專利名稱：核酸、肽核酸衍生物及它們的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸及肽核酸衍生物，它們的制備方法，含它們的產(chǎn)品，及它們在醫(yī)藥、生物領(lǐng)域中的用途。
背景技術(shù)：
利用人工合成的化合物來模擬生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能，尤其是具有特定功能的生物大分子，對進一步理解和闡明它們在生物體內(nèi)的作用及機制都具有重要科學(xué)意義。其中包括大分子-大分子、大分子-小分子之間的相互作用，甚至是分子復(fù)合物之間的相互作用。如酶與底物的相互作用，抗體與抗原的相互作用，受體與藥物(包括化學(xué)藥和生物藥)的相互作用等等?；诜肿幼饔脵C制的研究結(jié)果，進而利用特定功能開發(fā)其在生命科學(xué)領(lǐng)域的用途具有十分重要的意義。
結(jié)構(gòu)決定功能。對于一個生物大分子，精確的高級結(jié)構(gòu)決定其復(fù)雜的生物學(xué)功能。用化學(xué)方法合成具有特定三維結(jié)構(gòu)的生物大分子是非常困難的，在多數(shù)情況下，試驗上幾乎是無法實現(xiàn)的。因此，用傳統(tǒng)的化學(xué)觀念和合成方法，要從三維結(jié)構(gòu)的層次來模擬大分子相互作用可行性甚微。分子間的信息傳遞和生物學(xué)功能的產(chǎn)生是通過分子表面的化學(xué)基團間的相互作用而產(chǎn)生的。其中蘊含著極其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，往往又是多位點、多功能問題。因而用簡單小分子模擬其功能則過于簡單化，幾乎達(dá)不到預(yù)期目的。
按照某一特定生物大分子三維結(jié)構(gòu)，構(gòu)建和維持一個特定的三維框架結(jié)構(gòu)，在特定位點上安裝相應(yīng)的化學(xué)功能基，并保持各功能基之間精確的相對空間位置和取向，就可能產(chǎn)生相應(yīng)的功能。
以一種化學(xué)組裝新概念來設(shè)計新的三維框架結(jié)構(gòu)，在框架結(jié)構(gòu)的特定區(qū)域，引入一組或一系列特定性質(zhì)的化學(xué)功能基(尤其是蛋白質(zhì)殘基)，它們在框架結(jié)構(gòu)中的位置，相對空間距離和空間取向都是可以設(shè)計并按預(yù)期目標(biāo)實現(xiàn)。人們稱這個區(qū)域為擬生物活性功能區(qū)。帶有擬生物活性功能區(qū)域的高級結(jié)構(gòu)可以用于模擬生物大分子功能，以及研究生物大分子-生物大分子之間，生物大分子-小分子之間，生物大分子-分子復(fù)合物之間的相互作用。
這些三維結(jié)構(gòu)框架可以是不同的化學(xué)實體，可以是單個分子，也可以是不同分子以不同形式結(jié)合的復(fù)合物。原則上，這些三維骨架結(jié)構(gòu)可以預(yù)知、可控，則可以作為選擇的框架結(jié)構(gòu)。例如，寡聚核苷酸的各種高級結(jié)構(gòu)可以通過設(shè)計堿基序列和精確的堿基配對原則來實現(xiàn)，如形成雙股螺旋結(jié)構(gòu)，三股螺旋結(jié)構(gòu)，平行雙螺旋結(jié)構(gòu)，四股螺旋結(jié)構(gòu)，以及基于二級結(jié)構(gòu)的“Y”字形結(jié)構(gòu)，“十”字形結(jié)構(gòu)等。形成精確三維框架結(jié)構(gòu)的原理是不同的堿基配對原則，如W-C堿基配對，Hoogsteen堿基配對等。
在本發(fā)明中設(shè)計采用的骨架有兩種，一種是核酸骨架，另一種是肽核酸骨架。形成螺旋結(jié)構(gòu)的精確識別均依賴于核酸堿基配對，形成骨架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。至于使用哪種螺旋結(jié)構(gòu)，則可根據(jù)研究對象設(shè)計寡聚核苷酸序列，在不同條件下，形成預(yù)期的三維螺旋結(jié)構(gòu)。承擔(dān)模擬功能的化學(xué)功能基連接在主鏈或堿基上，但不影響堿基配對形成的特異性和穩(wěn)定性。因此，在某一構(gòu)建單元上引入哪種化學(xué)功能基，以及合成寡聚物后進而在螺旋結(jié)構(gòu)上的位置，可以根據(jù)此單元上核酸堿基的性質(zhì)及其在寡聚核苷酸序列中的位置精確定位，換言之，構(gòu)建單元在三維框架結(jié)構(gòu)中的位置，就決定了特定功能基的位置。例如含有A的結(jié)構(gòu)單元會與雙螺旋互補鏈上的T配對，如果含A構(gòu)建單元上帶有咪唑殘基，我們就能夠準(zhǔn)確知道咪唑基在螺旋中的位置。依此類推，我們可以把不同氨基酸殘基或不同化學(xué)基團引入到螺旋結(jié)構(gòu)的特定位置，再根據(jù)表面上各類基團的性質(zhì)、位置、分布和空間取向，研究生物大分子之間的相互作用。這些作用可以是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)與核酸或其它生物大分子，蛋白質(zhì)與各種小分子等各種不同類型分子間的相互作用。從另外的角度看，常見的蛋白質(zhì)與其它分子的作用有酶與底物(小分子和大分子)的相互作用，抗體與抗原的相互作用，受體與藥物(包括化學(xué)藥和生物藥)的相互作用等等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要內(nèi)容是1、以一種化學(xué)組裝新概念來設(shè)計新的三維框架結(jié)構(gòu)，進而研究生物大分子、分子復(fù)合物、小分子之間相互作用以及模擬生物大分子功能。2、設(shè)計、合成一系列帶有各類不同功能基的核酸或其類似物構(gòu)建單元，如含蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基所有的各類功能基，換言之，合成含有各類天然氨基酸側(cè)鏈殘基的構(gòu)建單元，然后，3、再將這些構(gòu)建單元按設(shè)計序列合成寡聚物，按堿基配對原則形成預(yù)期的三維骨架，在這些可以預(yù)知螺旋結(jié)構(gòu)的骨架上，各氨基酸側(cè)鏈功能基的相對位置和空間取向均可以精確定位。理論上，這一設(shè)計理念可用來模擬任何生物大分子的活性功能基結(jié)構(gòu)模式，進而表現(xiàn)不同的生物學(xué)功能以及進一步研究分子間相互作用。
在核苷酸結(jié)構(gòu)單元引入氨基酸殘基的位點有三，分別位于核糖、磷酸和堿基；肽核酸序列中引入氨基酸殘基的位置分別是主鏈和堿基，研究它們的性質(zhì)和生物功能。
一般地，酶與配體間的相互作用主要有氫鍵，靜電相互作用，和疏水相互作用。這些相互作用使各功能基間發(fā)生質(zhì)子和電荷轉(zhuǎn)移。主要的功能基有羥基，氨基，巰基，羧基，羰基、酰胺基，酯基、脲基、胍基，肟基，咪唑基、吲哚基等極性基團，和非極性的烷基，芳香基等。再根據(jù)酶的活性中心功能基的種類和相對三維空間位置，在高級結(jié)構(gòu)上總體布局、調(diào)整這些功能基種類，相對空間位置以及取向，就可能達(dá)到模擬各種酶的目的。
核酶和RNA干涉的發(fā)現(xiàn)有力地證明了一定結(jié)構(gòu)特點的核酸確實具有酶催化作用。進一步的研究還表明核酸的催化機理在本質(zhì)上與蛋白酶相同，都涉及功能基間的氫鍵形成，質(zhì)子或電荷的轉(zhuǎn)移，以及疏水相互作用等，因此，本發(fā)明的要點也適用于核酶，換言之，核酶是本發(fā)明的一個例證。
本發(fā)明的目的在于設(shè)計將氨基酸的側(cè)鏈功能基引入核酸或肽核酸序列，合成新的核酸類似物和肽核酸類似物，尋找具有蛋白質(zhì)酶催化功能的新型功能性大分子。
本發(fā)明人的深入研究和文獻(xiàn)報道都表明，嘧啶的五位和8-氮-7-去氮腺嘌呤的7位，不參與堿基間氫鍵的形成，在這兩個位置的取代基向核酸螺旋結(jié)構(gòu)的大溝區(qū)伸展，一些取代基具有提高螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的作用。在核酸的核糖-磷酸骨架上的改造也有利于對核酸性質(zhì)的改善，如改善對核酸酶的水解穩(wěn)定性和對細(xì)胞膜的透膜能力，以及改善藥代動力學(xué)性質(zhì)等。
本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，通過合成式I、II 得到的含式V的核酸序列和含式VI的肽核酸序列可以與互補的DNA序列形成二級結(jié)構(gòu)。
因此含式V的核酸序列和含VI的肽核酸序列可以用于模擬生物大分子、檢測試劑、疾病的診斷和治療。
本發(fā)明的第一方面涉及式I和式II的核苷類似物， 其中式I和II中，B為天然堿基(腺嘌呤，鳥嘌呤，脲嘧啶，胸腺嘧啶，胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤等等)，含保護基的天然堿基，或如式III、IV所示非天然堿基， 在式III和IV中，在脲嘧啶的五位和8-氮-7-去氮嘌呤的七位引入取代基-X-R1，其中，X可為各種連接臂形式，如(-CH2-)n，(-CH＝CH-)n，(-C≡C-)n，-O-，-C(O)-，-OC(O)-，-C(O)O-，-NH-，N(R1)2-，-C(O)NH-，-NHC(O)-，-CH＝N-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)NH-，-S(O)2NH-，或者是它們的組合，n為0-10，其中當(dāng)n為0時，即沒有連接臂X，R1可為蛋白質(zhì)的所有氨基酸殘基側(cè)鏈所含的功能基，包括(1)疏水性基團甲基(丙氨酸)，芐基(苯丙氨酸)，異丙基(纈氨酸)，1-甲硫基乙基[CH3S(CH2)2-](甲硫氨酸)，3-甲基丙基[(CH3)2CHCH2-](亮氨酸)，1-甲基丙基[CH3CH2CH(CH3)-](異亮氨酸)；(2)親水性基團如羥甲基(HOCH2-)(絲氨酸)，1-羥乙基[CH3CH(OH)-](蘇氨酸)，4-咪唑甲基(組氨酸)，4-氨基丁基[NH2(CH2)4-](賴氨酸)，巰甲基(HSCH2-)(半胱氨酸)，3-吲哚甲基(色氨酸)，四氫吡咯-2-(脯氨酸)，4-羥基苯甲基(酪氨酸)，1-胍基丙基(精氨酸)，氨甲酰甲基(天冬酰胺)，1-氨甲酰乙基(谷氨酰胺)，羧甲基(天冬氨酸)，1-羧乙基(谷氨酸)；其中當(dāng)n不為0時，以X為連接臂(1).R1可為碳原子數(shù)為2至10的烴基及其異構(gòu)體，包括直鏈和支鏈烷基，環(huán)烷基，烯基，和炔基，以及它們的異構(gòu)體，如甲基，乙基，乙烯基，正丙基，異丙基，烯丙基，炔丙基，正丁基，異丁基，叔丁基，1-(或2-，3-)丁烯基，1-(或2-，3-)丁炔基，戊基，環(huán)戊基，環(huán)戊二烯基，己基，環(huán)己基，等；含氮、氧、硫、硒等雜原子的(直鏈和支鏈)烷基，環(huán)烷基，烯基，和炔基，其雜原子表現(xiàn)為以下功能基團，如巰基，醚鍵，硫醚鍵，氨基，胺基，胍基，脲基，羧基，酯基，羥基，酰胺基，磺?；酋０坊?，磺酰酯基，亞磺?；瑏喕酋０坊?，亞磺酰酯基，硝基，硝酸酯基，亞硝基，亞硝酸酯基，鹵素，擬鹵素等；雜環(huán)類基團如，2-(或/和3-取代)呋喃基，2-(或/和4-，5-取代)咪唑基，2-(或/和3-，N-取代)吡咯基，2-(或/和4-，5-取代)噁唑基，2-(或/和3-取代)噻吩基，3-(或/和2-，4-，5-，6，N-取代)吲哚基，2-(或/和3-取代)四氫呋喃基，2-(或/和3-，N-取代)四氫吡咯基，2-(或/和3-取代)四氫噻吩基，2-(或/和3-，4-取代)哌啶基，2-(或/和3-，N-取代)嗎啉基，2-(或/和3-，5-取代)噻唑基，2-(或/和3-，5-取代)四氫噻唑基等；(2).R1可為碳原子數(shù)為6到20的芳香烴基和雜芳香烴基，和取代的芳香烴基和雜芳香烴基，如苯基，萘基，蒽基，芴基等；雜芳香烴基含氮，氧，硫，硒等雜原子，如2-(或3-，4-)吡啶基，喹啉基，異喹啉基。在取代的芳香烴基和雜芳香烴基中，其取代基定義為如甲基，乙基，乙烯基，正丙基，異丙基，烯丙基，炔丙基，正丁基，異丁基，叔丁基，1-(或2-，3-)丁烯基，1-(或2-，3-)丁炔基，戊基，環(huán)戊基，環(huán)戊二烯基，己基，環(huán)己基等碳原子數(shù)為1-10的烴基；或含巰基，醚鍵，硫醚鍵，氨基，胺基，胍基，脲基，羧基，酯基，羥基，酰胺基，磺酰基，磺酰胺基，磺酰酯基，亞磺酰基，亞磺酰胺基，亞磺酰酯基，硝基，硝酸酯基，亞硝基，亞硝酸酯基，鹵素，擬鹵素，咪唑基，吡咯基，吲哚基等功能基的這類烴基。
式IV中，P2可為氫，乙?；郊柞；?，茴香酰基，異丁?；?，鄰硝基苯氧乙?；?，N，N-二甲胺基甲叉基，苯氧乙?；?，叔丁基苯氧乙酰基，三氟乙?；?，對甲基苯甲?；?，碳酸烷基甲酯，碳酸烷基烯丙酯等，氨基和亞胺基的保護基有苯甲?；惗□；?，三氟乙酰基，N，N-二甲胺基亞甲基，N，N-二丁胺基亞甲基。
式I中，P1可為乙酰基，三甲基硅基，二乙基硅基，叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基，四氫吡喃基，烯丙基，叔丁氧甲基，(鄰硝基，對硝基，對鹵代，對氰基)芐基，三苯甲基，對甲氧苯基二苯基，4，4’-甲氧基三苯甲基等。
式I中，當(dāng)B為天然堿基或保護的天然堿基時，R2可為N，N-二異丙胺基，4-嗎啡啉基，1-四氫吡咯基，2，2，6，6-四甲基哌啶基；R3可為-X-R1，-NH-R1，-N(R1)2(其中兩個R1可以相同也可以是R1的不同組合)，但不包括2-氰乙基，甲氧基，乙氧基，N，N-二異丙胺基，N，N-二甲胺基，N，N-二乙胺基；式I中，當(dāng)B為非天然堿基時，R2可為N，N-二異丙胺基，嗎啡啉基，四氫吡咯基，2，2，6，6-四甲基哌啶基；R3可為2-氰乙基，-X-R1，-NH-R1，-N(R1)2(其中兩個R1可以相同也可以是R1的不同組合)。
式II中，當(dāng)B為非天然堿基時，R4，R5，R6，R7，R8的可為H，R1或-X-R1；式II中，當(dāng)B為天然堿基或保護的天然堿基時，R4，R5，R6，R7，R8的定義為H，R1或-X-R1，但不同時為H；當(dāng)R5，R6，R7，R8為氫時，R4不為羥甲基和4-咪唑甲基；式II中，R9可為H或-X-R1，R10可為H，叔丁氧羰基(Boc)，芴甲氧羰基(Fmoc)，芐氧羰基，芐基或三苯甲基；式II中，R11可為氫，甲基，乙基，烯丙基，芐基，4-硝基芐基，4-甲基芐基，4-甲氧基芐基；式II中，R5與R6，R7與R8，R5與R7，R6與R8，R9/R10與R5/R6，R9/R10與R7/R8之間形成以(-CH2-)n結(jié)構(gòu)相連的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，n為1～4；或與主鏈(N-C-C，或N-C，或C-C)形成含雜原子(O，S，N等)的三至七元環(huán)狀結(jié)構(gòu)，雜原子形成如醚鍵，硫醚鍵等。
本發(fā)明的第二方面涉及含式V的核酸序列和含式VI的肽核酸序列
式V中，當(dāng)B為非天然堿基時，R12可為O-，OH，S-，SH，Se-，SeH或式I中的R1，當(dāng)B為天然堿基或保護的天然堿基時，R12可為式I中的R3，但不為O-，OH，S-，SH，Se-，SeH；Y可為O，S，Se等原子。
式VI中，R4，R5，R6，R7，R8，R9與式II中的R4，R5，R6，R7，R8，R9定義相同。
在含式V的核酸序列和/或含式VI的肽核酸序列中，含式V和/或式VI的個數(shù)可在1～50個。
本發(fā)明的第三方面涉及I，II，III，IV，V和VI其中之一或它們的任意組合，作為模擬生物大分子、檢測試劑、疾病診斷和治療藥物應(yīng)用。
在本發(fā)明中使用的縮寫具有下面含義Boc-叔丁氧羰基Bom-芐氧甲基DCC-N，N-二環(huán)己基碳二亞胺DCM-二氯甲烷DIEA-二異丙基乙胺DMF-N，N-二甲基甲酰胺DMSO-二甲亞砜DMT-4，4’-二甲氧基三苯甲基DMT-T-5’-(4，4’-二甲氧基)-三苯甲基-胸腺核苷ESI-MS-電噴霧離子化質(zhì)譜His-組氨酸PAGE-聚丙稀酰胺凝膠電泳TBDPS-叔丁基二苯基硅烷基TFA-三氟醋酸
Tol-對甲基苯甲酰基堿基以羥基修飾的構(gòu)建單元的合成按反應(yīng)路線1和2制備反應(yīng)路線1 (i)六甲基二硅胺烷，硫酸銨，碘化亞銅/CHCl3；(ii)TBDPS-Cl，咪唑/CHCl3；(iii)甲醇鈉/甲醇；(iv)DMT-Cl/吡啶；(v)β-氰乙基-單氯-N，N-二異丙基-亞磷酰胺，DIEA/二氯甲烷反應(yīng)路線2 (i)六甲基二硅胺烷，硫酸銨，碘化亞銅/CHCl3；(ii)甲醇鈉/甲醇；(iii)DMT-Cl/吡啶；(iv)β-氰乙基-單氯-N，N-二異丙基-亞磷酰胺，DIEA/二氯甲烷反應(yīng)路線1和路線2中，堿基的羥基保護基應(yīng)與核糖的DMT保護基區(qū)分開來，前者應(yīng)在在后續(xù)的合成步驟和DNA固相合成(酸性條件下)中穩(wěn)定，且固相合成后能在較溫和的堿性(氨水，50℃)條件完全脫保護。因此，在本發(fā)明的合成路線設(shè)計中，在核糖的5’位還未脫保護之前，以叔丁基二苯基硅烷基保護堿基上的羥基。然后，將脫去對甲基苯甲?；?’和3’位羥基分別用DMT保護，和進行亞磷?；?，所獲得的構(gòu)建單元可用于固相DNA合成。
堿基含羧基功能基構(gòu)建單元的合成可按反應(yīng)路線3制備反應(yīng)路線3
(i)六甲基二硅胺烷，硫酸銨，碘化亞銅/CHCl3；(ii)甲醇鈉/甲醇；(iii)氨的甲醇溶液；(iv)DMT-Cl/吡啶；(v)β-氰乙基-單氯-N，N-二異丙基-亞磷酰胺，DIEA/二氯甲烷反應(yīng)路線3是為了在DNA螺旋結(jié)構(gòu)上引入羧基和酰胺基，本發(fā)明首先在脲嘧啶的5位以適當(dāng)?shù)倪B接臂引入酯基，在糖苷化反應(yīng)，5’位羥基的DMT保護和3’位羥基的亞磷?；螅糜贒NA的固相合成。然后，用氫氧化鈉的甲醇/水溶液處理DNA序列，將酯基水解位羧基，或用氨的甲醇溶液處理DNA序列，將酯基轉(zhuǎn)化為酰胺基，這樣就在DNA螺旋結(jié)構(gòu)上分別引入了重要的功能基。
堿基含咪唑功能基構(gòu)建單元的合成可按反應(yīng)路線4制備反應(yīng)路線4 (i)0.1M Li2PdCl4；(ii)TFA；(iii)DMT-Cl/吡啶；(iv)β-氰乙基-單氯-N，N-二異丙基-亞磷酰胺，DIEA/二氯甲烷反應(yīng)路線4中，在脲嘧啶的5位引入了參與許多蛋白酶的催化活性中心的咪唑基，它既可作為氫鍵供體，又可作為氫鍵給體，在糜蛋白酶的催化中心起到傳遞氫鍵的作用。首先按文獻(xiàn)方法合成三苯甲基保護的4-乙烯基咪唑，然后與5-氯汞基-2’-去氧脲苷進行縮合反應(yīng)得到預(yù)期的核苷類似物，并將咪唑環(huán)上的三苯甲基在酸性條件下除去后，后續(xù)的DMT保護和亞磷?；闯Ｒ?guī)程序進行，得到適于DNA固相合成的構(gòu)建單元。
堿基含疏水性基團構(gòu)建單元的合成可按反應(yīng)路線5制備反應(yīng)路線5 (i)六甲基二硅胺烷，硫酸銨，碘化亞銅/CHCl3；(ii)苯乙胺，DCC；(iii)甲醇鈉/甲醇；(iv)DMT-Cl/吡啶；(v)β-氰乙基-單氯-N，N-二異丙基-亞磷酰胺，DIEA/二氯甲烷在反應(yīng)路線5中，將帶苯環(huán)的酰胺基引入脲嘧啶的5位，是為了獲得大分子的疏水性區(qū)域，首先合成含羧基的保護的核苷，然后與苯乙胺發(fā)生酰胺化反應(yīng)，得到所需的功能基，繼之以5’位的DMT保護和3’位的亞磷?；?，得到適于DNA固相合成的構(gòu)建單元。
亞磷酸酯鏈含功能基的構(gòu)建單元合成可按反應(yīng)路線6和反應(yīng)路線7制備反應(yīng)路線6
R為芴甲氧羰氧乙基253-甲基-丁基26苯乙基27芴甲氧羰氧-3-氧丙基28芴甲氧羰氧-4-氧丁基29甲氧羰丙基30(i)引入基團的醇類化合物，吡啶/DCM，-78℃；(ii)二異丙胺，-40℃；(iii)DMT-T，DIEA反應(yīng)路線7 (i)二異丙胺/DCM，-78℃；(ii)DMT-T，DIEA，-40℃；(iii)四氮唑，2-[1-(2，4-硝基苯基)-1H-咪唑基-4-]-乙醇在反應(yīng)路線6和7，通過形成亞磷酸酯用含有羥基、羧基、疏水性烴基、苯環(huán)以及咪唑基修飾磷，得到適于DNA固相合成的構(gòu)建單元。
肽核酸構(gòu)建單元的堿基引入羥基及主鏈引入咪唑基的合成可按反應(yīng)路線8制備
反應(yīng)路線8 (i)甲磺酸芐酯/DMF，100℃；(ii)溴乙酸乙酯，碳酸鉀/DMF；(iii)DCC，N-2-叔丁氧羰基-胺乙基甘氨酸甲酯或Boc-His(Bom)-OCH3；(iv)1M氫氧化鋰在反應(yīng)路線8中，第(iii)中，如果反應(yīng)原料為N-2-叔丁氧羰基-胺乙基甘氨酸甲酯，則得到構(gòu)建單元34，如果反應(yīng)原料為Boc-His(Bom)-OCH3，則得到構(gòu)建單元35，通過此反應(yīng)路線，可在堿基上修飾，也可在主鏈上修飾，得到的構(gòu)建單元可直接用于肽核酸的合成。
具體實施例方式
下面的實施例用來進一步說明本發(fā)明，但這并不意味著對本發(fā)明的任何限制。
實施例11.1 1-(2-去氧-3，5-二-氧-對甲基苯甲?；?β-D-erythro-核糖)-5-(2-羥乙基)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮(1)將5-羥乙基脲嘧啶(4g，25.64mmol)懸浮在六甲基二硅胺烷(20ml)中，加入少量硫酸銨，加熱此混合物，回流過夜。減壓蒸餾除去剩余的六甲基二硅胺烷后，加入氯仿(400ml)，然后加入1-氯-2-去氧-3，5-二對甲基苯甲?；颂?12g，30.89mmol)和碘化亞銅(5.9g，30.89mmol)，室溫下攪拌3小時。將此混合物傾入飽和的碳酸氫鈉溶液中，攪拌1h，分出有機層，水洗一遍，用無水硫酸鈉干燥，過濾后濃縮得到糖漿狀液體，柱層析法分離出無色固體產(chǎn)物，11.5g，產(chǎn)率為88.5％。Rf(CH2Cl2/CH3OH 20∶1)0.35。1H NMR(d6-DMSO)2.26(t，J＝6.7Hz，5-CH2CH2O)，2.39(2s，CH3O)，2.54(m，2’-H)，3.41(m，5-CH2CH2O)，4.47-4.59(m，4’H，5’-H)，5.59(m，3’-H)，6.28(t，J＝7.6Hz，1’-H)，7.47(s，6-H)，7.34，7.89(2m，Ph)，11.33(s，NH)。
1.2 1-(2-去氧-3，5-二-氧-對甲基苯甲酰基-β-D-erythro-核糖)-5-(2-二苯基叔丁基硅氧乙基)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮(2)化合物1(9g，17.7mmol)懸浮于0.2M甲醇鈉/甲醇溶液中，室溫下反應(yīng)3h。反應(yīng)液用冰醋酸中和后，濃縮，硅膠柱層析分離出產(chǎn)物，為無色結(jié)晶，4.5g，產(chǎn)率為93.4％。Rf(CH2Cl2/CH3OH 9∶1)0.27。1H NMR(d6-DMSO)2.10(m，2’-H)，2.35(m，5-CH2CH2OH)，3.47(m，5-CH2CH2O)，3.54(m，5’-H)，3.77(m，4’H)，4.23(m，3’-H)，4.50(t，J＝5.6Hz，5-CH2CH2OH)，5.19(d，J＝4.2Hz，3’-OH)，4.94(t，J＝5.2Hz，5’-OH)，6.16(t，J 6.9，1’-H)，7.65(s，6-H)，11.20(s，NH)。
1.3 1-(β-D-erythro-2-去氧-核糖)-5-(2-二苯基叔丁基硅氧乙基)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮(3)向化合物1(12.6g，24.8mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液中加入咪唑和叔丁基二苯基氯硅烷(7.2ml，27.5mmol)，將此反應(yīng)混合物在室溫攪拌半小時。將此反應(yīng)液用二氯甲烷(100ml)稀釋后，用1M鹽酸和水分別洗滌兩次，然后用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，得到糖漿狀產(chǎn)物，直接用于下一步的脫保護反應(yīng)。
將以上產(chǎn)物溶于0.1M甲醇鈉/甲醇溶液，在室溫下攪拌1h。反應(yīng)液用冰醋酸中和，并濃縮，產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化，得到泡狀無色固體(11.4g)，產(chǎn)率為88％。Rf(CH2Cl2/CH3OH 9∶1)0.54。元素分析C27H34N2O6Si(M 510.65)，理論值C 63.50，H 6.71，N 5.49；實測值C 63.06，H 6.56，N 5.40。1H NMR(d6-DMSO)0.96(s，tert-Bu)，2.00(m，2’-H)，2.48(m，superimposed，5-CH2CH2O)，3.55(dd，5-CH2CH2O)，3.71-3.78(m，4’-H，5’-H)，4.22(m，3’-H)，5.03(t，J＝5.2Hz，5’-OH)，5.23(d，J＝4.2Hz，3’-OH)，6.17(t，J＝7.0Hz，1’-H)，7.75(s，6-H)，7.38-7.58(m，Ph)，11.28(s，NH)。
1.4 1-[β-D-erythro-2-去氧-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)]-5-(2-二苯基叔丁基硅氧乙基)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮(4)將化合物3(5.6g，11mmol)與無水吡啶共蒸3次，然后以無水吡啶(10ml)作溶劑，向此溶液中加入4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(4.87g，14.37mmol)，1.5h后，加入2ml甲醇，攪拌5分鐘，反應(yīng)液濃縮用于柱層析，得到無色泡狀固體產(chǎn)物8.86g，產(chǎn)率98.6％。Rf(CH2Cl2/CH3OH 20∶1)0.44。元素分析C48H52N2O8Si(M 813.02)，理論值C 70.91，H 6.45，N 3.45；實測值C 70.83，H 6.40，N 3.58。1H NMR(d6-DMSO)0.91(s，tert-Bu)，2.09(m，2’-H)，2.27(t，J＝1.6Hz，5-CH2H2O)，3.17(d，J＝4.5Hz，5-CH2CH2O)，3.65(m，5’-H)，3.70(s，OCH3)，3.88(m，4’H)，4.21(m，3’-H)，5.34(d，J＝4.5Hz，3’-OH)，6.16(t，J＝6.7Hz，1’-H)，6.85-7.53(s，6-H；m，Ph)，11.34(s，NH)。
1.5 1-[β-D-erythro-2-去氧-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)]-5-(2-二苯基叔丁基硅氧乙基)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮3’-[(2-氰乙基)-N，N-二異丙基亞磷酰胺](5)在室溫攪拌下，向化合物4(1.8g，2.21mmol)的二氯甲烷溶液中加入二異丙基乙基胺(2.5ml)，然后滴加β-氰乙基-單氯-N，N-二異丙基-亞磷酰胺，直到反應(yīng)物完全轉(zhuǎn)化。將反應(yīng)化合物用二氯甲烷稀釋，并用5％碳酸氫鈉溶液和飽和鹽水各洗一次，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，濃縮得到無色無定形固體1.33g，產(chǎn)率為59％。Rf(CH2Cl2/CH3COCH320∶1)0.65，0.75。31P NMR(CDCl3)149.06，149.66；1H NMR(CDCl3)0.99(s，tert-Bu)，1.07，1.17[d，J＝6.7Hz，N(CH(CH3)2)]，2.11-2.64(m，2’-H，5-CH2CH2，NCCH2CH2O)，3.30-3.78(m，5-CH2CH2，NC CH2CH2O，5’-H)，3.74(2s，OCH3)，4.17(m，4’H)，4.52(m，3’-H)，6.28(t，J＝6.9Hz，1’-H)，6.79-7.56(s，6-H；m，Ph)。
實施例22.15-(3-叔丁基二苯基硅氧丙基)-脲嘧啶(6)按照實施例1.3法，在二氯甲烷(20ml)中，以5-(3-三羥丙基)脲嘧啶(1.5g，8.81mmol)，咪唑(0.66g，9.7mmol)，叔丁基二苯基氯硅烷(2.56ml，9.8mmol)得到產(chǎn)物3-叔丁基二苯基硅氧丙基脲嘧啶，3.4g，產(chǎn)率為94.4％。Rf(CH2Cl2/CH3OH 20∶1)0.15。元素分析C23H28N2O3Si(M 408.57)，理論值C 67.61，H 6.91，N 6.86；實測值C 67.56，H 6.78，N 6.74。1H NMR(d6-DMSO)0.99(s，tBu)，1.69(m，5-CH2CH2CH2)，2.25(t，J＝7.3Hz，5-CH2CH2CH2)，3.62(t，J＝6.3Hz，5-CH2CH2CH2)，7.15(s，6-H)，7.45，7.61(2m，Ph)，11.01，10.63(s，2NH)。
2.2 1-(2-去氧-3，5-二-氧-對甲基苯甲?；?β-D-erythro-核糖)-5-(2-二苯基叔丁基硅氧丙基)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮(7)按實施例1.1法，將5-(3-叔丁基二苯基硅氧丙基脲嘧啶(2.4g，5.88mmol)用六甲基二硅胺烷發(fā)生硅烷化反應(yīng)后，在氯仿(300ml)中與1-氯-2-去氧-3，5-二對甲基苯甲酰-D-核糖(3g，7.06mmol)，CuI(2g)，反應(yīng)。經(jīng)柱層析得到無色固體產(chǎn)物2.45g，產(chǎn)率為54.8％。Rf(CH2Cl2/CH3OH 20∶1)0.59。元素分析C44H48N2O8Si(M 760.95)，理論值C 69.45，H 6.13，N 3.68；實測值C 69.18，H 6.11，N 3.88。1H NMR(d6-DMSO)0.96(s，tert-Bu)，1.58(m，5-CH2CH2CH2)，2.11(t，J＝7.4Hz，5-CH2CH2CH2)，2.29，2.40(2s，CH3)，2.57(m，2’-H)，3.50(t，J＝6.3Hz，5-CH2CH2CH2)，4.50-4.63(m，4’-H，5’-H)，5.62(m，3’-H)，6.30(t，J＝7.1Hz，1’-H)，7.24-7.94(m，6-H，Ph)，11.40(s，NH)。
2.3 1-(β-D-erythro-2-去氧-核糖)-5-(2-二苯基叔丁基硅氧丙基)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮(8)將化合物6(2.38g，3.13mmol)溶于甲醇鈉/甲醇溶液(0.2M，50ml)中，在室溫下反應(yīng)3hr，反應(yīng)液用冰醋酸中和，然后濃縮用于常壓柱層析，產(chǎn)物為無色固體，1.15g，產(chǎn)率為63％。Rf(CH2Cl2/CH3OH9∶1)0.68。元素分析C28H36N2O6Si.0.5H2O(M 533.68)，理論值C62.96，H 6.93，N 5.25；實測值C 62.70，H 6.90，N 5.09。1H NMR(d6-DMSO)0.99(s，tert-Bu)，1.72(m，5-CH2CH2CH2)，2.04(m，2’-H)，2.31(m，5-CH2CH2CH2)，3.54(m，5-CH2CH2CH2)，3.64(m，5’-H)，3.77(m，4’-H)，4.22(m，3’-H)，5.01(t，J＝5.2Hz，5’-OH)，5.23(d，J＝4.2Hz，3’-OH)，6.16(t，J＝6.9Hz，1’-H)，7.40-7.62(m，Ph)，7.66(s，6-H)，11.35(s，NH)。
2.4 1-[β-D-erythro-2-去氧-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)]-5-(2-二苯基叔丁基硅氧丙基)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮(9)將化合物8(1g，1.91mmol)與無水吡啶共蒸3次后，溶于無水吡啶(2ml)中，向此溶液加入DMT-Cl(0.77g，2.3mmol)。在室溫下反應(yīng)1hr后，加入甲醇(5ml)，并繼續(xù)反應(yīng)5min。將此反應(yīng)液濃縮用于常壓柱層析，得到無色固體，1.3g，產(chǎn)率為82.5％。Rf(CH2Cl2/CH3OH 20∶1)0.49。元素分析C49H54N2O8Si(M 827.05)，理論值C 71.16，H 6.58，N 3.39；實測值C 71.07，H 6.58，N 3.93。1H NMR(d6-DMSO)0.94(s，tert-Bu)，1.52(m，5-CH2CH2CH2)，1.91(m，2’-H)，2.16(t，5-CH2CH2CH2)，3.17(m，5-CH2CH2CH2)，3.39(m，5’-H)，3.67(2s，OCH3)，3.89(m，4’H)，4.29(m，3’-H)，5.34(d，J＝4.5Hz，5.34，3’-OH)，6.20(t，J＝6.9Hz，1’-H)，6.82-7.57(m，6-H，arom.H)，11.35(s，NH)。
2.5 1-[β-D-erythro-2-去氧-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)]-5-(2-二苯基叔丁基硅氧乙基)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮3’-[(2-氰乙基)-N，N-二異丙基亞磷酰胺](10)從化合物9(1g，1.21mmol)在含二異丙基乙基胺的二氯甲烷的溶液中與β-氰乙基-單氯-N，N-二異丙基-亞磷酰胺反應(yīng)。反應(yīng)液在用二氯甲烷稀釋后，用5％碳酸氫鈉溶液和飽和鹽水洗滌。干燥后濃縮，經(jīng)常壓柱層析純化，得到無色固體產(chǎn)物0.65g，產(chǎn)率為52.4％。Rf(CH2Cl2/CH3COCH320∶1)0.60，0.63。31P NMR(CDCl3)149.06，149.53；1H NMR(CDCl3)0.98(s，tert-Bu)，1.21，1.29[m，N(CH(CH3)2)]，1.46-2.73(m，N(CH(CH3)2)，5-CH2CH2CH2，2’-H)，2.41(t，J＝6.5Hz，5-CH2CH2CH2)，3.30-3.68(m，5-CH2CH2CH2，NCCH2CH2O，5’-H)，3.71(2s，OCH3)，4.17(m，4’H)，4.60(m，3’-H)，6.35(m，1’-H)，6.77-7.61(m，6-H，Ph)。
實施例33.1 1-(β-D-erythro-2-去氧-核糖)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮-5-丙酸甲酯(12)按化合物1的合成方法制備，得到化合物11后，直接進行脫保護反應(yīng)，得到化合物12，2.6g，收率45.6％。Rf(CH2Cl2/CH3OH 9∶1)0.42。元素分析C13H18N2O7(M 314.29)，理論值C 49.68，H 5.77，N 8.91；實測值C 49.67，H 5.52，N 8.47。1H NMR(d6-DMSO)2.08(m，2’-H)，2.48(m，5-CH2CH2)，3.59(s，CH3)，3.56(m，5’-H)，3.77(m，4’H)，4.24(m，3’-H)，5.03(t，J＝5.2Hz，5’-OH)，5.24(d，J＝4.2Hz，3’-OH)，6.16(t，J＝6.9Hz，1’-H)，7.72(s，6-H)，11.33(s，NH)。
3.2 1-(β-D-erythro-去氧-核糖)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮5-丙酰胺(13)將化合物12(0.5g，1.59mmol)的氨/甲醇溶液(70ml)置于密閉容器中，室溫下攪拌7天。將此反應(yīng)液濃縮至產(chǎn)物開始析出，得到無色固體0.45g，產(chǎn)率為94.5％。元素分析C12H17N3O6(M 299.28)，理論值C 48.16，H 5.73，N 14.04；實測值C 48.45，H 5.77，N13.66。Rf(CH2Cl2/CH3OH 9∶1)0.1。1H NMR(d6-DMSO)2.08(m，2’-H)，2.23，2.40(2m，5-CH2CH2)，3.57(m，5’-OH)，3.76(m，4’H)，4.23(m，3’-H)，5.01(t，J＝5.2Hz，5’-OH)，5.23(d，J4.5，3’-OH)，6.16(t，J＝6.7Hz，1’-H)，7.25，6.77(2s，NH2)，7.65(s，6-H)，Ph)，11.29(s，NH)。
3.3 1-[(β-D-erythro-2-去氧-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基))-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮-5-丙酸甲酯(14)從化合物12(1.2g，3.82mmol)和DMT-Cl(1.55g，4.58mmol)在吡啶(3ml)中反應(yīng)，室溫下攪拌2小時，反應(yīng)完全后加入2ml甲醇攪拌5分鐘，反應(yīng)液濃縮后經(jīng)常壓柱層析得到無色固體化合物14，1.7g，產(chǎn)率為72％。Rf(CH2Cl2/CH3OH 20∶1)0.41。1H NMR(d6-DMSO)2.15-2.55(m，5-CH2CH2，2’-H)，3.20(m，5’-H)，3.52(s，CH3)，3.73(s，OCH3)，3.89(m，4’H)，4.29(m，3’-H)，5.34(d，J＝3.6Hz，3’-OH)，6.19(t，J＝6.7Hz，1’-H)，6.87-7.27(m，6-H，Ph)，11.40(s，NH)。
3.4 1-[(β-D-erythro-2-去氧-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基))-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮5-丙酸甲酯3’-[(2-氰乙基)-N，N-二異丙基亞磷酰胺](15)從化合物14(1.09g，1.767mmol)和β-氰乙基-單氯-N，N-二異丙基-亞磷酰胺，二異丙基乙基胺(1ml)在二氯甲烷(10ml)中于室溫下反應(yīng)得到產(chǎn)物，經(jīng)用二氯甲烷稀釋，5％NaHCO3和鹽水洗滌，干燥并濃縮，由常壓柱層析得到產(chǎn)物，0.8g，55.6％。Rf(CH2Cl2/CH3COCH38∶1)0.40，0.52。31P NMR(CDCl3)149.57，149.20；1H NMR(CDCl3)1.06-1.18[m，2CH(CH3)2]，2.14-2.64[m，5-CH2CH2，2’-H，CH(CH3)2]，3.31-3.86(m，5’-H，OCH2CH2CN)，3.57(s，CH3)，3.79(s，OCH3)，4.16(m，4’H)，4.63(m，3’-H)，6.37(m，1’-H)，6.82-7.59(m，6-H，Ph)。
實施例44.1 1-(β-D-erythro-2-去氧-核糖)-5-[2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-)-(E)-乙烯基-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮(16)5-氯汞基-2’-去氧脲苷(2g，4.3mmol)，1-三苯甲基-4-乙烯基咪唑，加入0.1M PdLi2Cl4的甲醇溶液(44ml)，室溫下反應(yīng)16h，向反應(yīng)混合物中充入硫化氫氣體(20min)。過濾除去不溶固體，將濾液濃縮用于常壓柱層析，得到無色固體，1.1g，產(chǎn)率為45.6％。元素分析C33H30N4O5.H2O(M 580.62)，理論值C 68.20，H 5.51，N 9.64；實測值C 68.55，H 5.39，N 8.94。Rf(CH2Cl2/CH3OH 9∶1)0.5。1H NMR(d6-DMSO)2.15(m，2’-H)，3.55-3.66(m，5’-H)，3.79(m，4’-H)，4.26(m，3’-H)，5.13(t，J4.8，5’-OH)，5.24(d，J＝4.5Hz，3’-OH)，6.19(t，J＝6.6Hz，1’-H)，6.95(s，5”-H)，6.84，7.22(2d，J＝16.1Hz，CH＝CH)，7.12，7.40(2m，2”-H Ph)，8.10(s，6-H)，11.40(s，NH)。
4.2 1-(β-D-erythro-2-去氧-核糖)-5-[2-(1H-咪唑-4-)-(E)-乙烯基-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮(17)將化合物16(1g，1.78mmol)溶于三氟乙酸/二氯甲烷溶液中，在室溫下攪拌30min后，減壓蒸餾除去三氟乙酸，用甲醇將殘留物反復(fù)溶解和蒸餾，然后用常壓柱層析方法分離出產(chǎn)物，為無色固體，0.4g，產(chǎn)率為70％。Rf(CH2Cl2/CH3OH 5∶1)0.12。1H NMR(d6-DMSO)2.15(m，2’-H)，3.63(m，5’-H)，3.80(m，4’-H)，4.28(m，3’-H)，5.18(t，J＝5.0Hz，5’-OH)，5.28(d，J＝4.2Hz，3’-OH)，6.20(t，J＝6.6Hz，1’-H)，6.76，7.31(2d，J＝15.1Hz，CH＝CH)，7.10(s，imH)，7.62(s，im-H)，8.08(s，6-H)，11.44(s，NH)，12.04(br，NH)。
4.3 1-[(β-D-erythro-2-去氧-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基))-5-[2-(1H-咪唑-4-)-(E)-乙烯基-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮(18)從化合物17(0.3g，0.937mmol)和DMT-Cl(0.38g，1.12mmol)在吡啶(0.5ml)中的反應(yīng)，經(jīng)常壓柱層析純化得到產(chǎn)物為無色無定形固體0.5g，產(chǎn)率為86％，Rf(CH2Cl2/CH3OH 9∶1)0.32。MS623.6(M+1)。1H NMR(d6-DMSO)2.15-2.38(m，2’-H)，3.67(s，OCH3)，3.91(m，4’H)，4.24(m，3’-H)，5.36(br，3’-OH)，6.21(t，J＝6.7Hz，1’-H)，6.69-7.72(m，Ar-H，CH＝CH，6-H，2”-H，5”-H)，11.55，12.04(2br，NH)。
4.4 1-[(β-D-erythro-2-去氧-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基))-5-[2-(1H-咪唑-4-)-(E)-乙烯基-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮3’-[(2-氰乙基)-N，N-二異丙基亞磷酰胺](19)從化合物18(0.5g，0.75mmol)和β-氰乙基-單氯-N，N-二異丙基-亞磷酰胺，二異丙基乙基胺(0.5ml)反應(yīng)得到產(chǎn)物，0.37g，收率57％。Rf(CH2Cl2/CH3OH 9∶1)0.64。31P NMR(CDCl3)149.25，149.63。1H NMR(CDCl3)1.16[2d，J＝4.8Hz，2CH(CH3)2]，2.35-2.64[m，2’-H，CH(CH3)2]，3.50-4.63(m，5’-H，OCH2CH2CN)，3.69(s，OCH3)，4.20(m，4’H)，4.62(m，3’-H)，6.26-8.03(m，1’-H，Ar-H，CH＝CH，6-H，2”-H，5”-H)，10.31，11.33(2 br，NH)。
實施例55.1 1-(2-去氧-3，5-二-氧-對甲基苯甲?；?β-D-erythro-核糖)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮-5-丙酸(20)5-脲嘧啶-3-丙酸(6g，32.6mmol)，CuI(6g)和1-氯-2-去氧-3，5-二對甲基苯甲?；颂?15g，38.6mmol)，得到無色粉末狀固體(14g)，產(chǎn)率為80％。Rf(CH2Cl2/CH3OH 20∶1)0.34。元素分析C28H28N2O9.0.5H2O(M 545.53)，理論值C 61.59，H 5.32，N 5.13；實測值C 61.78，H 5.13，N 5.02。1H NMR(d6-DMSO)2.30(m，5-CH2CH2COOH)，2.38，2.40(2s，CH3)，2.57(m，2’-H)，4.47-4.64(m，4’-H，5’-H)，5.61(m，3’-H)，6.31(t，J＝7.1Hz，1’-H)，7.51(s，6-H)，7.31-7.93(m，Ph)，11.44(s，NH)，12.13(s，COOH)。
5.2 1-(2-去氧-3，5-二-氧-對甲基苯甲?；?β-D-erythro-核糖)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮-5-[(N-苯乙基)-丙酰胺](21)向化合物20(1.4g，2.61mmol)的二氯甲烷溶液(30ml)加入DCC(1.4g，6.79mmol)和苯乙胺(0.75ml，6mmol)，此反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜，濃縮后用柱層析得到產(chǎn)物，為無色固體0.85g，產(chǎn)率為51％。Rf(CH2Cl2/CH3OH 20∶1)0.59。元素分析C36H37N3O8(M639.69)，理論值C 67.59，H 5.83，N 6.57；實測值C 67.70，H5.75，N 6.50。1H NMR(d6-DMSO)2.28(t，J＝7.3Hz，5-CH2CH2CO)，2.31-2.617m，2’-H，5-NHCH2CH2Ph)，2.36，2.40(2s，CH3)，2.67(t，J＝7.3Hz，5-CH2CH2CO)，3.24(m，5-NHCH2CH2Ph)，4.45-4.62(m，4’-H，5’-H)，5.58(m，3’-H)，6.29(t，J＝7.1Hz，1’-H)，7.49(s，6-H)，7.15-7.92(m，Ph，NHCO)，11.42(s，NH)。
5.3 1-(2-去氧-β-D-erythro-核糖)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮5-[(N-苯乙基)-丙酰胺](22)將化合物21懸浮在0.1M甲醇鈉/甲醇溶液(200ml)中，室溫下反應(yīng)3hr。用冰醋酸中和反應(yīng)液，濃縮后用柱層析分離得到無色固體產(chǎn)物，1.1g，產(chǎn)率為85.3％。Rf(CH2Cl2/CH3OH 9∶1)0.32。元素分析C20H25N3O6.0.5H2O(M 412.43)，理論值C 58.19，H 6.30，N 10.18；實測值C 58.46，H 6.30，N 10.04。1H NMR(d6-DMSO)2.25-2.04(m，2’-H，5-NHCH2CH2Ph)，2.41(t，J＝7.3Hz，5-CH2CH2CO)，2.67(t，J＝7.3Hz，5-CH2CH2CO)，3.24(m，5-NHCH2CH2Ph)，3.57(m，5’-H)，3.76(m，4’-H)，4.23(m，3’-H)，5.03(t，J＝5.3Hz，5’-OH)，5.24(d，J＝4.2Hz，3’-OH)，6.17(t，J＝6.9Hz，1’-H)，7.16-7.29(m，Ph)，7.64(s，6-H)，7.91(t，J＝5.5Hz，NHCO)，11.32(s，NH)。
5.4 1-[(2-去氧-β-D-erythro-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基))-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮5-[(N-苯乙基)-丙酰胺](23)化合物22(0.8g，2mmol)在無水吡啶(2ml)中與DMT-Cl(0.81g，2.4mmol)反應(yīng)，得到無色固體產(chǎn)物，1.12g，產(chǎn)率為79.4％Rf(CH2Cl2/CH3OH 20∶1)0.25。元素分析C41H43N3O8(M 705.80)，理論值C 69.77，H 6.14，N 5.95；實測值C 69.82，H 6.10，N 6.14。1H NMR(d6-DMSO)2.12-2.28(m，2’-H，5-NHCH2CH2Ph，5-CH2CH2CO)，2.65(t，J＝7.3Hz，5-CH2CH2CO)，3.16-3.23(m，5’-H，5-NHCH2CH2Ph)，3.73(s，CH3O)，3.86(m，4’-H)，4.22(m，3’-H)，5.32(d，J＝4.8Hz，3’-OH)，6.17(t，J＝6.7Hz，1’-H)，6.87-7.40(m，6-H，Ph)，7.79(t，J＝5.6Hz，NHCO)，11.38(s，NH)。
5.5 1-[(2-去氧-β-D-erythro-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基))-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮5-[(N-苯乙基)-丙酰胺]3’-[(2-氰乙基)-N，N-二異丙基亞磷酰胺](24)
化合物22(0.8g，1.13mmol)在二氯甲烷(10ml)中與β-氰乙基-單氯-N，N-二異丙基-亞磷酰胺和二異丙基乙基胺(0.75ml)的反應(yīng)得到產(chǎn)物，為無色固體，0.75g，產(chǎn)率為73.3％。31P NMR(CDCl3)149.22，149.50；1H NMR(CDCl3)1.18[m，2CH(CH3)2]，2.06-2.76[m，2’-H，5-NHCH2CH2Ph，5-CH2CH2CO，5-CH2CH2CO，CH(CH3)2]，3.16-3.23(m，5’-H，5-NHCH2CH2Ph，OCH2CH2CN)，3.78(s，CH3O)，4.17(m，4’-H)，4.61(m，3’-H)，6.35(t，J＝6.9Hz，1’-H)，6.83-7.54(m，6-H，Ph)。
實施例66.1 1-[(2-去氧-β-D-erythro-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基))-5-甲基-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮3’-[(2-芴甲氧羰氧乙基)-N，N-二異丙基亞磷酰胺](25)550mg(4mmol)三氯化磷于反應(yīng)瓶中，分別加入5mL干燥二氯甲烷、320mg(4mmol)干燥吡啶，冷卻至-78℃。1.14g(4mmol)芴甲氧羧酸-(2-羥基)乙酯溶于5mL二氯甲烷，緩慢滴加于反應(yīng)液中，室溫攪拌3小時，置于冰箱中過夜。取出，冷卻至-40℃，滴加810mg(8mmol)二異丙胺，低溫反應(yīng)3h后，室溫放置20h。取4.0g(7.3mmol)5’-(4，4’-二甲氧基)-三苯甲基-胸苷、2.10g DIEA和8mL二氯甲烷，注入反應(yīng)液中，室溫下攪拌4小時。反應(yīng)液用飽和NaHCO3、飽和NaCl溶液分別洗滌二次，無水Na2SO4干燥有機相。濾除Na2SO4，減壓除二氯甲烷，得到淡黃色油狀物，經(jīng)硅膠柱層析，得到1.10g無色泡狀產(chǎn)物，收率28.7％(按三氯化磷計)。Rf0..55(DCM∶丙酮 9∶1)；31P-NMR(CD3Cl)，δP149.12，149.81。1H-NMR(CD3Cl)，δH1.05～1.20[m，12H，-CH(CH3)2]，1.39(s，3H，-CH3)，2.30～3.40[m，6H，2’-H，-CH(CH3)2，5’-H]，3.44～3.90[m，7H，O-CH2-CH2-O，O-CH2-CH-(fluorene)]，3.78(s，6H，-OCH3)，4.21(m，1H，4’-H)，4.65(m，1H，3’-H)，6.41(m，1H，1’-H)，6.73～7.77(m，22H，Ar-H)，8.16(br，NH)。
6.2 1-[2-去氧-β-D-erythro-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)]-5-甲基-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮3’-[(3-芴甲氧羰氧丙基)-N，N-二異丙基-亞磷酰胺](26)722mg(5.25mmol)三氯化磷于反應(yīng)瓶中，分別加入5mL干燥二氯甲烷、416mg(5.25mmol)干燥吡啶，冷卻至-78℃。1.56g(4mmol)芴甲氧羧酸-1-(3-羥基)丙酯溶于6mL二氯甲烷，緩慢滴加于反應(yīng)液中，室溫攪拌3小時，置于冰箱中過夜。取出，冷卻至-40℃，滴加1060mg(10.4mmol)二異丙胺，低溫反應(yīng)3h后，室溫放置20h。取2.8g(5.1mmol)5’-(4，4’-二甲氧基)-三苯甲基-胸苷、2.70g(20.9mmol)DIEA和10mL二氯甲烷，注入反應(yīng)液中，室溫下攪拌6小時。反應(yīng)液用飽和NaHCO3、飽和NaCl溶液分別洗滌二次，無水Na2SO4干燥有機相。濾除Na2SO4，減壓除二氯甲烷，得到淡黃色油狀物，經(jīng)硅膠柱層析，得到2.13g無色泡狀產(chǎn)物，收率41.8％(按三氯化磷計)。Rf0.8(DCM∶丙酮 12∶1)；31P-NMR(CD3Cl)δP147.89，148.31。1H-NMR(CD3Cl)，δH1.04～1.20[m，12H，-CH(CH3)2]，1.40(s，3H，-CH3)，1.66～2.00(m，2H，O-CH2-CH2-CH2-O)，2.30～3.60[m，6H，2’-H，-CH(CH3)2，5’-H]，3.60(m，2H，P-O-CH2-CH2-CH2-O)，3.77(s，6H，-OCH3)，4.20(m，1H，4’-H)，4.20～4.40[m，5H，P-O-CH2-CH2-CH2-O，O-CH2-CH-(fluorene)]，4.64(m，1H，3’-H)，6.41(m，1H，1’-H)，6.73～7.77(m，22H，Ar-H)，8.38(br，NH)；6.3 1-[(2-去氧-β-D-erythro-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基))-5-甲基-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮3’-[(4-芴甲氧羰氧丁基)-N，N-二異丙基-亞磷酰胺](27)取510mg(3.70mmol)三氯化磷于反應(yīng)瓶中，分別加入5mL干燥二氯甲烷、294mg(3.71mmol)干燥吡啶，冷卻至-78℃。1.15g(3.70mmol)芴甲氧羧酸-1-(4-羥基)丁酯溶于5mL二氯甲烷，緩慢滴加于反應(yīng)液中，室溫攪拌3小時，置于冰箱中過夜。取出，冷卻至-40℃，滴加750mg(7.41mmol)二異丙胺，低溫反應(yīng)3h后，室溫放置20h。取2.0g(3.67mmol)5’-(4，4’-二甲氧基)-三苯甲基-胸苷、1.90g(14.7mmol)DIEA和10mL二氯甲烷，注入反應(yīng)液中，室溫下攪拌6小時。反應(yīng)液用飽和NaHCO3、飽和NaCl溶液分別洗滌二次，無水Na2SO4干燥，濃縮得到淡黃色油狀物，經(jīng)硅膠柱層析，得到1.07g無色泡狀產(chǎn)物，收率41.8％(按三氯化磷計)。Rf0.49(DCM∶丙酮 12∶1)。31P-NMR(CD3Cl)，δP147.5，148.0。1H-NMR(CD3Cl)，δH1.03～1.20[m，12H，-CH(CH3)2]，1.39(s，3H，-CH3)，1.66～2.00(m，4H，O-CH2-CH2-CH2-CH2-O)，2.30～3.60[m，6H，2’-H，-CH(CH3)2，5’-H]，3.55(m，2H，P-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O)，3.77(s，6H，-OCH3)，4.16(m，1H，4’-H)，4.20～4.40[m，5H，P-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O，O-CH2-CH-(fluorene)]，4.64(m，1H，3’-H)，6.41(m，1H，1’-H)，6.73～7.77(m，22H，Ar-H)，8.38(br，NH)。
6.4 1-[(2-去氧-β-D-erythro-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基))-5-甲基-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮3’-(苯乙基-N，N-二異丙基-亞磷酰胺)(28)取526mg(3.83mmol)三氯化磷于干燥并充滿氬氣的反應(yīng)瓶中，分別加入5mL干燥二氯甲烷、299mg(3.78mmol)干燥吡啶，冷卻至-78℃。468mg(3.83mmol)苯乙醇溶于5mL二氯甲烷，緩慢滴加于反應(yīng)液中，室溫攪拌3小時，置于冰箱中過夜。取出，冷卻至-40℃，滴加775mg(7.66mmol)二異丙胺，低溫反應(yīng)3h后，室溫放置20h。取2.0g(3.65mmol)5’-(4，4’-二甲氧基)-三苯甲基-胸苷、2.0g DIEA和10mL二氯甲烷，注入反應(yīng)液中，室溫下攪拌4小時。反應(yīng)液用飽和NaHCO3、飽和NaCl溶液分別洗滌二次，無水Na2SO4干燥有機相。濾除Na2SO4，減壓除二氯甲烷，得到淡黃色油狀物，經(jīng)硅膠柱層析，得到1.30g無色泡狀產(chǎn)物，收率42.6％(按三氯化磷計)。Rf0.55(DCM∶丙酮 9∶1)。31P-NMR(CD3Cl)，δP147.18，147.73。1H-NMR(CD3Cl)，δH1.02～1.20[m，12H，-CH(CH3)2]，1.40(m，3H，-CH3)，2.20～3.90[m，10H，2’-H，O-CH2-CH2-Ar，-N-CH(CH3)2，5’-H]，3.77(s，6H，-OCH3)，4.15(d，1H，4’-H)，4.62(m，1H，3’-H)，6.42(m，1H，1’-H)，6.81～7.70(m，19H，Ar-H)，8.86(br，NH)。
6.5 1-[(2-去氧-β-D-erythro-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基))-5-甲基-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮3’-[(3-甲基)-丁基-N，N-二異丙基-亞磷酰胺](29)取529mg(3.85mmol)三氯化磷于反應(yīng)瓶中，分別加入5mL干燥二氯甲烷、305mg(3.85mmol)干燥吡啶，冷卻至-78℃。339.5mg(3.85mmol)3-甲基-1-丁醇溶于5mL二氯甲烷，緩慢滴加于反應(yīng)液中，室溫攪拌3小時，置于冰箱中過夜。取出，冷卻至-40℃，滴加755mg(7.50mmol)二異丙胺，低溫反應(yīng)3h后，室溫放置20h。取2.0g(3.65mmol)5’-(4，4’-二甲氧基)-三苯甲基-胸苷、1.93g DIEA和8mL二氯甲烷，注入反應(yīng)液中，室溫下攪拌4小時。反應(yīng)液用飽和NaHCO3、飽和NaCl溶液分別洗滌二次，無水Na2SO4干燥有機相。濾除Na2SO4，減壓除二氯甲烷，得到淡黃色油狀物，經(jīng)硅膠柱層析，得到0.96g無色泡狀產(chǎn)物，收率33.8％(按三氯化磷計)。Rf0.57(DCM∶丙酮 9∶1)；1H-NMR(CD3Cl)，δH0.83～1.20[m，18H，-CH(CH3)2]，1.15[m，2H，-CH2-CH(CH3)2]，1.39(s，3H，-CH3)，1.50[m，2H，-CH2-CH(CH3)2]，2.30～3.90[m，7H，2’-H，O-CH2-CH2，-N-CH(CH3)2，5’-H]，3.79(s，6H，-OCH3)，4.15(d，1H，4’-H)，4.65(m，1H，3’-H)，6.44(m，1H，1’-H)，6.82～7.70(m，14H，Ar-H)。31P-NMR(CD3Cl)，δP147.08，147.50。
6.6 1-[(2-去氧-β-D-erythro-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基))-5-甲基-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮3’-[(3-甲氧羰丙基)-N，N-二異丙基-亞磷酰胺](30)取425mg(3.10mmol)三氯化磷于反應(yīng)瓶中，分別加入5mL干燥二氯甲烷、245mg(3.10mmol)干燥吡啶，冷卻至-78℃。365mg(3.10mmol)4-羥基-丁酸甲酯溶于5mL二氯甲烷，緩慢滴加于反應(yīng)液中，室溫攪拌3小時，置于冰箱中過夜。取出，冷卻至-40℃，滴加626mg(6.20mmol)二異丙胺，低溫反應(yīng)3h后，室溫放置20h。取1.69g(3.10mmol)5’-(4，4’-二甲氧基)-三苯甲基-胸苷、1.60g(12.4mmol)DIEA和10mL二氯甲烷，注入反應(yīng)液中，室溫下攪拌6小時。反應(yīng)液用飽和NaHCO3、飽和NaCl溶液分別洗滌二次，無水Na2SO4干燥有機相。濾除Na2SO4，減壓除二氯甲烷，得到淡黃色油狀物，經(jīng)硅膠柱層析，得到300mg無色泡狀產(chǎn)物，收率14.4％(按三氯化磷計)。Rf0.54，0.64(DCM∶丙酮 9∶1)；1H-NMR(CD3Cl)，δH1.03～1.30[m，12H，-CH(CH3)2]，1.40(s，3H，-CH3)，1.59(m，2H，O-CH2-CH2-CH2-C＝O)，1.72～1.94(m，2H，O-CH2-CH2-CH2-C＝O)，2.25～2.50[m，2H，C(2’)-H2]，3.25～3.75[m，9H，-CH(CH3)2，O＝C-OCH3，O-CH2-CH2-CH2-C＝O，C(5’)-H2]，3.79(s，6H，-OCH3)，4.18[m，1H，C(4’)-H]，4.63[m，1H，C(3’)-H]，6.40[m，1H，C(1’)-H]，6.81～7.66(m，14H，Ar-H]，8.13(br，NH)；31P-NMR(CD3Cl)，δP147.75，148.13。
實施例77.1 1-[(2-去氧-β-D-erythro-核糖-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基))-5-甲基-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮3’-[(2-[1-(2，4-硝基苯基)-1H-咪唑基-4-]-乙基)-N，N-二異丙基-亞磷酰胺](31)取297mg(2.16mmol)三氯化磷于反應(yīng)瓶中，加入10mL干燥二氯甲烷，冷卻至-78℃滴加875mg(8.64mmol)二異丙胺，室溫攪拌過夜。取0.94g(1.73mmol)5’-(4，4’-二甲氧基)-三苯甲基-胸苷、557mg(12.4mmol)DIEA和10mL二氯甲烷，注入反應(yīng)液中，室溫下攪拌24小時。加入90mg四氮唑，360mg 2-[1-(2，4-硝基苯基)-1H-咪唑基-4-]-乙醇，室溫放置20h。反應(yīng)液用飽和NaHCO3、飽和NaCl溶液分別洗滌二次，無水Na2SO4干燥有機相。濾除Na2SO4，減壓除二氯甲烷，得到淡黃色油狀物，經(jīng)硅膠柱層析，得到490mg黃色泡狀產(chǎn)物，收率39.8％(按2-[1-(2，4-硝基苯基)-1H-咪唑基-4-]-乙醇計)。Rf0.31(乙酸乙酯∶三乙胺 100∶3)；1H-NMR(CD3Cl)，δH1.03～1.30[m，12H，-CH(CH3)2]，1.38(s，3H，-CH3)，2.25～2.50[m，2H，C(2’)-H2]，3.30～3.68[m，6H，-CH(CH3)2，O-CH2-CH2-imidazole，C(5’)-H2]，3.77(m，8H，-OCH3，O-CH2-CH2-imidazole)，4.18[m，1H，C(4’)-H]，4.65[m，1H，C(3’)-H]，6.40[m，1H，C(1’)-H]，6.82～7.38(m，17H，Ar-H)，8.16(br，NH)，8.44[m，1H，5-H(Dnp)]，8.77[d，1H，3-H(Dnp)]；31P-NMR(CD3Cl)，δP147.55。
實施例88.1 5-(2-芐氧乙基)-尿嘧啶(32)將5-(2-羥乙基)尿嘧啶(10.3g，66mmol)加入二甲基甲酰胺(100ml)中，加入新制的甲磺酸芐酯(24.6g，132mmol)，加熱至100℃，反應(yīng)48小時。蒸干溶劑，剩余物用乙醚洗滌兩次。加入無水乙醇(100ml)，加熱至50℃，趁熱過濾，減壓濃縮至30ml，放入冰箱冷藏。過濾，濾出物干燥，得無色固體，8.89g，Mp 144-150℃。元素分析C13H14N2O3(M 246.26)，理論值C 63.40，H 5.30，N 11.38；實測值C 63.25，H 5.38，N 11.46。1HNMR(d6-DMSO)2.45(t，2H，CH2-OH)，3.49(t，2H，CH2-CH2)，4.51(s，2H，-CH2-C6H5)，7.30(m，6H，-C6H5and C＝CH)，10.68(d，1H，CH-NH-CO)，11.04(s，1H，CO-NH-CO)。
8.2 5-(2-芐氧乙基)-尿嘧啶-1-乙酸(33)將5-(2-芐氧乙基)尿嘧啶(8.86g，36mmol)溶于二甲基甲酰胺(100ml)中，加入K2CO3(5.79g，42mmol)，30分鐘后，滴加溴乙酸甲酯(5.47g，36mmol)，室溫攪拌過夜。蒸干溶劑，加入冰水(20ml)，過濾，用水(20ml)洗滌。濾出物加入水(30ml)和(20ml)四氫呋喃中，用1M的氫氧化鋰維持PH＝12，至TLC檢測反應(yīng)完全。溶液用乙酸乙酯萃取兩次，用1MHCl調(diào)pH＝2.0，收集沉淀，干燥，得白色固體5.96g，產(chǎn)率54.3％。mp180～181℃。1HNMR(d6-DMSO)2.47(t，2H，CH2-O)，3.49(t，2H，CH2-CH2)，4.40(s，2H，N-CH2-CO)，4.46(s，2H，-CH2-C6H5)，7.33(m，5H，-C6H5)，7.49(s，1H，C＝CH)，11.46(s，1H，CO-NH-CO)。
8.3 N-[(5-(2-芐氧乙基)-尿嘧啶-1-乙?；?]-N-(2-叔丁氧羰基-氨基乙基)-甘氨酸甲酯(34)將5-(2-芐氧乙基)-尿嘧啶-1-乙酸(1.00g，3.29mmol)溶于二甲基甲酰胺(10ml)中，冷卻至0℃，加入DCC(0.81g，3.93mmol)，30分鐘后加入(N-2-叔丁氧羰基-氨基乙基)-甘氨酸甲酯(0.80g，3.45mmol)，繼續(xù)在0℃反應(yīng)1小時，室溫反應(yīng)過夜。蒸干溶劑，硅膠柱層析分離得1.25g，產(chǎn)率73.5％。ESI-MS519[M+H]+。
8.4 N-[5-(2-芐氧乙基)-尿嘧啶-1-乙酰基]-N-(2-叔丁氧羰基-氨基乙基)-甘氨酸(35)將N-[5-(2-芐氧乙基)-尿嘧啶-1-乙?；鵠-N-(2-叔丁氧羰基-氨基乙基)-甘氨酸甲酯(1.25g，2.41mmol)溶于水(10ml)和四氫呋喃(10ml)的混和溶液中，用1M的氫氧化鋰維持pH12，至反應(yīng)完全。溶液用乙酸乙酯萃取兩次，用1MHCl調(diào)pH2。乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，乙醇/乙醚重結(jié)晶，得無色固體0.99g，產(chǎn)率81.1％。元素分析C24H32N4O8(M 504.53)，理論值C 57.13，H 6.39，N 11.10；實測值C 57.34，H 6.58，N 11.34。1H NMR(DMSO)1.37[s，9H，C(CH3)3]，2.50(t，2H，CH2-O)，3.00-3.50(m，4H，NHCH2CH2NH)，3.51(dd，2H，-CH2-C6H5)，3.98(s，1.4H，CH2COO)，4.20(s，0.6H，CH2COO)，4.45(s，2H，-CH2-C6H5)，4.49(s，0.6H，NCH2CON)，4.66(s，1.4H，NCH2CON)，7.20-7.35(m，6H，-C6H5和C＝CH)，11.32(s，0.6H，COCHCO)，11.34(s，1.4H，COCHCO)，12.70(br s，1H，COOH)。
實施例99.1 Nα-叔丁氧羰基-Nπ-芐氧甲基-L-組氨酸甲酯(9a)500mL反應(yīng)器，加入二甲基甲酰胺100mL，11.25gNα-叔丁氧羰基-Nπ-芐氧甲基-L-組氨酸(30mmol)，4.14g無水K2CO3(30mmol)，再加入甲磺酸甲酯3.31g(30mmol)，室溫反應(yīng)過夜，停止。減壓蒸去二甲基甲酰胺，加入適量水，乙酸乙酯萃取三次，依次以飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸干，得到10.13g淺黃色油狀物，收率86.8％。元素分析C20H27N3O5(349.51)，理論值C 61.68，H 6.99，N 10.79，實測值C 61.27，H 7.38，N10.82。1HNMR(CDCl3，)1.41[s，9H，-C(CH3)3]，3.09-3.19(m，2H，-CHCH2C)，3.72(s，3H，-OCH3)，4.47(s，2H，-O-CH2-Ar)，4.58(m，1H，NCH(CH2)CO)，5.28-5.32(m，3H，-NHCH and NCH2O)，6.87(s，1H，-C＝CH-N)，7.28-7.39(m，5H，Ar-H)，7.48(s，1H，-N-CH＝N-)。ESI-MS390.2[M+H]+。
9.2 Nπ-芐氧甲基-L-組氨酸甲酯(9b)100mL反應(yīng)器，加入Nα-叔丁氧羰基-Nπ-芐氧甲基-L-組氨酸甲酯(9a)10.13g(26mmol)，二氧六環(huán)20mL，全部溶解，加入4M HCl/二氧六環(huán)20mL，室溫反應(yīng)1小時，原料消失，蒸干，加入適量水，乙醚萃取兩次，分批加入碳酸氫鈉，充分?jǐn)嚢柚翢o氣泡產(chǎn)生，乙酸乙酯萃取三次，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸干，得到6.06g油狀物，收率80.5％。
9.3 Nα-(2-叔丁氧羰基氨基乙基)-Nπ-芐氧甲基-L-組氨酸甲酯(9c)250mL反應(yīng)器，Nπ-芐氧甲基-L-組氨酸甲酯(9b)6.62g(21mmol)加入無水甲醇70mL中，-20℃，加入N-叔丁氧羰基氨基乙醛(3.33g，21mmol)，攪拌30分鐘。加入NaBH3CN(0.925g，14.7mmol)，HAc2.4g(29.4mmol)，反應(yīng)30鐘，室溫反應(yīng)1小時，停止。加入乙酸乙酯，再以飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌三次，飽和氯化鈉水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸干，柱層析，得到無色油狀物7.70g，收率85％。元素分析C22H32N4O5(432.67)，理論值C 61.09，H 7.46，N 12.95，實測值C 59.84，H 7.70，N 12.24。1HNMR(CDCl3)1.44[s，9H，-C(CH3)3]，2.5-3，2(m，6H，-CH2CH2和-CH-CH2-C)，3.53-3.56(m，1H，-CH-COOCH3)，3.67(s，3H，-COOCH3)，4.42(s，2H，-OCH2-Ar)，5.00(br，1H，-NH-CH-COOCH3)，5.33-5.38(m，2H，-N-CH2-O-Bzl)，6.88(s，1H，-C＝CH-N-)，7.30-7.36(m，5H，-O-CH2-Ar-H)，7.50(s，1H，-N-CH＝N-)。ESI-MS433.4[M+H]+。
9.4 N-[5-(2-芐氧乙基)-尿嘧啶-1-乙?；鵠-N-(2-叔丁氧羰基-氨基乙基)-Nπ-芐氧甲基-L-組氨酸甲酯(9d)將5-(2-芐氧乙基)-尿嘧啶-1-乙酸(5.30g，17.4mmol)溶于DMF(50ml)中，冷卻至0℃，加入DCC(4.77g，23.2mmol)，30分鐘后加入(6.81g，15.8mmol)Nα-(2-叔丁氧羰基氨基乙基)-Nπ-芐氧甲基-L-組氨酸甲酯(9c)，繼續(xù)在0℃反應(yīng)1小時，室溫反應(yīng)過夜。蒸干溶劑，硅膠柱層析分離得7.65g油狀物，產(chǎn)率67.6％。1HNMR(CDCl3)1.36(s，9H，-C(CH3)3)，2.50(m，2H，CH2-O)，2.70-3.40(m，6H，-CH2CH2和-CH-CH2-C)，3.52(t，2H，-CH2-C6H5)，3.57(s，3H，-OCH3)，4.21(m，1H，-CH-COOCH3)，4.40-4.70(m，6H，-OCH2-Ar and-OCH2-Ar和NCH2CON)，5.43(m，2H，N-CH2-O)，6.83(s，1H，-C＝CH-N-)，7.20-7.40(m，10H，-O-CH2-Ar-H)，7.43(s，1H，-N-CH＝N-)，7.76(s，1H，C＝CH-N)，11.37(s，1H，COCHCO)。
9.5 N-[5-(2-芐氧乙基)-尿嘧啶-1-乙?；鵠-N-(2-叔丁氧羰基-氨基乙基)-Nπ-芐氧甲基-L-組氨酸(36)將N-[5-(2-芐氧乙基)-尿嘧啶-1-乙?；鵠-N-(2-叔丁氧羰基-氨基乙基)-Nπ-芐氧甲基-L-組氨酸甲酯(9d)(7.65g，2.41mmol)溶于水(100ml)和四氫呋喃(100ml)的混和溶液中，用2M的氫氧化鋰維持pH13，至反應(yīng)完全。溶液用乙酸乙酯萃取兩次，用1MHCl調(diào)pH2。減壓蒸干，加入無水乙醇(300ml)，過濾，無水硫酸鈉干燥。蒸干，乙醇/乙醚重結(jié)晶，得白色固體6.94g，產(chǎn)率92.5％。元素分析C36H44N6O9(M 704.77)，理論值C 61.35，H 6.29，N 11.92；實測值C 61.55，H 6.18，N 11.98。1HNMR(CDCl3)1.35(s，9H，-C(CH3)3)，2.4736(m，2H，CH2-O)，2.7-3.4(m，6H，-CH2CH2and-CH-CH2-C)，3.51(m，2H，-CH2-C6H5)，4.22(m，1H，-CH-COOCH3)，4.40-4.70(m，6H，-OCH2-Ar，-OCH2-Ar，NCH2CONH)，5.41(s，0.7H，NCH2CON)，4.48(s，0.3H，NCH2CON)，6.77(s，0.7H，-C＝CH-N-)，6.81(s，0.3H，-C＝CH-N-)，7.20-7.45(m，11H，-C6H5，-N-CH＝N-)，7.74(s，0.7H，C＝CH-N)，7.75(s，0.3，C＝CH-N)，11.28(s，0.3H，COCHCO)，11.36(s，0.7H，COCHCO)。
權(quán)利要求
1.式I，II的核苷類似物 其中式I和II中，B為天然堿基(腺嘌呤，鳥嘌呤，脲嘧啶，胸腺嘧啶，胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤等等)，含保護基的天然堿基，或如式III、IV所示非天然堿基， 在式III和IV中，在脲嘧啶的五位和8-氮-7-去氮嘌呤的七位引入取代基-X-R1，其中，X可為各種連接臂形式，如(-CH2-)n，(-CH＝CH-)n，(-C≡C-)n，-O-，-C(O)-，-OC(O)-，-C(O)O-，-NH-，N(R1)2-，-C(O)NH-，-NHC(O)-，-CH＝N-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)NH-，-S(O)2NH-，或者是它們的組合，n為0-10，其中當(dāng)n為0時，即沒有連接臂X，R1可為蛋白質(zhì)的所有氨基酸殘基側(cè)鏈所含的功能基，包括(1)疏水性基團甲基(丙氨酸)，芐基(苯丙氨酸)，異丙基(纈氨酸)，1-甲硫基乙基[CH3S(CH2)2-](甲硫氨酸)，3-甲基丙基[(CH3)2CHCH2-](亮氨酸)，1-甲基丙基[CH3CH2CH(CH3)-](異亮氨酸)；(2)親水性基團如羥甲基(HOCH2-)(絲氨酸)，1-羥乙基[CH3CH(OH)-](蘇氨酸)，4-咪唑甲基(組氨酸)，4-氨基丁基[NH2(CH2)4-](賴氨酸)，巰甲基(HSCH2-)(半胱氨酸)，3-吲哚甲基(色氨酸)，四氫吡咯-2-(脯氨酸)，4-羥基苯甲基(酪氨酸)，1-胍基丙基(精氨酸)，氨甲酰甲基(天冬酰胺)，1-氨甲酰乙基(谷氨酰胺)，羧甲基(天冬氨酸)，1-羧乙基(谷氨酸)，其中當(dāng)n不為0時，以X為連接臂(1).R1可為碳原子數(shù)為2至10的烴基及其異構(gòu)體，包括(直鏈和支鏈)烷基，環(huán)烷基，烯基，和炔基，以及它們的異構(gòu)體，如甲基，乙基，乙烯基，正丙基，異丙基，烯丙基，炔丙基，正丁基，異丁基，叔丁基，1-(或2-，3-)丁烯基，1-(或2-，3-)丁炔基，戊基，環(huán)戊基，環(huán)戊二烯基，己基，環(huán)己基，等；含氮、氧、硫、硒等雜原子的(直鏈和支鏈)烷基，環(huán)烷基，烯基，和炔基，其雜原子表現(xiàn)為以下功能基團，如巰基，醚鍵，硫醚鍵，氨基，胺基，胍基，脲基，羧基，酯基，羥基，酰胺基，磺?；?，磺酰胺基，磺酰酯基，亞磺?；?，亞磺酰胺基，亞磺酰酯基，硝基，硝酸酯基，亞硝基，亞硝酸酯基，鹵素，擬鹵素等；雜環(huán)類基團如，2-(或/和3-取代)呋喃基，2-(或/和4-，5-取代)咪唑基，2-(或/和3-，N-取代)吡咯基，2-(或/和4-，5-取代)噁唑基，2-(或/和3-取代)噻吩基，3-(或/和2-，4-，5-，6，N-取代)吲哚基，2-(或/和3-取代)四氫呋喃基，2-(或/和3-，N-取代)四氫吡咯基，2-(或/和3-取代)四氫噻吩基，2-(或/和3-，4-取代)哌啶基，2-(或/和3-，N-取代)嗎啉基，2-(或/和3-，5-取代)噻唑基，2-(或/和3-，5-取代)四氫噻唑基等；(2).R1可為碳原子數(shù)為6到20的芳香烴基和雜芳香烴基，和取代的芳香烴基和雜芳香烴基，如苯基，萘基，蒽基，芴基等；雜芳香烴基含氮，氧，硫，硒等雜原子，如2-(或3-，4-)吡啶基，喹啉基，異喹啉基。在取代的芳香烴基和雜芳香烴基中，其取代基定義為如甲基，乙基，乙烯基，正丙基，異丙基，烯丙基，炔丙基，正丁基，異丁基，叔丁基，1-(或2-，3-)丁烯基，1-(或2-，3-)丁炔基，戊基，環(huán)戊基，環(huán)戊二烯基，己基，環(huán)己基等碳原子數(shù)為1-10的烴基；或含巰基，醚鍵，硫醚鍵，氨基，胺基，胍基，脲基，羧基，酯基，羥基，酰胺基，磺酰基，磺酰胺基，磺酰酯基，亞磺?；瑏喕酋０坊?，亞磺酰酯基，硝基，硝酸酯基，亞硝基，亞硝酸酯基，鹵素，擬鹵素，咪唑基，吡咯基，吲哚基等功能基的這類烴基，式IV中，P2可為氫，乙酰基，苯甲?；?，茴香?；?，異丁?；?，鄰硝基苯氧乙?；?，N，N-二甲胺基甲叉基，苯氧乙?；宥』窖跻阴；?，三氟乙?；瑢谆郊柞；妓嵬榛柞?，碳酸烷基烯丙酯等，氨基和亞胺基的保護基有苯甲?；惗□；?，三氟乙酰基，N，N-二甲胺基亞甲基，N，N-二丁胺基亞甲基，式I中，P1可為乙酰基，三甲基硅基，二乙基硅基，叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基，四氫吡喃基，烯丙基，叔丁氧甲基，(鄰硝基，對硝基，對鹵代，對氰基)芐基，三苯甲基，對甲氧苯基二苯基，4，4’-甲氧基三苯甲基等，式I中，當(dāng)B為天然堿基或保護的天然堿基時，R2可為N，N-二異丙胺基，4-嗎啡啉基，1-四氫吡咯基，2，2，6，6-四甲基哌啶基；R3可為-X-R1，-NH-R1，-N(R1)2(其中兩個R1可以相同也可以是R1的不同組合)，但不包括2-氰乙基，甲氧基，乙氧基，N，N-二異丙胺基，N，N-二甲胺基，N，N-二乙胺基；式I中，當(dāng)B為非天然堿基時，R2可為N，N-二異丙胺基，嗎啡啉基，四氫吡咯基，2，2，6，6-四甲基哌啶基；R3可為2-氰乙基，-X-R1，-NH-R1，-N(R1)2(其中兩個R1可以相同也可以是R1的不同組合)。式II中，當(dāng)B為非天然堿基時，R4，R5，R6，R7，R8的可為H，R1或-X-R1；式II中，R9可為H或-X-R1，R10可為H，叔丁氧羰基(Boc)，芴甲氧羰基(Fmoc)，芐氧羰基，芐基或三苯甲基；式II中，R11可為氫，甲基，乙基，烯丙基，芐基，4-硝基芐基，4-甲基芐基，4-甲氧基芐基；式II中，R5與R6，R7與R8，R5與R7，R6與R8，R9/R10與R5/R6，R9/R10與R7/R8之間形成以(-CH2-)n結(jié)構(gòu)相連的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，n為1～4；或與主鏈(N-C-C，或N-C，或C-C)形成含雜原子(O，S，N等)的三至七元環(huán)狀結(jié)構(gòu)，雜原子形成如醚鍵，硫醚鍵等。
2.含式V的核酸序列和含式VI的肽核酸序列 式V中，當(dāng)B為非天然堿基時，R12可為O-，OH，S-，SH，Se-，SeH或R1，當(dāng)B為天然堿基或保護的天然堿基時，R12可為R3，但不為O-，OH，S-，SH，Se-，SeH；Y可為O，S，Se等原子，式VI中，R4，R5，R6，R7，R8，R9與權(quán)利要求1中的相應(yīng)定義相同，在含式V的核酸序列和含式VI的肽核酸序列中，式V和式VI的個數(shù)可在1～50個。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中B為天然堿基(腺嘌呤，鳥嘌呤，脲嘧啶，胸腺嘧啶，胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤等)，含保護基的天然堿基，或修飾堿基和含保護基的修飾堿基，修飾堿基為在脲嘧啶的五位和8-氮-7-去氮嘌呤的七位引入取代基-X-R1。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中修飾堿基中的X為各種連接臂形式，如-CH2-)n，(-CH＝CH-)n，(-C≡C-)n，-O-，-C(O)-，-OC(O)-，-C(O)O-，-NH-，N(R1)2-，-C(O)NH-，-NHC(O)-，-CH＝N-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)NH-，-S(O)2NH-，或者是它們的組合，n為0-10。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中在修飾堿基中，當(dāng)n為零，即沒有連接臂X時，R1可為蛋白質(zhì)的所有氨基酸殘基側(cè)鏈所含的功能基，包括(1)疏水性基團甲基(丙氨酸)，芐基(苯丙氨酸)，異丙基(纈氨酸)，1-甲硫基乙基[CH3S(CH2)2-](甲硫氨酸)，3-甲基丙基[(CH3)2CHCH2-](亮氨酸)，1-甲基丙基[CH3CH2CH(CH3)-](異亮氨酸)；(2)親水性基團如羥甲基(HOCH2-)(絲氨酸)，1-羥乙基[CH3CH(OH)-](蘇氨酸)，4-咪唑甲基(組氨酸)，4-氨基丁基[NH2(CH2)4-](賴氨酸)，巰甲基(HSCH2-)(半胱氨酸)，3-吲哚甲基(色氨酸)，四氫吡咯-2-(脯氨酸)，4-羥基苯甲基(酪氨酸)，1-胍基丙基(精氨酸)，氨甲酰甲基(天冬酰胺)，1-氨甲酰乙基(谷氨酰胺)，羧甲基(天冬氨酸)，1-羧乙基(谷氨酸)。
6.權(quán)利要求1的化合物，其中在修飾堿基中，當(dāng)n不為零時，以X為連接臂，(1).R1可為碳原子數(shù)為2至10的烴基及其異構(gòu)體，包括(直鏈和支鏈)烷基，環(huán)烷基，烯基，和炔基，以及它們的異構(gòu)體，如甲基，乙基，乙烯基，正丙基，異丙基，烯丙基，炔丙基，正丁基，異丁基，叔丁基，1-(或2-，3-)丁烯基，1-(或2-，3-)丁炔基，戊基，環(huán)戊基，環(huán)戊二烯基，己基，環(huán)己基，等；含氮、氧、硫、硒等雜原子的(直鏈和支鏈)烷基，環(huán)烷基，烯基，和炔基，其雜原子表現(xiàn)為以下功能基團，如巰基，醚鍵，硫醚鍵，氨基，胺基，胍基，脲基，羧基，酯基，羥基，酰胺基，磺?；?，磺酰胺基，磺酰酯基，亞磺?；?，亞磺酰胺基，亞磺酰酯基，硝基，硝酸酯基，亞硝基，亞硝酸酯基，鹵素，擬鹵素等；雜環(huán)類基團如，2-(或/和3-取代)呋喃基，2-(或/和4-，5-取代)咪唑基，2-(或/和3-，N-取代)吡咯基，2-(或/和4-，5-取代)噁唑基，2-(或/和3-取代)噻吩基，3-(或/和2-，4-，5-，6，N-取代)吲哚基，2-(或/和3-取代)四氫呋喃基，2-(或/和3-，N-取代)四氫吡咯基，2-(或/和3-取代)四氫噻吩基，2-(或/和3-，4-取代)哌啶基，2-(或/和3-，N-取代)嗎啉基，2-(或/和3-，5-取代)噻唑基，2-(或/和3-，5-取代)四氫噻唑基等；(2).R1可為碳原子數(shù)為6到20的芳香烴基和雜芳香烴基，和取代的芳香烴基和雜芳香烴基，如苯基，萘基，蒽基，芴基等；雜芳香烴基含氮，氧，硫，硒等雜原子，如2-(或3-，4-)吡啶基，喹啉基，異喹啉基。在取代的芳香烴基和雜芳香烴基中，其取代基定義為如甲基，乙基，乙烯基，正丙基，異丙基，烯丙基，炔丙基，正丁基，異丁基，叔丁基，1-(或2-，3-)丁烯基，1-(或2-，3-)丁炔基，戊基，環(huán)戊基，環(huán)戊二烯基，己基，環(huán)己基等碳原子數(shù)為1-10的烴基；或含巰基，醚鍵，硫醚鍵，氨基，胺基，胍基，脲基，羧基，酯基，羥基，酰胺基，磺酰基，磺酰胺基，磺酰酯基，亞磺酰基，亞磺酰胺基，亞磺酰酯基，硝基，硝酸酯基，亞硝基，亞硝酸酯基，鹵素，擬鹵素，咪唑基，吡咯基，吲哚基等功能基的烴基。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中在式III和IV中，脲嘧啶的五位和8-氮-7-去氮腺嘌呤的七位取代基可為羥甲基，2-羥乙基，3-羥丙基，3-羥基丙炔基，咪唑乙基，咪唑乙烯基，乙酸基，丙酸基，乙酰胺基，丙酰胺基，苯乙基，苯乙炔基等天然氨基酸和非天然氨基酸的側(cè)鏈功能基。
8.權(quán)利要求1的化合物，其中在式I中，當(dāng)B為非天然堿基時，R2和R3可為R1，-X-R1，-NH-R1，-N(R1)2，R1可以相同也可以是不同。
9.在權(quán)利要求1的化合物，其中在式II中，R5與R6，R7與R8，R5與R7，R6與R8，R9/R10與R5/R6，R9/R10與R7/R8之間形成以(-CH2-)n結(jié)構(gòu)相連的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，n為1～4；或與主鏈(N-C-C，或N-C，或C-C)形成含雜原子(O，S，N等)的三至七元環(huán)狀結(jié)構(gòu)，雜原子形成如醚鍵，硫醚鍵等。
10.權(quán)利要求2的化合物，其中在含式V的核酸序列中，當(dāng)B為非天然堿基時，脲嘧啶的五位和8-氮-7-去氮嘌呤的七位取代選自以下基團羥甲基，2-羥乙基，3-羥丙基，3-羥基丙炔基，咪唑乙基，咪唑乙烯基，乙酸基，丙酸基，乙酰胺基，丙酰胺基，苯乙基，苯乙炔基等天然氨基酸和非天然氨基酸的側(cè)鏈功能基；在含式V的核酸序列中，當(dāng)B為非天然堿基時，R12可為O-，OH，S-，SH，Se-，SeH或R1，當(dāng)B為天然堿基或保護的天然堿基時，R12可為R3，但不為O-，OH，S-，SH，Se-，SeH；Y可為O，S，Se等原子。
11.權(quán)利要求2的化合物，其中在含式VI的肽核酸序列中，脲嘧啶的五位和8-氮-7-去氮嘌呤的七位取代基同權(quán)利要求10中的；R4，R5，R6，R7，R8，R9的定義同權(quán)利要求1中的。
12.權(quán)利要求1和/或權(quán)利要求2中的式I，II，III，IV，V或VI化合物或它們的任意組合，作為模擬生物大分子、檢測試劑、疾病診斷和治療藥物應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及核酸及肽核酸衍生物，它們的制備方法，含它們的產(chǎn)品，及它們在醫(yī)藥、生物領(lǐng)域中的用途。
文檔編號A61K31/7068GK1814614SQ20051000730
公開日2006年8月9日 申請日期2005年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月6日
發(fā)明者劉克良, 何軍林, 梁遠(yuǎn)軍, 魏霞, 褚征, 張迪, 徐亮 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所