專利名稱：光敏劑和噬菌體的軛合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有光敏劑和噬菌體(bacteriophage)的軛合物的組合物，特別是被認(rèn)為是葡萄球菌噬菌體(staphylophage)的葡萄球菌的噬菌體。本發(fā)明還涉及所述軛合物在感染性疾病的光動力學(xué)治療的方法中的用途。
背景技術(shù)：
由于許多種病原細(xì)菌的抗生素耐藥性的快速顯現(xiàn)，對抗細(xì)菌感染的抗菌劑的作用日益變得無效。這種病原體之一是金黃色葡萄球菌(S.aureus)，它的特性是引起諸如癤、癰、膿皰病的皮膚感染，以及痤瘡、燒傷和傷口的感染。如果感染有機體是毒性菌株，那么例如感染或集落化的棉塞可以產(chǎn)生被認(rèn)為是中毒性休克綜合征的有生命威脅的毒血癥。有機體也可以從這些感染或者從諸如靜脈導(dǎo)管的外來物中進入血流，并引起諸如心內(nèi)膜炎、骨髓炎、腦膜炎和肺炎的這些其它位置的感染。
許多細(xì)菌能夠?qū)е缕つw和傷口的感染，例如，凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase-negative staphylococci)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、鏈球菌(streptococci)、棒狀桿菌屬(corynebacterium spp.)、大腸桿菌(E.coli)、產(chǎn)氣克雷伯桿菌(Klebsiella aerogenes)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)、擬桿菌屬(Bacteroides spp.)、綠濃假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和消化鏈球菌屬(Peptostreptococcusspp.)。這些細(xì)菌日益顯示出對抗生素治療的耐藥性。
特別地，金黃色葡萄球菌的耐藥菌株已經(jīng)出現(xiàn)。在1961年第一次報告了甲氧苯青霉素(Methicillin)耐藥的金黃色葡萄球菌(MRSA)(Jevons，M.(1961)British Medical Journal，1，124-5)，現(xiàn)在這些菌株成為全世界醫(yī)院獲得性感染的主要原因，并在很多護理和居住地中流行。其引起了明顯的感染，并且每年在英國有數(shù)百病人的發(fā)病率，這對衛(wèi)生保健是一種令人擔(dān)憂的挑戰(zhàn)(Ayliffe等，J Hosp Infect(1988)，39，253-90)。
自從第一次報告了MRSA，已經(jīng)證明這些有機體已經(jīng)對很多種抗菌劑產(chǎn)生耐藥性，這些抗菌劑包括紅霉素、氨基糖苷類、四環(huán)素類、三甲氧芐二氨嘧啶、磺胺類和氯霉素。MRSA菌株已經(jīng)發(fā)展為僅僅對單種臨床提供的抗生素敏感了諸如萬古霉素(vancomycin)和替考拉寧(teicoplanin)的糖肽類。但是，抗藥性發(fā)展至此，現(xiàn)在已經(jīng)報告有對萬古霉素有耐藥性的菌株(Hiramatsu，K.(1998)，American Journal ofMedicine，104，7S-10S)。這些菌株被稱為VRSA(耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌)和異-VRSA(暴露在高水平的萬古霉素后而產(chǎn)生的耐藥性菌株)。目前，對MRSA感染的病人的處理通常包括抗菌劑的給藥，但情況仍然是，有發(fā)展為對許多所使用的藥劑的耐藥性的證據(jù)。
由于對所有現(xiàn)有的抗菌素基本耐藥的菌株的出現(xiàn)，MRSA現(xiàn)在已成為健康的嚴(yán)重威脅。目前，術(shù)語MRSA本身更精確地用在甲氧苯青霉素和多種抗菌素耐藥的金黃色葡萄球菌。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些MRSA菌株不僅在醫(yī)院內(nèi)部而且在醫(yī)院之間迅速傳播。這些菌株已經(jīng)被稱為流行性MRSA(EMRSA)。自從1981年報告了第一株EMRSA菌株(EMRSA-1)以來，已經(jīng)鑒別出17種不同的EMRSA，它們?nèi)慷紝Χ喾N抗菌素具有耐藥性。最近，兩種最流行的菌株是EMRSA-15和EMRSA-16，它們占已報告的30000種MRSA分離菌的60-70％(Livermore，D(2000)Int.J.Antimicrobial Agents，16，S3-S10)。重要的是，MRSA菌株(被稱為社區(qū)獲得的MRSA(CA-MRSA))已經(jīng)開始在社區(qū)中傳播，即，在非就醫(yī)的個體之間。
從以上所述，很顯然，迫切需要對抗細(xì)菌感染，特別是MRSA感染的替代方法。
一種方法是使用光活性劑獲得使有機體致死的光敏作用。這涉及用可光活化的化學(xué)藥品(光敏劑)處理有機體，在適合波長的光的照射下，該化學(xué)藥品會產(chǎn)生引起溶菌作用的細(xì)胞毒性物質(zhì)。在體外使用甲苯胺藍(lán)O(TBO)和二磺酸鋁酞菁(AlPcS2)作為光敏劑，這種技術(shù)已經(jīng)用于達到殺滅廣譜的包括金黃色葡萄球菌和MRSA的細(xì)菌。光敏劑和激光都不能單獨起到殺菌的作用(Wilson等，(1994)J AntimicrobChemother 33，619-24)。在隨后的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)16株EMRSA菌株在AlPcS2的存在下容易被低劑量的紅光(674nm)殺滅(Griffiths等，(1997)J Antimicrob Chemother，40，873-6)。在更高的光照劑量下，可達到100％殺滅。
光動力學(xué)治療(PDT)是這種方法在疾病治療中的應(yīng)用。它是治療腫瘤中確立的程序并成為消毒血液產(chǎn)品手段的基礎(chǔ)?，F(xiàn)在，已經(jīng)評價了PDT對治療感染的應(yīng)用。例如，與氬激光器聯(lián)合的血卟啉已經(jīng)用于治療多種神經(jīng)外科手術(shù)后感染和腦膿腫(Lombard等，(1985)，腫瘤與其它疾病的光動力治療(Photodynamic Therapy of Tumours and otherDiseases)，Jori & Perria出版)。一個有關(guān)于感染性疾病的PDT的潛在的問題是它缺乏特異性。因此，如果宿主細(xì)胞以及目標(biāo)有機體同時結(jié)合或攝取光敏劑，接下來的照射也可以導(dǎo)致宿主細(xì)胞的死亡?？朔@種問題的一種方法是通過使用靶向化合物即任何一種能特異結(jié)合到病原體表面的化合物。
已表明，幾種靶向化合物當(dāng)軛合到光敏劑時，它們能夠成功地去除細(xì)菌的特異菌株。例如，免疫球蛋白G(IgG)已經(jīng)用于靶向金黃色葡萄球菌蛋白A(Gross等(1997)，Photochemistry and Photobiology，66，872-8)?？寡例l卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)脂多糖的單克隆抗體(Bhatti等(2000)，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，44，2615-8)和抗牙齦卟啉單胞菌與粘放線菌(Actinomyces viscosus)的多聚-L-賴氨酸肽(Soukos等(1998)，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，42，2595-2601)。通過右旋糖苷鏈軛合到光敏劑錫(IV)綠素e6(SnCe6)的單克隆抗體選擇性地殺滅在630nm波長照射的綠濃假單胞菌(P.aeruginosa)，而金黃色葡萄球菌未受影響(Friedberg等(1991)，AnnN Y Acad Sci，618，383-393)。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)使用軛合到SnCe6的IgG來靶向EMRSA菌株1、EMRSA菌株3、EMRSA菌株15和EMRSA菌株16(Embleton等(2002)，J Antimicrob Chemother，50，857-864)。與單獨使用光敏劑比較，達到了更高水平的殺滅，并且在與血鏈球菌(Streptococcus sanguis)的混合物中選擇性地殺滅EMRSA菌株。IgG的局限在于僅能靶向表達蛋白A的金黃色葡萄球菌。因此，亟需能靶向任何金黃色葡萄球菌菌株的選擇性的靶向劑。
噬菌體是感染某些細(xì)菌的病毒，經(jīng)常使細(xì)菌的細(xì)胞溶解并因此引起細(xì)胞死亡。噬菌體已被客觀地建議用作抗菌劑。但是，在金黃色葡萄球菌疾病的治療中使用葡萄球菌的噬菌體(稱為葡萄球菌噬菌體)的一個問題是他們限制了宿主的范圍。盡管有能溶解許多種金黃色葡萄球菌菌株的多價抗菌素，可是其它的菌株還是有耐藥性，因此單獨的噬菌體并不能提供殺滅所有金黃色葡萄球菌菌株的有效方法。
已知，盡管一些噬菌體僅僅殺滅有限范圍的細(xì)菌，可它們會結(jié)合較廣譜的細(xì)菌。本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些噬菌體可以用作光敏劑的有效的靶向傳輸系統(tǒng)。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)將噬菌體連接到光敏劑時，用合適波長的光照射時，所形成的光敏劑-噬菌體軛合物會高效地殺滅細(xì)菌。
噬菌體-光敏劑軛合物能被用來治療或預(yù)防很廣范圍的皮膚和傷口的細(xì)菌感染。最常見的從皮膚和傷口感染分離的有機體有凝固酶陰性葡萄球菌，金黃色葡萄球菌，鏈球菌，例如化膿性鏈球菌(Streptoccocus pyogenes)、棒狀桿菌屬、大腸桿菌、產(chǎn)氣克雷伯桿菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、痤瘡丙酸桿菌、桿菌屬、綠濃假單胞菌和消化鏈球菌屬。
特別地，光敏劑和葡萄球菌噬菌體軛合物可以用于抗葡萄球菌屬(Staphylococci spp.)的菌株的光動力學(xué)治療的方法，特別是抗MRSA、EMRAS、VRSA、異-VRSA和CA-MRSA。
本發(fā)明提供了組合物，其包括連接到噬菌體而形成光敏劑-噬菌體軛合物的光敏化合物(光敏劑)。該噬菌體可以是葡萄球菌的噬菌體，并且優(yōu)選是能結(jié)合到金黃色葡萄球菌，特別是MRSA、EMRAS、VRSA、異-VRSA或CA-MRSA的葡萄球菌噬菌體。所述組合物可以用在光動力學(xué)治療的方法中。
所述噬菌體優(yōu)選使用共價鍵連接到所述光敏劑，該光敏劑和/或該噬菌體包含或可以被修飾為包含利用化學(xué)或光反應(yīng)試劑共價交聯(lián)的基團，從而產(chǎn)生交聯(lián)鍵，例如硫醇-硫醇交聯(lián)、胺-胺交聯(lián)、胺-硫醇交聯(lián)、胺-羧酸交聯(lián)、硫醇-羧酸交聯(lián)、羥基-羧酸交聯(lián)、羥基-硫醇交聯(lián)以及它們的組合的交聯(lián)鍵。
所述光敏劑可合適地選自卟啉(例如血卟啉衍生物、次卟啉)、酞菁(例如鋅、硅和鋁酞菁)、綠素類(例如錫綠素e6、錫綠素e6的多聚賴氨酸衍生物、間-四羥基苯綠素、苯并卟啉衍生物、錫本紫紅素)、菌綠素類、吩噻嗪類(例如甲苯胺藍(lán)、亞甲藍(lán)、二甲基亞甲藍(lán))、吩嗪(例如中性紅)、吖啶類(例如吖啶黃、原黃素、吖啶橙、氨吖啶)、德卟啉類、花菁類(例如部花菁540(merocyanine 540))、蒽環(huán)類(例如阿霉素和表阿霉素)、脫鎂葉綠甲脂酸類、sapphyrins類(五齒芳香族大環(huán)類)、富勒烯、鹵化咕噸類(例如孟加拉玫瑰紅)、苝醌顏料(例如金絲桃菌、竹紅菌素)、gilvocarcins類、叔噻吩類、苯并菲啶類、補骨脂素類和核黃素類。
本發(fā)明使用上述軛合物殺滅細(xì)菌，為了獲得更有效地抗特定感染細(xì)菌的軛合物，可以根據(jù)欲殺滅的特定有機體來選擇用于軛合物的噬菌體。在優(yōu)選的實施方案中，感染細(xì)菌是MRSA、EMRAS、VRSA、異-VRSA或CA-MRSA，并且軛合物包括葡萄球菌的噬菌體75或噬菌體φ11。
盡管有更多的實施例，但下面的表1僅示出了一些細(xì)菌-噬菌體配對的例子。更為新型的噬菌體可以被分離和/或用于目標(biāo)細(xì)菌?？梢酝ㄟ^使用單價噬菌體、多價噬菌體或者單價噬菌體的組合或者單價與多價噬菌體的組合，按照需要改變治療的特異性。
表1

本發(fā)明的組合物合適地含有至少0.01μg/ml的光敏劑，優(yōu)選至少0.02μg/ml，更優(yōu)選至少0.05μg/ml直至200μg/ml，優(yōu)選最高至100μg/ml，更優(yōu)選最高至50μg/ml。所述組合物中所述噬菌體的合適的量為1×105-1×1010pfu，優(yōu)選為1×106-1×109pfu，更優(yōu)選1×106-1×108pfu。
本發(fā)明的組合物還包含二價離子源，例如Ca2+或Mg2+，優(yōu)選Ca2+。例子包括氯化鈣、碳酸鈣和氯化鎂，所述離子合適的含量為5-200mM，優(yōu)選5-15mM，更優(yōu)選約10mM。
所述組合物還可以包含一種或多種選自緩沖劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、抗氧化劑、防腐劑、膠凝劑和再礦化劑的成分。
本發(fā)明進一步提供了殺滅細(xì)菌的方法，其包括，(a)用本發(fā)明的組合物接觸欲處理的區(qū)域，以至于在所述區(qū)域的任何細(xì)菌結(jié)合到所述光敏劑-噬菌體軛合物；和(b)用能被光敏劑吸收的波長的光照射所述區(qū)域。
合適的細(xì)菌在上述表1中列出，優(yōu)選金黃色葡萄球菌，更優(yōu)選MRSA、EMRAS、VRSA、異-VRSA或CA-MRSA。
在本發(fā)明的方法中，可以使用任何發(fā)射適當(dāng)波長的光源。選擇光的波長相應(yīng)于所述光敏劑的吸收最大值并且具有有效的能量來活化該光敏劑。所述光源可以是能產(chǎn)生單色或多色光的任何設(shè)備或生物系統(tǒng)。例子包括激光、發(fā)光二極管、弧光燈、鹵素?zé)?、白熾燈或生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光的發(fā)射器。在某種環(huán)境下，太陽光也可以是合適的。優(yōu)選地，由所述光源發(fā)射的光波長可以為200-1060nm，優(yōu)選400-750nm。合適的激光可以有1-100mW的功率并且光束直徑為1-10mm。用于激光照射的合適的激光的光劑量為5-333Jcm-2，優(yōu)選5-30Jcm-2。對于白光照射，合適的劑量為0.01-100kJ/cm2，優(yōu)選0.1-20kJ/cm2，更優(yōu)選3-10kJ/cm2，合適的照射持續(xù)時間為1秒-15分鐘，優(yōu)選1-5分鐘。
以下光源可以合適地用于本發(fā)明氦氖(HeNe)氣體激光器(633nm)氬激發(fā)染料激光器(500-700nm，5W輸出)銅蒸汽激發(fā)染料激光器(600-800nm)受激準(zhǔn)分子激發(fā)染料激光器(400-700nm)金蒸汽激光器(628nm，10W輸出)可調(diào)固態(tài)激光器(532-1060nm)，包括Sd:YAG發(fā)光二極管(LED)(400-800nm)二極管激光器(630-850nm，25W輸出)，例如鎵硒砷化物鎢絲燈鹵素冷光源熒光燈。
在本發(fā)明的方法中，所述組合物合適在藥物可接受的含水載體中呈溶液或懸浮液的形式，但也可以為諸如粉末或凝膠，軟膏或乳劑的固態(tài)。所述組合物可以通過搽擦、撒、噴霧或其它常用技術(shù)用于感染區(qū)域。
本發(fā)明進一步提供所述組合物用于治療人體或動物體的用途，該組合物適當(dāng)?shù)靥峁┝嗽谥委熡杉?xì)菌感染引發(fā)的狀態(tài)的用途，特別是被葡萄球菌所感染，更特別是被MRSA、EMRAS、VRSA、異-VRSA或CA-MRSA所感染。
本發(fā)明可以用于治療細(xì)菌感染，特別是被葡萄球菌所感染，更特別是被MRSA、EMRAS、VRSA、異-VRSA或CA-MRSA所感染，從而可以治療或預(yù)防諸如癤、癰、乳腺炎和膿皰病的皮膚感染，可以治療或預(yù)防痤瘡、燒傷或傷口的感染，或者可以治療或預(yù)防起因于細(xì)菌感染的心內(nèi)膜炎、骨髓炎、腦膜炎和肺炎，可以治療或預(yù)防由于使用導(dǎo)管、植入物或其它醫(yī)療設(shè)備所引起的感染，或者可以預(yù)防手術(shù)后例如剖腹產(chǎn)的感染。
本發(fā)明也可以用于預(yù)防通過載體的細(xì)菌的傳輸，該載體本身，如果有，幾乎不出現(xiàn)癥狀。


圖1顯示了噬菌體75-SnCe6軛合物對不同的EMRSA菌株的效果。
圖2顯示了軛合物、非軛合物、僅有光敏劑或僅有噬菌體且存在或沒有照射對EMRSA-16和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的效果。
圖3至圖5顯示了本發(fā)明改變光劑量對EMRSA-16和金黃色葡萄球菌8325-4的效果。
圖6顯示了使用固定濃度的φ11-SnCe6軛合物時光劑量對EMRSA-16的效果。
圖7顯示了本發(fā)明對于VRSA(Mu3)菌株、異-VRSA(Mu50)和CA-MRSA(MW2)的效果。
圖8顯示了本發(fā)明對于化膿性鏈球菌的效果。
圖9顯示了本發(fā)明對于痤瘡丙酸桿菌的效果。
實施例材料和方法制備以下培養(yǎng)液營養(yǎng)肉湯2(NB2)培養(yǎng)液通過將25g營養(yǎng)肉湯2(Nutrient Broth 2)(Oxoid)(10.0g/lLab-Lemco粉末，10.0g/l胨，5.0g/l NaCl)加入到1升去離子蒸餾水而制成1升培養(yǎng)液?；旌虾?，該培養(yǎng)液在121℃高壓滅菌15分鐘。
胰化胨大豆酵母肉湯培養(yǎng)液(TSY)通過將39g胰化胨大豆肉湯(Tryptone Soya Broth)(Oxoid)(17.0g/l酪蛋白胰消化物，3.0g/l豆粕的papaic消化物，2.5g/l葡萄糖，2.5g/l二堿基磷酸鉀，5.0g/l NaCl)和0.5％酵母提取物(9.8g/l總氮，5.1g/l氨基氮，0.3g/l NaCl)加入到1升去離子蒸餾水而制成1升培養(yǎng)液，混合后，該培養(yǎng)液在121℃高壓滅菌15分鐘。
營養(yǎng)肉湯2頂層瓊脂將0.35％(w/v)的細(xì)菌學(xué)瓊脂(Agar Bacteriological)(瓊脂1號，AgarNo.1，Oxoid)加入到NB2培養(yǎng)液，經(jīng)過混合，該培養(yǎng)液在121℃高壓滅菌15分鐘。
營養(yǎng)肉湯2底層瓊脂將0.7％(w/v)的細(xì)菌學(xué)瓊脂(Agar Bacteriological)加入到NB2培養(yǎng)液，經(jīng)過高壓滅菌，加入10mM CaCl2(在1升NB2中含10ml 1MCaCl2)。
哥倫比亞血液瓊脂(CBA)將37.1g哥倫比亞瓊脂基(Columbia Agar Base，Oxoid)(23.0g/l特種胨，1.0g/l淀粉，5.0g/l NaCl，10.0g/l瓊脂)加入到1升去離子蒸餾水，高壓滅菌后，讓液體瓊脂在室溫中冷卻直至可以操作，然后加入5％(v/v)去纖維蛋白的馬血液(E &O Laboratories，Scotland)。
甘露醇鹽瓊脂(MSA)將111g甘露醇鹽瓊脂(Oxoid)(75.0g/l NaCl，10.0g/l甘露醇，1.0g/lLab-Lemco粉末，10.0g/l胨，0.025g/l酚紅，15.0g/l瓊脂)加入到1升去離子蒸餾水。
全部混合物在121℃高壓滅菌15分鐘。然后將液體瓊脂傾倒入培養(yǎng)板中，覆蓋并冷卻過夜。
目標(biāo)有機體用于實施例中的有機體如下所示，給出了名稱和NCTC(英國國家典型培養(yǎng)物保藏中心，National Collection of Type Cultures，UK)或ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，American Type Culture Collection，USA)的保藏號感染性的甲氧苯青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌(EMRSA)-1(NCTC11939)(EMRSA)-3(NCTC 13130)(EMRSA)-15(NCTC 13142)(EMRSA)-16(NCTC 13143)Mu3(ATCC 700698)，是一種具有對萬古霉素異源耐藥性的抗甲氧苯青霉素金黃葡萄球菌(MRSA)菌株，被設(shè)計為異源抗萬古霉素金黃葡萄球菌(異-VRSA)(Hanaki等(1998)，J.Antimicrob.Chemother.42199-209)Mu50，是典型的VRSA菌株(Hiramatsu等(1997)，J.Antimicrob.Chemother.40135-136)MW2是社區(qū)獲得的MRSA菌株。社區(qū)獲得的MRSA菌株(CA-MRSA)在其基因組中的共有葡萄球菌盒染色體mec(staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)IV型，經(jīng)常是有毒的，并且主要引起皮膚和軟組織感染。原型CA-MRSA菌株的基因序列MW2已經(jīng)顯示了附加毒性因子的存在而不是平常地存在于其它的金黃色葡萄球菌菌株(Baba等(2002)，Lancet.25；359(9320)1819-27)。
表皮葡萄球菌(NCTC 11047)化膿性鏈球菌(ATCC 12202)痤瘡丙酸桿菌(ATCC 29399)
金黃色葡萄球菌8324-5(Novick(1967)Virology 33；156-166)通過在CBA上每周的亞培養(yǎng)來維持所有的菌株。
噬菌體噬菌體75(Public Health Laboratory Service，UK)是血清組F葡萄球菌噬菌體，能感染EMRSA-16，EMRSA-3并微弱感染EMRSA-15。
噬菌體φ11(Iandolo et al，(2002)，Gene 289(1-2)；109-118)是一種血清組B的溫和噬菌體，φ11是具有低的溶原化作用頻率的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。它感染包括很多人和動物病原體的金黃色葡萄球菌細(xì)胞溶解組III菌株。
噬菌體繁殖在15ml Falcon試管中加入中指數(shù)(mid-exponential)的EMRSA-16(300μl)，將大約105pfu噬菌體75加入到該試管并且讓其在室溫下培養(yǎng)30分鐘使該噬菌體感染所述的細(xì)菌。將9ml冷卻的熔化的頂層NB2瓊脂(含10mMCaCl2)加入到該試管中，然后將混合物傾倒在未干的NB2基質(zhì)瓊脂培養(yǎng)板上，將該培養(yǎng)板在37℃培養(yǎng)過夜。
第二天早晨將含10mMCaCl2的1ml NB2加到每個培養(yǎng)板中，將含液體培養(yǎng)液的頂層瓊脂刮入到一個小的離心管中。然后將收集到的瓊脂在4℃在15000rpm的離心機中旋轉(zhuǎn)15分鐘。收集上清液并通過0.45μm(Nalgene)的過濾器以除去任何細(xì)菌細(xì)胞。得到的噬菌體75的溶液在4℃下儲存。
噬菌體沉淀進行噬菌體沉淀以純化繁殖后的從NB2培養(yǎng)液得到的噬菌體75。向5ml的NB2中的噬菌體75，加入1.3ml 5M NaCl(1M的最終濃度)和0.2ml 1x磷酸鹽緩沖液(PBS)(8.0g/l NaCl，0.2g/l KCl，1.15g/lNa2HPO4，0.2g/l KH2PO4)，并將20％的PEG(聚乙二醇8000，Sigma)加入到該溶液中慢慢攪拌過夜直至完全溶解。然后將該溶液放在冰上過夜然后第二天早上將該溶液在4℃以8000rpm離心20分鐘，除去上清液，留下的粒狀物再次懸浮在2.5ml 1x PBS，并通過0.45μm的過濾器過濾。
光敏劑所使用的光敏劑是錫(IV)綠素e6(SnCe6)(Frontier Scientific，Lancashire，英國)，在633nm波長有光活性。
軛合物的制備在攪拌下將2mg SnCe6溶解在800μl的活性緩沖液中(0.1MMES(2-(N-嗎啉(乙基磺酸)(Sigma))，0.5M NaCl，pH5.5)，制得EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)鹽酸碳二亞胺)(Sigma)溶液(1ml活性緩沖液中含4mg)和S-NHS(N-羥磺基琥珀酰亞胺)(Fluka)溶液(250μl活性緩沖液中含2.7mg)。
對溶解的SnCe6，加入200μl溶解的EDC和S-NHS，該混合物在攪拌下在室溫放置1至4小時來提供穩(wěn)定的氨反應(yīng)中間產(chǎn)物。由于SnCe6是一種光敏試劑，因此用鋁箔將該混合物覆蓋。通過加入1.4μlβ-巰基乙醇(Sigma)反應(yīng)終止。
使用1∶1∶2.5摩爾比的SnCe6∶EDC∶S-NHS的反應(yīng)物進行實驗。
通過加入0.7ml 1M NaOH將SnCe6反應(yīng)混合物的pH值中和到7.0，然后將1.5ml噬菌體加到氨反應(yīng)溶液中使該噬菌體上的氨基與SnCe6的羧基反應(yīng)，接著混合4至16小時，該反應(yīng)用2.5μl的乙醇胺(Sigma)終止。
如以上噬菌體沉淀中所述的，在通過沉淀兩次光敏劑-噬菌體軛合物(PS-噬菌體)的軛合作用之后將PS-噬菌體從單體PS中分離，接著針對PBS透析PS-噬菌體。
在以下的實施例中，噬菌體75的濃度是7.3×106pfu/ml，SnCe6/噬菌體-SnCe6的濃度為1.5μg/ml。
激光器所使用的激光器是采用輸出功率為35mW的127型Stabilite氦-氖(He-Ne)激光器(Spectra Physics，美國)，激光器以直徑1.25mm的平行光束、633nm的波長照射。
實施例1將在中指數(shù)生長期的EMRSA-16的培養(yǎng)物稀釋到1×107cfu/ml，接著與磁力攪拌棒一起將該已稀釋的細(xì)菌的幾個20μl樣品放入96孔培養(yǎng)板(Nunc)的孔中。
將上述制備的100μl噬菌體75-SnCe6軛合物和10mM的最終濃度的氯化鈣(CaCl2)加入到該細(xì)菌中，將孔中的內(nèi)容物在室溫下伴隨攪拌孵育5分鐘。通過將100μl 1xPBS加入到細(xì)菌中實施為對照，并用作試驗樣品的參考，試驗重復(fù)一次。
孵育后，所述孔中的內(nèi)容物伴隨著攪拌直接暴露到相應(yīng)于能量密度為21J/cm2的激光中5分鐘，將鋁箔放入周圍的孔中使任何泄漏的激光均反射回目標(biāo)孔中，對照為沒有激光照射。
所述激光暴露后，立刻從每個孔中取出100μl的樣品，并在1.5mlEppendorf試管中在1ml TSY中從10-1到10-4進行系列稀釋，接著將每個稀釋液的50μl等分試樣放于并展開在一半的CBA培養(yǎng)皿上，該培養(yǎng)皿放置在37℃的培養(yǎng)箱中過夜。第二天早晨計數(shù)活存數(shù)量，在四組數(shù)值間取平均數(shù)并乘以適當(dāng)?shù)南♂屜禂?shù)，并進行繪圖分析。
7.3×106pfu/ml的噬菌體1.5μg/ml的SnCe6/噬菌體發(fā)現(xiàn)超過99.9％的EMRSA-16被殺滅。
實施例2用EMRSA-1代替EMRSA-16重復(fù)實施例1，發(fā)現(xiàn)99.98％的細(xì)菌被殺滅。
實施例3用EMRSA-3代替EMRSA-16重復(fù)實施例1，發(fā)現(xiàn)超過99.99％的細(xì)菌被殺滅。
實施例4用EMRSA-15代替EMRSA-16重復(fù)實施例1，發(fā)現(xiàn)超過99.99％的細(xì)菌被殺滅。
實施例5用表皮葡萄球菌代替EMRSA-16重復(fù)實施例1，發(fā)現(xiàn)超過99.99％的細(xì)菌被殺滅。
實施例1-5的結(jié)果顯示在圖1中。
實施例6用EMRSA-16和表皮葡萄球菌各10μl代替EMRSA-16的20μl的樣品重復(fù)實施例1，將樣品放在MBA板來上計數(shù)。
7.3×106pfu/ml的噬菌體1.5μg/ml的SnCe6/噬菌體2.1J/cm2的激光發(fā)現(xiàn)在該混合培養(yǎng)物中超過99.99％的兩種細(xì)菌菌株被殺滅。
對比實施例首先在沒有軛合物且沒有進行激光照射，第二用SnCe6光敏劑并且用激光照射，以及第三用噬菌體75且沒有進行激光照射，重復(fù)實施例。
實施例6和對比實施例的結(jié)果如圖2所示。
這些實施例顯示，所述軛合物高效地殺滅了所試驗的所有EMRSA菌株。由于噬菌體75僅能感染EMRSA-15和EMRSA-16，這說明該噬菌體能成功地結(jié)合到不能感染的菌株上，因此噬菌體75可作為靶向劑。然后被附著的光敏劑依靠激光照射而影響殺滅細(xì)菌。
單獨用表皮葡萄球菌和與MRSA的混合物均能獲得顯著的殺傷，說明該噬菌體也結(jié)合到無關(guān)的葡萄球菌菌株上。所述噬菌體75-SnCe6軛合物可用于多種葡萄球菌感染。
實施例7使用抗金黃色葡萄球菌的φ11-SnCe6軛合物和激光源的靶向光動力學(xué)治療除了將金黃色葡萄球菌菌株8325-4用作繁殖菌株以外，按照以上噬菌體75所述將噬菌體φ11繁殖并進行沉淀。用上面描述的方法將錫綠素e6(SnCe6)軛合到葡萄球菌噬菌體φ11上，獲得了2.3和3.5μgml-1的SnCe6與4.7×107pfu ml-1的噬菌體的結(jié)合濃度。接著這些φ11-SnCe6軛合物與多種金黃色葡萄球菌進行孵育并用35mW的HeNe激光器(21J/cm2)以633nm的波長照射5分鐘，軛合的SnCe6的最終濃度是1.15μg ml-1。
結(jié)果顯示，5分鐘的照射后，φ11-SnCe6軛合物得到了對金黃色葡萄球菌8325-4(相對于在磷酸鹽緩沖溶液中的對照計算)的92.33％的殺滅率，同時相應(yīng)濃度(1.15μg ml-1)的SnCe6沒有獲得任何殺滅。結(jié)果如圖3所示。
我們還證明盡管在嚴(yán)格的最佳的條件下φ11僅能感染有機體(EMRSA-16)的抗甲氧苯青霉素菌株，但這個φ11-SnCe6軛合物可有效地對抗這種菌株，獲得了88.11％的殺滅率。對照試驗的范圍諸如沒有光敏劑的光照(L+S-)，沒有光照的光敏劑(L-S+)，和1×107pfu ml-1的未共扼的噬菌體(L-S-)，沒有產(chǎn)生明顯的殺滅。結(jié)果如圖4所示。
在鈣(10mM)的存在下通過增加光劑量到10分鐘，使用φ11-SnCe6軛合物(1.75μg ml-1)，我們得到抗金黃色葡萄球菌8325-4的99.88％的殺滅。結(jié)果如圖5所示。
對于圖3至圖5，加入光敏劑(或者SnCe6或者φ11-SnCe6)得到1.15μg ml-1(相對于SnCe6)的終濃度。光源是35mW的氦/氖激光器，在圖3和圖4的情況下照射(使用照射時)5分鐘，在圖5的情況下照射10分鐘。
研究改變光劑量對用SnCe6-噬菌體φ11軛合物獲得的殺滅的效果。除了用氦/氖激光器以1分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘和30分鐘的不同的時間照射細(xì)菌懸浮液外，按照上述方式進行試驗。在每種情況下，φ11-SnCe6軛合物的濃度(最終濃度等于3.5μg ml-1的SnCe6)是相同的。
在黑暗中用φ11-SnCe6軛合物對有機體孵育60分鐘對活存計數(shù)沒有明顯作用。但是，當(dāng)φ11-SnCe6軛合物存在下用激光照射懸浮液，伴隨著更長的照射時間可以獲得更大的殺滅，用30分鐘的照射時間，獲得了活存計數(shù)的減少接近99.9999％使用φ11-SnCe6給出了3.5μg ml-1的最終濃度(相對于SnCe6)，光源是35mW的氦/氖激光器并照射(當(dāng)使用照射時)1分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘和30分鐘。結(jié)果如圖6所示。
在圖3-6中SnCe6＝錫綠素e6φ11-SnCe6＝錫綠素e6軛合到噬菌體φ11上PBS＝磷酸鹽緩沖液L+S+＝在軛合物存在下照射的細(xì)菌L+S-＝在沒有軛合物時照射的細(xì)菌L-S+＝在沒有光照下存在軛合物的細(xì)菌L-S-＝在沒有光照和軛合物時的細(xì)菌實施例8使用噬茵體75-錫(IV)綠素e6軛合物和白光源對金黃色葡萄球菌致命的光敏作用細(xì)菌菌株金黃色葡萄球菌8325-4EMRSA-16光源KL200(Schott)，這是20瓦鹵素冷光源，附加到其上的光導(dǎo)向是柔性的光纖維束，其以5cm距離引導(dǎo)到96孔培養(yǎng)板上。4孔的正方形放置在光源的中心。
近似的光強度＝44,000勒克斯(lux)或470μW/nm按照上面所述將噬菌體75軛合到SnCe6上，使用的噬菌體的濃度為1×107pfu/ml。
對在營養(yǎng)液中生長過夜的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物進行離心，再懸浮在PBS中并在600nm處將OD值調(diào)節(jié)到0.05(近似于4×107cfu/ml)。
將50μl的細(xì)菌培養(yǎng)物等份加入96孔培養(yǎng)板中并將50μl的如下一種溶液加入該孔中1)在PBS中的3.5μg/ml SnCe6-噬菌體75(最終濃度1.75μg/ml，1×106pfu/孔)2)在PBS中的1.75μg/ml SnCe6-噬菌體75(最終濃度0.875μg/ml，5×105pfu/孔)3)在PBS中的3.5μg/ml SnCe6(最終濃度1.75μg/ml)4)在PBS中的1.75μg/ml SnCe6(最終濃度0.875μg/ml)5)PBS6)在PBS中的濃度為5×105或1×106pfu/孔的噬菌體75這些孔或者用白光(一次4個孔)照射，或者用錫箔包上儲存在黑暗中。
多種的照射時間后，從每孔中取出等份，系列稀釋并展開到哥倫比亞血液瓊脂上，將瓊脂培養(yǎng)皿在37℃孵育過夜，第二天進行計數(shù)。
結(jié)果表2金黃色葡萄球菌8325-4

EMRSA-16


％殺滅率-這是與用PBS孵育的細(xì)菌并保持在黑暗中比較而計算出的。
所有結(jié)果都是重復(fù)試驗的平均數(shù)。
對照包括用SnCe6、噬菌體75-SnCe6和噬菌體75孵育的細(xì)菌而沒有進行白光照射。噬菌體75也進行白光照射。
所有的對照都有細(xì)菌計數(shù)，它與未加入光敏劑和未進行照射的對照懸浮液沒有明顯地不同。
實施例9對金黃色葡萄球菌菌株Mu3、Mu50和MW2進行進一步試驗，向金黃色葡萄球菌(Mu3和Mu50)的抗萬古霉素菌株或社區(qū)獲得的MRSA(MW2)菌株的懸浮液，加入鹽溶液、噬菌體75、SnCe6或噬菌體75-SnCe6并用氦/氖激光器以35mW照射樣品。
所使用的SnCe6的濃度為1.5μg/ml，噬菌體濃度為5.1×107噬菌區(qū)形成單位/ml，光能劑量為21J/cm2。柱上的數(shù)字表示相對于僅加入鹽溶液的樣品的有機體的％殺滅率。結(jié)果如圖7所示。
實施例10使用錫綠素e6(SnCe6)對化膿性鏈球菌的致死光敏作用在37℃、含有5％CO2的空氣氣氛中，化膿性鏈球菌ATCC12202在腦心灌注液(Brain Heart Infusion broth)中生長。通過離心法收集細(xì)胞并再懸浮在磷酸鹽緩沖液(PBS)中并稀釋到在PBS中的1×107cfu/ml。接著將20μl稀釋了的細(xì)菌懸浮液的樣品與磁力攪拌棒一起放入96孔培養(yǎng)板中的孔中。將在PBS中的100μl不同濃度(1-50μl/ml)的SnCe6加入細(xì)菌懸浮液，對照為加入到細(xì)菌的100μlPBS且或者照射(L+S-)或者保持在黑暗中(L-S-)，重復(fù)該試驗一次。
孵育后，伴隨著攪拌，一些孔中的內(nèi)容物用具有633nm波長的發(fā)射光的35mW的氦/氖激光器照射10分鐘，相應(yīng)的能量密度為42J/cm2。將鋁箔放在周圍的孔中使任何泄漏的激光反射回目標(biāo)孔中。對照孔沒有進行激光照射。
用激光照射后，立刻從每個孔中取出100μl樣品并在1.5mlEppendorf試管中在1ml TSY中從10-1到10-5進行系列稀釋，接著將每個稀釋液的兩份50μl的等份試樣展開在一半的CBA培養(yǎng)皿上，該培養(yǎng)皿放置在37℃的細(xì)菌培養(yǎng)箱中至多48小時，計數(shù)得到的菌落以確定活存有機體的數(shù)量。
隨著SnCe6濃度的增長在黑暗中孵育的有機體活存計數(shù)沒有明顯地受到影響。沒有光敏劑也沒有用激光照射有機體。但是在SnCe6存在下對有機體的照射產(chǎn)生了依賴于濃度的存活計數(shù)降低。用50μl/ml的光敏劑的濃度獲得了99.9997％的有機體的殺滅率。結(jié)果如圖8所示。在圖8中L+(空心柱)＝在沒有SnCe6存在但有各種濃度光敏劑存在下用激光照射的培養(yǎng)物；L-(陰影柱)＝在沒有SnCe6存在但有各種濃度光敏劑存在下在黑暗中孵育的培養(yǎng)物。
實施例11使用錫綠素e6(SnCe6)對痤瘡丙酸桿菌的致死光敏作用在37℃、厭氧氣氛中，痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)ATCC 29399在預(yù)先還原的腦心灌注液中生長。通過離心法收集細(xì)胞并再次懸浮在磷酸鹽緩沖液(PBS)中并在PBS中稀釋到1×108cfu/ml。接著將20μl稀釋了的細(xì)菌懸浮液的樣品與磁力攪拌棒一起放入96孔培養(yǎng)皿中的孔中。將在PBS中的100μl不同濃度(1-50μl/ml)的SnCe6加入細(xì)菌懸浮液，對照為加入到細(xì)菌的100μl PBS且或者照射(L+S-)或者保持在黑暗中(L-S-)，該試驗進行兩次。
孵育后，伴隨著攪拌，用具有633nm波長發(fā)射光的35mW的氦/氖激光器照射一些孔中的內(nèi)容物10分鐘，相應(yīng)的能量密度為42J/cm2。將鋁箔放在周圍的孔中使任何泄漏的激光反射回目標(biāo)孔中。對照孔沒有進行激光照射。
用激光照射后，立刻從每個孔中取出100μl樣品并在1.5mlEppendorf試管中在1ml預(yù)先還原的TSY中從10-1到10-5進行系列稀釋，接著將每個稀釋液的兩份50μl的等份試樣展開在一半的CBA培養(yǎng)皿上，該培養(yǎng)皿在37℃厭氧孵育，計數(shù)得到的菌落以確定活存有機體的數(shù)量。
隨SnCe6濃度的增加在黑暗中孵育的有機體的成活計數(shù)沒有明顯地受到影響。沒有使用光敏劑也沒有用激光照射有機體。但是在SnCe6存在下對有機體的照射產(chǎn)生了依賴于濃度的存活計數(shù)的降低。用50μl/ml的光敏劑的濃度獲得了100％的有機體的殺滅率。結(jié)果如圖9所示。在圖9中，L+(空心柱)＝在沒有SnCe6存在但有各種濃度光敏劑存在下用激光照射的培養(yǎng)物；L-(暗影柱)＝在沒有SnCe6存在但有各種濃度光敏劑存在下在黑暗中孵育的培養(yǎng)物。
實施例12TBO和噬菌體的軛合物的制備將1mg甲苯胺藍(lán)O(TBO)與0.4mg EDC、0.6mg S-NHS和200μl噬菌體(5×107pfu/ml)溶解在800μl的活性緩沖液中(0.1M MES，0.5MNaCl，pH5.5)。在加入1.4μl 2-巰基乙醇中和EDC之后，在攪拌下反應(yīng)進行15到30分鐘，反應(yīng)再進行2至4小時，之后加入羥胺達到10mM的最終濃度終止反應(yīng)。
通過兩次噬菌體沉淀并接著用PBS透析，將TBO-噬菌體軛合物從游離的TBO分離。
權(quán)利要求
1.組合物，其含有光敏劑和噬菌體的軛合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述噬菌體是葡萄球菌噬菌體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述光敏劑共價地連接到所述噬菌體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的組合物，其中所述光敏劑選自卟啉類、酞菁類、綠素類、菌綠素類、吩噻嗪類、吩嗪類、吖啶類、德卟啉、菁族、蒽環(huán)類、脫鎂葉綠甲脂酸類、sapphyrins類、富勒烯、鹵化咕噸類、苝醌顏料、gilvocarcins類、叔噻吩類、苯并菲啶類、補骨脂素類和核黃素類。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述光敏劑是錫(IV)綠素e6(SnCe6)。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的組合物，其中所述噬菌體選自噬菌體53、75、79、80、83、φ11、φ12、φ13、φ147、φMR11、48、71、φ812、SK311、φ131、SB-I、U16、C1、SF370.1、SP24、SFL、A1、ATCC 12202-B1、f304L、φ304S、φ15、φ16、782、P1c1r100KM、P1、T1、T3、T4、T7MS2、P1、M13、UNL-1、ACQ、UT1、tbalD3、E79、F8、pf20B3、F116、G101、B86、T7M、ACq、UT1、BLB、PP7、ATCC 29399-B1和B40-8。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述噬菌體是噬菌體75或噬菌體φ11。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的組合物，其中所述光敏劑的濃度為0.01-200μg/ml。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的組合物，其中所述噬菌體的濃度為1×105-1×1010pfu/ml。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的組合物，其中還包含Ca2+離子源，優(yōu)選氯化鈣。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的組合物，其在藥物可接受的載體中呈溶液的形式。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的組合物，其中所述組合物還包含緩沖劑、鹽、抗氧化劑、防腐劑、膠凝劑或再礦化劑中的一種或多種。
13.殺滅細(xì)菌的方法，包括(a)用上述權(quán)利要求任一項所述的組合物接觸欲處理的區(qū)域，從而使任何存在的細(xì)菌結(jié)合到所述的光敏劑-噬菌體軛合物；且(b)用被所述光敏劑吸收的波長的光照射所述區(qū)域。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述細(xì)菌是葡萄球菌、特別是MRSA、EMRAS、VRSA、異-VRSA或CA-MRSA。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述的光是激光或白光。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述激光來自于氦氖氣體激光器。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述激光具有200-1060nm的波長。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任一項所述的方法，其中所述激光器具有1-100mW的功率以及1-10mm的光束直徑。
19.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述激光照射的光劑量為5-333Jcm-2。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述白光的光劑量為0.01-100kJ/cm2。
21.根據(jù)權(quán)利要求15-20中任一項所述的方法，其中所述照射的持續(xù)時間為1秒至15分鐘。
22.根據(jù)權(quán)利要求13-21中任一項所述的方法，其中存在于被處理的所述區(qū)域內(nèi)或上面的所述組合物的濃度為0.00001-1％w/v。
23.權(quán)利要求1-12中任一項所述的組合物的用途，是用于治療人體或動物體。
24.權(quán)利要求1-12中任一項所述的組合物在治療細(xì)菌感染的藥物制備中的用途。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的用途，其中所述細(xì)菌感染是金黃色葡萄球菌，特別是MRSA、EMRAS、VRSA、異-VRSA或CA-MRSA。
26.在光動力學(xué)治療(PDT)中噬菌體作為靶向劑的用途。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的用途，其中所述噬菌體是葡萄球菌噬菌體。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的組合物，其基本上是實施例中所描述的。
29.根據(jù)權(quán)利要求13-22中任一項所述的方法，其基本上是實施例中所描述的。
30.根據(jù)權(quán)利要求23-27中任一項所述的用途，其基本上是實施例中所描述的。
全文摘要
本發(fā)明提供含有光敏劑和噬菌體的軛合物的組合物，該軛合物可用于在光動力學(xué)治療的靶向方法中殺菌，特別是MRSA、EMRAS、VRSA、異－VRSA或CA－MRSA菌株。
文檔編號A61K47/48GK1867357SQ200480029625
公開日2006年11月22日 申請日期2004年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月9日
發(fā)明者邁克爾·威爾遜, 肖恩·奈爾 申請人:Ucl 生物醫(yī)學(xué)公共有限公司