專利名稱：4－氧代喹啉化合物的穩(wěn)定晶體的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及6-(3-氯-2-氟芐基)-1-[(S)-1-羥甲基-2-甲基丙基]-7-甲氧基-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸(有時在下文中稱為化合物A) 的穩(wěn)定晶體及其混合晶體。本發(fā)明還涉及包含所述晶體或混合晶體的藥物組合物。
背景技術(shù)：
本申請人已經(jīng)在由相同的申請人提交的日本專利申請?zhí)?003-293117中公開了上述化合物A具有對整合酶的抑制作用并且顯示抗HIV的作用(具體地，實施例4-32和實驗實施例)，所述整合酶是作為AIDS(獲得性免疫缺陷綜合征)的致病病毒的HIV(人免疫缺陷病毒)生長所必需的酶。
通常，當將化合物用作藥品時，要求所述化合物的化學和物理的穩(wěn)定性從而維持質(zhì)量和/或有利于保存。出于相同的原因，理想地，不僅最終的藥物組合物，而且作為合成原材料的化合物在化學和物理上都是穩(wěn)定的。
因此，這樣的化合物優(yōu)選地是晶體，特別優(yōu)選地是穩(wěn)定的晶體。當所述化合物具有晶體同質(zhì)多晶現(xiàn)象時，一般選擇最穩(wěn)定的晶體。
盡管上述申請描述了化合物A，但是沒有發(fā)現(xiàn)關于化合物A的晶形的具體描述。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明人已經(jīng)研究了化合物A的各種晶形，嘗試發(fā)現(xiàn)化合物A的穩(wěn)定晶體。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)化合物A具有晶體同質(zhì)多晶現(xiàn)象，并且具有特定晶形的化合物A的晶體有效用作穩(wěn)定的晶體，基于所述發(fā)現(xiàn)，他們完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供下列各項。
如通過X-射線粉末衍射計所測量，6-(3-氯-2-氟芐基)-1-[(S)-1-羥甲基-2-甲基丙基]-7-甲氧基-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸的晶體(晶形II)，其X-射線粉末衍射模式在6.56，13.20，19.86，20.84，21.22，25.22°的衍射角2θ(°)下具有特征衍射峰；[2]如通過X-射線粉末衍射計所測量，6-(3-氯-2-氟芐基)-1-[(S)-1-羥甲基-2-甲基丙基]-7-甲氧基-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸的晶體(晶形III)，其X-射線粉末衍射模式在8.54，14.02，15.68，17.06，17.24，24.16，25.74°的衍射角2θ(°)下具有特征衍射峰；[3]6-(3-氯-2-氟芐基)-1-[(S)-1-羥甲基-2-甲基丙基]-7-甲氧基-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸的晶體(晶形III)，其外推起始溫度是162.1±5.0℃；[4]上述[1]到[3]中任一項的晶體，其具有不低于70％的晶體純度；[5]包含上述1的晶體和上述[2]或[3]的晶體的混合晶體；[6]上述[5]的混合晶體，其中晶體純度不低于70％；[7]包含上述[1]-[4]中任一項的晶體，或上述[5]或[6]的混合晶體，和藥用載體的藥物組合物；[8]一種整合酶抑制劑，其包含上述[1]-[4]中任一項的晶體，或上述[5]或[6]的混合晶體作為活性成分；[9]一種抗病毒劑，其包含上述[1]-[4]中任一項的晶體，或上述[5]或[6]的混合晶體作為活性成分；[10]一種抗-HIV藥劑，其包含上述[1]-[4]中任一項的晶體，或上述[5]或[6]的混合晶體作為活性成分；[11]一種抗HIV組合物，其包含上述上述[1]-[4]中任一項的晶體，或上述[5]或[6]的混合晶體，和一種或多種其它抗HIV活性物質(zhì)作為活性成分；和[12]一種用于與其它抗HIV藥劑進行多藥物療法的抗HIV藥劑，其包含上述[1]-[4]中任一項的晶體，或上述[5]或[6]的混合晶體作為活性成分。
附圖簡述

圖1顯示X-射線粉末衍射模式的多重記錄，其中上面的線顯示晶形III的衍射模式，中間的線顯示晶形I的衍射模式，下面的線顯示晶形II的衍射模式，縱軸顯示衍射強度(cps每秒計數(shù)刻度間隔是2500cps)，橫軸顯示衍射角2θ(°)。
圖2顯示獲自晶形I的在穩(wěn)定性測試的3天保存后的樣品的X-射線粉末衍射模式的多重記錄。為了進行比較，最上面的線顯示晶形II的衍射模式(初始條件)，最下面的線顯示晶形I的衍射模式(開始條件)，從第二條線起顯示的是在下列保存條件下的衍射模式保存條件#6(60℃/75％R.H.，開放容器，3周保存)，保存條件#4(60℃，具有塞子的容器，3周保存)，保存條件#5(60℃，開放容器，3周保存)，保存條件#3(80℃，開放容器，3天保存)和保存條件#2(80℃，具有塞子的容器，3天保存)?？v軸顯示衍射強度(cps每秒計數(shù)刻度間隔是2500cps)，橫軸顯示衍射角2θ(°)。
發(fā)明效果本發(fā)明的化合物A的晶體或混合晶體具有上述的特定晶形并具有優(yōu)異的物理和化學穩(wěn)定性，其又具有這樣的優(yōu)勢，即使得長期保持化合物A的質(zhì)量成為可能，這有利于保存。此外，它們具有這樣的優(yōu)勢，即在各種藥物組合物和大批量的生產(chǎn)過程中的操作容易進行，降低了生產(chǎn)成本。
發(fā)明詳述本發(fā)明在下面詳細進行闡釋。
在本發(fā)明中，化合物A的“晶形II”指化合物A的晶體，如通過X-射線粉末衍射計所測量，其X射線粉末衍射模式在6.56，13.20，19.86，20.84，21.22，25.22°的衍射角2θ(°)下具有特征衍射峰。
在本發(fā)明中，化合物A的“晶形III”指化合物A的晶體，如通過X-射線粉末衍射計所測量，其X射線粉末衍射模式在8.54，14.02，15.68，17.06，17.24，24.16，25.74°的衍射角2θ(°)下具有特征衍射峰。
在上述衍射角2θ(°)下的衍射峰值由于測量工具或測量條件等可能顯示出微小的測量誤差。具體的，測量誤差可以在±0.2，優(yōu)選±0.1，更優(yōu)選±0.06的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的化合物A的晶體也通過熱分析進行表征。例如，當本發(fā)明的化合物A的晶形III進行示差掃描量熱法(DSC)時，吸熱峰的焓是約81J/g，并且外推起始溫度是162.1±5.0℃，優(yōu)選162.1±3.0℃，更優(yōu)選162.1±1.0℃，其中“外推起始溫度”是指，如通過JIS K 7121(塑料的傳遞溫度的測量方法)所定義，在較低溫度側(cè)向較高溫度側(cè)的外推基線與切線的交叉點的溫度，所述切線是在DSC曲線中在較低溫度側(cè)的熔融峰的前沿(leading edge)上顯示最大斜率的點上所引的切線。當吸熱峰的焓和外推起始溫度在上述范圍內(nèi)時，化合物A的晶體是穩(wěn)定的。
本發(fā)明的化合物A的晶體可以是晶形II或晶形III，或晶形II和晶形III的混合晶體。對于在化合物A的藥品等中的使用，優(yōu)選晶形II或晶形III，因為它們是穩(wěn)定的晶體，并且更優(yōu)選晶形III，因為它是最穩(wěn)定的晶體。此外，考慮到作為藥物組合物在給藥后活體生物的可吸收性，晶形II是優(yōu)選的。
在本發(fā)明中，“晶體純度”指化合物A的晶形II或晶形III的純度。在晶形II和晶形III的混合晶體的情形中，其指相對于晶形II和晶形III的物質(zhì)總量的晶體的比率。本發(fā)明的晶體的純度可以通過，例如已知方法諸如X-射線粉末衍射學、熱分析等來測定。本發(fā)明的晶體或混合晶體的純度不需要是100％，并且可以不低于70％，優(yōu)選地不低于80％，更優(yōu)選地不低于90％，更優(yōu)選地不低于95％，并且最優(yōu)選地不低于98％。優(yōu)選在該范圍內(nèi)的純度以保證質(zhì)量。
本發(fā)明的化合物A的晶體或混合晶體可以作為各種藥物組合物施用給哺乳動物(人、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、羊、猴等)等，所述藥物組合物諸如，用于例如預防和/或治療AIDS的抗-HIV藥劑、HIV整合酶抑制劑、抗病毒劑等。
當本發(fā)明的化合物A的晶體或混合晶體用作藥物組合物時，其混合以藥用載體、賦形劑、稀釋劑、填充劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖劑、乳劑、增香劑、著色劑、甜味劑、增稠劑、矯味藥、溶解助劑和本身公知的其它添加劑，諸如水、植物油、醇(例如乙醇或苯甲醇等)、聚乙二醇、甘油三乙酸酯、明膠、糖(例如乳糖、淀粉等)、硬脂酸鎂、滑石、 羊毛脂、凡士林等，通過常規(guī)方法成型為片劑、丸劑、粉末、顆粒劑、栓劑、注射劑、滴眼劑、液體劑、膠囊、錠劑、氣溶膠、酏劑、混懸劑、乳劑、糖漿等，并且進行全身性或局部和口服或腸胃外給藥。
盡管劑量根據(jù)年齡、體重、癥狀、治療效果、給藥方法等有所變化，對于成年人，其通常在每次給藥0.01mg到1g，其以口服或以注射劑的劑型諸如靜脈內(nèi)注射劑等一天給藥一次到數(shù)次。
通常要求抗-HIV藥劑在長時間內(nèi)維持其效果，從而使其可以不僅有效用于病毒生長的短暫抑制，還有效用于禁止病毒再生長。這意味著，長時期給藥是必需的，并且高的單一劑量在夜晚等可能經(jīng)常是不可避免的以便長時期維持效果。這樣的長時期和高劑量的給藥增加了副作用的危險。
鑒于此，本發(fā)明的優(yōu)選方式之一是容許口服給藥的高吸收的這樣的化合物，和能夠?qū)⒈皇┯没衔锏难簼舛染S持達更長時期的這樣的化合物。
至于“AIDS的預防”指，例如將藥劑施用給這樣的個體，其測試HIV為陽性但是尚未發(fā)展為AIDS的疾病狀態(tài)，將藥劑施用給這樣的個體，其在治療后顯示AIDS的改善的疾病狀態(tài)，但是仍舊攜帶待消除的HIV，并且其仍憂慮AIDS的復發(fā)，和施用藥劑消除對于可能的感染的擔心。
本發(fā)明的抗-HIV組合物用于，例如AIDS的多藥物組合治療。待用于抗-HIV組合物的“其它的抗-HIV活性物質(zhì)”的實例包括抗-HIV抗體、HIV疫苗、免疫刺激劑諸如干擾素等、HIV核酶、HIV反義藥物、HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、HIV蛋白酶抑制劑、在病毒識別的宿主細胞的結(jié)合受體(CD4，CXCR4，CCR5等)和病毒之間的結(jié)合抑制劑等。
HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的具體實例包括立妥韋(R)(齊多夫定)、拉夫米定(R)(拉夫米定)、澤瑞特(R)(sanilvudine)、惠妥滋(R)(去羥肌苷)、扎西他濱(R)(扎西他濱)、 阿貝卡韋(R)(硫酸阿巴卡韋)、奈韋拉平(R)(奈韋拉平)、施多寧(R)(依法韋侖)、甲磺酸地拉韋啶(R)(甲磺酸地拉韋啶)、雙汰芝(R)(齊多夫定+拉米夫定)、Trizivir(R)(硫酸阿巴卡韋+拉米夫定+齊多夫定)、Coactinon(R)(乙米韋林)、Phosphonovir(R)、Coviracil(R)、阿洛夫定(3’-氟-3’-脫氧胸苷)、Thiovir(硫代膦甲酸)、卡普韋林(5-[(3，5-二氯苯基)硫代]-4-異丙基-1-(4-吡啶基甲基)咪唑-2-甲醇氨基甲酸)、替諾福韋disoproxil富馬酸鹽(酯)((R)-[[2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]磷酸雙(異丙氧基羰基氧基甲基)酯富馬酸鹽(酯))，DPC-083((4S)-6-氯-4-[(1E)-環(huán)丙基乙烯基]-3，4-二氫-4-三氟甲基-2(1H)-喹唑啉酮)，DPC-961((4S)-6-氯-4-(環(huán)丙基乙炔基)-3，4-二氫-4-(三氟甲基)-2(1H)-喹唑啉酮)，DAPD((-)-β-D-2，6-二氨基嘌呤二氧戊環(huán))，Immunocal，MSK-055，MSA-254，MSH-143，NV-01，TMC-120，DPC-817，GS-7340，TMC-125，SPD-754，D-A4FC，卡普韋林，UC-781，emtricitabine，阿洛夫定，疊氮膦，UC-781，BCH-10618，DPC-083，Etravirine，BCH-13520，MIV-210，硫酸阿巴卡韋/拉米夫定，GS-7340，GW-5634，GW-695634等，其中(R)意為注冊商標(下同)并且其它藥劑的名稱是通用名。
HIV蛋白酶抑制劑的具體實例包括佳息患(R)(硫酸茚地那韋乙醇鹽)、沙奎那韋、Invirase(R)(甲磺酸沙奎那韋)，諾韋(R)(利托那韋)，奈非那韋(R)(甲磺酸奈非那韋)，洛匹那韋，Prozei(R)(氨普奈韋)，Kaletra(R)(利托那韋+洛匹那韋)，mozenavir dimesylate([4R-(4α，5α，6β)]-1，3-雙[(3-氨基苯基)甲基]六氫-5，6-二羥基-4，7-雙(苯基甲基)-2H-1，3-二氮雜-2-酮二甲磺酸鹽(酯))，替拉那韋(3’-[(1R)-1-[(6R)-5，6-二氫-4-羥基-2-氧代-6-苯基乙基-6-丙基-2H-吡喃-3-基]丙基]-5-(三氟甲基)-2-吡啶磺酰胺)，拉西那韋(N-[5(S)-(叔-丁氧基羰基氨基)-4(S)-羥基-6-苯基-2(R)-(2，3，4-三甲氧基芐基)己酰]-L-纈氨酸2-甲氧基乙酰胺)，KNI-272((R)-N-叔-丁基-3-[(2S，3S)-2-羥基-3-N-[(R)-2-N-(異喹啉-5-基氧基乙酰基)氨基-3-甲基硫代丙酰]氨基-4-苯基丁酰]-5，5-二甲基-1，3-噻唑烷-4-羧酰胺)，GW-433908，TMC-126，DPC-681，buckminsterfullerene，MK-944A(MK944(N-(2(R)-羥基-1(S)-茚滿基)-2(R)-苯基甲基-4(S)-羥基-5-[4-(2-苯并[b]呋喃基甲基)-2(S)-(叔-丁基氨基甲?；?哌嗪-1-基]戊酰胺)+硫酸茚地那韋)，JE-2147([2(S)-氧代-4-苯基甲基-3(S)-[(2-甲基-3-氧基)苯基羰基氨基]-1-氧雜丁基]-4-[(2-甲基苯基)甲基氨基]羰基-4(R)-5，5-二甲基-1，3-噻唑)，BMS-232632((3S，8S，9S，12S)-3，12-雙(1，1-二甲基乙基)-8-羥基-4，11-二氧代-9-(苯基甲基)-6-[[4-(2-吡啶基)苯基]甲基]-2，5，6，10，13-五氮雜四癸烷二羧酸二甲酯)，DMP-850((4R，5S，6S，7R)-1-(3-氨基-1H-吲唑-5-基甲基)-4，7-二芐基-3-丁基-5，6-二羥基全氫-1，3-二氮雜-2-酮)，DMP-851，RO-0334649，Nar-DG-35，R-944，VX-385，TMC-114，替拉那韋，福沙那韋鈉，福沙那韋鈣，Darunavir，GW-0385，R-944，RO-033-4649，AG-1859等。
HIV整合酶抑制劑例示為S-1360，L-870810等，DNA聚合酶抑制劑或DNA合成抑制劑例示為膦甲酸鈉注射液(R)，ACH-126443(L-2’，3’-二脫氫-二脫氧-5-氟胞苷)，恩替卡韋((1S，3S，4S)-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]鳥嘌呤)，calanolide A([10R-(10α，11β，12α)]-11，12-二氫-12-羥基-6，6，10，11-四甲基-4-丙基-2H，6H，10H-苯并[1，2-b3，4-b’5，6-b”]三吡喃-2-酮)，calanolide B，NSC-674447(1，1’-偶氮雙甲酰胺)，依斯卡多(歐寄生提取物)，盧比替康等，HIV反義藥物例示為HGTV-43，GEM-92等，抗-HIV抗體或其它抗體例示為NM-01，PRO-367，KD-247，Cytolin(R)，TNX-355(CD4抗體)，AGT-1，PRO-140(CCR5抗體)，抗-CTLA-4Mab等，HIV疫苗或其它疫苗例示為ALVAC(R)，AIDSVAX(R)，Remune(R)，HIVgp41疫苗，HIVgp120疫苗，HIVgp140疫苗，HIVgp160疫苗，HIVp17疫苗，HIVp24疫苗，HIVp55疫苗，AlphaVax載體系統(tǒng)，canarypox gp160疫苗，AntiTat，MVA-F6 Nef疫苗，HIVrev疫苗，C4-V3肽，p2249f，VIR-201，HGP-30W，TBC-3B，PARTICLE-3B等，Antiferon(干擾素-α疫苗)等，干擾素或干擾素激動劑例示為Sumiferon(R)，MultiFeron(R)，干擾素-τ，Reticulose，人白細胞干擾素α等，CCR5拮抗劑例示為SCH-351125等，作用在HIV p24上的藥劑例示為GPG-NH2(甘氨酰-脯氨酰-甘氨酰胺)等，HIV融合抑制劑例示為FP-21399(1，4-雙[3-[(2，4-二氯苯基)羰基氨基]-2-氧代-5，8-二鈉磺酰基]萘基-2，5-二甲氧基苯基-1，4-二腙)，T-1249，合成的聚合結(jié)構(gòu)No3，pentafuside，F(xiàn)P-21399，PRO-542，Enfuvirtide等，IL-2激動劑或拮抗劑例示為白介素-2，Imunace(R)，Proleukin(R)，白細胞介素注射劑(R)，地尼白介素-2(R)等，TNF-α拮抗劑例示為Thalomid(R)(沙利度胺)，英夫利昔單抗(R)(英夫利昔單抗)，curdlan sulate，α-葡糖苷酶抑制劑例示為Bucast(R)等，嘌呤核苷磷酸酶抑制劑例示為培得星(2-氨基-4-氧代-3H，5H-7-[(3-吡啶基)甲基]吡咯并[3，2-d]嘧啶)等，程序性細胞死亡激動劑或抑制劑例示為維司力農(nóng)(R)，Panavir(R)，輔酶Q10(2-癸(3-甲基-2-亞丁烯基)-5，6-二甲氧基-3-甲基-對-苯并醌)等，膽堿酯酶抑制劑例示為益智膠囊(R)等，免疫調(diào)節(jié)劑例示為Imunox(R)，Prokine(R)，Met-腦啡肽(6-de-L-精氨酸-7-de-L-精氨酸-8-de-L-纈氨酰胺-adrenorphin)，WF-10(10-倍稀釋的四氯癸氧化物溶液)，Perthon，PRO-542，SCH-D，UK-427857，AMD-070，AK-602等。
此外，例舉神經(jīng)妥樂平(R)，正二十二烷醇(R)，Ancer 20(R)，Ampligen(R)，Anticort(R)，Inactivin(R)等，PRO-2000，Rev M10基因，HIV特異性細胞毒性T細胞(CTL免疫治療，ACTG方法080治療，CD4-ξ基因治療)，SCA結(jié)合蛋白，RBC-CD4復合物，莫特沙芬釓，GEM-92，CNI-1 493，(±)-FTC，Ushercell，D2S，BufferGel(R)，VivaGel(R)，Glyminox陰道凝膠，十二烷基硫酸鈉，2F5，2F5/2G12，VRX-496，Ad5gag2，BG-777，IGIV-C，BILR-255等。
作為在多藥物組合療法中待用于本發(fā)明的抗-HIV組合物的“其它抗-HIV活性物質(zhì)”，優(yōu)選的是HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和HIV蛋白酶抑制劑。可以組合使用兩種或三種或甚至更多種類的藥劑，其中具有不同作用機制的藥劑的組合是優(yōu)選的實施方案之一。此外，優(yōu)選選擇無副作用加倍(duplication)的藥劑。
藥劑的組合的具體實例包括由下列各項組成的組的組合依法韋侖，替諾福韋，emtricitabine，茚地那韋，奈非那韋，atazanavir，利托那韋+茚地那韋，利托那韋+洛匹那韋和利托那韋+沙奎那韋，去羥肌苷+拉米夫定，齊多夫定+去羥肌苷，司他夫定+去羥肌苷，齊多夫定+拉米夫定，司他夫定+拉米夫定和emtriva，和本發(fā)明的晶體或混合晶體(Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-Infected Adults andAdolescents.2001年8月13日)。特別優(yōu)選的是本發(fā)明的晶體或混合晶體與依法韋侖，茚地那韋，奈非那韋，替諾福韋，emtricitabine，齊多夫定或拉米夫定的兩種藥劑組合使用，和本發(fā)明的晶體或混合晶體與齊多夫定+拉米夫定，替諾福韋+拉米夫定，替諾福韋+齊多夫定，替諾福韋+依法韋侖，替諾福韋+奈非那韋，替諾福韋+茚地那韋，替諾福韋+emtricitabine，emtricitabine+拉米夫定，emtricitabine+齊多夫定，emtricitabine+依法韋侖，emtricitabine+奈非那韋，emtricitabine+茚地那韋，奈非那韋+拉米夫定，奈非那韋+齊多夫定，奈非那韋+依法韋侖，奈非那韋+茚地那韋，依法韋侖+拉米夫定，依法韋侖+齊多夫定或依法韋侖+茚地那韋的三種藥劑的組合使用。
本發(fā)明的化合物A的晶體或混合晶體的制備方法沒有被特別限制，并且所述晶體可以通過本身已知的方法或在下面的實施例中顯示的方法等進行制備。
實施例盡管本發(fā)明的化合物A的晶體的制備方法在下面通過參考實施例進行闡釋，其僅僅是實施例并且不以任何方式來限制本發(fā)明。
參考實施例1化合物A的晶形I的生產(chǎn)步驟1 將2，4-二氟苯甲酸(50g，316mmol)溶于濃硫酸(200ml)中，并在不超過5℃下逐份加入N-碘琥珀酰亞胺(68g，300mmol)。在完成添加后，將混合物于相同溫度下攪拌4.5hr。將反應混合物倒入冰水(約600ml)中，隨后加入10％的亞硫酸鈉水溶液，并攪拌混合物。通過過濾收集沉淀的固體，用水洗滌，并進行真空干燥以得到粗制晶體(85g)。合并以相同方式獲得的粗制晶體(總量205g)，并從50％乙醇水溶液(820ml)重結(jié)晶以得到作為白色固體的2，4-二氟-5-碘苯甲酸(148g，產(chǎn)率73％)。
1H NMR(CDCl3300MHz)(σ)ppm6.94(1H，dd，J＝10.3，10.3Hz)，8.46(1H，d，J＝7.5Hz)步驟2
將步驟1中獲得的化合物(148g，521mmol)溶于甲苯(750ml)，加入亞硫酰氯(76ml，1.04mol)和二甲基甲酰胺(催化量)，將混合物在回流下加熱2hr。于60℃濾去不可溶的物質(zhì)，并將濾液在減壓下進行濃縮并與甲苯(330ml)共沸。將殘余物溶于四氫呋喃(400ml)，并將該溶液逐滴加入到四氫呋喃(400ml)中的3，3-二甲基氨基丙烯酸乙酯(82g，573mmol)和三乙胺(87ml，625mmol)的溶液中，將混合物在回流下加熱7hr。讓反應混合物冷卻到室溫，并在減壓下進行濃縮。加入水(700ml)和乙酸乙酯(800ml)進行分配。用飽和碳酸氫鈉水溶液(250ml，X2)，水(300ml)和飽和鹽水(300ml)連續(xù)洗滌有機層，并通過硫酸鈉進行干燥。在過濾不可溶的物質(zhì)后，將過濾液在減壓下進行濃縮以得到作為褐色固體的2-(2，4-二氟-5-碘苯甲酰)-3-二甲基氨基丙烯酸乙酯的粗制產(chǎn)物(210g)。
步驟3 將步驟2中獲得的粗制產(chǎn)物(210g)溶于四氫呋喃(500ml)，加入(S)-(+)-valinol(54g，521mmol)，將混合物于室溫攪拌30min。將反應混合物在減壓下進行濃縮，并將殘余物溶于二甲基甲酰胺(600ml)。加入碳酸鉀(144g，1.04mol)并將混合物于70℃加熱攪拌2hr。讓反應混合物冷卻，并加入到水(1500ml)中并進行攪拌。通過過濾收集沉淀的固體并用30％乙醇水溶液(500ml)和二乙醚(150ml)與己烷(150ml)的混合溶劑連續(xù)洗滌獲得的固體并將其進行真空干燥以得到作為米色固體的7-氟-1-((S)-1-羥甲基-2-甲基丙基)-6-碘-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯(178g，產(chǎn)率76％)。
1H NMR(DMSO-d6300MHz)(δ)ppm0.72(3H，d，J＝6.6Hz)，1.10(3H，d，J＝6.6Hz)，1.28(3H，t，J＝7.0Hz)，2.27(1H，br)，3.77(1H，br)，3.86(1H，br)，4.23(2H，q，J＝7.0Hz)，4.56(1H，br)，5.12(1H，t，J＝4.9Hz)，8.09(1H，d，J＝11.1Hz)，8.62(1H，d，J＝7.5Hz)，8.68(1H，s)MS(ESI)M+448
步驟4 其中TBDMS意指叔丁基二甲基甲硅烷基基團。
將步驟3中獲得的化合物(80g，179mmol)溶于二甲基甲酰胺(320ml)中，加入咪唑(16g，233mmol)和氯化叔丁基二甲基甲硅烷基(30g，197mmol)，將混合物于室溫攪拌1.5hr。將水加入到反應混合物并用乙酸乙酯抽提混合物。用飽和氯化銨水溶液和飽和鹽水連續(xù)洗滌有機層，并通過硫酸鈉進行干燥。過濾有機層并將濾液在減壓下進行濃縮。通過硅膠色譜法(乙酸乙酯∶己烷＝1∶3-1∶2)純化獲得的殘余物以得到作為無色非晶形形式的1-((S)-1-叔-丁基二甲基甲硅氧基甲基-2-甲基丙基)-7-氟-6-碘-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯(77g，產(chǎn)率77％)。
1H NMR(CDCl3400MHz)(δ)ppm-0.07(3H，s)，-0.05(3H，s)，0.77(9H，s)，0.84(3H，d，J＝6.5Hz)，1.1 8(3H，d，J＝6.5Hz)，1.40(3H，t，J＝7.2Hz)，2.35-2.50(1H，m)，3.85-3.95(1H，m)，3.98-4.10(2H，m)，4.30-4.40(2H，m)，7.26(1H，s)，8.64(1H，s)，8.94(1H，d，J＝7.2Hz)MS(ESI)M+562步驟5 (四氫呋喃中的3-氯-2-氟芐基鋅溴化物溶液的制備)在氬氣流下，將鋅粉(11g，267mmol)懸浮于四氫呋喃(30ml)中，于65℃加入1，2-二溴乙烷(0.15ml，1.8mmol)和氯化三甲基硅烷(0.45ml，3.6mmol)，并將混合物加熱攪拌30min。于65℃逐滴加入在四氫呋喃(100ml)中的3-氯-2-氟芐基溴(41g，178mmol)溶液，并將混合物加熱攪拌2hr讓其冷卻到室溫以得到四氫呋喃中的1M 3-氯-2-氟芐基鋅溴化物溶液。這被用于接下來的主要步驟。
(主要步驟)將步驟4中獲得的化合物(76g，136mmol)溶于四氫呋喃(600ml)中，并在氬氣流下，加入二亞芐基丙酮鈀(II)(3.2g，5.5mmol)和三呋喃基膦(2.6g，11.0mmol)，并于60℃逐滴加入前述在四氫呋喃(178ml，178mmol)中的1M 3-氯-2-氟芐基鋅溴化物溶液。在結(jié)束逐滴添加后，伴隨著在相同溫度下加熱來攪拌混合物2hr。讓反應混合物冷卻到室溫，加入飽和的氯化銨水溶液，并將混合物通過Celite進行過濾。用乙酸乙酯將濾液抽提兩次。用水(兩次)和飽和鹽水連續(xù)洗滌有機層，并通過硫酸鎂進行干燥。過濾有機層并將濾液在減壓下進行濃縮，通過硅膠色譜法(氯仿∶丙酮＝40∶1)純化獲得的殘余物以得到作為無色非晶形形式的1-((S)-1-叔-丁基二甲基甲硅氧基甲基-2-甲基丙基)-6-(3-氯-2-氟芐基)-7-氟-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯(68 g，產(chǎn)率84％)。
1H NMR(CDCl3400MHz)(δ)ppm-0.09(3H，s)，-0.05(3H，s)，0.75(9H，s)，0.85(3H，d，J＝6.7Hz)，1.1 8(3H，d，6.7Hz)，1.39(3H，t，J＝7.1Hz)，2.45(1H，br)，3.89-3.92(1H，m)，3.98-4.02(1H，m)，4.07-4.12(1H，m)，4.12(2H，s)，4.34-4.41(2H，m)，6.96-7.00(1H，m)，7.03-7.05(1H，m)，7.21-7.24(1H，m)，7.26-7.29(1H，m)，8.39(1H，d，J＝8.8Hz)，8.63(1H，s)步驟6 將步驟5中獲得的化合物(48g，86mmol)溶于甲醇(300ml)，加入水(5ml)和28％甲醇鈉甲醇溶液(176ml，862mmol)，將混合物在回流下加熱24hr。讓反應混合物冷卻到室溫并通過加入6N鹽酸中和混合物。在減壓下蒸發(fā)甲醇。將水加入到獲得的溶液中并攪拌混合物。通過過濾收集沉淀的固體并將獲得的固體溶于乙酸乙酯中。將混合物用水洗滌并通過硫酸鈉進行干燥。過濾溶液并將濾液在減壓下進行濃縮。將獲得的殘余物由乙酸乙酯-己烷重結(jié)晶以得到作為白色固體的化合物(32g，產(chǎn)率86％)。通過在回流下加熱將獲得的化合物(32g)溶于乙酸丁酯(160ml)，于75℃接種晶形II。將混合物攪拌3.5hr同時讓其自然冷卻。通過過濾收集沉淀的固體，用乙酸丁酯(25ml)洗滌并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物(25g，產(chǎn)率77％)。通過在回流下于50℃加熱將獲得的化合物(4.0g)溶于甲醇(40ml)，并于室溫逐滴加到水(40ml)中。將混合物于室溫攪拌16hr，過濾，并用66％的甲醇水溶液洗滌剩余的固體，并將其進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶體(晶形I)(3.9g，產(chǎn)率97％)。
m.p.151-152℃1H NMR(DMSO-d6300MHz)(δ)ppm0.72(3H，d，J＝6.5Hz)，1.16(3H，d，J＝6.5Hz)，2.30-2.50(1H，m)，3.70-3.90(1H，m)，3.90-4.00(1H，m)，4.03(3H，s)，4.12(2H，s)，4.80-4.90(1H，m)，5.19(1H，t)，7.19-7.25(2H，m)，7.46-7.51(2H，m)，8.04(1H，s)，8.88(1H，s)，15.44(1H，s)MS(ESI)M+448實施例1化合物A的晶形II的生產(chǎn)步驟1 將2，4-二氟苯甲酸(50g，0.316mmol)溶于濃硫酸(200ml)中，并在不超過5℃下按份加入N-碘琥珀酰亞胺(68g，300mmol)。在完成添加后，將混合物于相同溫度下攪拌4.5hr。將反應混合物倒入冰水(約600ml)中，隨后加入10％的亞硫酸鈉水溶液，攪拌混合物。通過過濾收集沉淀的固體，用水洗滌，并進行真空干燥以得到粗制晶體(85g)。合并以相同方式獲得的粗制晶體(總量205g)，并由50％乙醇水溶液(820ml)重結(jié)晶以得到作為白色固體的2，4-二氟-5-碘苯甲酸(148g，產(chǎn)率73％)。
1H NMR(CDCl3300MHz)(σ)ppm6.94(1H，dd，J＝10.3，10.3Hz)，8.46(1H，d，J＝7.5Hz)步驟2 將步驟1中獲得的化合物(148g，521mmol)溶于甲苯(750ml)，加入亞硫酰氯(76ml，1.04mol)和二甲基甲酰胺(催化量)，將混合物在回流下加熱2hr。于60℃濾去不可溶的物質(zhì)，并將濾液在減壓下進行濃縮與甲苯(330ml)一起共沸。將殘余物溶于四氫呋喃(400ml)，并將這種溶液逐滴加入到在四氫呋喃(400ml)中的3，3-二甲基氨基丙烯酸乙酯(82g，573mmol)和三乙胺(87ml，625mmol)的溶液中，將混合物在回流下加熱7hr。讓反應混合物冷卻到室溫并在減壓下進行濃縮。加入水(700ml)和乙酸乙酯(800ml)以便進行分配。用飽和碳酸氫鈉水溶液(250ml)兩次，水(300ml)和飽和鹽水(300ml)連續(xù)洗滌有機層，并通過硫酸鈉進行干燥。過濾混合物，并將濾液在減壓下進行濃縮以得到作為褐色固體的2-(2，4-二氟-5-碘苯甲酰)-3-二甲基氨基丙烯酸乙酯的粗制產(chǎn)物(210g)。
步驟3 將步驟2中獲得的粗制產(chǎn)物(210g)溶于四氫呋喃(500ml)，加入(S)-(+)-valinol(54g，0.521mmol)，將混合物于室溫攪拌30min。將反應混合物在減壓下進行濃縮，并將殘余物溶于二甲基甲酰胺(600ml)。加入碳酸鉀(144g，1.04mol)，將混合物于70℃加熱攪拌2hr。讓反應混合物冷卻到室溫，加到水(1500ml)中并攪拌混合物。通過過濾收集沉淀的固體。將獲得的固體用30％乙醇水溶液(500ml)和二乙醚(150ml)與己烷(150ml)的混合溶劑連續(xù)洗滌，并將其進行真空干燥以得到作為米色固體的7-氟-1-((S)-1-羥甲基-2-甲基丙基)-6-碘-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯(178g，產(chǎn)率76％(相對于步驟2))。
1H NMR(DMSO-d6300MHz)(δ)ppm0.72(3H，d，J＝6.6Hz)，1.10(3H，d，J＝6.6Hz)，1.28(3H，t，J＝7.0Hz)，2.27(1H，br)，3.77(1H，br)，3.86(1H，br)，4.23(2H，q，J＝7.0Hz)，4.56(1H，br)，5.12(1H，t，J＝4.9Hz)，8.09(1H，d，J＝11.1Hz)，8.62(1H，d，J＝7.5Hz)，8.68(1H，s)MS(ESI)M+448步驟4 將步驟3中獲得的化合物(150g，335mmol)溶于二甲基甲酰胺(500ml)，加入咪唑(30g，0.436mmol)和叔-丁基二甲基甲硅烷基氯(56g，369mmol)，將混合物于室溫攪拌1.5hr。將水加入到反應混合物中并用乙酸乙酯抽提。用水，飽和氯化銨水溶液和飽和鹽水連續(xù)洗滌有機層，并通過硫酸鈉進行干燥。過濾有機層并將濾液在減壓下進行濃縮，通過硅膠色譜法(乙酸乙酯∶己烷＝1∶3-1∶2)純化獲得的殘余物以得到作為無色非晶形形式的1-((S)-1-叔-丁基二甲基甲硅氧基甲基-2-甲基丙基)-7-氟-6-碘-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯(173g，產(chǎn)率92％)。
1H NMR(CDCl3400MHz)(δ)ppm-0.07(3H，s)，-0.05(3H，s)，0.77(9H，s)，0.84(3H，d，J＝6.5Hz)，1.18(3H，d，J＝6.5Hz)，1.40(3H，t，J＝7.2Hz)，2.35-2.50(1H，m)，3.85-3.95(1H，m)，3.98-4.10(2H，m)，4.30-4.40(2H，m)，7.26(1H，s)，8.64(1H，s)，8.94(1H，d，J＝7.2Hz)MS(ESI)M+562
步驟5 (四氫呋喃中的3-氯-2-氟芐基鋅溴化物溶液的制備)在氬氣流下，將鋅粉(11g，175mmol)懸浮于四氫呋喃(30ml)中，于60℃加入1，2-二溴乙烷(0.1ml，1.20mmol)和氯化三甲基硅烷(0.29ml，2.4mmol)，并將混合物加熱攪拌30min。于60℃逐滴加入在四氫呋喃(60ml)中的3-氯-2-氟芐基溴(27g，119mmol)的溶液。將混合物加熱攪拌1hr并讓其冷卻到室溫以得到在四氫呋喃中的1M3-氯-2-氟芐基鋅溴化物溶液。這被用于接下來的主要步驟中。
(主要步驟)將步驟4中獲得的化合物(50g，89mmol)溶于四氫呋喃(400ml)并，在氬氣流下，加入二氯雙(三苯膦)鈀(II)(2.1g，3.6mmol)并于60℃逐滴加入上述在四氫呋喃中的1M3-氯-2-氟芐基鋅溴化物溶液。在結(jié)束逐滴添加后，在相同溫度下將混合物加熱攪拌1.5hr。讓反應混合物冷卻到室溫，加入1N鹽酸并用乙酸乙酯抽提混合物3次。用水和飽和鹽水連續(xù)洗滌有機層，并通過硫酸鎂進行干燥。過濾有機層并將濾液在減壓下進行濃縮，通過硅膠色譜法(乙酸乙酯∶己烷＝1∶2-1∶1)純化獲得的殘余物以得到作為褐色非晶形形式的1-((S)-1-叔-丁基二甲基甲硅氧基甲基-2-甲基丙基)-6-(3-氯-2-氟芐基)-7-氟-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯(43g，產(chǎn)率83％)。
1H NMR(CDCl3400MHz)(δ)ppm-0.09(3H，s)，-0.05(3H，s)，0.75(9H，s)，0.85(3H，d，J＝6.7Hz)，1.18(3H，d，6.7Hz)，1.39(3H，t，J＝7.1Hz)，2.45(1H，br)，3.89-3.92(1H，m)，3.98-4.02(1H，m)，4.07-4.12(1H，m)，4.12(2H，s)，4.34-4.41(2H，m)，6.96-7.00(1H，m)，7.03-7.05(1H，m)，7.21-7.24(1H，m)，7.26-7.29(1H，m)，8.39(1H，d，J＝8.8Hz)，8.63(1H，s)
步驟6 將步驟5中獲得的化合物(43g，74mmol)溶于甲醇(280ml)，加入28％甲醇鈉甲醇溶液(151ml，742mmol)和水(4.3ml)，將混合物在回流下加熱20hr。將反應混合物通過Celite進行過濾。將濾液在減壓下進行濃縮。將水(400ml)加入到殘余物中，并用己烷(100ml)洗滌混合物。通過加入濃鹽酸(65ml)來酸化水性層，并用乙酸乙酯抽提混合物。用水和飽和鹽水連續(xù)洗滌有機層，并通過硫酸鈉進行干燥。過濾溶液并將濾液在減壓下進行濃縮。通過在回流下加熱將獲得的粗制產(chǎn)物(35g，褐色油)溶于乙酸乙酯(49ml)，加入己烷(30ml)同時讓其冷卻，并將混合物攪拌18.5hr。通過過濾收集沉淀的固體，用乙酸乙酯和己烷(1∶1)的混合溶劑洗滌，并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶體(晶形II)(27g，產(chǎn)率82％)。
m.p.153.7-153.9℃1H NMR(DMSO-d6300MHz)(δ)ppm0.72(3H，d，J＝6.5Hz)，1.16(3H，d，J＝6.5Hz)，2.30-2.50(1H，m)，3.70-3.90(1H，m)，3.90-4.00(1H，m)，4.03(3H，s)，4.12(2H，s)，4.80-4.90(1H，m)，5.19(1H，t)，7.19-7.25(2H，m)，7.46-7.51(2H，m)，8.04(1H，s)，8.88(1H，s)，15.44(1H，s)MS(ESI)M+448實施例2化合物A的晶形II的生產(chǎn)實施例2-1化合物A的晶形II的生產(chǎn)步驟1 將2，4-二氟苯甲酸(100g，633mmol)溶于濃硫酸(400ml)，在不超過5℃下按份加入N-碘琥珀酰亞胺(142g，601mol)。在完成添加后，將混合物于相同溫度下攪拌6hr。將反應混合物倒入冰水(約2400ml)中，隨后加入飽和的亞硫酸鈉水溶液，攪拌混合物。通過過濾收集沉淀的固體，用水洗滌，并進行真空干燥以得到粗制晶體(188g)。合并以相同方式獲得的粗制晶體(總量568g)，并由50％乙醇水溶液(2600ml)重結(jié)晶以得到作為白色固體的2，4-二氟-5-碘苯甲酸(388g，產(chǎn)率68％)。
1H NMR(CDCl3300MHz)(σ)ppm6.94(1H，dd，J＝10.3，10.3Hz)，8.46(1H，d，J＝7.5Hz)步驟2 將步驟1中獲得的化合物(200g，704mmol)溶于甲苯(1000ml)，加入亞硫酰氯(103ml，408mmol)和二甲基甲酰胺(催化量)，將混合物在回流下加熱2hr。濾去不可溶的物質(zhì)，并將濾液在減壓下進行濃縮并與甲苯一起共沸。將殘余物溶于四氫呋喃(500ml)，將這種溶液逐滴加入到在四氫呋喃(500ml)中的3，3-二甲基氨基丙烯酸乙酯(111g，775mmol)和三乙胺(118ml，845mmol)溶液中，將混合物在回流下加熱3hr。讓反應混合物冷卻到室溫并進行過濾并將濾液在減壓下進行濃縮。加入水(500ml)和乙酸乙酯(800ml)以便進行分配。用飽和碳酸氫鈉水溶液(200ml)，水(200ml)和飽和鹽水連續(xù)洗滌有機層，并通過硫酸鈉進行干燥。過濾有機層，并將濾液在減壓下進行濃縮以得到作為褐色固體的2-(2，4-二氟-5-碘苯甲酰)-3-二甲基氨基丙烯酸乙酯的粗制產(chǎn)物(273g)。
步驟3
將步驟2中獲得的粗制產(chǎn)物(273g)溶于四氫呋喃(650ml)，加入(S)-(+)-valinol(73g，708mmol)，將混合物于室溫攪拌2hr。將反應混合物在減壓下進行濃縮并將殘余物溶于二甲基甲酰胺(800ml)。加入碳酸鉀(195g 1.41mol)，將混合物于70℃加熱攪拌2.5hr。讓反應混合物冷卻到室溫，加到水(2000ml)中并攪拌混合物。通過過濾收集沉淀的固體。將獲得的固體用水和30％乙醇水溶液(650ml)連續(xù)進行漿洗并進行真空干燥以得到粗制產(chǎn)物(217g)。用乙酸乙酯(650ml)和己烷(440ml)的混合溶劑對獲得的粗制產(chǎn)物(217g)進行漿洗，同時在回流下加熱。過濾混合物，并將剩余固體進行真空干燥以得到作為淺褐色固體的7-氟-1-((S)-1-羥甲基-2-甲基丙基)-6-碘-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯(207g，產(chǎn)率66％(相對于步驟2))。
1H NMR(DMSO-d6300MHz)(δ)ppm0.72(3H，d，J＝6.6Hz)，1.10(3H，d，J＝6.6Hz)，1.28(3H，t，J＝7.0Hz)，2.27(1H，br)，3.77(1H，br)，3.86(1H，br)，4.23(2H，q，J＝7.0Hz)，4.56(1H，br)，5.12(1H，t，J＝4.9Hz)，8.09(1H，d，J＝11.1Hz)，8.62(1H，d，J＝7.5Hz)，8.68(1H，s)MS(ESI)M+448步驟4 將步驟3中獲得的化合物(150g，335mmol)溶于二甲基甲酰胺(450ml)，加入咪唑(27g，397mmol)和叔-丁基二甲基甲硅烷基氯(58g，385mmol)，將混合物于室溫攪拌過夜。將水(900ml)加入到反應混合物中，用乙酸乙酯(680ml)抽提混合物。用水(450ml，3次)和飽和鹽水(200ml)連續(xù)洗滌有機層，并通過硫酸鈉進行干燥。過濾有機層，并將濾液在減壓下進行濃縮以得到作為淺黃色非晶形形式的1-((S)-1-叔-丁基二甲基甲硅氧基甲基-2-甲基丙基)-7-氟-6-碘-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯的粗制產(chǎn)物(192g)。
步驟5 將步驟4中獲得的粗制產(chǎn)物(162g)溶于四氫呋喃(160ml)，在氬氣流下，加入二亞芐基丙酮鈀(II)(1.7g，2.9mmol)和三呋喃基膦(1.3g，5.8mmol)。于60℃向這種混合物中逐滴加入如實施例1，步驟5中相同方式獲得的在四氫呋喃中的1M 3-氯-2-氟芐基鋅溴化物溶液(375ml，375mmol)，在結(jié)束逐滴添加后，在相同溫度下將所述混合物加熱攪拌3.5hr。讓反應混合物冷卻到室溫，加入乙酸乙酯(640ml)和10％的檸檬酸水溶液(400ml)，將混合物濾過Celite，并分配濾液。用水(200ml)，飽和碳酸氫鈉水溶液(400ml)和飽和鹽水(200ml)連續(xù)洗滌有機層，并通過硫酸鈉進行干燥。過濾有機層，并將濾液在減壓下進行濃縮以得到作為褐色油的1-((S)-1-叔-丁基二甲基甲硅氧基甲基-2-甲基丙基)-6-(3-氯-2-氟芐基)-7-氟-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯的粗制產(chǎn)物(186g)。
步驟6
將步驟5中獲得的粗制產(chǎn)物(193g)溶于異丙醇(650ml)，加入1N氫氧化鈉水溶液(1290ml，1.29mol)，將混合物在回流下加熱2hr。讓反應混合物冷卻到室溫，并濾過Celite。通過加入濃鹽酸來酸化濾液并攪拌混合物。通過過濾收集沉淀的固體，并進行真空干燥以得到作為淺黃色固體的粗制產(chǎn)物(132g)。合并以相同方式獲得的粗制產(chǎn)物(總量143g)，懸浮于乙酸丁酯(430ml)中并進行勻漿攪拌，伴隨著在回流下加熱1hr。讓混懸液冷卻到室溫并進行過濾并進行真空干燥以得到作為灰色固體的6-(3-氯-2-氟芐基)-7-氟-1-((S)-1-羥甲基-2-甲基丙基)-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸(99g，產(chǎn)率74％(相對于步驟3))。
1H NMR(DMSO-d6400MHz)(δ)ppm0.71(3H，d，J＝6.5Hz)，1.13(3H，d，J＝6.5Hz)，2.36(1H，br)，3.77(1H，br)，3.94(1H，br)，4.25(2H，s)，4.77(1H，br)，5.16(1H，t，J＝2.4Hz)，7.19-7.23(1H，m)，7.32-7.35(1H，m)，7.48-7.52(1H，m)，8.24-8.28(2H，m)，9.00(1H，s)，15.00(1H，s)MS(ESI)M+436步驟7 將步驟6中獲得的化合物(99g，227mmmol)溶于甲醇(530ml)，加入28％甲醇鈉甲醇溶液(465ml，2.28mol)，將混合物在回流下加熱20hr。讓反應混合物冷卻到室溫并濾過Celite。將濾液在減壓下進行濃縮。通過加入水(200ml)和濃鹽酸(190ml)來酸化殘余物，并用乙酸乙酯(500ml)進行抽提。用水(200ml)將有機層洗滌兩次，并通過硫酸鈉進行干燥。過濾混合物，并將濾液在減壓下進行濃縮以得到粗制產(chǎn)物(108g)。以加熱將獲得的粗制產(chǎn)物(108g)溶于乙酸異丁酯(330ml)并攪拌混合物，同時讓其冷卻24hr。通過過濾收集沉淀的固體，并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A(71g，產(chǎn)率69％)。合并以相同方式獲得的粗制晶體(總量233g)，通過在回流下加熱溶于乙酸異丁酯(470ml)，并過夜攪拌混合物同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體，并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶體(晶形II)(206g，產(chǎn)率88％)。
1H NMR(DMSO-d6300MHz)(δ)ppm0.72(3H，d，J＝6.5Hz)，1.16(3H，d，J＝6.5Hz)，2.30-2.50(1H，m)，3.70-3.90(1H，m)，3.90-4.00(1H，m)，4.03(3H，s)，4.12(2H，s)，4.80-4.90(1H，m)，5.19(1H，t)，7.19-7.25(2H，m)，7.46-7.51(2H，m)，8.04(1H，s)，8.88(1H，s)，1 5.44(1H，s)MS(ESI)M+448實施例2-2化合物A的晶形II的生產(chǎn)步驟1 將5-溴-2，4-二氟苯甲酸(82.7kg，349mol)溶于甲苯(420L)，加入亞硫酰氯(62.3kg，523mol)和二甲基甲酰胺(催化量)，將混合物于70℃攪拌6hr。讓反應混合物冷卻到室溫，在減壓下進行濃縮，再與甲苯(420L)進行共沸。將殘余物溶于甲苯(220L)，將這種溶液逐滴加入到在甲苯(220L)中的3，3-二甲基氨基丙烯酸乙酯(55.0kg，384mol)和二異丙基乙胺(58.6kg，523mol)的溶液中，將混合物于70℃加熱攪拌21hr。讓反應混合物冷卻到室溫，加入(S)-(+)-valinol(36.0kg，349mol)，將混合物于室溫攪拌1.5hr。向反應混合物中加入水(420L)以進行分配，并用1N鹽酸(250L，兩次)，水(420L)，5％碳酸氫鈉水溶液(250L，兩次)，水(420L)和10％鹽水(250L)連續(xù)洗滌有機層。將抽提物在減壓下進行濃縮并與二甲基甲酰胺(420L)一起共沸以得到含有2-(5-溴-2，4-二氟苯甲酰)-3-((S)-1-羥甲基-2-甲基丙基甲基氨基)丙烯酸乙酯粗制產(chǎn)物的濃縮殘余物(330L)。
步驟2
向在二甲基甲酰胺中的步驟1中所獲粗制產(chǎn)物的溶液(330L)中加入1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一烷(105kg，349mol)并將混合物于室溫攪拌23hr。向反應混合物中加入二甲基甲酰胺(330L)，隨后加入水(170L)，在攪拌2hr后，逐滴加入水(170L)。通過過濾收集沉淀的固體并用二甲基甲酰胺(170L)-水(170L)混合物洗滌，隨后用乙醇(460L)-水(200L)混合溶液洗滌。將獲得的固體進行真空干燥，懸浮于乙酸乙酯(330L)-正庚烷(330L)混合物中并進行漿洗。過濾混懸液，并將殘余固體進行真空干燥以得到作為黃白色固體的6-溴-7-氟-1-((S)-1-羥甲基-2-甲基丙基)-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯(102kg，產(chǎn)率73％)。通過高效液相色譜(HPLC)分析確認這種化合物相當于所述化合物的標準產(chǎn)物。
步驟3 將步驟2中獲得的化合物(45.0kg，112mol)與咪唑(9.95kg，146mol)懸浮于甲苯(180L)中，于50℃加入在甲苯(45L)中的叔-丁基二甲基甲硅烷基氯(17.8kg，118mol)，將混合物于相同溫度下攪拌3hr。將甲苯(230L)加入反應混合物中，并用水(450L，兩次)和20％鹽水(450L)進行連續(xù)洗滌。將抽提物在減壓下進行濃縮并與四氫呋喃(320L)一起共沸以得到含有6-溴-1-((S)-1-叔-丁基二甲基甲硅氧基甲基-2-甲基丙基)-7-氟-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯的粗制產(chǎn)物的濃縮殘余物(390L)。
步驟4
(四氫呋喃中的3-氯-2-氟芐基鋅溴化物溶液的制備)在氮氣流下，將鋅粉(18.8kg，287mol)懸浮于四氫呋喃(130L)，于60℃加入1，2-二溴乙烷(470g，2.50mol)，將混合物于相同溫度下攪拌30min。于室溫下向這種混懸液中加入氯化三甲基硅烷(560g，3.10mol)，并將混合物加熱攪拌30min。于0℃逐滴加入在四氫呋喃(65L)中的3-氯-2-氟芐基溴(54.0kg，242mol)的溶液，將混合物于20℃攪拌3hr。濾去殘余的鋅以得到在四氫呋喃中的1M3-氯-2-氟芐基鋅溴化物溶液。這用于接下來的主要步驟中。
(主要步驟)在氮氣流下，將三(二亞芐基丙酮)二鈀(O)(1.96kg，3.36mol)和三苯膦(1.77kg，6.72mol)溶于四氫呋喃(180L)，將混合物于室溫攪拌1hr。于室溫逐滴加入在四氫呋喃中的步驟3中獲得的粗制產(chǎn)物溶液(390L)并用四氫呋喃(45L)洗滌。于室溫逐滴加入在前制備的上述在四氫呋喃中的1M 3-氯-2-氟芐基鋅溴化物溶液(164kg，157mol)，將混合物于55℃加熱攪拌5hr。讓反應混合物冷卻到室溫，加入甲苯(230L)和25％氯化銨水溶液(230L)并攪拌混合物。過濾后，將混合物分配。用25％氯化銨水溶液(230L)，水(230L)，5％碳酸氫鈉水溶液(230L，3次)和10％鹽水(230L)連續(xù)洗滌有機層。將提取物在減壓下進行濃縮以得到作為褐色油的6-(3-氯-2-氟芐基)-7-氟-1-((S)-1-羥甲基-2-甲基丙基)-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸的粗制產(chǎn)物(80L)。
步驟5將步驟4中獲得的粗制產(chǎn)物(80L)溶于異丙醇中(180L)，加入1N氫氧化鈉水溶液(180L，180mol)，將混合物于50℃加熱攪拌9hr。將活性炭(4.5kg)加入到反應混合物中。將混合物于室溫攪拌30min，通過纖維素粉過濾并用異丙醇(45L)-水(45L)混合物充分洗滌。向濾液中加入水(180L)和正庚烷(230L)，攪拌后，將混合物進行分配。用正庚烷(230L)再次洗滌水層。將4N鹽酸(45L，180mol)和甲基異丙酮(450L)加入到有機層中，攪拌后，將混合物進行分配。用10％鹽水(230L)，兩次用8.5％碳酸氫鈉水溶液(230L)，0.5N鹽酸(230L)和水(230L)連續(xù)洗滌有機層。將提取物在減壓下進行濃縮，與甲苯(230L)一起共沸3次。將殘余物于100℃攪拌1.5hr，讓其冷卻至室溫并攪拌3hr。通過過濾收集沉淀的固體并用甲苯(45L)洗滌獲得的固體并將其進行真空干燥以得到作為淺黃色固體的6-(3-氯-2-氟芐基)-7-氟-1-[(S)-1-羥甲基-2-甲基丙基]-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸(42.5kg，產(chǎn)率87％)。通過HPLC分析確認這種化合物相當于標準產(chǎn)物。
步驟6 將步驟5中獲得的化合物(39.2kg，89.9mol)溶于甲醇(240L)中，于10℃逐滴加入28％甲醇鈉甲醇溶液(173kg，899mol)，將混合物于70℃加熱攪拌21hr。將活性炭(3.9kg)加入到反應混合物中。將混合物于室溫攪拌1hr，通過纖維素粉進行過濾并用甲醇(80L)充分洗滌。將水(29kg，1620mol)加入到濾液中并將混合物在減壓下進行濃縮。將殘余物與異丙醇(240L，120L)一起共沸兩次。向殘余物中加入15％鹽水(200L)和甲苯(200L)，攪拌后，將混合物進行分配。用20％鹽水(200L，3次)，包含氯化鈉(10kg)的0.5N鹽酸(200L)和20％鹽水(200L)連續(xù)洗滌有機層。將有機層在減壓下進行濃縮并與一起乙酸乙酯(200L)共沸。將乙酸乙酯(320L)和水(200L)加入到殘余物中，攪拌后，將混合物進行分配。將有機層在減壓下進行濃縮并與乙酸異丁酯(200L)一起共沸兩次。通過加熱溶解殘余物，在它熱的時候進行過濾，并用乙酸異丁酯(20L)充分洗滌。將晶種(化合物A的晶形II，39g)于60℃加入到濾液中，將混合物于相同溫度下攪拌1.5hr。于80℃加熱攪拌混合物2hr，讓其冷卻至室溫并進一步攪拌6hr。通過過濾收集沉淀的固體。用乙酸異丁酯(40L)洗滌獲得的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶體(晶形II)(29.0kg，產(chǎn)率72％)。通過HPLC和X射線粉末衍射(XRPD)分析確定這種晶體相當于晶體的標準產(chǎn)品(實施例2-1中獲得的化合物A的晶形II)。
實施例2-3化合物A的晶形II的生產(chǎn)晶形II還可以根據(jù)實施例2-3-1到2-3-26中所述的方法通過結(jié)晶而進行生產(chǎn)。
實施例2-3-1通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于1-丁醇(2ml)中。將混合物攪拌17小時同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(125mg，產(chǎn)率63％)。
實施例2-3-2通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于乙酸丁酯(2ml)中。將混合物攪拌17小時同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(102mg，產(chǎn)率51％)。
實施例2-3-3通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于甲基異丁酮(2ml)中。逐滴加入庚烷(2ml)并將混合物攪拌6hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(168mg，產(chǎn)率84％)。
實施例2-3-4通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于乙醇(2ml)中。將混合物攪拌17小時同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(56mg，產(chǎn)率28％)。
實施例2-3-5通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于乙酸乙酯(2ml)中。逐滴加入庚烷(1.6ml)并將混合物攪拌6hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(166mg，產(chǎn)率83％)。
實施例2-3-6通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于甲乙酮(2ml)中。逐滴加入庚烷(4ml)并將混合物攪拌6hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(123mg，產(chǎn)率62％)。
實施例2-3-7通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于1-丙醇(2ml)中。將混合物攪拌17小時同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(91mg，產(chǎn)率46％)。
實施例2-3-8通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于異丙醇(2ml)中。將混合物攪拌17小時同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(88mg，產(chǎn)率44％)。
實施例2-3-9通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于異丙基苯(2ml)中。將混合物攪拌17小時同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(188mg，產(chǎn)率94％)。
實施例2-3-10通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于茴香醚(2ml)中。將混合物攪拌17小時同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(107mg，產(chǎn)率54％)。
實施例2-3-11通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于丙酮(2ml)中。逐滴加入庚烷(2ml)并將混合物攪拌16.5hr同時讓其冷卻。另外添加庚烷(4ml)，并將混合物再攪拌24hr。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(134mg，產(chǎn)率67％)。
實施例2-3-12通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于乙醇(2ml)中。逐滴加入庚烷(4ml)并將混合物攪拌19hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(129mg，產(chǎn)率65％)。
實施例2-3-13通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于異丙醇(2ml)中。逐滴加入庚烷(4ml)并將混合物攪拌19hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(166mg，產(chǎn)率83％)。
實施例2-3-14通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于1-丙醇(2ml)中。逐滴加入庚烷(4ml)并將混合物攪拌19hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(158mg，產(chǎn)率79％)。
實施例2-3-15通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于異丁醇(2ml)中。將混合物攪拌21hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(131mg，產(chǎn)率66％)。
實施例2-3-16通過在100℃加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于甲苯(2ml)中。將混合物攪拌37hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(190mg，產(chǎn)率95％)。
實施例2-3-17
通過在60℃加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于甲基丁酮(2ml)中。逐滴加入庚烷(1.8ml)并將混合物攪拌37hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(191mg，產(chǎn)率96％)。
實施例2-3-18通過在60℃加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于氯仿(1ml)中。逐滴加入異丙醚(1.8ml)并將混合物攪拌37hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(184mg，產(chǎn)率92％)。
實施例2-3-19通過在60℃加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于四氫呋喃(1ml)中。逐滴加入異丙醚(2ml)并將混合物攪拌41hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(144mg，產(chǎn)率72％)。
實施例2-3-20通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于異丁醇(2ml)。逐滴加入庚烷(2ml)并將混合物攪拌21hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(160mg，產(chǎn)率80％)。
實施例2-3-21通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于丁醇(2ml)中。逐滴加入庚烷(2ml)并將混合物攪拌21hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(152mg，產(chǎn)率76％)。
實施例2-3-22通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于乙酸異丁酯(2ml)中。將混合物攪拌21hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(140mg，產(chǎn)率70％)。
實施例2-3-23
通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于乙酸異丁酯(2ml)中。逐滴加入庚烷(2ml)并將混合物攪拌21hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(178mg，產(chǎn)率89％)。
實施例2-3-24通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于乙酸丁酯(2ml)中。逐滴加入庚烷(1.5ml)并將混合物攪拌21hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(158mg，產(chǎn)率78％)。
實施例2-3-25通過在110℃加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于茴香醚(2ml)中。逐滴加入庚烷(2ml)并將混合物攪拌21hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(187mg，產(chǎn)率89％)。
實施例2-3-26通過在回流下加熱將實施例1中獲得的化合物A(200mg)溶于乙酸丁酯(2ml)中。在迅速冷卻后，將混合物攪拌2hr。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(131mg，產(chǎn)率66％)。
實施例2-4化合物A的晶形II的生產(chǎn)步驟1將在實施例1，步驟5中獲得的1-((S)-1-叔-丁基二甲基甲硅氧基甲基-2-甲基丙基)-6-(3-氯-2-氟芐基)-7-氟-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯(48g，86mmol)溶于甲醇(300ml)中，加入水(5ml)和28％甲醇鈉甲醇溶液(176ml，862mmol)，在回流下加熱混合物24hr。讓反應混合物冷卻到室溫，用6N鹽酸中和并在減壓下蒸發(fā)甲醇。將水加入到獲得的溶液中，攪拌后，通過過濾收集沉淀的固體。將獲得的固體溶于乙酸乙酯，用水洗滌，并通過硫酸鈉進行干燥。過濾混合物并將濾液在減壓下進行濃縮。將獲得的殘余物由乙酸乙酯-己烷進行重結(jié)晶以得到作為白色固體的化合物A(初凝晶29.5g，次級結(jié)晶2.8g，總共32.3g，產(chǎn)率86％)。
m.p.151-152℃1H NMR(DMSO-d6300MHz)(δ)ppm0.72(3H，d，J＝6.5Hz)，1.16(3H，d，J＝6.5Hz)，2.30-2.50(1H，m)，3.70-3.90(1H，m)，3.90-4.00(1H，m)，4.03(3H，s)，4.12(2H，s)，4.80-4.90(1H，m)，5.19(1H，t)，7.19-7.25(2H，m)，7.46-7.51(2H，m)，8.04(1H，s)，8.88(1H，s)，15.44(1H，s)MS(ESI)M+448步驟2通過在回流下加熱將步驟1中獲得的化合物A(32.3g)溶于乙酸丁酯(160ml)中。于63℃接種實施例2的晶形II并將混合物攪拌3hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶體(晶形II)(24.79 g，產(chǎn)率77％)。
實施例2-5化合物A的晶形II的生產(chǎn)步驟1 將實施例1，步驟5中獲得的1-((S)-1-叔-丁基二甲基甲硅氧基甲基-2-甲基丙基)-6-(3-氯-2-氟芐基)-7-氟-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯(19g，33mmol)溶于異丙醇(100ml)中，加入1N氫氧化鈉水溶液(200ml，200mmol)，并在回流下將混合物加熱2.5hr。讓反應混合物冷卻到室溫，并將混合物濾過Celite。通過加入濃鹽酸來酸化濾液，并于室溫攪拌2hr。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為淺黃色固體的6-(3-氯-2-氟芐基)-7-氟-1-((S)-1-羥甲基-2-甲基丙基)-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸(12g，產(chǎn)率82％)。
1H NMR(DMSO-d6400MHz)(δ)ppm0.71(3H，d，J＝6.5Hz)，1.13(3H，d，J＝6.5Hz)，2.36(1H，br)，3.77(1H，br)，3.94(1H，br)，4.25(2H，s)，4.77(1H，br)，5.16(1H，t，J＝2.4Hz)，7.1 9-7.23(1H，m)，7.32-7.35(1H，m)，7.48-7.52(1H，m)，8.24-8.28(2H，m)，9.00(1H，s)，15.00(1H，s)
步驟2 將步驟1中獲得的化合物(12g，27mmol)溶于甲醇(64ml)，加入28％甲醇鈉甲醇溶液(52ml，256mmol)，將混合物在回流下加熱24hr。讓反應混合物冷卻到室溫并濾過Celite。將濾液在減壓下進行濃縮。通過加入水(360ml)和濃鹽酸來酸化殘余物，并用乙酸乙酯進行抽提。用水和飽和鹽水連續(xù)洗滌有機層并通過硫酸鈉進行干燥。過濾混合物，并將濾液在減壓下進行濃縮以得到作為褐色油的粗制產(chǎn)物(13g)。通過加熱將獲得的粗制產(chǎn)物(13g)溶于乙酸異丁酯(60ml)中，接種后，將混合物攪拌23hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體，并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A(9.2g，產(chǎn)率75％)。
1H NMR(DMSO-d6300MHz)(δ)ppm0.72(3H，d，J＝6.5Hz)，1.16(3H，d，J＝6.5Hz)，2.30-2.50(1H，m)，3.70-3.90(1H，m)，3.90-4.00(1H，m)，4.03(3H，s)，4.12(2H，s)，4.80-4.90(1H，m)，5.19(1H，t)，7.19-7.25(2H，m)，7.46-7.51(2H，m)，8.04(1H，s)，8.88(1H，s)，15.44(1H，s)MS(ESI)M+448步驟3 將在實施例1，步驟2中獲得的2-(2，4-二氟-5-碘苯甲酰)-3-二甲基氨基丙烯酸乙酯(20g)用乙酸乙酯(60ml)和己烷(40ml)的混合溶劑漿洗并在回流下加熱。過濾混合物，并將剩余固體進行真空干燥以得到作為米色固體的7-氟-1-((S)-1-羥甲基-2-甲基丙基)-6-碘-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯(18g，產(chǎn)率94％)。
1H NMR(DMSO-d6300MHz)(δ)ppm0.72(3H，d，J＝6.6Hz)，1.10(3H，d，J＝6.6Hz)，1.28(3H，t，J＝7.0Hz)，2.27(1H，br)，3.77(1H，br)，3.86(1H，br)，4.23(2H，q，J＝7.0Hz)，4.56(1H，br)，5.12(1H，t，J＝4.9Hz)，8.09(1H，d，J＝11.1Hz)，8.62(1H，d，J＝7.5Hz)，8.68(1H，s)MS(ESI)M+448步驟4 將步驟3中獲得的化合物(19 g，42mmol)溶于二甲基甲酰胺(65ml)中，加入咪唑(3.4g，49.9mmol)和叔-丁基二甲基甲硅烷基氯(7.2g，47.8mmol)，將混合物于室溫攪拌1.5hr。將水加入到反應混合物中，用乙酸乙酯抽提混合物。用水，飽和氯化銨水溶液和飽和鹽水連續(xù)洗滌有機層，并通過硫酸鈉進行干燥。過濾有機層，并將濾液在減壓下進行濃縮以得到作為米色非晶形形式的1-((S)-1-叔-丁基二甲基甲硅氧基甲基-2-甲基丙基)-7-氟-6-碘-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯的粗制產(chǎn)物(24g)。
1H NMR(CDCl3400MHz)(δ)ppm-0.07(3H，s)，-0.05(3H，s)，0.77(9H，s)，0.84(3H，d，J＝6.5Hz)，1.18(3H，d，J＝6.5Hz)，1.40(3H，t，J＝7.2Hz)，2.35-2.50(1H，m)，3.85-3.95(1H，m)，3.98-4.10(2H，m)，4.30-4.40(2H，m)，7.26(1H，s)，8.64(1H，s)，8.94(1H，d，J＝7.2Hz)MS(ESI)M+562步驟5 將步驟4中獲得的粗制產(chǎn)物(24g)溶于四氫呋喃(200ml)中，并在氬氣流下，加入二亞芐基丙酮鈀(II)(984mg，1.7mmol)和三呋喃基膦(795mg，3.4mmol)，并于60℃逐滴加入在四氫呋喃中的如實施例1，步驟5同樣方式獲得的1M 3-氯-2-氟芐基鋅溴化物溶液(56ml，56mmol)。在完成逐滴添加后，攪拌混合物，同時在相同溫度下加熱2hr。讓反應混合物冷卻到室溫，加入飽和的氯化銨水溶液，并濾過Celite，并用乙酸乙酯將濾液抽提兩次。用水(兩次)和飽和鹽水連續(xù)洗滌有機層，并通過硫酸鎂進行干燥。過濾有機層，并將濾液在減壓下進行濃縮以得到作為褐色糊劑的1-((S)-1-叔-丁基二甲基甲硅氧基甲基-2-甲基丙基)-6-(3-氯-2-氟芐基)-7-氟-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯的粗制產(chǎn)物(30g)。
步驟6 將步驟5中獲得的粗制產(chǎn)物(30g)溶于異丙醇(150ml)，加入1N氫氧化鈉水溶液(300ml，300mmol)，將混合物在回流下加熱2.5hr。讓反應混合物冷卻到室溫，并將混合物濾過Celite。通過加入濃鹽酸來酸化濾液，將混合物于室溫攪拌2hr。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為米色固體的粗制產(chǎn)物(18g)。將獲得的粗制產(chǎn)物(18g)懸浮于乙酸丁酯(90ml)中，并通過在回流下加熱1進行勻漿攪拌。讓混懸液冷卻到室溫，過濾并進行真空干燥以得到作為白色固體的6-(3-氯-2-氟芐基)-7-氟-1-((S)-1-羥甲基-2-甲基丙基)-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸(11g，產(chǎn)率62％(相對于步驟3))。
1H NMR(DMSO-d6400MHz)(δ)ppm0.71(3H，d，J＝6.5Hz)，1.13(3H，d，J＝6.5Hz)，2.36(1H，br)，3.77(1H，br)，3.94(1H，br)，4.25(2H，s)，4.77(1H，br)，5.16(1H，t，J＝2.4Hz)，7.19-7.23(1H，m)，7.32-7.35(1H，m)，7.48-7.52(1H，m)，8.24-8.28(2H，m)，9.00(1H，s)，15.00(1H，s)MS(ESI)M+436步驟7 將步驟6中獲得的化合物(11g，26mmol)溶于甲醇(60ml)，加入28％甲醇鈉甲醇溶液(52ml，256mmol)，將混合物在回流下加熱24hr。讓反應混合物冷卻到室溫并濾過Celite，并將濾液在減壓下進行濃縮。通過加入水(330ml)和濃鹽酸來酸化殘余物，并用乙酸乙酯抽提混合物。用水和飽和鹽水連續(xù)洗滌有機層，并通過硫酸鈉進行干燥。過濾混合物，并將濾液在減壓下進行濃縮以得到作為褐色油的粗制產(chǎn)物(12g)。通過在回流下加熱將獲得的粗制產(chǎn)物(12g)溶于乙酸異丁酯(60ml)中。接種晶種(化合物A的晶形II)，并將混合物攪拌23hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A(8.2g，產(chǎn)率71％)。
1H NMR(DMSO-d6300MHz)(δ)ppm0.72(3H，d，J＝6.5Hz)，1.16(3H，d，J＝6.5Hz)，2.30-2.50(1H，m)，3.70-3.90(1H，m)，3.90-4.00(1H，m)，4.03(3H，s)，4.12(2H，s)，4.80-4.90(1H，m)，5.19(1H，t)，7.19-7.25(2H，m)，7.46-7.51(2H，m)，8.04(1H，s)，8.88(1H，s)，15.44(1H，s)MS(ESI)M+448步驟8通過在回流下加熱將步驟7中獲得的化合物A(7.66g)和步驟2中獲得的化合物A(9.17g)溶于乙酸異丁酯(84ml)并將混合物攪拌16hr同時讓其冷卻。通過過濾收集沉淀的固體并進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A的晶形II(14.73g，產(chǎn)率88％)。
實施例2-6化合物A的晶形II的生產(chǎn)步驟1 將2，4-二氟苯甲酸(100g，633mmol)溶于三氟甲磺酸(400ml)，并在不超過5℃下按份加入N-碘琥珀酰亞胺(157g，696mmol)。完成添加后，將混合物于50℃攪拌1.5hr。將反應混合物倒入冰水中，并將混合物攪拌1hr。通過過濾收集沉淀的固體，用水和己烷連續(xù)洗滌，并進行真空干燥以得到作為白色固體的2，4-二氟-5-碘苯甲酸(179g產(chǎn)率，定量)。
1H NMR(CDCl3300MHz)(σ)ppm6.94(1H，dd，J＝10.3，10.3Hz)，8.46(1H，d，J＝7.5Hz)步驟2
將步驟1中獲得的化合物(28g，100mmol)溶于乙酸乙酯(300ml)，加入草酰氯(11ml，122mmol)和二甲基甲酰胺(催化量)，將混合物于室溫攪拌2hr。將濾液在減壓下進行濃縮并與甲苯一起進行共沸。將殘余物溶于四氫呋喃(100ml)，將這種溶液逐滴加入到在四氫呋喃(100ml)中的3，3-二甲基氨基丙烯酸乙酯(17g，120mmol)和三乙胺(21ml，150mmol)的溶液中，將混合物在回流下加熱3hr。讓反應混合物冷卻并加入乙酸乙酯(200ml)。用水(兩次)和飽和鹽水連續(xù)洗滌混合物，并通過硫酸鈉進行干燥。過濾混合物并將濾液在減壓下進行濃縮。將獲得的殘余物進行用二乙醚(50ml)和己烷(50ml)的混合溶劑進行勻漿攪拌。過濾混合物并將殘余固體進行真空干燥以得到作為黃色固體的2-(2，4-二氟-5-碘苯甲酰)-3-二甲基氨基丙烯酸乙酯粗制產(chǎn)物(26g，產(chǎn)率63％)。
步驟3 將步驟2中獲得的粗制產(chǎn)物(22g，55mmol)溶于四氫呋喃(110ml)，加入(S)-(+)-valinol(6.8g，65.8mmol)，將混合物于50℃加熱攪拌30min。將反應混合物在減壓下進行濃縮，并將殘余物溶于乙酸乙酯(100ml)，用水和飽和鹽水連續(xù)洗滌，并通過硫酸鎂進行干燥。過濾混合物并將濾液在減壓下進行濃縮。將獲得的殘余物溶于二甲基甲酰胺(80ml)，加入碳酸鉀(19g，137mmol)，將混合物于60℃加熱攪拌1.5hr。讓反應混合物冷卻到室溫并在減壓下進行濃縮。將水(250ml)加入到獲得的殘余物中將混合物于室溫攪拌30min。通過過濾收集沉淀的固體。用水(100ml)，乙酸乙酯(10ml)和己烷(40ml)的混合溶劑連續(xù)洗滌獲得的固體并進行真空干燥以得到作為淺黃色固體的7-氟-1-((S)-1-羥甲基-2-甲基丙基)-6-碘-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯(22g，產(chǎn)率88％)。
1H NMR(DMSO-d6300MHz)(δ)ppm0.72(3H，d，J＝6.6Hz)，1.10(3H，d，J＝6.6Hz)，1.28(3H，t，J＝7.0Hz)，2.27(1H，br)，3.77(1H，br)，3.86(1H，br)，4.23(2H，q，J＝7.0Hz)，4.56(1H，br)，5.12(1H，t，J＝4.9Hz)，8.09(1H，d，J＝11.1Hz)，8.62(1H，d，J＝7.5Hz)，8.68(1H，s)MS(ESI)M+448步驟4 將步驟3中獲得的化合物(22g，48mmol)溶于二甲基甲酰胺(60ml)，加入咪唑(3.9g，57.7mmol)和叔-丁基二甲基甲硅烷基氯(8.0g，53.0mmol)，將混合物于室溫攪拌1.5hr。將反應混合物在減壓下進行濃縮，并將獲得的殘余物溶于乙酸乙酯(200ml)，用水(兩次)和飽和鹽水連續(xù)洗滌，并通過硫酸鈉進行干燥。過濾混合物并將濾液在減壓下進行濃縮。通過硅膠色譜法(乙酸乙酯∶己烷＝3∶7-4∶6)純化獲得的殘余物以得到作為白色蠟的1-((S)-1-叔-丁基二甲基甲硅氧基甲基-2-甲基丙基)-7-氟-6-碘-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯(25g，產(chǎn)率92％)。
1H NMR(CDCl3400MHz)(δ)ppm-0.07(3H，s)，-0.05(3H，s)，0.77(9H，s)，0.84(3H，d，J＝6.5Hz)，1.18(3H，d，J＝6.5Hz)，1.40(3H，t，J＝7.2Hz)，2.35-2.50(1H，m)，3.85-3.95(1H，m)，3.98-4.10(2H，m)，4.30-4.40(2H，m)，7.26(1H，s)，8.64(1H，s)，8.94(1H，d，J＝7.2Hz)MS(ESI)M+562步驟5 將步驟4中獲得的化合物(25g，44mmol)溶于四氫呋喃(200ml)中，并在氬氣流下，加入二亞芐基丙酮鈀(II)(1.0g，1.8mmol)和三呋喃基膦(824mg，3.5mmol)。于60℃逐滴加入在四氫呋喃中的與實施例1，步驟5中相同方式獲得的1M 3-氯-2-氟芐基鋅溴化物溶液(58ml，58mmol)。在結(jié)束逐滴添加后，將混合物在回流下加熱3hr。讓反應混合物冷卻到室溫，加入乙酸乙酯(200ml)，用1N鹽酸，水，飽和碳酸氫鈉水溶液，水和飽和鹽水連續(xù)洗滌，并通過硫酸鈉進行干燥。過濾混合物并將濾液在減壓下進行濃縮。通過硅膠色譜法(乙酸乙酯∶己烷＝4∶6-1∶1)純化獲得的殘余物以得到作為淺黃色油的1-((S)-1-叔-丁基二甲基甲硅氧基甲基-2-甲基丙基)-6-(3-氯-2-氟芐基)-7-氟-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸乙酯(17g，產(chǎn)率68％)。
1H NMR(CDCl3400MHz)(δ)ppm-0.09(3H，s)，-0.05(3H，s)，0.75(9H，s)，0.85(3H，d，J＝6.7Hz)，1.18(3H，d，6.7Hz)，1.39(3H，t，J＝7.1Hz)，2.45(1H，br)，3.89-3.92(1H，m)，3.98-4.02(1H，m)，4.07-4.12(1H，m)，4.12(2H，s)，4.34-4.41(2H，m)，6.96-7.00(1H，m)，7.03-7.05(1H，m)，7.21-7.24(1H，m)，7.26-7.29(1H，m)，8.39(1H，d，J＝8.8Hz)，8.63(1H，s)步驟6 將步驟5中獲得的化合物(17g，30mmol)溶于甲醇(120ml)，加入28％甲醇鈉甲醇溶液(62ml，304mmol)，將混合物在回流下加熱19hr。讓反應混合物冷卻到室溫，加入水(200ml)，并在減壓下蒸發(fā)甲醇。通過加入濃鹽酸來酸化殘余物，用乙酸乙酯抽提，并通過硫酸鈉進行干燥。過濾混合物，并將濾液在減壓下進行濃縮以得到作為淺黃色油的化合物A的粗制產(chǎn)物(14g)。
步驟7于室溫將步驟6中獲得的化合物A(14.11g)懸浮于乙酸乙酯(20ml)和己烷(20ml)的混合溶劑中，接種晶種(化合物A的晶形II)，并將混合物攪拌1hr。過濾混懸液，并將殘余固體進行真空干燥以得到作為白色固體的化合物A(晶形II，10.40g，產(chǎn)率77％)。
實施例3化合物A的晶形III的生產(chǎn)實施例3-1化合物A的晶形III的生產(chǎn)將實施例2-2中獲得的化合物A的晶形II(10.0g，22.3mmol)加入到乙酸異丁酯(30mL)中并通過在回流下加熱溶解晶體。將溶液冷卻至90℃，并攪拌5hr以便讓晶體沉淀。讓這種溶液進一步冷卻到室溫，并再攪拌12hr。通過過濾收集沉淀的晶體。用乙酸異丁酯洗滌獲得的晶體(10mL)并進行真空干燥以得到白色晶體(9.85g，產(chǎn)率98.5％)。由于通過XRPD分析將這種晶體確認為不同于晶形II，所以將顯示與此晶體同樣XRPD圖(圖1)的晶體視為晶形III。
實施例3-2化合物A的晶形III的生產(chǎn)將實施例2-2中獲得的化合物A的晶形II(250g，558mmol)加入到乙酸異丁酯中(750mL)。于室溫加入實施例3中獲得的化合物A的晶形III的晶種(12.5g)并將混合物攪拌17hr。通過過濾收集沉淀的晶體。用乙酸異丁酯(250mL)洗滌獲得的晶體，并進行真空干燥以得到作為白色晶體的目標產(chǎn)物(晶形III，259g，產(chǎn)率98.6％)。通過XRPD分析將這種晶體確認為相當于所述晶體(在實施例3-1中獲得的化合物A的晶形III)的標準產(chǎn)物。
實施例3-3化合物A的晶形III的生產(chǎn)將實施例2-2中獲得的化合物A(晶形II，10.0g，22.3mmol)加入到異丙醇(30mL)中，并將混合物在回流下加熱以溶解晶體。將溶液冷卻到70℃加入實施例3-1中獲得的化合物A的晶形III的晶種(10mg)，并將混合物攪拌5hr。讓此混合物進一步冷卻到室溫，攪拌12hr，通過過濾收集晶體。用異丙醇(10mL)洗滌獲得的晶體，并進行真空干燥以得到作為白色晶體的目標產(chǎn)物(晶形III，9.72g，產(chǎn)率97.2％)。通過XRPD分析將這種晶體確認為相當于所述晶體(在實施例3-1中獲得的化合物A的晶形III)的標準產(chǎn)物。
實施例3-4化合物A的晶形III的生產(chǎn)將實施例2-2中獲得的化合物A的晶形II(7.00g，15.6mmol)加入乙醇(52.5mL)和水(7mL)的混合溶液中并通過加熱溶解。加入水(28mL)，于70℃加入目標產(chǎn)物的晶種(10mg)并將混合物攪拌4hrs。在讓其冷卻到室溫后，將混合物冰冷并進一步攪拌2hrs，通過過濾收集晶體。將獲得的晶體用冷乙醇(8.4mL)和水(5.6mL)的混合溶液洗滌并進行真空干燥以得到作為白色晶體的目標產(chǎn)物(晶形III，6.77g，產(chǎn)率96.8％)。通過XRPD分析確認此晶體相當于標準產(chǎn)物(實施例3-1)。
實驗實施例通過下列分析測試來測定每種晶形的特性值，并利用它們作為指標來進行每種晶形的穩(wěn)定性測試。
樣品除非另外指定，將參考實施例1中獲得的前述晶體(晶形I)，實施例1中獲得的晶體(晶形II)和實施例3-1中獲得的晶體(晶形III)用作樣品。
分析測試1.X-射線粉末衍射學本測試的目的在于獲得X-射線粉末衍射模式以指定在參考實施例1，實施例1和實施例3-1中獲得的晶形。將所述衍射模式用來指定晶形，評估穩(wěn)定性，以測定純度等。
將樣品固定到鋁室中，利用X-射線粉末衍射計(RINT 2000/PC Ultima+，Rigaku Corporation生產(chǎn)，X-射線源Cu-Kα1射線，電子管電壓40kV，電子管電流40mA，掃描速度每min5°，步寬0.02°，衍射角5-40°)進行測量，基于此獲得所述衍射模式。獲得的衍射模式顯示于圖1中。
如圖1中所示，來自各個樣品的X-射線粉末衍射模式是不同的。
因此證實了在參考實施例1，實施例1和實施例3-1中獲得的晶體彼此不同，并且顯示如在X-射線粉末衍射模式中所示的特征性衍射模式。所以，在本說明書中，基于這些X-射線粉末衍射模式，它們被命名為晶形I，晶形II和晶形III。
為了說明晶形，可以基于圖1中的衍射圖以全面的方式評估每種晶體的衍射峰特征。
下面顯示由圖1的衍射模式說明的主衍射峰和特征衍射峰。
主衍射峰2θ＝6.58，14.40，14.64，15.24，16.48，19.16，20.90，21.14，22.24，24.74，25.64，26.12，27.20°；特征衍射峰2θ＝6.58，14.40，19.16，20.90，21.14°。
主衍射峰2θ＝6.56，9.04，13.20，14.62，15.24，16.48，19.86，20.84，21.22，22.24，25.22，25.96，26.12，27.34°；特征衍射峰2θ＝6.56，13.20，19.86，20.84，21.22，25.22°。
主衍射峰2θ＝8.54，14.02，15.68，15.90，16.00，17.06，17.24，17.84，18.12，19.50，19.90，22.26，22.68，23.02，24.16，24.76，25.18，25.74，25.98，27.50，28.80，30.38，30.72，32.54°；特征衍射峰2θ＝8.54，14.02，15.68，17.06，17.24，24.16，25.74°。
2.熱分析本測試的目的是測量在示差掃描量熱法(DSC)測量曲線的吸熱峰上的焓和外推起始溫度。這些值是上述晶形I，晶形II和晶形III的穩(wěn)定性的指標之一，并且能夠被用作指標來指定晶形。
2.1.晶形I和晶形II的焓和外推的起始溫度利用示差掃描量熱法(DSC)測量裝置(DSC8240，Rigaku Corporation生產(chǎn))對晶形I和晶形II進行測量，在大氣下，測量樣品5±1mg，升溫速率10℃/min，鋁質(zhì)開放盤，氧化鋁作為參照。測定獲得的DSC曲線的吸熱峰上的熱焓和推斷的起始溫度。
2.2.晶形III的熱焓和推斷的起始溫度利用差動掃描式量熱器(DSC)測量裝置(DSC8240，Rigaku Corporation生產(chǎn))對晶形III進行測量，在大氣下，測量樣品5.0±0.5mg，升溫速率5℃/min，鋁質(zhì)閉合盤，氧化鋁作為參照。測定獲得的DSC曲線吸熱峰上的焓和外推的起始溫度。
結(jié)果顯示于表1中。
表1吸熱峰上關于焓和外推起始溫度的DSC曲線

如表1中所示，在三種晶形中，晶形III顯示最大的焓和最高的外推起始溫度。因而，晶形III被確認為最穩(wěn)定的形式。
3.純度測試本測試的目的是測量化合物A的純度。所述純度可以用作化學穩(wěn)定性的指標。
3.1.晶形I和晶形II的化合物的純度將每種樣品(晶形I和晶形II，約10mg)溶于乙腈中以制成10mL的量并用作樣品溶液。將這種溶液(10μL)在下列條件下應用到高效液相色譜(HPLC)中。通過自動積分測量每種樣品溶液的峰面積，并通過下列公式測定純度。所述純度顯示于下表5和6中。
純度(％)＝100-(Asum/As)×100As獲自樣品溶液的峰的總峰面積Asum獲自樣品溶液的除了主峰之外的峰的總峰面積測試條件檢測器UV吸光測定計(波長259nm)柱CAPCELL PAKMG(內(nèi)徑4.6cm，長15cm，顆粒大小5μm，ShiseidoCo.，Ltd.生產(chǎn))柱溫40℃左右的恒溫流動相A三氟乙酸溶液(1∶1000)
流動相B在乙腈中的三氟乙酸溶液(1∶1000)梯度程序如下表2中所示，改變流動相A和流動相B的混合比例來控制濃度梯度。
表2

流速1mL/min3.2.晶形III的化合物的純度將樣品(晶形III，約50mg)溶于流動相B和流動相A的混合物(4∶1)中以制成50mL的量，將其用作樣品溶液。對這種溶液(1mL)進行精確測量并加入流動相B和流動相A的混合物(4∶1)以精確地制成100mL的量，將其用作標準溶液。將樣品溶液和標準溶液(15μL)在下列條件下應用于高效液相色譜(HPLC)。通過自動積分測量每種溶液的峰面積，并通過下列公式測定純度。所述純度顯示于下表7中。
純度(％)＝100-(Asum/Ar)As獲自標準溶液的主峰的峰面積Asum獲自樣品溶液的除了主峰之外的峰的總峰面積測試條件檢測器UV吸光測定計(波長259nm)柱Waters XTerra MC C18(內(nèi)徑4.6cm，長5cm，顆粒直徑2.5μm，Waters生產(chǎn))柱溫40℃左右的恒溫流動相A將磷酸加入到磷酸氫二鉀溶液中(1→1149)以調(diào)節(jié)pH到7.0流動相B乙腈梯度程序如下表3中所示，改變流動相A和流動相B的混合比例來控制濃度梯度。
表3

流速0.9mL/min4.溶解度測試本測試的目的是測量晶體在各種測試溶液中和在各種pH下的溶解度。溶解度是上述晶形I，晶形II和晶形III的穩(wěn)定性的指標之一并且還可以用作晶形被活體生物吸收的參考指標。
將每種樣品(I型晶形I，晶形II和晶形III，約10mg)與下列測試溶液(5mL)一起置于10mL離心管中并用振動器(SR-1M；Tietech Co.，Ltd.生產(chǎn))振動14小時。振動后，將混合物離心(3000rpm，20min)并將上清液濾過0.2μm孔徑-13mm直徑的聚四氟乙烯盤式過濾器(Millex-LG；MilliporeCorporation生產(chǎn))。通過高效液相色譜(HPLC)進行測量。結(jié)果顯示于表4中。
表4溶解度測試

1)日本藥典，一般測試方法，崩解測試方法，第一流體。將鹽酸(7.0mL)和水加入到氯化鈉(2.0g)中制成1000mL的量。這種溶液是透明和無色的并且具有大約1.2的pH。
2)日本藥典，一般測試方法，崩解測試方法，第二流體。將0.2mol/L氫氧化鈉樣品(118mL)和水加入到0.2mol/L磷酸二鈉鉀樣品(250mL)中以制成1000mL的量。這種溶液是透明和無色的并且具有大約6.8的pH。
3)通過以給定的比例混合磷酸氫二鈉和檸檬酸以調(diào)節(jié)到給定的pH來獲得McIlvaine緩沖液。
由上述結(jié)果，確認晶形II比晶形III具有更高的溶解度。
5.穩(wěn)定性測試在下列保存條件下進行每種樣品的穩(wěn)定性測試。晶形I的結(jié)果顯示于表5中，晶形II的結(jié)果顯示于表6中，而晶形III的結(jié)果顯示于表7中。
如在表6和表7中所示，與起始樣品相比，晶形II和晶形III在所有保存條件下并不顯示測試結(jié)果的任何差異。相反地，如在表5中所示，晶形I在保存條件#3(80℃，保存在開放容器中3天)和保存條件#5(60℃，保存在開放容器中3周)下保存后獲自樣品的X-射線粉末衍射模式顯示了變化，并且觀察到晶形I的X-射線粉末衍射模式與來自晶形II的X-射線粉末衍射模式相重疊。因而，據(jù)估計一部分的樣品在保存期間顯示向晶形II的的晶體轉(zhuǎn)變。晶形I的在保存條件#1-6下保存樣品的樣品X-射線粉末衍射模式顯示于圖2中。
表5晶形I穩(wěn)定性測試的結(jié)果

R.H.相對濕度XRDX-射線粉末衍射學表6晶形II穩(wěn)定性測試的結(jié)果

R.H.相對濕度XRDX-射線粉末衍射學表7晶形III穩(wěn)定性測試的結(jié)果

R.H.相對濕度XRDX-射線粉末衍射學由上述穩(wěn)定性測試的結(jié)果，觀察到晶形I是不穩(wěn)定的但是晶形II和晶形III在各種保存條件下極為穩(wěn)定。所以，顯然晶形II和晶形III對于用作藥物產(chǎn)品等是優(yōu)選的。
就活體生物的可吸收性來說，晶形II更加優(yōu)選，而晶形III是更加優(yōu)選的，因為它是最穩(wěn)定的晶體。
由于晶形II和晶形III都是穩(wěn)定的，所以它們的混合晶體可以用于本發(fā)明。
實驗實施例下面闡釋本發(fā)明化合物A的晶體或混合晶體的HIV整合酶抑制活性的評估方法。
(i)重組整合酶基因表達系統(tǒng)的構(gòu)建HIV整合酶全長基因(J.Virol.，67，425-437(1993))的第185位苯丙氨酸被組氨酸取代并插入質(zhì)粒pET21a(+)(Novagen生產(chǎn))的限制酶NdeI和XhoI位點中，由此構(gòu)建整合酶表達載體pET21a-IN-F185H。
(ii)整合酶蛋白的生產(chǎn)和純化將用(i)中獲得的質(zhì)粒pET21a-IN-F185H轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(E.coli)重組BL21(DE3)于30℃振動培養(yǎng)于包含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中。當培養(yǎng)物達到對數(shù)生長期時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷以促進整合酶基因的表達。繼續(xù)培養(yǎng)3hr以促進整合酶蛋白的聚積。通過離心分離將重組大腸桿菌收集在沉淀物中并保存于-80℃。
將大腸桿菌懸浮于包含1M氯化鈉的裂解緩沖液(20m MHEPES(pH7.5)，5mM DTT，10mM CHAPS，10％甘油)中并重復加壓和減壓以進行破裂，于4℃，40,000×g，60min離心分離以回收可溶于水的級分(上清液)。用不含氯化鈉的裂解緩沖液將其稀釋10倍，混合以SP-Sepharose(Pharmacia Corporation生產(chǎn))并于4℃攪拌60min以便讓整合酶蛋白吸收入樹脂中。用包含100mM氯化鈉的裂解緩沖液洗滌樹脂并用包含1M氯化鈉的裂解緩沖液洗脫整合酶蛋白。
將洗脫的整合酶蛋白溶液加樣到Superdex 75(Pharmacia Corporation)柱上進行凝膠過濾。用包含1M氯化鈉的裂解緩沖液洗脫蛋白質(zhì)。
收集獲得的整合酶蛋白級分并將其保存于-80℃。
(iii)DNA溶液的制備將Greiner合成的下列DNA溶于TE緩沖液(10mM Tris-鹽酸(pH8.0)，1mM EDTA)中并混合以供體DNA，目標DNA，和每種互補鏈(+和-鏈)至1μM。將混合物于95℃加熱5min，80℃ 10min，70℃ 10min，60℃ 10min，50℃ 10min和40℃ 10min并保存于25℃以得到用于測試的雙鏈DNA。
供體DNA(具有連接于5’末端上的生物素的-鏈)供體+鏈5’-生物素-ACC CTT TTA GTC AGT GTG GAA AAT CTC TAGCA-3’(SEQ ID NO1)供體-鏈5’-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAC TGA CTA AAA G-3’(SEQ ID NO2)目標DNA(+，-鏈，都具有添加在3’末端上的洋地黃毒苷)目標+鏈5’-TGA CCA AGG GCT AAT TCA CT-Dig-3’(SEQ ID NO3)目標-鏈5’-AGT GAA TTA GCC CTT GGT CA-Dig-3’(SEQ ID NO4)(iv)酶(HIV整合酶)抑制活性的測定用TE緩沖液將供體DNA稀釋到10nM，將其中50μl加入到鏈霉抗生物素包被的微量滴定板(Roche生產(chǎn))的每孔中并讓其于37℃吸附60min。隨后用包含0.1％吐溫20的磷酸鹽緩沖液(Dulbecco PBS，SankoJunyaku Co.，Ltd.)和磷酸鹽緩沖液洗滌DNA。接著，將反應混合物(70μl，見下列對于組成的*)，用反應混合物稀釋的測試物質(zhì)(10μl)和100μg/ml整合酶蛋白質(zhì)(10μl)加入每個孔中并且在37℃反應60min。
接著，加入50nM目標DNA(10μl)，在37℃反應10min并且用包含0.1％吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌以終止反應。
接著，加入100mU/ml過氧化物酶標記的抗-洋地黃毒苷抗體溶液(Roche生產(chǎn)，100μl)，并且將所述混合物在37℃反應60min，隨后用包含0.1％的吐溫20的磷酸鹽緩沖液進行洗滌。
加入過氧化物酶著色溶液(Bio Rad生產(chǎn)，100μl)，并且使其在室溫反應4min。通過加入1N硫酸(100μl)來終止所述著色反應。測量在450nm的吸光度。
按照下列公式由抑制率計算本發(fā)明的化合物A的HIV整合酶抑制活性(IC50)。將結(jié)果顯示于表8中。
抑制率(％)＝[1-(目標-空白)/(對照-空白)]×100目標；存在測試化合物的時候孔的吸光度對照；不存在測試化合物的時候孔的吸光度空白；不存在測試化合物，不存在整合酶蛋白的時候孔的吸光度*反應混合物的組成30mM嗎啉代丙磺酸(MOPS)，5mM MgCl2，3mM二硫蘇糖醇(DTT)，0.1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)，5％甘油，10％二甲亞砜(DMSO)，0.01％吐溫20表8

抗病毒活性的評估本發(fā)明的化合物A的晶體或混合晶體與現(xiàn)存的抗-HIV藥劑的組合應用的效果可以通過下列方式進行測定。
例如，從現(xiàn)存的核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(齊多夫定、拉米夫定、替諾福韋)，非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(依法韋侖)或蛋白酶抑制劑(茚地那韋、奈非那韋)和化合物A的晶體或混合晶體等的兩種藥劑的組合使用的效果通過使用用HIV-1 IIIB感染的CEM-SS細胞的XTT方法進行評估。
此外，評估化合物A的晶體或混合晶體，齊多夫定和拉米夫定，或化合物A的晶體或混合晶體、替諾福韋和拉米夫定等的三種藥劑的組合使用的效果。
在組合使用測試之前，測量每種藥劑單獨的IC50和CC50。將基于這些結(jié)果測定的5個濃度的藥劑a和9個濃度的藥劑b進行組合以評估兩種藥劑的組合使用的效果。對于三種藥劑的組合使用，將高濃度的藥劑b和藥劑c進行混合并且將藥劑a和濃度進行組合來評估。
基Prichard和Shipman MacSynergy II版本2.01和Deltagraph版本1.5d的程序，分析化合物A的晶體或混合晶體和單獨的藥物組合或組合其的組合的測試結(jié)果。
從獲自3次測試的在每種組合藥劑的濃度下的％抑制來繪制三維圖，其中具有95％(或68％，99％)的置信界限，并且基于由其計算的μM2％的數(shù)值來評估組合使用的效果。評估的標準顯示如下。
相互作用的定義 μM2％強協(xié)同作用 ＞100弱協(xié)同作用 +51-+100添加作用 +50--50弱拮抗作用 -51--100強拮抗作用 ＜-100工業(yè)適用性具有上述具體晶形的本發(fā)明的化合物A的晶體，顯示抗-HIV作用以及優(yōu)越的晶體穩(wěn)定性。因此，將其用作藥物組合物的原材料，所述藥物組合物具體而言指用于預防和/或治療AIDS的各種藥物組合物。
本申請基于在日本提交的專利申請?zhí)?004-150979，將其內(nèi)容并入本文作為參考。將本文引用的所有參考文獻，包括專利、專利申請和出版物全部內(nèi)容并入本文作為參考。
序列表<110>日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社<120>4-氧代喹啉化合物的穩(wěn)定的晶體<130>09765<150>JP2004-150979<151>2004-5-20<160>4<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于HIV整合酶的活性測定的供體正鏈<400>1acccttttag tcagtgtgga aaatctctag ca 32<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于HIV整合酶的活性測定的供體負鏈<400>2actgctagag attttccaca ctgactaaaa g 31<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于HIV整合酶的活性測定的目標正鏈<400>3tgaccaaggg ctaattcact 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于HIV整合酶的活性測定的目標負鏈<400>4agtgaattag cccttggtca 20
權(quán)利要求
1.一種6-(3-氯-2-氟芐基)-1-[(S)-1-羥甲基-2-甲基丙基]-7-甲氧基-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸的晶體(晶形II)，如通過X-射線粉末衍射計所測量，其X-射線粉末衍射模式在6.56，13.20，19.86，20.84，21.22，25.22°的衍射角2θ(°)下具有特征衍射峰。
2.一種6-(3-氯-2-氟芐基)-1-[(S)-1-羥甲基-2-甲基丙基]-7-甲氧基-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸的晶體(晶形III)，如通過X-射線粉末衍射計所測量，其X-射線粉末衍射模式在8.54，14.02，15.68，17.06，17.24，24.16，25.74°的衍射角2θ(°)下具有特征衍射峰。
3.一種6-(3-氯-2-氟芐基)-1-[(S)-1-羥甲基-2-甲基丙基]-7-甲氧基-4-氧代-1，4-二氫喹啉-3-羧酸的晶體(晶形III)，其具有162.1±5.0℃的外推起始溫度。
4.權(quán)利要求1-3任一項的晶體，其具有不低于70％的晶體純度。
5.一種混合晶體，其包含權(quán)利要求1的晶體和權(quán)利要求2或3的晶體。
6.權(quán)利要求5的混合晶體，其中晶體的純度不低于70％。
7.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-4中任一項的晶體或者權(quán)利要求5或6的混合晶體、和藥用載體。
8.一種整合酶抑制劑，其包含權(quán)利要求1-4中任一項的晶體或者權(quán)利要求5或6的混合晶體作為活性成分。
9.一種抗病毒劑，其包含權(quán)利要求1-4中任一項的晶體或者權(quán)利要求5或6的混合晶體作為活性成分。
10.一種抗-HIV藥劑，其包含權(quán)利要求1-4中任一項的晶體或者權(quán)利要求5或6的混合晶體作為活性成分。
11.一種抗-HIV組合物，其包含權(quán)利要求1-4中任一項的晶體或者權(quán)利要求5或6的混合晶體、以及一種或多種其它的抗-HIV活性物質(zhì)作為活性成分。
12.一種用于與其它抗-HIV藥劑進行多藥物療法的抗-HIV藥劑，其包含權(quán)利要求1-4中任一項的晶體或者權(quán)利要求5或6的混合晶體作為活性成分。
全文摘要
本發(fā)明提供6－(3－氯－2－氟芐基)－1－[(S)－1－羥甲基－2－甲基丙基]－7－甲氧基－4－氧代－1，4－二氫喹啉－3－羧酸的晶體，如通過粉末X－射線衍射學所測量，其顯示在衍射角2θ(°)下具有特征衍射峰的特定粉末X－射線衍射模式。本發(fā)明的晶體在物理和化學穩(wěn)定性上是優(yōu)越的。
文檔編號A61K31/47GK1956961SQ20058001614
公開日2007年5月2日 申請日期2005年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月20日
發(fā)明者佐藤元秀, 本村隆尚, 松田隆, 近藤健太郎, 安藤公司, 松田浩二, 三宅修司, 植原秀人 申請人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社