(1)原核表達(dá)載體pET-28a(+)購置Novagen公司。
(2)構(gòu)建方法采用常規(guī)的基因克隆方法。
將上述方法獲得的雙鏈插入到pET28a的Nhe I處，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)酶切鑒定、PCR、測序，證明構(gòu)建成pET28a-PTD4重組質(zhì)粒。DNA序列測定由上海博亞完成。PCR鑒定引物為P1GGCAGCACGACAAGCTCGAGP2AACCCCTCAAGACCCGTTTAGAG，片段大小為298bpPCR擴(kuò)增反應(yīng)條件循環(huán)參數(shù)為95℃變性5min，94℃1min、50℃1min、72℃1min，循環(huán)擴(kuò)增次數(shù)30次，最后72℃延伸10min。
重組體pET28a-PTD4鑒定結(jié)果見圖2，從圖2的結(jié)果可以判斷重組體pET28a-PTD4構(gòu)建成功。
實(shí)施例2構(gòu)建含GFP基因的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4-GFP1.利用PCR方法擴(kuò)增綠色熒光蛋白的GFP基因(1)pEGFP-C1購自CLONETECH公司。
(2)PCR引物序列如下P35′-ACGGATCCATGGTGAGCAAGGGCG-3′P45′-GCGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′兩條引物5′端分別含有限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I的識別位點(diǎn)。
(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件循環(huán)參數(shù)為94℃5min，94℃55sec、62℃55sec、72℃1min，循環(huán)擴(kuò)增30次，最后72℃保溫10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶大小正確。
2.構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-PTD4-GFP(1)原核表達(dá)載體pET28a-PTD4的構(gòu)建見步驟(一)。
(2)構(gòu)建方法采用常規(guī)的基因克隆方法。
PCR擴(kuò)增片段GFP和pET28a-PTD4重組質(zhì)粒分別經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切，回收目的片斷，連接、轉(zhuǎn)化DH5α，擴(kuò)增提取質(zhì)粒。
重組體鑒定結(jié)果見圖3，從圖3的結(jié)果可以判斷重組體pET28a-PTD4-GFP構(gòu)建成功。
實(shí)施例3構(gòu)建含vp3基因的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4-GFP-VP31.利用PCR方法擴(kuò)增雞貧血病毒的vp3基因(1)構(gòu)建含vp3基因的真核表達(dá)載體pcDNA-vp3，具體方法參見王宇哲，田俊，屈伸等，雞貧血病毒vp3基因的構(gòu)建及體外凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的研究，同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001，30(4)300-4。[18](2)PCR引物序列如下P55′-AGGAATTCATGAACGCTCTCCAAG-3′P65′-GCGTCGACTTACAGTCTTATACGCC-3′兩條引物5′端分別含有限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I的識別位點(diǎn)。
(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件循環(huán)參數(shù)為94℃5min，94℃55sec、60℃50sec、72℃55sec，循環(huán)擴(kuò)增30次，72℃保溫10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定無誤。
2.構(gòu)建含vp3基因的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4-VP3(1)原核表達(dá)載體pET28a-PTD4-GFP的構(gòu)建見步驟(二)。
(2)構(gòu)建方法采用常規(guī)的基因克隆方法。
PCR擴(kuò)增片段vp3和pET28a-PTD4-GFP重組質(zhì)粒分別經(jīng)經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切，回收目的片段，連接、轉(zhuǎn)化DH5α，擴(kuò)增提取質(zhì)粒。
重組體鑒定結(jié)果見圖4，從圖4的結(jié)果可以判斷重組體pET28a-PTD4-GFP-VP3構(gòu)建成功。
實(shí)施例4PTD4-GFP、PTD4-GFP-VP3融合蛋白的表達(dá)及純化1.原核表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)PlysS購置Novagen公司。鎳親和層析柱購置Promega公司。IPTG購置BBI公司。BCA蛋白測定試劑盒購置Pierce公司。
2.融合蛋白表達(dá)過程將純化后的二種重組質(zhì)粒pET28a-PTD4-GFP、pET28a-PTD4-GFP-VP3分別轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)PlysS。在5ml含0.05mg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)，到A600＝0.4~0.6時，加入IPTG至終濃度1.0mM誘導(dǎo)8小時，超聲破菌，離心收集包涵體，以未誘導(dǎo)菌作對照，經(jīng)12.5％SDS-PAGE鑒定。
3.融合蛋白純化過程將包涵體溶于含8 mol/l尿素的上樣緩沖液中，經(jīng)鎳親和層析柱純化，操作步驟按試劑盒要求進(jìn)行。SDS-PAGE鑒定洗脫蛋白，合并含目的蛋白的洗脫液，透析、濃縮、過濾除菌，BCA法測定蛋白含量，-80℃保存。
4.PTD4-GFP融合蛋白鑒定結(jié)果見圖5和圖6。圖5的電泳結(jié)果說明得到純的PTD4-GFP融合蛋白；圖6的電泳結(jié)果說明得到純的PTD4-GFP-VP3融合蛋白。
實(shí)施例5本發(fā)明融合蛋白的體外透膜效應(yīng)實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)材料(1)PTD4-GFP及PTD4-GFP-VP3的PBS(磷酸鹽緩沖液0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na2HPO4，0.024％KH2PO4)溶液。
(2)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為人源肝癌細(xì)胞系HepG2購置CCTCC。
2.實(shí)驗(yàn)方法將人源肝癌細(xì)胞HepG2接種于培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后，用1μmol/L的融合蛋白PTD4-GFP及PTD4-GFP-VP3孵育細(xì)胞，2h后吸去培養(yǎng)液，PBS洗三次，然后置于熒光顯微鏡下觀察。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果PTD4-GFP、PTD4-GFP-VP3融合蛋白分別加入到體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中，2h后在細(xì)胞中可見明顯的綠色熒光，見圖7、圖8、圖9和圖10。
結(jié)合圖7、圖8、圖9和圖10的結(jié)果，表明PTD4-GFP、PTD4-GFP-VP3融合蛋白均成功透過細(xì)胞膜進(jìn)入HepG2細(xì)胞中，說明本發(fā)明合成的PTD4具有介導(dǎo)融合蛋白透膜的功能。
實(shí)施例6本發(fā)明融合蛋白PTD4-GFP-VP3誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)材料(1)PTD4-GFP-VP3的PBS(磷酸鹽緩沖液0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na2HPO4，0.024％KH2PO4)溶液。
(2)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為人源肝癌細(xì)胞系HepG2購置CCTCC。TUNEL檢測試劑盒購置Promega公司。
2.實(shí)驗(yàn)方法將處理過的蓋玻片置于六孔板內(nèi)，人源肝癌細(xì)胞HepG2以合適密度接種于六孔板中，細(xì)胞貼壁后，用1μmol/L的融合蛋白PTD4-GFP-VP3孵育細(xì)胞4-5天，PBS洗三次，4％多聚甲醛固定30min，TUNEL檢測細(xì)胞凋亡(FITC染色)并用DAPI復(fù)染，操作過程按照說明書進(jìn)行。置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果融合蛋白PTD4-GFP-VP3與HepG2細(xì)胞孵育4-5天，TUNEL檢測細(xì)胞凋亡并用DAPI復(fù)染，激光共聚焦顯微鏡下明顯可見細(xì)胞核皺縮，邊集，說明其融合蛋白能引起細(xì)胞凋亡，見圖11、圖12、圖13和圖14。
結(jié)合圖11、圖12、圖13和圖14的結(jié)果，說明PTD4-GFP-VP3融合蛋白誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡效應(yīng)。
實(shí)施例7以本發(fā)明提供的PTD4-GFP-VP3融合蛋白為活性成分，加上PBS(磷酸鹽緩沖液0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na2HPO4，0.024％KH2PO4)溶液，按常規(guī)方法制備成抗腫瘤藥物制劑。
實(shí)施例8
以本發(fā)明提供的PTD4-GFP-VP3融合蛋白為活性成分，加上PBS溶液和10％的甘油，按常規(guī)方法制備成抗腫瘤藥物制劑。
實(shí)施例9以本發(fā)明提供的PTD4-GFP-VP3融合蛋白為活性成分，加上一定量的尿素(如4M)，按常規(guī)方法制備成抗腫瘤藥物制劑。
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以下為本發(fā)明涉及的核苷酸序列和氨基酸序列，表中序列依次分別是序列1是PTD4的DNA序列(只顯示了編碼鏈的序列，以下同)；序列2是PTD4的氨基酸序列；序列3是Apoptin的DNA序列；序列4是Apoptin的氨基酸序列；序列5是Apoptin的氨基酸序列；序列6是GFP的DNA序列；序列7是表達(dá)PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白的DNA序列；序列8是PTD4-GFP--Apoptin融合蛋白的氨基酸序列；序列9是凝血酶酶切后的PTD4-GFP--Apoptin融合蛋白的氨基酸序列。
序列表<110>華中科技大學(xué)<120>一種治療腫瘤的生物藥物PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白及制備方法<130>1<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>1tatgcccgcg cggcagcacg acaagctcga gcc33<210>2<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>2Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala1 5 10<210>3<211>366<212>DNA<213>Chicken anemia virus<400>3atgaacgctc tccaagaaga tactccaccc ggaccatcaa cggtgttcag gccaccaaca 60agttcacggc cgttggaaac ccctcactgc agagagatcc ggattggtat cgctggaatt 120acaatcactc tatcgctgtg tggctgcgcg aatgctcgcg ctcccacgct aagatctgca 180actgcggaca attcagaaag cactggtttc aagaatgtgc cggacttgag gaccgatcaa 240cccaagcctc cctcgaagaa gcgatcctgc gacccctccg agtacagggt aagcgagcta 300aaagaaagct tgattaccac tactcccagc cgaccccgaa ccgcaaaaag gcgtataaga 360ctgtaa 366<210>4<211>121<212>PRT<213>Chicken anemia virus<400>4
Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe1 5 10 15Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu20 25 30Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly35 40 45Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn50 55 60Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln65 70 75 80Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg85 90 95Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro100 105 110Arg Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu115 120<210>5<211>717<212>DNA<213>Aequorea victoria<400>5atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac120ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc180ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag240cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc300ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg360gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac420aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac480ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc540gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc660ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag717<210>6<211>239<212>PRT<213>Aequorea victoria<400>6Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu1 5 10 15Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly20 25 30Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys PheIle35 40 45Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr50 55 60Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys65 70 75 80Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu85 90 95Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu100 105 110Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly115 120 125Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr130 135 140Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn145 150 155 160Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser165 170 175Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu195 200 205Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe210 215 220Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys225 230 235<210>7<211>1230<212>DNA<213>人工序列<400>7atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat60atggctagtt atgcccgcgc ggcagcacga caagctcgag cccctagcat gactggtgga 120cagcaaatgg gtcgcggatc catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 180cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 240ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 300ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 360cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 420gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg 480aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 540gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 600atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 660gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 720gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 780gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 840atggacgagc tgtacaagga attcatgaac gctctccaag aagatactcc acccggacca 900tcaacggtgt tcaggccacc aacaagttca cggccgttgg aaacccctca ctgcagagag 960atccggattg gtatcgctgg aattacaatc actctatcgc tgtgtggctg cgcgaatgct 1020cgcgctccca cgctaagatc tgcaactgcg gacaattcag aaagcactgg tttcaagaat 1080gtgccggact tgaggaccga tcaacccaag cctccctcga agaagcgatc ctgcgacccc 1140tccgagtaca gggtaagcga gctaaaagaa agcttgatta ccactactcc cagccgaccc 1200
cgaaccgcaa aaaggcgtat aagac tgtaa 1230<210>8<211>409<212>PRT<213>人工序列<400>8Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1 5 10 15Arg Gly Ser His Met Ala Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala20 25 30Arg Ala Pro Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Met35 40 45Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val50 55 60Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu65 70 75 80Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys85 90 95Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu100 105 110Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln115 120 125His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg130 135 140Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val145 150 155 160Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile165 170 175Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn180 185 190Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
195 200 205Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val210 215 220Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro225 230 235 240Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser245 250 255Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val260 265 270Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Glu Phe275 280 285Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe290 295 300Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu305 310 315 320Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly325 330 335Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn340 345 350Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln355 360 365Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg370 375 380Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro385 390 395 400Arg Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu405<210>9<211>392<212>PRT<213>人工序列
<400>9Gly Ser His Met Ala Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg1 5 10 15Ala Pro Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Met Val20 25 30Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu35 40 45Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly50 55 60Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr65 70 75 80Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr85 90 95Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His100 105 110Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr115 120 125Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys130 135 140Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp145 150 155160Phe Lys Glu Asp Gly AsnIle Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr165170 175Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile180 185 190Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln195 200 205Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val210 215 220
Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys225 230 235 240Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr245 250 255Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Glu Phe Met260 265 270Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe Arg275 280 285Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu Ile290 295 300Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly Cys305 310 315 320Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn Ser325 330 335Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln Pro340 345 350Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg Val355 360 365Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro Arg370 375 380Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu385 390
權(quán)利要求
1.蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域4-綠色熒光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin，具有序列表中序列8或序列9所示的氨基酸序列。
2.含有PTD4、GFP和Apoptin基因的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4-GFP-Apoptin。
3.權(quán)利要求1所述的融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的融合蛋白在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。
5.蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域4-綠色熒光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin的制備方法，包括以下步驟a.構(gòu)建含PTD4序列的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4；b.構(gòu)建含GFP基因的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4-GFP；c.構(gòu)建含Apoptin基因的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4-GFP-Apoptin；d.PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白的表達(dá)及純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域4-綠色熒光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin的制備方法，其特征在于所說的構(gòu)建含PTD4序列的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4的方法是根據(jù)PTD4多肽氨基酸組成設(shè)計其堿基序列，合成兩條寡核苷酸片段，將兩條寡核苷酸片段等摩爾混合，95℃10min，然后室溫放置1h復(fù)性，形成編碼PTD4的雙鏈DNA；將該雙鏈插入到pET28a的Nhe I處，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)酶切鑒定、PCR、測序，證明構(gòu)建成pET28a-PTD4重組質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域4-綠色熒光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin的制備方法，其特征在于所說的構(gòu)建含GFP基因的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4-GFP的方法是利用PCR方法擴(kuò)增綠色熒光蛋白的GFP基因，將PCR擴(kuò)增片段GFP和pET28a-PTD4重組質(zhì)粒分別經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切，回收目的片斷，連接、轉(zhuǎn)化DH5α，擴(kuò)增提取質(zhì)粒，獲重組體pET28a-PTD4-GFP。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域4-綠色熒光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin的制備方法，其特征在于所說的構(gòu)建含Apoptin基因的原核表達(dá)載體pET28a-PTD4-GFP-Apoptin的方法是利用PCR方法擴(kuò)增雞貧血病毒的Apoptin基因，將PCR擴(kuò)增片段Apoptin和pET28a-PTD4-GFP重組質(zhì)粒分別經(jīng)經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切，回收目的片段，連接、轉(zhuǎn)化DH5α，擴(kuò)增提取質(zhì)粒，獲重組體pET28a-PTD4-GFP-Apoptin。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域4-綠色熒光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin的制備方法，其特征在于所說的PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白的表達(dá)及純化的方法是將重組質(zhì)粒pET28a-PTD4-GFP-Apoptin轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)PlysS，在5ml含0.05mg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)，到A600＝0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度1.0mM誘導(dǎo)8小時，超聲破菌，離心收集包涵體，以未誘導(dǎo)菌作對照，經(jīng)12.5％SDS-PAGE鑒定；將包涵體溶于含8mol/l尿素的上樣緩沖液中，經(jīng)鎳親和層析柱純化，操作步驟按試劑盒要求進(jìn)行。SDS-PAGE鑒定洗脫蛋白，合并含目的蛋白的洗脫液，透析、濃縮、過濾除菌，BCA法測定蛋白含量，-80℃保存。
10.表達(dá)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域4-綠色熒光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin的基因，具有序列表中序列7所示的核苷酸序列。
全文摘要
一種治療腫瘤的生物藥物PTD4－GFP－Apoptin融合蛋白，利用合成的PTD4直接將Apoptin蛋白導(dǎo)入細(xì)胞，繼而利用Apoptin特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)腫瘤凋亡、抑制腫瘤生長的目的，同時利用綠色熒光蛋白(GFP)能發(fā)出綠色熒光的特點(diǎn)，在熒光顯微鏡下能觀察到該融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布，顯示藥物在靶部位的聚集情況，從而能夠?qū)崿F(xiàn)對治療過程的有效監(jiān)控和適時調(diào)整。通過蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該融合蛋白能穿透生物膜，通過TUNEL法及DAPI染色證實(shí)該融合蛋白能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對腫瘤細(xì)胞具有極大的殺傷能力，且不損傷正常細(xì)胞，不會發(fā)生導(dǎo)入外源基因的危險，能用于對腫瘤的治療。
文檔編號A61K38/17GK101081870SQ200610019239
公開日2007年12月5日 申請日期2006年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月31日
發(fā)明者屈伸, 孫軍, 宗義強(qiáng) 申請人:華中科技大學(xué)