專利名稱：：含有二苯乙烯總苷的藥物組合物及其在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于中藥新藥研發(fā)領(lǐng)域，具體涉及一種含有二苯乙烯總苷的藥物組合物及其在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肝炎的發(fā)生多為病毒感染所致。在我國(guó)罹患率較高的是乙型病毒性肝炎。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，急性乙型病毒性肝炎的治愈率約為1/3，死亡率約為1/3，其余多轉(zhuǎn)為慢性乙肝。慢性乙肝以及乙肝病毒攜帶者在我國(guó)發(fā)生率已逾10％。目前市場(chǎng)上療效較好的抗乙肝病毒藥物很少，而且也未能滿足病人的需要。在品種繁多的治療乙肝病毒藥物中，西藥因價(jià)格昂貴、副作用較大，療效不能令人滿意，在我國(guó)推廣使用難合國(guó)情。為此，迫切需要為眾多的乙型肝炎疾病患者提供藥理作用明確、藥效高、毒副作用低的治療乙型肝炎的藥物?；⒄葹檗た浦参锘⒄萈olygonumcuspidatumSieb.etZucc.的干燥根莖，其性微苦，微寒；歸肝、膽、肺經(jīng)；虎杖具有祛風(fēng)利濕、祛痰止咳、清熱解毒、活血化瘀等功效。從現(xiàn)代研究來(lái)看，虎杖具有抗血小板聚集、改善微循環(huán)、保肝降酶、降脂、抗氧化、抗病毒等多種藥理活性，臨床用于治療高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、高脂血癥及各種病毒感染等疾病。有關(guān)虎杖的藥理作用報(bào)道很多。其中劉蕾等(虎杖對(duì)小鼠CCl4性肝損傷的保護(hù)作用.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2001年6月第24卷第3期)研究結(jié)果表明虎杖煎劑能顯著降低CCl4(四氯化碳)誘導(dǎo)的肝損傷小鼠的血清ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)、AST(谷草轉(zhuǎn)氨酶)值，增強(qiáng)SOD(超氧化物歧化酶)活力，降低MDA(丙二醛)含量，說(shuō)明虎杖煎劑對(duì)CCl4致肝損傷具有一定保護(hù)作用。謝揚(yáng)等(虎杖及其復(fù)方制劑抗病毒有效成分研究與臨床應(yīng)用.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2004，15(8)527)報(bào)道虎杖及其復(fù)方制劑是常用的一種光譜抗病毒中藥，已廣泛應(yīng)用于病毒性肝炎等疾病的治療。從報(bào)道的文獻(xiàn)中可以看出虎杖具有明顯的保肝、抗病毒作用，但其發(fā)揮作用的確切有效成分還未見有詳細(xì)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)象，對(duì)虎杖進(jìn)行了深入研究，并發(fā)現(xiàn)了虎杖中的有效部位二苯乙烯總苷具有明顯的保肝降酶、利膽、抗病毒作用。本發(fā)明的目的在于提供一種含有二苯乙烯總苷的用于治療乙型肝炎的藥物組合物及其藥物制劑，并提供了該藥物組合物或藥物制劑在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的二苯乙烯總苷是從中藥虎杖中提取的有效部位。所述虎杖為蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.的干燥根莖。本發(fā)明在此提供了一種制備二苯乙烯總苷的制備方法。本發(fā)明所述的二苯乙烯總苷可用如下方法得到取虎杖藥材，粉碎成過(guò)10-30目篩的粗粉，用8-16倍藥材重量體積的水或不同濃度乙醇提取，提取液減壓濃縮至相對(duì)密度為1.05～1.08(60℃時(shí))的浸膏，加3-10倍藥材重量的去離子水溶解，離心(3000轉(zhuǎn)/分，8分/次)，上清液過(guò)大孔吸附樹脂柱，用去離子水除雜，然后再用10％以下濃度乙醇除雜，最后用20％-40％的乙醇以0.8L/kg.h流速解吸，收集解吸液，減壓回收乙醇，濃縮并真空干燥(60℃，-0.09Mpa)，粉碎得虎杖提取物，其有效部位為二苯乙烯總苷。上述虎杖提取物中二苯乙烯總苷含量以虎杖苷計(jì)大于等于55％。上述提取方法中所用的樹脂可以是D-101、Dm301或AB-8型。本發(fā)明所述的二苯乙烯總苷也可以通過(guò)其它制備方法制備，其二苯乙烯總苷以虎杖苷計(jì)含量應(yīng)大于等于55％。經(jīng)研究，本發(fā)明所述的二苯乙烯總苷主要包含兩種化合物，分別為白藜蘆醇(Resveratrol)和虎杖苷(Polydatin)，其中主要成分為虎杖苷。二者化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下虎杖苷(polydatin)本發(fā)明提供了一種含有二苯乙烯總苷的用于治療乙型肝炎的藥物組合物，其中的活性成分為二苯乙烯總苷，且二苯乙烯總苷以虎杖苷計(jì)含量大于等于55％。本發(fā)明所述的含有二苯乙烯總苷的用于治療乙型肝炎的藥物組合物，其中二苯乙烯總苷以虎杖苷計(jì)含量大于等于80％。為了將二苯乙烯總苷開發(fā)成治療乙型肝炎的藥物，可將其制成不同的藥物劑型，該中藥藥物制劑以上述二苯乙烯總苷為主要活性成分，并包括了藥劑學(xué)上可接受的輔料組分。藥物劑型包括常規(guī)劑型如片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊劑、注射劑、貼劑、霜?jiǎng)┑?。另外可制成新型給藥制劑，如經(jīng)皮給藥系統(tǒng)、靶向給藥制劑、緩控釋制劑、粘膜給藥系統(tǒng)等，其中靶向給藥制劑可以是納米粒、脂質(zhì)體、微囊、微球等。給藥途徑可以包括口服、粘膜、經(jīng)皮、注射等，其中注射給藥可以是經(jīng)肌肉、皮下或靜脈等途徑。在制備膠囊劑或片劑時(shí)，選用的輔型劑可以是淀粉、糊精或環(huán)糊精、蔗糖、硬脂酸鹽等常規(guī)充填劑。各制劑的后期制備工藝及設(shè)備均屬制藥領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，本發(fā)明對(duì)此不作限定，故在此不予詳述。本發(fā)明所述的含有二苯乙烯總苷的藥物制劑，優(yōu)選劑型是膠囊劑和片劑，其中二苯乙烯總苷以虎杖苷計(jì)含量大于等于55％，其制備方法可按領(lǐng)域內(nèi)公知的制備技術(shù)制備。本發(fā)明所述的含有二苯乙烯總苷的藥物制劑，優(yōu)選劑型是凍干粉針劑，其中二苯乙烯總苷以虎杖苷計(jì)含量大于等于80％，其制備方法可按領(lǐng)域內(nèi)公知的制備技術(shù)制備。為了研究二苯乙烯總苷在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明人根據(jù)《中藥(新藥)臨床前研究指導(dǎo)原則》，重點(diǎn)研究了二苯乙烯總苷在保肝降酶和抗乙肝病毒方面的藥效，另外也研究了二苯乙烯總苷在免疫調(diào)節(jié)、利膽和降脂等方面的藥效。研究結(jié)果表明二苯乙烯總苷對(duì)各種因素導(dǎo)致的急、慢性肝損傷均具有顯著的預(yù)防保護(hù)和治療作用；體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提示其對(duì)乙肝病毒(HBV)亦具有顯著的抑制作用；另外研究還表明，二苯乙烯總苷可以提高正常大鼠膽汁流量，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的異常，并對(duì)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫功能具有調(diào)節(jié)作用，而免疫功能失調(diào)正是慢性肝炎肝細(xì)胞損傷的主要機(jī)理。研究結(jié)果說(shuō)明二苯乙烯總苷可從多個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)發(fā)揮治療肝炎的功效。二苯乙烯總苷的急性毒性研究、一般藥理研究以及對(duì)大鼠和犬的長(zhǎng)期毒性研究結(jié)果均提示該藥物毒性非常小，藥效劑量遠(yuǎn)低于毒性劑量。因此二苯乙烯總苷具有明顯的保肝降酶、利膽、降脂、抗病毒作用，且具有免疫調(diào)節(jié)功能。鑒于二苯乙烯總苷具有高效、低毒的特點(diǎn)，因此市場(chǎng)應(yīng)用前景非常廣闊。綜上所述，本發(fā)明所述的藥物組合物或者藥物制劑可在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用，具體包括在制備治療急、慢性乙型肝炎藥物中的應(yīng)用和在制備治療乙型病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用。具體實(shí)施例為了便于理解二苯乙烯總苷在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用，發(fā)明人完成了下述主要藥效學(xué)試驗(yàn)。但本發(fā)明并不限于下述試驗(yàn)內(nèi)容。試驗(yàn)例1對(duì)四氯化碳致小鼠急性肝損傷的預(yù)防保護(hù)作用一、材料與方法1.受試藥物二苯乙烯總苷，性狀，棕褐色粉末，由本發(fā)明人制備，含量＞55％。2.陽(yáng)性對(duì)照藥聯(lián)苯雙酯滴丸，北京協(xié)和藥廠，規(guī)格1.5mg×500丸/盒，批號(hào)03100103，有效期3年。3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物II級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體重22±2g，由北醫(yī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。4.方法取昆明種小鼠72只，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(聯(lián)苯雙酯200mg/kg)、二苯乙烯總苷小(20mg/kg)、中(40mg/kg)、大(80mg/kg)劑量組，共6組，12只/組。除空白對(duì)照組與模型對(duì)照組外，其余各組均按0.2ml/10g灌胃給藥，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積的蒸餾水，每日1次，共7日，并于第7日給藥1h后，除空白對(duì)照組外，其余各組均腹腔注射0.12％四氯化碳花生油溶液0.1ml/10g造成小鼠急性肝損傷模型，造模后16h摘眼球取血測(cè)血清ALT、AST。5.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較運(yùn)用方差齊性檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。二、試驗(yàn)結(jié)果(見表1)表1二苯乙烯總苷對(duì)四氯化碳致小鼠急性肝損傷血清ALT、AST的影響(n＝12，注與空白對(duì)照組比較，△△△P＜0.001；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，**P＜0.001。由上表結(jié)果可見，二苯乙烯總苷小、中、大劑量組與模型對(duì)照組比較，ALT、AST值明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異均有顯著性，且具有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。本結(jié)果說(shuō)明二苯乙烯總苷對(duì)四氯化碳致小鼠急性肝損傷有明顯的預(yù)防保護(hù)作用。試驗(yàn)例2對(duì)D-氨基半乳糖致大鼠急性肝損傷的治療作用一、材料與方法受試藥物、陽(yáng)性對(duì)照藥、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理方法同試驗(yàn)例1。1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物II級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，體重140～160g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所繁育場(chǎng)提供，合格證號(hào)SCXK11-00-0006。2.方法Wistar大鼠72只，雌雄各半，體重140～160g，按體重隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(聯(lián)苯雙酯150mg/kg)、二苯乙烯總苷小(15mg/kg)、中(30mg/kg)和大(60mg/kg)劑量組。除空白對(duì)照組腹腔注射等體積的生理鹽水外，其余各組均腹腔注射D-氨基半乳糖生理鹽水溶液600mg/kg，造成急性肝損傷模型。造模后除空白對(duì)照組與模型對(duì)照組給予等體積的生理鹽水外，其余各組分別在造模后1小時(shí)、10小時(shí)及21小時(shí)按0.2ml/10g的給藥量灌胃給藥一次，并于造模后22小時(shí)腹主動(dòng)脈取血，測(cè)血清ALT、AST、TP、ALB值。二、試驗(yàn)結(jié)果(見表2、表3)表2二苯乙烯總苷對(duì)D-氨基半乳糖致大鼠急性肝損傷血清ALT、AST的影響(n＝12，注與空白對(duì)照組比較，△△△P＜0.001；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。由上表結(jié)果可見二苯乙烯總苷小、中、大劑量組與模型對(duì)照組比較，ALT、AST值明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異具有顯著性。表3二苯乙烯總苷對(duì)D-氨基半乳糖致大鼠急性肝損傷血清TP、ALB的影響(n＝12，注與空白對(duì)照組比較，△△△P＜0.001；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。由上表結(jié)果可見，二苯乙烯總苷小、中、大劑量組與模型對(duì)照組比較，TP值明顯升高，ALB值明顯升高，差異具有顯著性。以上結(jié)果可知，二苯乙烯總苷灌胃給藥對(duì)D-氨基半乳糖致大鼠急性肝損傷有明顯的治療作用。試驗(yàn)例3對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷的預(yù)防保護(hù)作用一、材料與方法受試藥物、陽(yáng)性對(duì)照藥、試驗(yàn)動(dòng)物、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理方法同試驗(yàn)例1。試驗(yàn)方法取昆明種小鼠72只，雌雄各半，體重22±2g，按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性組(聯(lián)苯雙酯200mg/kg)、二苯乙烯總苷小(20mg/kg)、中(40mg/kg)、大(80mg/kg)劑量組，共6組，12只/組。除空白對(duì)照組和模型對(duì)照組外，其余各組均按0.2ml/10g灌胃給予相應(yīng)藥物，空白對(duì)照組與模型對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，每日1次，共7日。于末次給藥后1h，除空白對(duì)照組外，其余各組均按0.2ml/10g灌胃給對(duì)乙酰氨基酚(120mg/kg)造成小鼠急性肝損傷模型，空白對(duì)照組灌胃給等體積生理鹽水(造模后禁食)，于造模后16h摘眼球取血，離心并提取血清，測(cè)血清ALT、AST。二、試驗(yàn)結(jié)果(見表4)表4二苯乙烯總苷對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷血清ALT、AST的影響(n＝12，注與空白對(duì)照組比較，△△△P＜0.001；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。由上表可知二苯乙烯總苷小、中、大劑量組與模型對(duì)照組比較，ALT值均明顯降低，差異具有顯著性(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，AST值均明顯降低，差異具有顯著性(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)。結(jié)果表明二苯乙烯總苷對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷有明顯的預(yù)防保護(hù)作用。試驗(yàn)例4對(duì)四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的治療作用一、材料與方法受試藥物、陽(yáng)性對(duì)照藥、試驗(yàn)動(dòng)物、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理方法同試驗(yàn)例2。試驗(yàn)方法取Wistar大鼠86只，隨機(jī)分出12只為空白對(duì)照組。其余均皮下注射25％四氯化碳花生油溶液(2ml/kg)，每周一、四各1次，連續(xù)6周，造成慢性肝損傷模型。于造模2周后眶后取血測(cè)血清ALT及AST值，根據(jù)血清ALT及AST值，并參考體重分為5組，即模型對(duì)照組、聯(lián)苯雙酯組(150mg/kg)、二苯乙烯總苷小(15mg/kg)、中(30mg/kg)、大(60mg/kg)劑量組。各組按1ml/100g體積灌胃給藥，模型及空白對(duì)照組給予等體積生理鹽水，每天給藥一次，連續(xù)給藥4周。于末次給藥后24小時(shí)，腹腔注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)將大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，測(cè)血清ALT、AST、A/G(白蛋白/球蛋白)值，并取肝臟測(cè)定肝臟羥脯氨酸及肝糖原含量。二、試驗(yàn)結(jié)果(見表5、6)表5二苯乙烯總苷對(duì)慢性肝損傷大鼠血清ALT、AST、A/G的影響(n＝12，<tablesid="table6"num="006"><tablewidth="838">組別劑量mg/kgALT(U/L)AST(U/L)A/G空白對(duì)照組模型對(duì)照組聯(lián)苯雙酯組二小苯乙烯中總苷大15015306040.85±6.35562.52±85.64△△△340.90±74.41***468.25±74.80**436.46±67.03***389.25±86.24***149.17±20.51843.78±28.46△△△511.35±111.61***768.12±117.13742.39±108.63*583.88±129.37***1.1866±0.180.8876±0.21△△△1.0962±0.15**1.0361±0.241.0486±0.16*1.0860±0.20*</table></tables>注與空白對(duì)照組比較，△△△P＜0.001；與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。由上表可知，二苯乙烯總苷小劑量組與模型對(duì)照組比較，ALT含量明顯降低，差異具有非常顯著性(P＜0.01)，中、大劑量組與模型對(duì)照組比較，ALT含量明顯降低，差異具有極顯著性(P＜0.001)。二苯乙烯總苷各給藥組AST含量均有降低趨勢(shì)，其中中、大劑量組與模型對(duì)照組比較，AST值明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異具有顯著性和極顯著性(P＜0.05、P＜0.001)。二苯乙烯總苷各劑量組A/G值均有回升的趨勢(shì)，其中中、大劑量組與模型對(duì)照組比較，A/G值明顯升高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異均有顯著性(P＜0.05)。表6二苯乙烯總苷對(duì)慢性肝損傷大鼠肝糖原、羥脯氨酸含量及肝系數(shù)的影響(n＝12，注與空白對(duì)照組比較，△△P＜0.01△△△P＜0.001；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001由上表可知，二苯乙烯總苷小、中、大劑量組與模型對(duì)照組比較，肝糖原均明顯升高，肝臟羥脯氨酸含量明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異有顯著性。由表5和表6可知，二苯乙烯總苷對(duì)四氯化碳致大鼠慢性肝損傷有明顯的治療作用。試驗(yàn)例5對(duì)小鼠免疫性肝損傷的預(yù)防保護(hù)作用一、材料與方法受試藥物、陽(yáng)性對(duì)照藥、試驗(yàn)動(dòng)物、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理方法同試驗(yàn)例1。試驗(yàn)方法取昆明種小鼠90只，雄性，按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性聯(lián)苯雙酯組(200mg/kg)、二苯乙烯總苷小(20mg/kg)、中(40mg/kg)、大(80mg/kg)劑量組，共6組，每組15只。除空白對(duì)照組給予等體積的生理鹽水外，其余各組均尾靜脈注射卡介苗5×107U/只一次，12天后小鼠再尾靜脈注射脂多糖6.0μg/只一次，造成小鼠免疫性肝損傷模型。注射卡介苗后，除空白與模型組給予等體積的生理鹽水外，注射卡介苗后二苯乙烯總苷小、中、大劑量組和陽(yáng)性藥組分別給予相應(yīng)劑量藥物，按0.2ml/10g體積灌胃給藥，每日一次，共12日。于注射LPS后12h，摘眼球取血，離心血清測(cè)ALT、AST、TP(總蛋白)、ALB(白蛋白)、A/G(白蛋白/球蛋白)。二、試驗(yàn)結(jié)果(見表7、8)表7二苯乙烯總苷對(duì)小鼠免疫性肝損傷動(dòng)物血清ALT、AST的影響(n＝15，注與空白對(duì)照組比較△△△P＜0.001；與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。由上表可知，二苯乙烯總苷小、中、大劑量與模型組比較，ALT值有不同程度下降，具有顯著性差異；大劑量組AST值有顯著性下降。表8二苯乙烯總苷對(duì)小鼠免疫性肝損傷血清TP、ALB、A/G的影響(n＝15，注與空白對(duì)照組比較，△△△P＜0.001；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。從表中可知，二苯乙烯總苷中、大劑量組與模型對(duì)照組比較，TP、A/G值明顯升高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理具有顯著性差異。二苯乙烯總苷三個(gè)劑量與模型對(duì)照組比較，ALB值有不同程度升高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理具有顯著性差異。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明二苯乙烯總苷對(duì)小鼠免疫性肝損傷具有明顯的預(yù)防保護(hù)作用。試驗(yàn)例6對(duì)乙肝病毒抑制作用的體外研究一、材料與方法1.材料1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株2.2.15細(xì)胞，為基因組內(nèi)整合有人乙肝病毒全基因組的肝癌HepG2細(xì)胞。1.2藥物受試藥物二苯乙烯總苷，同試驗(yàn)一；陽(yáng)性藥物拉米夫定(3TC)片劑2.實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞接種于96孔板24小時(shí)后，棄去各孔培養(yǎng)液，將二苯乙烯總苷藥液從1mg/ml設(shè)起，依次用DMEM培養(yǎng)液2倍稀釋成6個(gè)濃度，每個(gè)濃度藥液作用5孔細(xì)胞，每孔藥液終體積為200μL，同時(shí)設(shè)不給藥細(xì)胞對(duì)照，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)72～96小時(shí)。用MTT試驗(yàn)測(cè)定各孔細(xì)胞的OD值(吸光值)。用BLiss法計(jì)算二苯乙烯總苷對(duì)2.2.15細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC50及無(wú)毒濃度(近似使95％的細(xì)胞存活的藥物濃度)。在95％細(xì)胞存活的藥物濃度以下設(shè)置6個(gè)倍比稀釋的藥物濃度，作用于2.2.15細(xì)胞，給藥方式同上，培養(yǎng)8天，分別收集培養(yǎng)4天及8天的培養(yǎng)上清液，用Elisa方法測(cè)定HBsAg和HBeAg的含量，具體用OD值表示；并計(jì)算受試藥物對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制百分率；用BLiss法算出二苯乙烯總苷和拉米夫定(3TC)對(duì)HBsAg和HBeAg的半數(shù)抑制濃度(IC50)。試驗(yàn)重復(fù)3次，觀察藥物作用的穩(wěn)定性。采用治療指數(shù)(TI)為評(píng)價(jià)藥物安全性和有效性的指標(biāo)，具體計(jì)算方法如下TI＝TC50(細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為50％時(shí)的藥物濃度)/IC50(抗原抑制率為50％時(shí)的藥物濃度)；判定標(biāo)準(zhǔn)TI＞2為有效；1≤TI≤2為有毒有效；TI＜1為毒性作用?？蓪⑹茉囁幬锱c陽(yáng)性對(duì)照藥進(jìn)行比較研究。二、試驗(yàn)結(jié)果(結(jié)果見表9)表9二苯乙烯總苷和3TC對(duì)乙肝病毒HBsAg和HBeAg的治療指數(shù)(TI)三批實(shí)驗(yàn)中二苯乙烯總苷對(duì)HBsAg和HBeAgTI的平均值分別為2.0和4.5；3TC在三批實(shí)驗(yàn)中，對(duì)HBsAg的TI平均值為4.6，對(duì)HBeAg未檢測(cè)到抑制作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明二苯乙烯總苷體外對(duì)乙肝病毒具有抑制作用，其中對(duì)HBeAg的抑制作用尤為顯著。試驗(yàn)例7對(duì)鴨乙型病毒性肝炎的影響一、材料和方法1.材料1.1動(dòng)物1日齡北京麻鴨，購(gòu)自北京前進(jìn)種鴨廠。1.2鴨乙型肝炎病毒陽(yáng)性血清采自上海麻鴨。1.3質(zhì)粒pUC18-DHBV-DNA(含有DHBV全基因組DNA；DHBV為鴨乙肝病毒)。1.4藥品受試藥物同試驗(yàn)例1；陽(yáng)性藥物拉米夫定(3TC)，同試驗(yàn)6。2.方法2.1建立鴨乙型肝炎動(dòng)物模型1日齡北京麻鴨，經(jīng)腿脛靜脈注射麻鴨DHBV-DNA陽(yáng)性鴨血清，每只0.3ml，以構(gòu)建鴨乙型肝炎動(dòng)物模型。7天后取血，進(jìn)行斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)血清中DHBV-DNA含量，篩選感染陽(yáng)性麻鴨。2.2實(shí)驗(yàn)分組及方法選取感染陽(yáng)性麻鴨75只，隨機(jī)分為5組，每組15只，分別為模型組(灌胃等體積生理鹽水)、陽(yáng)性藥組(口服給藥3TC，20mg/kg)、二苯乙烯總苷小(60mg/kg)、中(120mg/kg)、大(240mg/kg)三個(gè)劑量給藥組，藥物經(jīng)鴨灌胃給藥，給藥體積為1mL/100g，每天1次，連續(xù)給藥10天，停藥3天。同時(shí)取10只麻鴨作為正常對(duì)照組，灌胃給予等體積生理鹽水，與其他劑量組平行操作，分別在給藥前(T0)、給藥后第5天(T5)、給藥后第10天(T10)及停藥后第3天(P3)取鴨頸血清測(cè)DHBV-DNA及DHBpresAg含量，停藥3天后各組麻鴨處死。2.3觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法2.3.1鴨血清DHBV-DNA含量(斑點(diǎn)雜交法檢測(cè))按照Dig標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行操作。將上述鴨血清進(jìn)行點(diǎn)膜，用Dig標(biāo)記的DHBV全基因組DNA作為探針，進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，NBT/BCIP底物顯色，用CMIAS系列—多功能真彩色病理圖象分析系統(tǒng)分析膜上斑點(diǎn)的平均光密度值，以該值來(lái)代表樣本中DHBV-DNA水平。2.3.2鴨血清鴨乙肝病前s表面抗原(DHBpresAg)含量(ELISA方法檢測(cè))取待檢測(cè)鴨血清，包被酶標(biāo)板，通過(guò)ELISA方法測(cè)OD值，以O(shè)D值的高低來(lái)反映血清中DHBpresAg的含量，OD值越高代表DHBpresAg的含量越高。2.3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法將每組鴨給藥后給藥后第5、10天和停藥后第3天鴨血清DHBV-DNA水平/DHBpresAg水平分別與同組給藥前鴨血清DHBV-DNA水平/DHBpresAg水平比較(采用成對(duì)t檢驗(yàn))，分析差異的顯著性；將各給藥組鴨給藥前、給藥后第5、10天和停藥后第3天鴨血清DHBV-DNA水平/DHBpresAg水平分別與相應(yīng)模型組(給藥前、給藥后第5、10天和停藥后第3天)鴨血清DHBV-DNA水平/DHBpresAg水平比較(采用組間t檢驗(yàn))，分析差異的顯著；判斷藥物對(duì)該兩指標(biāo)的抑制效果；同時(shí)計(jì)算每組鴨用藥給藥后第5、10天和停藥后第3天對(duì)鴨血清中上述兩指標(biāo)的抑制率。二、試驗(yàn)結(jié)果(見表10、11、12、13)表10二苯乙烯總苷對(duì)鴨血清中DHBV-DNA含量的影響注*成對(duì)t檢驗(yàn)給藥組不同時(shí)間(T5、T10、P3)鴨血清DHBV-DNA平均光密度值與未藥前(T0)平均光密度值比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001?！鹘M間t檢驗(yàn)給藥組不同時(shí)間(T5、T10、P3)鴨血清DHBV-DNA平均光密度值與模型組(T5、T10、P3)平均光密度值比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。表11二苯乙烯總苷對(duì)鴨血清中DHBV-DNA的抑制率結(jié)果由上表可見二苯乙烯總苷能明顯降低鴨血清中DHBV-DNA的含量，具有差異顯著性，且具有良好的量效關(guān)系，停藥后無(wú)“反跳”現(xiàn)象。二苯乙烯總苷對(duì)DHBV-NA的抑制率最高可達(dá)61％，且大劑量組的抑制率明顯高于中、小劑量組。表12二苯乙烯總苷對(duì)鴨血清中DHBpresAg的影響注*成對(duì)t檢驗(yàn)，給藥組不同時(shí)間(T5、T10、P3)鴨血清DHBV-DNA平均光密度值與未給藥前(T0)平均光密度值比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001?！鹘M間t檢驗(yàn)給藥組不同時(shí)間(T5、T10、P3)鴨血清DHBV-DNA平均光密度值與模型組(T5、T10、P3)平均光密度值比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。表13二苯乙烯，總苷對(duì)鴨血清中DHBpresAg的抑制率結(jié)果由表可見，二苯乙烯總苷對(duì)DHBpresAg有抑制作用，但對(duì)DHBV-DNA的抑制率更高，考慮到DHBpresAg的含量只能近似代表病毒的數(shù)量，而病毒DNA的含量更接近真實(shí)的病毒量，故仍認(rèn)為二苯乙烯總苷對(duì)乙肝病毒的增殖具有明顯的抑制作用，且作用持久而穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明二苯乙烯總苷對(duì)鴨乙型病毒性肝炎具有較好的治療效果作用。具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明藥物的制備方法[實(shí)施例1]本發(fā)明所述二苯乙烯總苷優(yōu)選的制備方法按照說(shuō)明書中提供的制備方法制備二苯乙烯總苷，具體如下取虎杖藥材(虎杖苷含量在2.55％)100kg，粉碎成過(guò)20目篩的粗粉，用12倍藥材重量體積的60％乙醇以0.6L/kg.h流速滲漉，提取液減壓回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.06(60℃時(shí))的浸膏，加6倍藥材重量的去離子水溶解，離心，上清液以0.8L/kg.h流速過(guò)D-101大孔吸附樹脂柱(柱徑∶柱高＝1∶10，樹脂重量為藥材重量的1.5倍)，用6倍于D-101樹脂體積的去離子水以1L/kg.h流速除雜，然后再用6倍于D-101樹脂體積的10％乙醇以0.8L/kg.h流速除雜，最后用8倍于D-101樹脂體積的30％的乙醇以0.8L/kg.h流速解吸，收集解吸液，減壓回收乙醇，濃縮并真空干燥，粉碎得二苯乙烯總苷，其含量為59.46％，虎杖苷含量為58.72％。本發(fā)明優(yōu)選劑型膠囊劑的制備方法[處方]虎杖總苷100克共制成1000粒[制法]按照實(shí)施例1所述的制備方法制備二苯乙烯總苷，粉碎過(guò)80目篩，加入藥用淀粉，過(guò)篩混合均勻，噴入95％乙醇溶液，制軟材，過(guò)40目篩制粒，60℃干燥，分裝于3#膠囊中，質(zhì)檢，包裝，即得。本發(fā)明優(yōu)選劑型片劑的制備方法采用實(shí)施例1制備方法制備二苯乙烯總苷100克，研磨粉碎，過(guò)80目篩。加入過(guò)80目篩的藥用淀粉40g，混合均勻，干燥后壓成1000片(140mg/每片)，即得。本品每粒片劑含虎杖苷(C20H22O8)，不得少于50mg?？诜?，一次2粒，每日三次。權(quán)利要求1.含有二苯乙烯總苷的用于治療乙型肝炎的藥物組合物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于二苯乙烯總苷以虎杖苷計(jì)含量大于等于55％。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于二苯乙烯總苷以虎杖苷計(jì)含量大于等于80％。4.含有二苯乙烯總苷的藥物制劑，其特征在于該制劑是由權(quán)利要求1～3任一權(quán)利要求所述的藥物組合物和藥學(xué)上可接受的輔料成分制備而成。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物制劑，其特征在于該制劑是片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊劑、注射劑、貼劑或霜?jiǎng)?.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物制劑，其優(yōu)選劑型是膠囊劑或片劑，其中二苯乙烯總苷以虎杖苷計(jì)含量大于等于55％。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物制劑，其優(yōu)選劑型是凍干粉針劑，其中二苯乙烯總苷以虎杖苷計(jì)含量大于等于80％。8.權(quán)利要求1～3、5～7任一權(quán)利要求所述的藥物組合物或藥物制劑在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征是在制備治療乙型病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征是在制備治療急、慢性乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。11.權(quán)利要求4所述的藥物制劑在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征是在制備治療乙型病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征是在制備治療急、慢性乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于中藥新藥研發(fā)領(lǐng)域，具體涉及一種治療乙型肝炎的藥物組合物，其主要成分為從我國(guó)傳統(tǒng)中藥虎杖中提取的有效部位二苯乙烯總苷(其中的主要成分為虎杖苷)，且二苯乙烯總苷以虎杖苷計(jì)含量大于等于55％。本發(fā)明還提供了含有二苯乙烯總苷的藥物制劑，其優(yōu)選劑型為膠囊劑、片劑及凍干粉針劑。本發(fā)明所述的含有二苯乙烯總苷的藥物組合物及其制劑具有較好的保肝、降酶、抗乙肝病毒的作用，可在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用，包括急、慢性乙型肝炎和病毒性乙型肝炎。文檔編號(hào)A61K9/00GK1977852SQ20051012763公開日2007年6月13日申請(qǐng)日期2005年12月7日優(yōu)先權(quán)日2005年12月7日發(fā)明者周亞偉申請(qǐng)人:周亞偉