專利名稱：浙貝乙素和膽汁酸的衍生物及藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥用化合物，特別涉及浙貝乙素和膽汁酸，以及它們在制備鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘藥物方面的應用。
背景技術：
咳嗽是一種常見病、多發(fā)病，它是機體的一種防御反射性機制，通過咳嗽可以清除呼吸道的分泌物或異物。引起咳嗽的常見原因有呼吸道急慢性感染、呼吸道異物吸入、呼吸道遭受壓迫如支氣管淋巴結腫大等。目前，鎮(zhèn)咳藥物雖然已發(fā)展有很多種，但這些藥物一般都通過對神經中樞的抑制而產生作用，具有較大的副作用，如嗎啡類化合物的使用會導致成癮、呼吸抑制和便秘，而右美沙芬可誘發(fā)幻覺、妄想等精神病癥狀。另外因感冒或急慢性支氣管炎、支氣管哮喘引起的咳嗽往往多痰，若單純使用鎮(zhèn)咳藥物，雖然咳嗽會有所減輕，但因痰液排出受阻，而痰液除有利于細菌的大量繁殖外，還可能含有收縮支氣管的物質，可能引發(fā)支氣管痙攣和過敏性哮喘，這樣咳嗽反而會遷延不止，病情加劇，因此對于這類咳嗽，在鎮(zhèn)咳的同時，必須進行化痰。這就需要研發(fā)毒副作用小且能有效鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘的藥物。

發(fā)明內容
相對于眾多鎮(zhèn)咳西藥的單純鎮(zhèn)咳作用來說，中藥復方大多同時具備鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘的功效，而且毒副作用較小，具有獨特的優(yōu)勢，如蛇膽貝母類復方制劑。但目前該類復方制劑在市場上要么僅以原藥材直接入藥，要么以藥材的粗提物入藥，難以解決傳統復方制劑的粗、大、黑等方面問題，患者使用相當不便，進入國際市場難度也很大。本發(fā)明人考慮到組成該類復方制劑的兩味中藥有其特殊性，如膽汁中的各種膽汁酸為有機酸而貝母的主要有效成分則為生物堿，且目前并未發(fā)現由這兩類有效成分反應生成衍生物或以一定比例組合成藥的報道，由此本發(fā)明人開展了該類復方制劑物質基礎相互作用的研究。進一步的藥理研究發(fā)現由兩味中藥各自的有效成分反應生成的鹽，相對原來單一的有效成分顯示出減毒增效的功用，合成路線簡單且具有一定的水溶性，可以代替該類復方制劑從而成為活性成分清晰、療效確切和質量可控的新藥物。
本發(fā)明的目的旨在克服現有鎮(zhèn)咳西藥毒副作用較大的缺點以及傳統中藥復方制劑粗大黑難獲國際認可等缺陷，提供一種或多種來源于中藥的兼有鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘作用的新型化合物或藥用組合物。
本發(fā)明技術方案如下以浙貝乙素和任意一種膽汁酸為原料，利用兩類物質的酸堿性和兩類物質側鏈取代基的特殊性，進行合成反應得到的有機鹽衍生物和酯類衍生物。
浙貝乙素結構式為 分子式C27H43NO3，為無色絨毛狀結晶，m.p.212℃-214℃，N原子為其堿性中心。
各膽汁酸的結構見如下通式，不同膽汁酸的區(qū)別僅在6、7或12位取代基的不同上。-COOH基團為各膽汁酸的酸性中心。
膽酸的各取代基分別是R1＝H；R2＝OH；R3＝OH；分子式為C24H40O5；為白色粉末狀結晶，m.p.178℃-182℃。
去氧膽酸的各取代基分別是R1＝H；R2＝H；R3＝OH；分子式為 C24H40O4，為白色粉末狀結晶，m.p.110℃-113℃。
鵝去氧膽酸的各取代基分別是R1＝H；R2＝OH；R3＝H；分子式為C24H40O4，為白色粉末狀結晶，m.p.144℃-146℃。
豬去氧膽酸的各取代基分別是R1＝OH；R2＝H；R3＝H；分子式為C24H40O4，為白色粉末狀結晶，m.p.168℃-170℃。
熊去氧膽酸的結構式如下
熊去氧膽酸的分子式為C24H40O4，為白色粉末狀結晶，m.p.185℃-189℃。
本發(fā)明包括利用浙貝乙素結構中的堿性中心和膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸或熊去氧膽酸結構中的酸性中心，使其在惰性溶劑如THF中反應生成弱酸弱堿鹽。該有機鹽相對于原料藥浙貝乙素和膽汁酸來說，不僅具有更為良好的鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘作用，且因其還具有一定的水溶性，便于制成各種劑型。
本發(fā)明還包括利用浙貝乙素結構中的羥基與膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸或熊去氧膽酸結構中的羧基反應生成的酯類衍生物，以及這些酯類衍生物在鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘方面的效用。
另外，本發(fā)明還包括浙貝乙素和膽汁酸中的一種或多種以一定比例組合而成的藥物組合物，以及這些藥物組合物在鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘方面的應用。
本發(fā)明提供的具有鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘活性的有機鹽，其特征在于它是利用浙貝乙素的堿性中心和膽汁酸的酸性中心進行反應而成的鹽，其結構通式如下 當為浙貝乙素膽酸鹽時，其取代基R1是α氫；R2是α羥基；R3是α羥基；當為浙貝乙素去氧膽酸鹽時，其取代基R1是α氫；R2是α氫；R3是α羥基；當為浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽時，其取代基R1是α氫；R2是α羥基；R3是α氫；當為浙貝乙素豬去氧膽酸鹽時，其取代基R1是α羥基；R2是α氫；R3是α氫；當為浙貝乙素熊去氧膽酸鹽時，其取代基R1是α氫；R2是β羥基；R3是α氫。
本發(fā)明提供的由浙貝乙素和膽汁酸反應而成的酯，其特征在于利用浙貝乙素結構中的3位羥基和膽汁酸中的羧基進行反應而成的酯，結構通式如下 當為浙貝乙素膽酸酯時，其取代基R1是α氫；R2是α羥基；R3是α羥基；當為浙貝乙素去氧膽酸酯時，其取代基R1是α氫；R2是α氫；R3是α羥基；當為浙貝乙素鵝去氧膽酸酯時，其取代基R1是α氫；R2是α羥基；R3是α氫；當為浙貝乙素豬去氧膽酸酯時，其取代基R1是α羥基；R2是α氫；R3是α氫；當為浙貝乙素熊去氧膽酸酯時，其取代基R1是α氫；R2是β羥基；R3是α氫。
本發(fā)明提供的鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘藥物組合物，是由浙貝乙素和膽汁酸按重量比2∶1至1∶2的比例混合而成，所述的膽汁酸是膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸或/和熊去氧膽酸。


圖1表示浙貝乙素膽酸鹽(簡稱CA鹽)、浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽(簡稱CDCA鹽)、浙貝乙素膽酸酯(簡稱CA酯)和浙貝乙素膽酸組合物(簡稱組合物)灌胃給藥的鎮(zhèn)咳效果，陽性對照藥為磷酸可待因(灌胃，10mg/kg)，鎮(zhèn)咳效果均以抑咳率(％)來表示。
圖1-1表示兩鹽的高(4.5mg/kg)、中(3mg/kg)、低(2mg/kg)三個劑量不同的鎮(zhèn)咳效果。與陰性對照*P＜0.05，**P＜0.01。
圖1-2為CA鹽和CDCA鹽的量效關系曲線。
圖1-3表示同等劑量下(劑量均為2mg/kg)，浙貝乙素膽酸鹽、浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽、浙貝乙素膽酸酯和浙貝乙素膽酸組合物與各自原料灌胃給藥鎮(zhèn)咳作用大小的比較。三種原料的鎮(zhèn)咳作用以浙貝乙素為最強，CA鹽、CDCA鹽、CA酯和組合物的鎮(zhèn)咳效果均比浙貝乙素強，均具有顯著性差異，與浙貝乙素比較*P＜0.05，而其中又以兩鹽的鎮(zhèn)咳效果要優(yōu)于酯和組合物。
圖2表示浙貝乙素膽酸鹽、浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽、浙貝乙素膽酸酯和浙貝乙素膽酸組合物灌胃給藥的祛痰活性，陽性對照藥品為愈創(chuàng)木酚甘油醚(灌胃，200mg/kg)。給藥劑量均為2.5mg/kg，與陰性對照*P＜0.05，**P＜0.01。圖中還表明浙貝乙素膽酸鹽顯示出比浙貝乙素更強的祛痰活性。
圖3表示浙貝乙素膽酸鹽、浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽、浙貝乙素膽酸酯和浙貝乙素膽酸組合物灌胃給藥的平喘活性，陽性對照為氨茶堿(灌胃，125mg/kg)。給藥劑量均為4mg/kg，與陰性對照*P＜0.05，**P＜0.01。圖中表明其中CA鹽、CDCA鹽要顯示出比浙貝乙素更強的平喘活性。
具體實施例方式
以下實施例旨在進一步說明本發(fā)明，并不對本發(fā)明的范圍加以限制。
實施例1浙貝乙素單體的分離制備將湖北貝母于60℃烘箱中干燥12小時后，粉碎過10目藥篩得湖北貝母藥材粉末，將湖北貝母藥材粉末用含水乙醇熱回流提取數次，過濾，收集并合并乙醇提取液，回收乙醇得濃縮液；濃縮液與適量2％鹽酸水溶液和硅藻土混合后，充分攪拌，過濾，收集濾液和殘渣。殘渣繼續(xù)用一定量2％鹽酸水溶液洗滌數次，過濾，收集濾液；合并以上濾液，濾液用5％NaOH堿化至一定pH值后，采用大孔吸附樹脂分離純化，其中包括水洗除雜、低濃度乙醇除雜和高濃度乙醇洗脫等步驟，收集高濃度乙醇洗脫液；高濃度乙醇洗脫液經減壓回收乙醇后得流浸膏，將流浸膏置于40℃真空干燥箱中數小時后即可得到淡黃色的湖北貝母總生物堿成品；再將湖北貝母總生物堿上硅膠H柱，用石油醚和乙酸乙酯進行梯度洗脫并用乙酸乙酯進行重結晶后，得白色針晶，經TLC鑒定為浙貝乙素單體，對照品由本教研室提供。
實施例2浙貝乙素膽酸鹽的制備浙貝乙素膽酸鹽的結構式如下 浙貝乙素膽酸鹽的制備方法是將浙貝乙素和膽酸等摩爾溶解于惰性有機溶劑THF中，在室溫下進行反應，攪拌12小時后，于旋轉蒸發(fā)儀上回收溶劑并真空干燥，所得物質用蒸餾水溶解過濾進行純化，再于旋轉蒸發(fā)儀上除去水，得到目標化合物浙貝乙素膽酸鹽，為白色粉末狀固體，其在蒸餾水中的溶解度可達1mg/ml；熔點137.3℃-139.2℃；1H-NMR(D2O，400MHZ)δ0.55(s，3H)，δ0.58(s，3H)，δ0.75(s，3H)，δ0.82(d，3H)，δ0.94(d，3H)，δ1.06(s，3H)，δ3.45-3.49(m，3H)，63.72(s，1H)，63.89(s，1H)。
實施例3浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽的制備浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽的結構式如下 浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽的制備方法是將浙貝乙素和鵝去氧膽酸等摩爾溶解于惰性有機溶劑THF中，在室溫下進行反應，攪拌12小時后，于旋轉蒸發(fā)儀上回收溶劑并真空干燥，所得物質用蒸餾水溶解過濾進行純化，再于旋轉蒸發(fā)儀上除去水，得到目標化合物浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽，為白色粉末狀固體，其在蒸餾水中為微溶；熔點132.0℃-134.5℃。
實施例4浙貝乙素膽酸酯的制備浙貝乙素膽酸酯的結構式如下 浙貝乙素膽酸酯的制備方法是在帶磁力攪拌和回流裝置的干燥圓底燒瓶中加入DMF(二甲基甲酰胺)，將浙貝乙素和膽酸等摩爾溶解于其中，攪拌溶解至溶液變澄清后，再加入等摩爾的DCC(碳二亞胺)及少量的DMAP(二甲氨基吡啶)，冰浴至4℃，攪拌2小時后，以TLC跟蹤并繼續(xù)于室溫下攪拌反應48小時，濾掉生成的白色沉淀，濾液蒸干后用甲醇溶解，于硅膠H柱上進行梯度洗脫，得到新生成的物質，用無水乙醇對其重結晶，得精制品為聚合成菊花狀的白色針晶，即制得目標產物浙貝乙素膽酸酯，收率為19％；熔點125.6℃-128.4℃；1H-NMR(CDCL3，400MHZ)δ0.64(s，3H)，δ0.85(s，3H)，δ0.9-0.95(d，3H)，δ1.19(s，3H)，δ1.21(s，3H)，δ1.23(s，3H)，δ3.63(s，1H)，δ3.65(s，1H)，δ3.81(s，1H)，δ3.93(s，1H)；Mass m/z(FAB)820(M+1)。
實施例5浙貝乙素膽酸鹽、浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽、浙貝乙素膽酸酯和浙貝乙素膽酸組合物(浙貝乙素和膽酸的重量比為2∶1至1∶2)鎮(zhèn)咳活性的測定采用豚鼠枸櫞酸噴霧引咳法，將豚鼠單個置于密封透明的有機玻璃室(16cm×16cm×16cm)內，使用402AI型超聲噴霧器，以恒速噴入17.5％枸櫞酸，噴霧時間為1min，記錄5min內豚鼠的咳嗽次數并進行預選，豚鼠的咳嗽聲音清脆響亮，以聽到聲音的計數，咳嗽次數少于10次者棄除，篩選出合格豚鼠。
合格豚鼠經過24小時的恢復后，隨機分組，每組六只，引咳前1小時灌胃給藥兩鹽的高中低劑量分別為4.5mg/kg、3mg/kg和2mg/kg；膽酸酯、組合物及原料藥浙貝乙素、膽酸和鵝去氧膽酸的給藥劑量均為2mg/kg.比較給藥前后豚鼠咳嗽次數C的變化，鎮(zhèn)咳效果以抑咳率＝((C給藥前-C給藥后)/C給藥前)×100％來表示。
結果表明1、當同等劑量灌胃給藥時，CDCA鹽、CA鹽、CA酯、組合物和原料藥浙貝乙素均具顯著鎮(zhèn)咳作用，參見附圖1-1和附圖1-3。而CA和CDCA兩原料的鎮(zhèn)咳效果則不明顯。2、同等劑量下，CDCA鹽、CA鹽、CA酯和組合物與原料藥浙貝乙素比較，均顯示出比浙貝乙素強的鎮(zhèn)咳效果，參見附圖1-3。其中又以CDCA鹽、CA鹽的效果要強于CA酯和組合物實施例6浙貝乙素膽酸鹽、浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽、浙貝乙素膽酸酯和浙貝乙素膽酸組合物(浙貝乙素和膽酸的重量比為2∶1至1∶2)及浙貝乙素祛痰活性的測定采用改良的小鼠酚紅法，選用22±2克的雄性昆明種小鼠，隨機分組，每組10只，實驗前禁食不禁水12h，灌胃給藥后30分鐘，再以500mg/kg的劑量給小鼠腹腔注射5％酚紅生理鹽水溶液，30分鐘后處死小鼠，盡量不損傷氣管，仰位固定于手術板上，剪開頸正中皮膚，分離氣管，小心地剔除氣管周圍組織，然后剪取甲狀軟骨至氣管分叉處的氣管段，取出氣管后，放入盛有生理鹽水2.00ml的試管中，震蕩30分鐘，加入0.20ml的1mol/L的NaOH溶液，以4000轉/分的轉速離心30分鐘，吸取離心液于558nm波長處測定各洗出液的吸光度，根據酚紅標準曲線，計算酚紅的排泌量，由此得出各化合物的祛痰活性，參見附圖2。
結果表明1、浙貝乙素膽酸鹽、浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽、浙貝乙素膽酸酯和浙貝乙素膽酸組合物(浙貝乙素和膽酸的重量比為2∶1至1∶2)及浙貝乙素均顯示出一定的祛痰活性，而其中又以浙貝乙素膽酸鹽為最強。2、從附圖2中可看出浙貝乙素膽酸鹽顯示出比浙貝乙素要強的祛痰活性。
實施例7浙貝乙素膽酸鹽、浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽、浙貝乙素膽酸酯和浙貝乙素膽酸組合物(浙貝乙素和膽酸的重量比為2∶1至1∶2)及浙貝乙素平喘活性的測定取150-200克的豚鼠，雌雄不拘，逐一測定引喘潛伏期，挑選合格者。將豚鼠放入402型超聲霧化儀中，以恒定速率噴入2％氯化乙酰膽堿和0.1％磷酸組胺的等量混合液15秒，觀察6分鐘之內豚鼠出現喘息性抽搐的潛伏期即引喘潛伏期，如見豚鼠跌倒立即將其取出，以免死亡。并記錄引喘潛伏期，引喘潛伏期大于120秒則認為不合格而不予選用。次日將合格豚鼠隨機分組，每組8只，精密稱取各樣品適量，配置成10ml溶液，豚鼠灌胃給藥，劑量為4mg/kg，給藥1小時后，以同樣條件引喘并測定引喘潛伏期。比較給藥前后引喘潛伏期的變化，觀察各樣品的平喘活性，參見附圖3。
結果表明1、五個樣品均顯示出一定的平喘活性，其中以浙貝乙素膽酸鹽為最強，在比氨茶堿低幾十倍的劑量下，二者平喘效果相似，與陰性比較P＜0.01；2、由附圖3還可看出這些樣品中以兩個鹽的平喘活性較浙貝乙素要強。
實施例8浙貝乙素膽酸鹽、浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽、浙貝乙素膽酸酯及浙貝乙素的LD50的測定取體重20±2g健康小白鼠50只，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半。小鼠在25℃環(huán)境中喂養(yǎng)三日，使其充分適應，于第四日開始實驗，實驗之前小鼠禁食不禁水12h，觀察小鼠一次性灌胃給藥后的中毒癥狀，死亡時間和死亡數目，用Bliss法計算LD50及其95％的可信限。
測得浙貝乙素膽酸鹽LD50＝16.2706mg/kg，95％的可信限為15.0882mg/kg～17.5457mg/kg；浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽LD50＝18.4166mg/kg，95％的可信限為11.0767mg/kg～30.6202mg/kg；浙貝乙素膽酸酯LD50＝10.2567mg/kg，95％的可信限為9.0176mg/kg～11.3207mg/kg；而原料藥浙貝乙素LD50＝5.2208mg/kg，95％的可信限為4.5251mg/kg～6.0234mg/kg，由急性毒性結果表明浙貝乙素與膽汁酸成鹽或成酯后，毒性大幅降低，尤其是所成的鹽，毒性僅為浙貝乙素的1/3，結合實施例5和實施例8，兩實施例的實驗結果說明浙貝乙素和膽汁酸成鹽或成酯后的衍生物在鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘方面具增效減毒的作用。
權利要求
1.一種或多種具有鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘活性的有機鹽，其特征在于它是利用浙貝乙素的堿性中心和膽汁酸的酸性中心進行反應而成的鹽，其結構通式如下 當為浙貝乙素膽酸鹽時，其取代基R1是α氫；R2是α羥基；R3是α羥基；當為浙貝乙素去氧膽酸鹽時，其取代基R1是α氫；R2是α氫；R3是α羥基；當為浙貝乙素鵝去氧膽酸鹽時，其取代基R1是α氫；R2是α羥基；R3是α氫；當為浙貝乙素豬去氧膽酸鹽時，其取代基R1是α羥基；R2是α氫；R3是α氫；當為浙貝乙素熊去氧膽酸鹽時，其取代基R1是α氫；R2是β羥基；R3是α氫。
2.一種或多種來源于浙貝乙素和膽汁酸反應而成的酯，其特征在于利用浙貝乙素結構中的3位羥基和膽汁酸中的羧基進行反應而成的酯，結構通式如下 當為浙貝乙素膽酸酯時，其取代基R1是α氫R2是α羥基；R3是α羥基；當為浙貝乙素去氧膽酸酯時，其取代基R1是α氫；R2是α氫；R3是α羥基；當為浙貝乙素鵝去氧膽酸酯時，其取代基R1是α氫；R2是α羥基；R3是α氫；當為浙貝乙素豬去氧膽酸酯時，其取代基R1是α羥基；R2是α氫；R3是α氫；當為浙貝乙素熊去氧膽酸酯時，其取代基R1是α氫；R2是β羥基；R3是α氫。
3.一種藥物組合物，其特征在于它是由浙貝乙素和膽汁酸按重量比2∶1至1∶2的比例混合而成的藥物組合物。
4.根據權利要求3所述的藥物組合物，其特征在于所述的膽汁酸是膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸或/和熊去氧膽酸。
5.權利要求1至2所要求保護的通式化合物或權利要求3所述的藥物組合物在制備鎮(zhèn)咳藥物中的應用。
6.權利要求1至2所要求保護的通式化合物或權利要求3所述的藥物組合物在制備祛痰藥物中的應用。
7.如權利要求1至2所要求保護的通式化合物或根據權利要求3的藥物組合物在制備平喘藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及浙貝乙素和膽汁酸(膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸和熊去氧膽酸等膽汁酸)形成的有機鹽，以及以浙貝乙素和這些膽汁酸為原料合成的酯類衍生物，以及將浙貝乙素和膽汁酸中的一種組合而成的藥物組合物。本發(fā)明還涉及到這些有機鹽和酯的衍生物以及藥物組合物在制備鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘藥物中的應用。
文檔編號A61P11/10GK101070337SQ20061001902
公開日2007年11月14日 申請日期2006年5月10日 優(yōu)先權日2006年5月10日
發(fā)明者吳繼洲, 徐仿周, 張勇慧, 阮漢利, 皮慧芳 申請人:華中科技大學