專利名稱：免疫調節(jié)作為cd80抑制劑的氧代吡唑并噌啉類的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫抑制CD80拮抗劑化合物N-(1-氮雜-二環(huán)[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氫-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺，涉及其制備方法，涉及含有其的組合物、并涉及其在受益于免疫調節(jié)的醫(yī)療癥狀的臨床治療中的應用，所述癥狀例如自身免疫性疾病、類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、糖尿病、哮喘、移植、全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosis)和銀屑病。
背景技術：
免疫系統(tǒng)擁有在免疫應答之中和之后通過各種調節(jié)機制控制在淋巴細胞的激活和失活之間的體內穩(wěn)態(tài)的能力。特異地抑制和/或關閉免疫應答是其中的一種機制。那么，當MHC分子將抗原呈遞到T-細胞受體時，只有存在輔助刺激信號下才能合適地激活T-細胞。不存在這些輔助信號時，淋巴細胞不會激活，同時既會誘導稱為無反應性或耐受性的功能性失活狀態(tài)，T-細胞也會由程序性細胞凋亡而特異性地消除。
一種這樣的輔助刺激信號參與在特化的呈抗原細胞上的CD80與在T-細胞上的CD28之間的相互作用，該信號已證實對全T-細胞激活是必需的(Lenschow等，(1996)Annu.Rev.Immunol.，14，233-258)。因此，需要提供可抑制這種CD80/CD28相互作用的化合物。
我們的待批國際專利申請PCT/GB2004/001008涉及式(I)的化合物以及其藥學或獸醫(yī)學上可接受的鹽、水合物或溶劑合物 式中
R1和R3獨立代表H、F、Cl、Br、-NO2、-CN、任選被F或Cl取代的Ci-C6烷基、或任選被F取代的CrC6烷氧基；R4代表羧酸基團(-COOH)或其酯，或-C(＝O)NR6R7、-NR7C(＝O)R6、-NR7C(＝O)OR6、-NHC(＝O)NR7R6或-NHC(＝S)NR7R6，其中R6代表H，或結構式為-(Alk)m-Q的基團，其中m是0或1，Alk是任選取代的二價直鏈或支鏈d-Ci2亞烷基、或C2-C12亞烯基、或C2-C12亞炔基或二價C3-C12碳環(huán)基，任何這些基團可含有一個或多個-O-、-S-或-N(Re)-鍵，其中R8代表H或C1-C4烷基、C3-C4鏈烯基、C3-C4炔基或C3-C6環(huán)烷基；和Q代表H；-NR9R10，其中R9和R10獨立地代表H、CrC4烷基、C3-C4鏈烯基、C3-C4炔基、C3-C6環(huán)烷基、酯基、任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基，或當Rg和R10與其所連接的N相連時形成一個可任選取代的環(huán)；和R7代表H或CrC6烷基；或當R6和R7與它們所連接的一個或幾個原子組合起來時形成一可任選取代的有5、6或7個環(huán)原子的單環(huán)雜環(huán)；和X代表鍵或結構式為-(Z)n-(Alk)-或-(Alk)-(Z)n-的二價基團，其中Z代表-O-、-S-或-NH-，Alk見與R6有關的定義，n是0或1。
發(fā)明描述本發(fā)明涉及具有上述PCT/GB2004/001008的通式(I)的具體化合物，本發(fā)明提供了式(IA)的化合物N-(1-氮雜-二環(huán)[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氫-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺，及其鹽、水合物和溶劑合物。

連接到苯甲酰氨基的氮上的1-氮雜-二環(huán)[2.2.2]辛-3-基環(huán)系統(tǒng)的碳原子是不對稱的，因此本發(fā)明的化合物以(R)-對映體或(S)-對映體或以(RS)-對映體混合物存在。在結構(IA)和文中其它地方，碳和苯甲酰氨基的氮之間的鍵沒有規(guī)定的方向。這兩種對映體(當然還有混合物)都具有CD80拮抗劑活性，但(R)對映體目前是優(yōu)選的。因此，本發(fā)明包括呈(R)-對映體以及(S)-對映體和(RS)-對映體混合物形式的化合物。
化合物(IA)可以互變體形式存在，如(IB)和(IC) 本發(fā)明包括N-(1-氮雜-二環(huán)[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氫-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺的所有互變體形式，尤其包括式(IA)、(IB)和(IC)的那些。
本發(fā)明的化合物是CD80拮抗劑。它們抑制CD80和CD28之間相互作用從而抑制了T細胞激活，因此調節(jié)了免疫應答。
因此本發(fā)明也包括(i)N-(1-氮雜-二環(huán)[2.2.2]辛-3-基H-(6，9-二氟-S-氧代-i，3-二氫-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺，或其藥學或獸醫(yī)學上可接受的鹽、水合物或溶劑合物，用于治療受益于免疫調節(jié)、尤其受益于免疫抑制的病癥。
(ii)N-(1-氮雜-二環(huán)[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氫-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺或其藥學或獸醫(yī)學上可接受的鹽、水合物或溶劑合物在制造用于治療受益于免疫調節(jié)、尤其受益于免疫抑制的病癥的藥物中的應用。
(iii)一種在包括人類在內的哺乳動物中進行免疫調節(jié)的方法，包括給予需要這種治療的哺乳動物免疫調節(jié)有效劑量的N-(1-氮雜-二環(huán)[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氫-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺或其藥學或獸醫(yī)學上可接受的鹽、水合物或溶劑合物。
(iv)一種藥學或獸醫(yī)學組合物，所述組合物含有N-(1-氮雜-二環(huán)[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氫-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺或其藥學或獸醫(yī)學上可接受的鹽、水合物或溶劑合物以及藥學或獸醫(yī)學上可接受的賦形劑或載體。
受益于免疫調節(jié)的癥狀包括急性彌散性腦脊髓炎腎上腺機能不全變應性脈管炎和肉芽腫病淀粉樣變性病(Amylodosis)強直性脊柱炎哮喘自身免疫阿狄森病自身免疫脫發(fā)自身免疫慢性活動型肝炎自身免疫溶血性貧血自身免疫露得清(Neutrogena)自身免疫血小板減少紫癜(thrombocytopenic purpura)貝切特氏病小腦變性慢性活動型肝炎慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)根神經(jīng)病慢性單克隆丙種蛋白神經(jīng)病典型結節(jié)性動脈周圍炎先天性腎上腺增生寒冰病杜林病糖尿病伊頓-蘭伯特肌無力綜合癥腦脊髓炎獲得性大皰性表皮松解結節(jié)紅斑谷蛋白敏感性腸道病古德帕斯徹氏綜合癥傳染性神經(jīng)元炎淋巴瘤樣甲狀腺炎甲狀腺機能亢進原發(fā)性血色素沉著癥膜性腎小球腎炎分離中樞神經(jīng)系統(tǒng)脈管炎(Isolated vasculitis of the central nervous system)川崎病最小變化腎病(Minimal change renal disease)混雜性脈管炎(Miscellaneous vasculitides)混合結締組織病傳導阻滯的多病灶運動神經(jīng)病(Multifocal motor neuropathy with conduction block)多發(fā)性硬化重癥肌無力視性眼陣攣/肌陣攣綜合癥類天皰瘡天皰瘡惡性貧血多肌炎/皮肌炎傳染后關節(jié)炎(Post-infective arthritides)原發(fā)性肝硬化銀屑病反應性關節(jié)炎(Reactive arthritides)萊特氏病視網(wǎng)膜病類風濕性關節(jié)炎硬化性膽管炎
Sjogren綜合癥全身強直綜合癥亞急性甲狀腺炎全身性紅斑狼瘡全身性壞死性脈管炎(Systemic necrotizing vasculitides)系統(tǒng)性硬皮病(硬皮病)大動脈炎顳動脈炎血栓閉塞性血管炎I型和II型自身免疫多腺綜合癥潰瘍性結腸炎眼色素層炎韋格納肉芽腫病N-(1-氮雜-二環(huán)[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氫-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺的鹽包括生理學可接受的酸加成鹽和堿鹽(base salt)。合適的酸加成鹽由可形成無毒鹽的酸制得。例子包括乙酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、硼酸鹽、右旋樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、乙二苯磺酸鹽、乙苯磺酸鹽(esylate)、甲酸鹽、延胡索酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、六氟磷酸鹽、羥苯酰苯酸鹽、鹽酸鹽/氯化物、氫溴酸鹽/溴化物、氫碘酸/碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硫酸鹽、萘酸鹽(naphthylate)、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、乳清酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、糖二酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽和三氟乙酸鹽。合適的堿鹽由可形成無毒性的鹽的堿制得。其例子包括鋁鹽、精氨酸、雙芐基乙撐二胺、鈣鹽、膽堿、二乙胺、二乙醇胺、甘氨酸、賴氨酸、鎂鹽、甲基葡胺、乙醇胺、鉀鹽、鈉鹽、緩血酸胺和鋅鹽。
如上所述，本發(fā)明包括含有本發(fā)明的化合物及藥學或獸醫(yī)學上可接受的賦形劑或載體的藥學或獸醫(yī)學的組合物。在這樣的組合物中，要了解任何特定病人的具體劑量水平取決于一系列因素，包括所用的具體化合物的活性，年齡，體重，總的健康狀況，性別，飲食情況，給藥時間，給藥途徑，排出率，藥物的組合情況和要接受治療的特定疾病的起因和嚴重性。典型的單劑量范圍為10mg-1000mg。最優(yōu)化的劑量水平和給藥頻率通過臨床試驗確定。
所述化合物可以任何與其藥代動力學性質一致的途徑制備給藥?？诜o藥的組合物的形式可以是藥片、膠囊、粉末、顆粒、錠劑、液體或凝膠制劑，例如口服的、局部的或無菌非腸道的溶液或懸浮液。用于口服的藥片和膠囊可以是單劑形式，并且可以含有常規(guī)的賦形劑，例如粘合劑(例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃蓍膠或聚乙烯吡咯烷酮)；填充劑(例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨醇或甘油)；壓片潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石粉、聚乙二醇或二氧化硅)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉)或可接受的潤濕劑(例如月桂基硫酸鈉)。藥片可以用常規(guī)藥學實踐中公知的方法包衣?？诜囊后w制劑的形式可以是，例如水或油的懸浮液、溶液、乳劑、糖漿或酏劑，或是制成干粉在使用前用水或其它的合適載體重新配制。這樣的液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，例如懸浮劑(例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、葡萄糖糖漿、明膠氫化的可食用油脂)；乳化劑(例如卵磷脂、失水山梨糖醇單油酸酯或阿拉伯膠)；非水載體(可以含有可食用的油)例如杏仁油、分餾的椰油、油酯(例如甘油、丙二醇或乙醇)；防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)，并且如果需要可以加入常規(guī)的調味劑或染色劑。
為局部應用于皮膚，該藥物可以制成霜劑、洗劑或軟膏劑。用于藥物的霜劑或軟膏劑是本領域公知的常規(guī)制劑，例如描述于藥學標準教科書(例如英國藥典)中的。
為局部應用于眼睛，該藥物可在合適的無菌水或非水載體中配制成溶液或懸浮液。其中也可以包括添加劑，例如緩沖液，例如偏亞硫酸氫鈉或依地酸二鈉(disodiumedeate)；防腐劑，包括殺菌劑和殺真菌劑(例如苯基乙酸汞或苯基硝酸汞、氯化芐烷銨或雙氯苯雙胍己烷)；以及增稠劑，例如羥丙甲纖維素(hypromellose)。
活性成份也可在無菌介質中以腸胃外給藥。取決于載體和所使用的濃度，藥物既可懸浮又可溶解在載體中。有利的是，佐劑如局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑也可溶解在載體中。
本發(fā)明的具體上述方式描述于以下非限制性實施例中藥物也可被制成作為鼻或吸入噴霧給藥，或作為粉末吸入。
以下實施例描述了通過一種常規(guī)途徑制備本發(fā)明的化合物。采用標準文獻方法以及通過PCT/GB2004/001008中描述的途徑也可通過其它途徑得到該化合物。
實施例(R)-N-(1-氮雜-二環(huán)r2.2.21辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-dihvdro-吡唑并f4，3-c1噌啉-2-基)-苯甲酰胺的制備在裝有回流冷凝器、磁力攪拌棒和鼓泡器的圓底燒瓶中加入4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氫-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酸(300mg)。加入亞硫酰氯(5ml)并將所得紅色懸浮液在氮氣下加熱回流。加熱時觀察到有氣體生成?；亓?小時后將澄清的紅色溶液冷卻至室溫并在真空下除去過量亞硫酰氯。將混合物蒸發(fā)至干以得到紅色粉末。
將該粉末懸浮液二乙醚(20ml)。將(R)-(+)-3-氨基奎寧環(huán)二鹽酸化物(174mg)與二乙醚(10ml)和乙基-二異丙基-胺(0.566g，0.762ml)混合并加入酰氯懸浮液中。[注意使用3-氨基奎寧環(huán)二鹽酸化物的(S)形式導致制得所需化合物的(S)-對映體]。將所得混合物在氮氣下室溫攪拌。攪拌4天后可檢測出產(chǎn)物峰[M+H]+451以及羧酸原料。
用水(50ml)淬滅反應混合物，固體通過過濾收集并用水洗滌。將該固體與飽和碳酸氫鈉溶液一起研磨，過濾并用水洗滌。然后通過HPLC純化產(chǎn)物得到酰胺。
MSMH+＝451.2NMR(d6 DMSO，500MHz)1.74(m，1H)；1.92(m，2H)；2.14(m，1H)；2.22(m，1H)；2.54(s，1H)；3.24(m，4H)；3.70(t，1H)；4.32(m，1H)；7.42(dt，1H)；7.60(m，1H)；7.99(d，2H)；8.36(d，2H)；8.58(d，1H)；9.58(brs，1H)。
通過下述BIAcore和均相時間分辨熒光(TR-Fret)試驗測試該化合物。結果如下BIAcoreKD＝0.35nMTR-FretEC50＝0.82nMBIAcore生物分子相互作用試驗生物素化的人CD80(hCD80-BT)是膜結合受體分子的重組可溶性形式，它與CD28結合啟動T細胞激活。人們廣泛地研究了CD80與CD28之間的相互作用(Collins等著，2002)。生物素化的人HLA-A2-tax是膜結合受體分子的重組可溶性形式，用在本實施例中作為對照蛋白，并且不期望它與本發(fā)明化合物相互作用。
BIAcore S51TM系統(tǒng)用于篩選上述實施例1-4的化合物。一系列S傳感器芯片CM5接在BIAcore S51TM上。使用標準的胺偶合方法將抗生物素蛋白鏈菌素偶合到羧甲基表面上。芯片表面用0.2M EDC/0.05M NHS激活，接著與抗生物素蛋白鏈菌素(0.25mg/ml，在10mM乙酸鈉中，pH5.0)結合，未占據(jù)的位點用1M乙二胺飽和。
BIAcore S51傳感器芯片有兩個分開的、用于固定蛋白質的傳感器位點。hCD80-BT固定在抗生物素蛋白鏈菌素覆蓋的一個傳感器位點的表面直至觀察到的應答為約3000RU。與化合物非特異結合的對照蛋白固定在第二個傳感器位點上。用于這些試驗的對照蛋白是生物素化的、人類HLA蛋白的可溶性形式。
在運行緩沖液(10mM，pH7.4，150mM NaCl，0.005％P20；5％DMSO)中配制一系列化合物的稀釋溶液(1000nM-0.05nM)。
BIAcore S51TM使用運行緩沖液以流速30μl/分鐘運行。注射入化合物和用于校正溶劑效應影響的數(shù)據(jù)的DMSO標準溶液。自動記錄數(shù)據(jù)并使用BIAcore S51評估軟件分析。
參考文獻Collins AV等，(2002)Immunity 17，201-210“再訪問的輔刺激分子的相互作用特性”(The interaction property of costimulatory molecules revisited)均相時間分辨熒光試驗上述的實施例進行無細胞的均相時間分辨熒光(HT-Fret)試驗測試來確定其作為CD80-CD28相互作用的抑制劑的活性。
在試驗中，銪和別藻藍蛋白(APC)與CD28和CD80間接相連(通過抗體接頭)形成復合物，該復合物使銪和APC靠近來產(chǎn)生信號。該復合物包括以下6種蛋白熒光標記1，接頭抗體1，CD28融合蛋白，CD80融合蛋白，接頭抗體2和熒光標記2。下表更詳細地描述了這些試劑。
在復合物的形成中，銪和APC靠近并產(chǎn)生信號。
通過用小鼠Fab片段(C215)替代CD80-小鼠的Fab片段融合蛋白(1.9μg/ml)來測量非特異性相互作用。試驗在黑色384孔板中進行，終體積為30μl。試驗緩沖液為50mM的Tris-HCl，150mM的NaCl，pH7.8，含有在使用前加入的0.1％的BSA(w/v)。
濃度為100μM-1JnM的化合物加入上述試劑。反應于室溫孵育4小時。使用WallacVictor 1420多功能計數(shù)儀進行雙重測量。第一次測量激發(fā)340nm，發(fā)射665nm，滯后50μs，窗口時間200μs。第二次測量激發(fā)340nm，發(fā)射615nm，滯后50μs，窗口時間200μs。計數(shù)值做熒光交叉、終止和背景的自動校正。
權利要求
1.N-(1-氮雜-二環(huán)[2.2.2]辛-3-基)-4-(6，9-二氟-3-氧代-1，3-二氫-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺，或其鹽、水合物或溶劑合物。
2.如權利要求1所述的化合物，其為(R)-對映體形式。
3.一種藥學或獸醫(yī)學組合物，所述組合物含有權利要求1或權利要求2所述的化合物以及藥學或獸醫(yī)學上可接受的賦形劑或載體。
4.如權利要求1或權利要求2所述的化合物，其用于治療受益于免疫調節(jié)的病癥。
5.權利要求1或權利要求2所述的化合物在制造用于治療受益于免疫調節(jié)的病癥的藥物中的用途。
6.一種在包括人類在內的哺乳動物中進行免疫調節(jié)的方法，所述方法包括給予需要這種治療的哺乳動物免疫調節(jié)有效劑量的權利要求1或權利要求2所述的化合物。
7.如權利要求4所述使用的化合物、如權利要求5所述的用途或如權利要求6所述的方法，其中，所述免疫調節(jié)是免疫抑制。
8.如權利要求4所述使用的化合物、如權利要求5所述的用途或如權利要求6所述的方法，其中，所述病癥是自身免疫性疾病、類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、糖尿病、哮喘、移植、全身性紅斑狼瘡或銀屑病。
全文摘要
N－(1－氮雜－二環(huán)[2.2.2]辛－3－基)4－(6，9－二氟－3－氧代－1，3－二氫－吡唑并[4，3－c]噌啉－2－基)－苯甲酰胺是CD80拮抗劑，可用于治療能受益于免疫抑制的疾病。
文檔編號A61P17/06GK1997645SQ200480043756
公開日2007年7月11日 申請日期2004年8月9日 優(yōu)先權日2004年8月9日
發(fā)明者I·R·馬修斯 申請人:阿維德克斯有限公司