專利名稱：兒茶素類的酯化物、其制造方法及含有該酯化物的飲食品或化妝品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗菌活性，可望應(yīng)用于飲食品或化妝品領(lǐng)域的兒茶素類或茶提取物的脂肪酸酯類。
背景技術(shù)：
在強烈渴求食品的安全·安心的時代，確保食品的安全性至關(guān)重要。隨著對健康追求的提高，在一般食品中發(fā)展低鹽化·低糖化的同時，食品中的水分活性上升，反而創(chuàng)造了微生物易于繁殖的環(huán)境。有文獻報道，產(chǎn)生食物中毒的原因中約87％或87％以上是細菌性的[加藤洋次，2001，月刊食品化學(xué)(FOOD CHEMICALS)(monthly)8月號，第195頁]。并且，雖說低溫流通系統(tǒng)已很發(fā)達，但人們?nèi)詮娏蚁Ｍ_保食品的保存性、安全性。而且，飲料等雖經(jīng)過加熱殺菌處理，但同時耐熱性芽孢菌又成為酸敗的原因。
以往，以防止食品、化妝品的腐敗和變質(zhì)為目的，把對羥基苯甲酸、苯甲酸、山梨酸等作為化學(xué)合成保存劑使用。其添加于食品中時，被定義為食品添加物中的保存劑，使用時有嚴(yán)格的限制。同時還將果膠分解物、魚精蛋白(protamine)、溶菌酶、茶提取物、日柏醇等作為食品添加物中的保存期延長劑使用。因這些天然抗菌劑抗菌活性弱，為完全防止腐敗等需大量添加。另外，因其有效成分為精油成分的較多，芳香獨特強烈及水溶性低，所以其使用范圍和量均受到限制。
茶提取物雖安全且具有適當(dāng)?shù)乃苄裕蛊涑浞职l(fā)揮抗菌效果的濃度存在以下問題，即作為抗菌成分的兒茶素自身所產(chǎn)生的苦味和澀味等會影響食品的香味。為解決此問題，有文獻公開了與環(huán)狀糊精并用的方法(日本特開平3-168046)及使用蛋白質(zhì)的方法[使用蛋白或植物蛋白質(zhì)等的方法(日本特開平2-202900)及與脫脂蛋黃并用的組合物(日本特開2001-31669)]。同樣，也有文獻公開了以降低苦味和澀味、提高水溶性為目的，將茶提取物用環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶使兒茶素類α糖苷化(日本特開平8-298930)及用蔗糖磷酸化酶制造兒茶素類的α-糖苷(日本特開平5-176786)。但對這些經(jīng)糖苷化了的物質(zhì)在有損食品香味方面所得到的改善以及保持或提高抗菌性的方面，卻完全未予記載。另外，在日本特開平11-116418中亦有如下記載，其以提供來自安全性高且廉價的天然物的抗菌物質(zhì)為目的，通過致力研究綠茶飲料的加熱溫度和加熱時間等可制造來自兒茶素類的抗菌物質(zhì)。
同時，也有報道是關(guān)于茶兒茶素類、茶黃素類可使抗耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)的抗生物質(zhì)的抗菌力增強(日本特開平9-132532)的內(nèi)容。
如上所述，雖從抗菌性及安全性方面對以兒茶素類為主要成分的茶提取物進行了種種研究，但卻均未達到既保持抗菌性、又不損傷食品香味及色澤的品質(zhì)方面的深度。
因此，為適應(yīng)消費者安全·安心的需求，更需要濃度低且具抗菌活性的抗菌材料。
并且，已知作為兒茶素類的脂肪酸酯衍生物是表沒食子兒茶素的3位羥基的脂肪酸酯(S.Uesato et al，Bioorg.Med.Chem.Lett，10(2000)1673-75、及US Pat.2003/0105030A1)。其中雖記載了其具有促進抗腫瘤性活性或抑制5-α還原酶活性，但對抗菌活性未加記載。同時，上述S.Uesato et al中雖通過羧基酯酶進行酶合成，但其基質(zhì)是由稱為脂肪酸p-硝基苯酯的、反應(yīng)性高的活性酯進行的酶反應(yīng)，而不是通常的脂肪酸、烷基酯或甘油三酯。
特別是已知兒茶素的3位羥基的脂肪酸酯是癸?；白貦磅ｕ?日本特開昭54-81274)。并記載了其對預(yù)防肝臟壞死及防止脂肪過氧化有效。但對兒茶素類的脂肪酸酯衍生物具有抗菌活性卻絲毫未予記載。且未顯示有關(guān)兒茶素及表兒茶素的辛酸酯的實施例。
專利文獻1日本特開平3-16804專利文獻2日本特開平2-202900專利文獻3日本特開2001-31669專利文獻4日本特開平8-298930
專利文獻5日本特開平5-17678專利文獻6日本特開平11-116418專利文獻7日本特開平9-132專利文獻8日本特開昭54-812非專利文獻1加藤洋次，2001，月刊食品化學(xué)(FOODCHEMICALS)(monthly)8月號，第195頁非專利文獻2S.Uesato et al，Bioorg.Med.Chem.Lett，10(2000)1673-非專利文獻3US P.0105030A1(2003年)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明著眼于兒茶素類的抗菌活性，并在提高其活性的同時減少兒茶素類所具有的苦味·澀味，由此提供一種可用于飲料或加工食品的保存期延長及化妝品防菌，且作為對耐熱性芽孢菌有抗菌活性的物質(zhì)的兒茶素類中鏈脂肪酸酯類。
發(fā)明還提供本發(fā)明的兒茶素類中鏈脂肪酸酯類的制造方法。
本發(fā)明還進一步提供以兒茶素類中鏈脂肪酸酯類為有效成分的抗菌劑。
本發(fā)明者等以含有兒茶素類的茶提取物及兒茶素類為基礎(chǔ)，銳意研究通過變換使用酶法或化學(xué)方法后，能否提高對耐熱性芽孢菌的抗菌活性的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了通過使用綠原酸酯酶和中鏈脂肪酸、其酯或其甘油三酯處理兒茶素類，或通過化學(xué)方法使中鏈脂肪酸與兒茶素類進行酯化反應(yīng)后，比原本的茶提取物或兒茶素類提高了對于耐熱性芽孢菌的抗菌活性，使本發(fā)明得以完成。
因此本發(fā)明是指兒茶素類中至少一個羥基與中鏈脂肪酸形成酯的酯型兒茶素(在本說明書中，有時簡稱為兒茶素類中鏈脂肪酸酯類)。
因在飲食時，本發(fā)明中的兒茶素類中鏈脂肪酸酯類易在消化道內(nèi)被脂肪酶水解成原本的茶提取物及兒茶素類，所以是安全性極高的抗菌劑。即本發(fā)明的物質(zhì)及含有其物的組合物不僅可望應(yīng)用于醫(yī)藥保健品，還可望應(yīng)用于化妝品或飲食品的保存及保存期延長等方面。
在本發(fā)明的兒茶素類中鏈脂肪酸酯類中，形成酯的中鏈脂肪酸的碳數(shù)優(yōu)選為8～12，最優(yōu)選為8。中鏈脂肪酸為直鏈或支鏈、飽和或不飽和均可，但優(yōu)選為直鏈飽和脂肪酸，例如可例舉為正辛酸、癸酸或月桂酸等的中鏈脂肪酸。最優(yōu)選為正辛酸。
從抗菌活性強方面優(yōu)選的中鏈脂肪酸酯類的非限定示例可例舉如下至少3位、5位或7位羥基中的任一個形成酯的酯型兒茶素。
只有2處羥基形成酯的酯型兒茶素(3’位和4’位的2處同時形成酯時，抗菌活性會稍有減弱，但也包含于本發(fā)明中)。
更具體地說，可例舉如下。
脂肪酸與兒茶素類，優(yōu)選與兒茶素或表兒茶素的3位羥基形成酯的單酯，脂肪酸與兒茶素類，優(yōu)選與兒茶素或表兒茶素的5位及3’位或4’位形成酯的二酯，脂肪酸與兒茶素類，優(yōu)選與兒茶素或表兒茶素的3位及3’位或4’位形成酯的二酯，以及脂肪酸與兒茶素類，優(yōu)選與兒茶素或表兒茶素的7位及3’位或4’位形成酯的二酯。
具體實施例方式
在本說明書中，作為原料使用的兒茶素類可優(yōu)選兒茶素(catechin)、表兒茶素(epicatechin)、沒食子兒茶素(gallocatechin)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin)，特別是還可使用兒茶素沒食子酸酯(catechingallate)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate)及表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate)。上述物質(zhì)具有羥基，可與中鏈脂肪酸形成酯。兒茶素類的部分或全部羥基可接受不影響其反應(yīng)性能的酯化等的修飾。
兒茶素類因含有于茶提取物中，所以將茶提取物直接作為本發(fā)明的原料使用正合適。對茶提取物無特別限制，例如可例舉為稱為煎茶、烘焙茶、玉露、冠茶、蒸制茶的綠茶類的不發(fā)酵茶，總稱為嬉野茶、青柳茶、烹茶的各種中國茶等的不發(fā)酵茶，包種茶、烏龍茶等的半發(fā)酵茶，紅茶、阿波番茶、碁石茶、普洱茶等的發(fā)酵茶及馬黛茶等的提取物。另外，茶提取物也可使用市場銷售的太陽化學(xué)株式會社制的SUNPHENON(綠茶兒茶素)、三井農(nóng)林株式會社制的POLYPHENON、三得利株式會社制的SUNOOLONG。
通過酶反應(yīng)的制造從兒茶素類中制造兒茶素類中鏈脂肪酸酯類，可利用酶反應(yīng)。
兒茶素類可作為水溶液用于反應(yīng)。也可直接使用富含兒茶素類的茶提取液。反應(yīng)時pH為3～7。還可在反應(yīng)體系中不使用水，而將兒茶素類作為粉末添加于反應(yīng)體系中使用的方法。
反應(yīng)中可使用的酶為酯酶，例如包含綠原酸酯酶及阿魏酸酯酶。已知這些酯酶是來自Asp.japonicus或Lactobacillus acidophilus的酶，并作為食品加工用酶由市場銷售。
例如，使用綠原酸酯酶(kikkoman公司制)或阿魏酸酯酶(日本Biocon公司制)均適合。
使用上述酯酶，可在兒茶素類的羥基上酯化中鏈脂肪酸。中鏈脂肪酸可使用游離的酸，也可使用中鏈脂肪酸中碳數(shù)為1～3的烷基酯，或中鏈脂肪酸的甘油三酯的形態(tài)。中鏈脂肪酸可在溶劑為正己烷、苯、甲苯等的反應(yīng)中與惰性非極性溶劑混合，在有水存在或無水存在的狀態(tài)下進行反應(yīng)。在無水條件下，兒茶素類如上所述以粉末形態(tài)添加于反應(yīng)體系。
反應(yīng)可在兒茶素類的水溶液及中鏈脂肪酸、其酯、及甘油三酯類的有機溶劑中，或在無上述溶劑的物質(zhì)中將酶以粉狀或溶解于水后添加，再經(jīng)靜置、攪拌、振蕩及混合來進行。反應(yīng)溫度應(yīng)為10～60℃，優(yōu)選為30～50℃左右。反應(yīng)時間為4～48小時雖已足夠，但也可經(jīng)時分析反應(yīng)液中的油層，當(dāng)酯化物的產(chǎn)量達最高時中止反應(yīng)。兒茶素類的量、中鏈脂肪酸的量及酶的量，作為標(biāo)準(zhǔn)可使用1∶2～10∶0.5～10(w/w)。
酶也可使用固定于載體的固定化酶代替粉狀酶。酶的固定化方法采用公知的方法，固定用載體可使用硅膠、硅藻土(celite)、k-角叉菜膠、甲殼質(zhì)、藻酸納等公知的載體{生物反應(yīng)器(Bioreactor)，福井三郎監(jiān)修·主編，講談社Scientific(1985年)；實踐生物反應(yīng)器(Bioreactor)，食品產(chǎn)業(yè)生物反應(yīng)器系統(tǒng)(Bioreactor System)技術(shù)研究組合編食品化學(xué)新聞社(1990年)}。而且也可將酶固定在用于水處理的離子交換樹脂上使用。其他的還可將酶固定于吸附色譜法及疏水吸附色譜法中使用的樹脂上后使用，一般地，可吸附蛋白質(zhì)的樹脂載體均可用于固定。
以兒茶素或表兒茶素作為原料進行酶反應(yīng)時，可得到3位的羥基與中鏈脂肪酸酯化后的產(chǎn)物。酯化產(chǎn)物可去除溶劑后直接使用，也可由硅膠色譜法及/或高速液相色譜法精制后使用。精制后的酯化產(chǎn)物為固狀(粉狀)物。
通過化學(xué)合成制造通過將兒茶素類，例如兒茶素或表兒茶素與中鏈脂肪酸在脫水縮合劑如碳化二亞胺衍生物的存在下，或中鏈脂肪酸氯化物和三乙胺或吡啶等的鹽基的存在下，在非質(zhì)子溶劑中或無溶劑時，進行0～60℃、2～24小時的反應(yīng)，可得到從兒茶素類中一個羥基被酯化后的產(chǎn)物到全由脂肪酸酯化的產(chǎn)物的混合物。這些混合物在必要時，例如可通過硅膠色譜法或更進一步通過高速液相色譜法等的通常方法精制，以分離目的位置被酯化的產(chǎn)物。
完全被酯化了的兒茶素類在氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀等的堿性金屬或堿性有機物和水、酒精等的質(zhì)子溶劑中，通過0～50℃、2～48小時的處理，可轉(zhuǎn)化為兒茶素類中部分羥基被酯化的產(chǎn)物。此時，所得到主要是3位羥基被酯化的產(chǎn)物。
抗菌活性本發(fā)明的兒茶素類中鏈脂肪酸酯類中，由1個或2個中鏈脂肪酸酯化了的產(chǎn)物，對于芽孢菌例如桿菌屬的菌或為耐熱性嗜酸菌的嗜酸性乳桿菌(L.Acdophilus)，與原本原料的兒茶素或表兒茶素相比顯示了強的增殖抑制作用。除上述菌外，還可期望對其他一般細菌的增殖抑制。
抗菌活性的測定法可采用公知的適當(dāng)?shù)姆椒?，例如可用實施?的方法進行。
本發(fā)明的兒茶素類的中鏈脂肪酸酯類，作為單體或組合物，可在食品領(lǐng)域的綠茶、無醇飲料、酒精飲料等的清涼飲料中，或調(diào)味劑、點心類、糖漿類、果實加工品、蔬菜加工品、肉制品、罐·瓶裝類等的一般食品中用于保存或延長保存期。另外在化妝品領(lǐng)域可用于防止化妝乳膏(cream)、軟膏、化妝液等的腐敗及變質(zhì)。
實施例以下以實施例為基礎(chǔ)進一步具體說明本發(fā)明，但其不限定本發(fā)明的范圍。
實施例1 酯化兒茶素的化學(xué)合成將兒茶素水合物(3.05g、10.5mmol)溶解于20ml四氫呋喃(THF)中，加入吡啶2.5ml(30.9mmol)。將混合液用冰冷卻，添加正辛酸氯化物3.6ml(21.1mmol)。添加后，置于室溫攪拌一夜。在反應(yīng)液中加入乙酸乙酯(AcOEt)，用飽和硫酸氫鉀水溶液、水、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水順次洗凈，再用無水硫酸鈉干燥后減壓餾出溶劑。把所得到的殘渣用硅膠色譜法分離(AcOEt/正己烷＝1/2～2/1)。在二酯組分中，用TLC(乙酸乙酯/正己烷＝1∶1)得到為高純度組分的3’，4’-O-二辛酰兒茶素1.25g。并且，作為單酯組分，可得到高純度的3’(及4’)-O-辛酰兒茶素0.78g。連接于3’或4’上的辛?；嗷マD(zhuǎn)移，成為基本上為1∶1的混合物。
3，4’-O-二辛酰-(+)-D-兒茶素(105)白色結(jié)晶，1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.87(6H，m)，1.2-1.4(16H，m)，1.60(4H，m)，2.39(1H，dd)，2.55(4H，t)，2.75(1H，dd)，3.86(1H，m)，4.65(1H，d)，5.11(1H，d)，5.72(1H，d)，6.00(1H，d)，7.2-7.4(3H，m)，8.99(1H，s)，9.24(1H，s)。
3’-O-辛酰及4’-O-辛酰-(+)-D-兒茶素(107)無定形物，1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.87(3H，t)，1.2-1.4(8H，m)，2.16(2H，m)，1.63(2H，m)，2.37(1H，m)，2.54(2H，t)，2.69(1H，m)，3.83(1H，m)，4.55(1H，dd)，5.00(1H，dd)，5.70(1H，d)，5.90(1H，s)，6.7-7.1(3H，m)，9.05(1H，s)，9.20(1H，s)，9.59(1H，s)。
實施例2 酯化兒茶素的化學(xué)合成將兒茶素水合物(3.04g、47.0mmol)溶解于20ml四氫呋喃(THF)中，加入吡啶3.8ml(30.9mmol)。將混合液用冰冷卻，添加正辛酸氯化物5.4ml(31.6mmol)。添加后，置于室溫攪拌一夜。在反應(yīng)液中加入乙酸乙酯(AcOEt)，用飽和硫酸氫鉀水溶液、水、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水順次洗凈，再用無水硫酸鈉干燥后減壓餾出溶劑。把所得到的殘渣用硅膠色譜法分離(AcOEt/正己烷＝1/2～2/1)。在二酯組分中，用TLC(乙酸乙酯/正己烷＝1∶1)得到為高純度組分的3’(或4’)，5-二-O-辛酰兒茶素0.17g及3’(或4’)，3-二-O-辛酰兒茶素0.10g。并且，作為其他組分，可得到2成分的組分(0.54g)，把一部分用HPLC(色譜柱Develosil C30-UG5、10×250mm、洗脫液80％乙腈水溶液)精制，得到3’(或4’)，7-二-O-辛酰以及3’，4’-O-二辛酰兒茶素。
3’(或4’)，5-二-O-辛酰-(+)-D-兒茶素(109)1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.85(6H，m)，1.2-1.4(16H，m)，1.63(4H，m)，2.18(1H，m)，2.36(1H，m)，2.54(4H，m)，3.86(1H，m)，4.63(1H，dd)，5.13(1H，dd)，6.0-6.2(2H，m)，6.7-7.1(3H，m)，9.5-9.7(2H，m)。
3’(或4’)，3-二-O-辛酰-(+)-D-兒茶素(110)1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.86(6H，m)，1.1-1.4(18H，m)，1.62(2H，m)，2.15(2H，m)，2.70(1H，m)，4.9-5.2(2H，m)，5.78(1H，d)，5.94(1H，s)，6.7-7.0(3H，m)，9.08(1H，d)，9.36(1H，s)，9.69(1H，s)。
3’(或4’)，7-二-O-辛酰-(+)-D-兒茶素(111)1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.86(6H，m)，1.2-1.4(16H，m)，1.60(4H，m)，2.38(1H，m)，2.55(4H，t)，2.75(1H，m)，3.90(1H，m)，4.6-4.8(1H，m)，5.0-5.2(1H，m)，5.7-6.2(2H，m)，6.7-7.4(3H，m)，8.9-9.8(2H，m)。
實施例3 酯化兒茶素的化學(xué)合成將兒茶素水合物(3g、10.3mmol)溶解于15ml四氫呋喃(THF)中，加入吡啶6.3ml(77.9mmol)。將混合液用冰冷卻，添加正辛酸氯化物9.7ml(56.8mmol)。添加后，置于室溫攪拌一夜。在反應(yīng)液中加入乙酸乙酯(AcOEt)，用飽和硫酸氫鉀水溶液、水、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水順次洗凈，再用無水硫酸鈉干燥后減壓餾出溶劑。把所得到的殘渣用硅膠色譜法分離(AcOEt/正己烷＝1/20～1/4)。減壓濃縮后，可得到7.0g的5-O-辛酰兒茶素及1.3g的5，7，3’，4’-四-O-辛酰兒茶素。將5-O-辛酰兒茶素(7.0g、7.6mmol)溶解于20ml二氯甲烷中，加入(1.74ml、28.8mmol)的乙醇胺，置于室溫下攪拌一夜。將反應(yīng)液用AcOEt/正己烷＝1/4稀釋后直接用硅膠色譜法分離(AcOEt/正己烷＝1/4～2/1)。將二酯再用色譜分離法(二氯甲烷/丙酮＝10/1～4/1)精制，得到高純度的3，7-二-O-辛酰兒茶素(75mg)。并且，將單酯組分濃縮后，得到1.46g的3-O-辛酰兒茶素。
3，7-二-O-辛酰-(+)-D-兒茶素(116)1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.85(6H，m)，1.1-1.4(18H，m)，1.59(2H，m)，2.15(2H，t)，2.4-2.6(4H，m)，5.00(1H，d)，5.13(1H，q)，6.13(1H，d)，6.21(1H，d)，6.56(2H，dd)，6.6-6.7(2H，m)，8.95(2H，s)，9.60(1H，s)。
3-O-辛酰-(+)-D-兒茶素(115)無定形結(jié)晶。1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.85(3H，t)，1.1-1.5(10H，m)，2.16(2H，m)，2.64(1H，dd)，4.90(1H，d)，5.10(1H，q)，5.77(1H，d)，5.93(1H，d)，6.57(1H，dd)，6.7-6.8(2H，m)，8.91(2H，bs)，9.05(1H，s)，9.32(1H，s)。
實施例4 酯化兒茶素的化學(xué)合成將5-O-辛酰兒茶素(6.6g、7.2mmol)溶解于20ml二氯甲烷中，加入乙醇胺(1.21ml、20.0mmol)，置于室溫下攪拌一夜。將反應(yīng)液用AcOEt/正己烷＝1/4稀釋后直接用硅膠色譜法分離(AcOEt/正己烷＝1/4～2/1)。在二酯組分內(nèi)，用TLC得到作為高純度的組分的3，5-二-O-辛酰兒茶素(180mg)。
3，5-二-O-辛酰-(+)-D-兒茶素(126)0.85(6H，m)，1.0-1.4(16H，m)，1.48(2H，t)，1.61(2H，t)，2.19(2H，t)，2.5-2.7(4H，m)，4.9-5.3(2H，m)，6.11(1H，d)，6.15(1H，d)，6.57(1H，dd)，6.6-6.8(2H，m)，9.06(2H，b)，9.86(1H，b)。
實施例5 酯化兒茶素的化學(xué)合成將4-O-辛酰兒茶素(3.5g、4.4mmol)溶解于10ml二氯甲烷中，加入乙醇胺(0.47ml、7.8mmol)，置于室溫下攪拌一夜。將反應(yīng)液用AcOEt/正己烷＝1/4稀釋后直接用硅膠色譜法分離(AcOEt/正己烷＝1/4～2/1)。在二酯組分內(nèi)，用TLC得到高純度的5，7-二-O-辛酰兒茶素(0.3g)。
5，7-二-O-辛酰兒茶素-(+)-D-兒茶素(121)1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.87(6H，m)，1.2-1.4(16H，m)，1.6-1.7(4H，m)，2.4-2.7(4H，m)，3.93(1H，q)，4.71(1H，d)，6.51(2H，dd)，6.59(1H，dd)，6.6-6.8(2H，m)，8.90(2H，bs)。
實施例6 抗菌活性的測定將用實施例1～5及后述參考例1制造的本發(fā)明物質(zhì)及兒茶素在二甲亞砜中溶解成種種濃度，在平底的96孔型多孔平板(CORNING&COSTAR公司制)中加入2μL后，再加入在預(yù)制的芽孢形成培養(yǎng)基{多聚蛋白胨10.0g、酵母膏5.0g、碳酸鈣15.0g、瓊脂15.0g、無機鹽水溶液5.0mL、蒸餾水1000mL；但其無機鹽水溶液的組成為硫酸鎂·7水合物4.0g、硫酸錳·5水合物0.216g、硫酸鐵·7水合物0.2g、氯化鈉0.2g、蒸餾水100mL}中配制的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis的芽孢為1×107個/mL的生理鹽水懸浮液50μL。在其中加入肉湯液體培養(yǎng)基(pH為7.0，日水制藥株式會社制)50μL，置于37℃培養(yǎng)一整夜。在培養(yǎng)開始時和培養(yǎng)開始后，用酶標(biāo)儀(Microplate Reader)(Thermo Labsystems公司制，芬蘭)計算測量690nm時的吸光度。以由下式算出的增殖抑制率為基礎(chǔ)，把抑制率和試劑濃度作為兩軸制成分布圖，求出本發(fā)明物對芽孢菌的50％抑制濃度(IC50)。
增殖抑制率(％)＝100×{Δ690(無添加)-Δ690(添加試劑)}/Δ690(無添加)，在此Δ690(無添加)表示培養(yǎng)開始前后的無添加組690nm時值的差，Δ690(試劑)表示培養(yǎng)開始前后的試劑添加組690nm時值的差。結(jié)果如表1所示。
對于耐高溫嗜酸性芽孢細菌酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)，亦可其變更培養(yǎng)溫度條件和液體培養(yǎng)基兩種類后同法進行，求出活性{培養(yǎng)溫度45℃；液體培養(yǎng)基干燥酵母膏(DifcoLaboratories制)0.4％、可溶性淀粉(nacalai tesque株式會社制)0.4％、葡萄糖(nacalai tesque株式會社制)1％、用1N硫酸調(diào)整到pH為3.8}。
結(jié)果如表1所示。


實施例7 3-O-辛酰-(+)-D-兒茶素(酶合成)在3-O-辛?；鶅翰杷氐幕瘜W(xué)合成品的HPLC系統(tǒng)(日立D-7000型、Diode-Array檢測器L-7451型)、色譜柱Develosil C30-UG-5(野村化學(xué)株式會社制、4.6×150mm、流動相5％-90％乙腈/0.1％TFA、0-15分鐘梯度洗脫、流速1.0ml/分鐘、檢測波長230nm或280nm)中，以保留時間14.2分鐘為指標(biāo)，對市場銷售的脂肪酶、酯酶酶劑進行了鑒別。而且，酶反應(yīng)體系是將兒茶素5mg溶解于20mM乙酸緩沖液(pH5.0)0.3ml中之后，添加酶劑、再添加辛酸0.3ml，在37℃下振蕩反應(yīng)。對反應(yīng)液的油層部分進行HPLC分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)綠原酸酯酶(kikkoman公司制)具有對兒茶素的酯轉(zhuǎn)移活性。結(jié)果顯示辛酸的峰(12.9分鐘)之后出現(xiàn)了14.2分鐘位置的峰，通過與化學(xué)合成品進行混合色譜分析，其保留時間與3-O-辛酰基兒茶素一致。
實施例8 3-O-辛酰-(+)-D-兒茶素(酶合成)將兒茶素5g溶解于300ml緩沖液中，加入綠原酸酯酶50g、再加上辛酸300ml用攪拌器邊攪拌邊進行20小時的反應(yīng)。將反應(yīng)液分液，把油層水洗后，減壓蒸餾(120℃、2mmHg)，去除辛酸后，將蒸餾殘渣用硅膠色譜法[用二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇(1％-30％的梯度)洗脫]部分精制，得到1.3g的粗生成物。將其一部分用Develosil ODS-HG-5分取色譜柱(野村化學(xué)株式會社制、10×250mm、流動相70％乙腈/0.1％TFA、流速1.3ml/分鐘、1.3ml分離)分離提取，得到高純度的上記化合物。NMR及質(zhì)譜分析與相對應(yīng)的合成品一致。
實施例9 3-O-辛酰-(+)-D-表兒茶素的酶合成將表兒茶素5g溶解于300ml緩沖液中，加入綠原酸酯酶50g再加上辛酸乙酯300ml用攪拌器邊攪拌邊進行20小時的反應(yīng)。將反應(yīng)液分液，把油層水洗后，用無水硫酸鈉干燥，之后用硅膠色譜法[用二氯甲烷洗脫正辛酸甲酯后，用二氯甲烷-甲醇(1％-30％的梯度)洗脫]部分精制，得到1.1g的粗生成物。將其一部分用Develosil C30-UG-5分取色譜柱(野村化學(xué)株式會社制、10×250mm、流動相60％乙腈/0.1％TFA、流速1.3ml/分鐘、0.65ml分離)分離提取，得到高純度的上記化合物。
實施例10 由各種脂肪酸供體進行的酯化物的酶合成將辛酸(C8)、辛酸乙酯(C8Et)、辛酸甘油三酯(MCT)作為脂肪酸供體與實施例8同樣進行酶反應(yīng)，對于反應(yīng)液中的油層部分經(jīng)時進行HPLC分析的結(jié)果，確認了各自的酯化物峰的增加。


C兒茶素、EC表兒茶素、C8辛酸、C8Et辛酸乙酯、MCT辛酸甘油三酯由上述結(jié)果可確認，根據(jù)本發(fā)明的酶法，除游離的辛酸外，辛酸乙酯及辛酸甘油三酯也成為脂肪酸供體，生成兒茶素及表兒茶素的各脂肪酸酯化物。
參考例1 3-O-癸?；?(+)-兒茶素的合成與實施例4相同，從兒茶素水合物(6.3g、21.8mmol)、及己酸氯化物25g(131.1mmol)中得到粗5-O-癸?；鶅翰杷?23.5g)。將其中的6g溶解于20ml二氯甲烷中，加入乙醇胺(1.75ml、29.0mmol)，置于室溫下攪拌一夜。將反應(yīng)液用AcOEt/正己烷＝1/4稀釋后直接用硅膠色譜法分離(AcOEt/正己烷＝1/4～2/1)。將所得到的單酯組分濃縮后，得到1.25g的3-O-癸?；鶅翰杷?無定形結(jié)晶)。
1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.85(3H，t)，1.1-1.5(12H，m)，2.1-2.2(2H，m)，2.6-2.7(1H，m)，4.90(1H，d)，5.10(1H，q)，5.76(1H，d)，5.92(1H，d)，6.56(1H，dd)，6.6-6.8(2H，m)，8.88(1H，s)，8.93(1H，s)，9.05(1H，s)，9.32(1H，s)。
權(quán)利要求
1.一種抗菌劑，其含有作為有效成分的由兒茶素類中至少一個羥基與中鏈脂肪酸形成酯的酯型兒茶素的至少一種。
2.權(quán)利要求1的抗菌劑，其形成酯的中鏈脂肪酸的碳數(shù)為8～12。
3.權(quán)利要求2的抗菌劑，其形成酯的中鏈脂肪酸的碳數(shù)為8。
4.權(quán)利要求1～3中任一項的抗菌劑，其兒茶素類中至少3位的羥基形成酯。
5.權(quán)利要求1～3中任一項的抗菌劑，其兒茶素類中至少5位的羥基形成酯。
6.權(quán)利要求1～3中任一項的抗菌劑，其兒茶素類中至少7位的羥基形成酯。
7.權(quán)利要求4～6中任一項的抗菌劑，其有2處的羥基形成酯。
8.權(quán)利要求1～3中任一項的抗菌劑，其含有作為有效成分的且從含有下述酯脂肪酸與兒茶素的3位羥基形成酯的單酯，脂肪酸與兒茶素的5位及3’位或4’位形成酯的二酯，脂肪酸與兒茶素的3位及3’位或4’位形成酯的二酯，以及脂肪酸與兒茶素的7位及3’位或4’位形成酯的二酯的群中選出的酯型兒茶素的至少一種。
9.權(quán)利要求1～8中任一項所述的抗菌劑，其為用于食品、飲料、化妝品或醫(yī)藥品的抗菌劑。
10.權(quán)利要求1～9中任一項的抗菌劑，其對耐熱性芽孢菌具抗菌活性。
11.一種制造酯型兒茶素的方法，其在從含有中鏈脂肪酸、其酯或甘油三酯的群中選出的脂肪酸供體的存在下，通過綠原酸酯酶或阿魏酸酯酶，使兒茶素類或其酯衍生物形成酯或進行酯交換反應(yīng)，從而由兒茶素類的至少一個羥基與中鏈脂肪酸形成酯。
12.權(quán)利要求11的方法，其酯形成或酯交換反應(yīng)在pH為3～7的緩沖液中，溫度為30～50℃時，進行4～48小時。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其脂肪酸供體為辛酸、辛酸乙酯或辛酸甘油三酯。
14.權(quán)利要求11～13中任一項的方法，兒茶素的3位與中鏈脂肪酸形成酯。
15.權(quán)利要求11～14中任一項的方法，兒茶素類以茶提取物的狀態(tài)用于反應(yīng)。
16.酯型兒茶素，其兒茶素類中至少一個羥基與中鏈脂肪酸形成酯(但不包括3-O-癸?；鶅翰杷?。
17.權(quán)利要求16中的酯型兒茶素，其形成酯的中鏈脂肪酸的碳數(shù)為8～12。
18.權(quán)利要求17中的酯型兒茶素，其形成酯的中鏈脂肪酸的碳數(shù)為8。
19.權(quán)利要求16～18中任一項的酯型兒茶素，其兒茶素類中至少3位的羥基形成酯。
20.權(quán)利要求16～18中任一項的酯型兒茶素，其兒茶素類中至少5位的羥基形成酯。
21.權(quán)利要求16～18中任一項的酯型兒茶素，其兒茶素類中至少7位的羥基形成酯。
22.權(quán)利要求19～21中任一項的酯型兒茶素，其有2處的羥基形成酯。
23.權(quán)利要求16～18中任一項的酯型兒茶素，其由含有下述酯脂肪酸與兒茶素的3位羥基形成酯的單酯，脂肪酸與兒茶素的5位及3’位或4’位形成酯的二酯，脂肪酸與兒茶素的3位及3’位或4’位形成酯的二酯，以及脂肪酸與兒茶素的7位及3’位或4’位形成酯的二酯的群中選出。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可用于飲料、加工食品的保存期延長及化妝品防菌，且對耐熱性芽孢菌有抗菌活性的物質(zhì)。本發(fā)明是兒茶素類中至少一個羥基與中鏈脂肪酸形成酯的酯型兒茶素。本發(fā)明中兒茶素類的中鏈脂肪酸酯類作為單體或組合物，對耐熱性芽孢菌顯示了強的增殖抑制，并通過添加于飲食品中，可防止飲食品腐敗及變質(zhì)，且還通過添加于化妝品中，可防止化妝品的腐敗及變質(zhì)。
文檔編號A61K8/30GK1810166SQ20061000264
公開日2006年8月2日 申請日期2006年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月26日
發(fā)明者深見治一, 中尾正宏, 并川耕士, 前田滿 申請人:三得利株式會社