專利名稱：：發(fā)光的鑭系(Ⅲ)螯合物、螯合劑及其衍生的軛合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一組新的螯合劑、新的螯合物、由所述螯合物或螯合劑標(biāo)記的生物分子，以及與所述螯合物、螯合劑或標(biāo)記的生物分子軛合的固體載體。
背景技術(shù)：
：本文中用于闡明發(fā)明背景的出版物和其他材料，尤其是用于為實(shí)踐提供額外的詳細(xì)細(xì)節(jié)的示例都結(jié)合進(jìn)來作為參考。在檢測中通過將使用期長的發(fā)射性鑭系(III)螯合物標(biāo)記或探針與時(shí)間_分辨熒光測定法結(jié)合使用，提供了一種產(chǎn)生靈敏的生物親和力試驗(yàn)的方法。事實(shí)上，基于鑭系(III)螯合物的時(shí)間-分辨熒光法已經(jīng)成為一種成功的檢測技術(shù)，而且其用在體外診斷中已經(jīng)有20多年了。人們已經(jīng)將以能量從鑭系(III)螯合物至非熒光淬滅劑的轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)的時(shí)間-分辨熒光淬滅試驗(yàn)應(yīng)用于不同的水解酶試驗(yàn)以及核酸檢測試驗(yàn)中。銪、鋱、鏑和釤螯合物的不同的光化學(xué)性質(zhì)甚至能夠使人們開發(fā)出多參數(shù)的同系試驗(yàn)。穩(wěn)定的發(fā)光鑭系(III)螯合物由具有反應(yīng)性基團(tuán)的、用于與生物活性分子共價(jià)軛合的配體，吸收激發(fā)能并將其轉(zhuǎn)移至鑭系離子的芳族結(jié)構(gòu)，和另外的螯合基團(tuán)，例如羧酸或膦酸結(jié)構(gòu)部分和胺組成。與有機(jī)發(fā)色團(tuán)不同，這些分子不經(jīng)受Raman散射或聚集淬滅。這樣就可以實(shí)現(xiàn)多標(biāo)記化和開發(fā)出含有若干個(gè)光吸收結(jié)構(gòu)部分的螯合物。發(fā)光的鑭系(III)螯合物必須滿足若干個(gè)要求a)所述分子在基態(tài)和激發(fā)態(tài)必須都是光化學(xué)穩(wěn)定的，b)所述分子必須是動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的，c)所述分子必須是化學(xué)穩(wěn)定的，d)激發(fā)波長必須盡可能高，優(yōu)選高于330nm，e)所述分子在激發(fā)波長處必須具有高激發(fā)系數(shù)，f)從配體至中心離子的能量轉(zhuǎn)移必須有效，g)發(fā)光的衰變時(shí)間必須長，h)所述螯合物應(yīng)該易溶于水，i)所述生物活性分子在與鑭系螯合物偶合之后必須保留其親和力。人們進(jìn)行了許多努力以調(diào)諧適用于時(shí)間_分辨熒光計(jì)應(yīng)用的螯合物標(biāo)記的光物理性質(zhì)。這些包括例如，由吡啶衍生物組成的穩(wěn)定的螯合物[US4，920，195，US4，801，722，US4，761，481'US4，459'186，EP0770610]、雙妣啶[US5，216，134]、三妣啶[US4，859，777，US5，202，423，US5，324，825]，或者作為能量介導(dǎo)基團(tuán)的各種酚化合物[US4，670，572，US4，794，191]，和作為螯合部分的多聚羧酸。此外，還公開了各種二羧酸酯衍生物[US5，032，677，US5，055，578，US4，772，563]、大環(huán)穴狀化合物[US4，927，923，EP493745A]和大環(huán)Schiff堿[EP369000]。據(jù)顯示，以連接于三個(gè)苯基乙炔基吡啶基發(fā)色團(tuán)上的1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷為基礎(chǔ)的銪(III)螯合物具有良好的發(fā)光性質(zhì)其發(fā)光產(chǎn)率(e①)顯著高于由單發(fā)色團(tuán)構(gòu)成的螯合物[Helv.Chim,Acta，1996，79，789];而且其動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定性也高。但是，所公開的螯合物不適用于生物分子的衍生，因?yàn)槠淙鄙佘椇纤璧姆磻?yīng)性基團(tuán)。此外，乙炔基還易于發(fā)生光致褪色，這在基于熒光顯微鏡術(shù)的應(yīng)用中尤其會(huì)產(chǎn)生問題。所述炔基還可能與體外試驗(yàn)所需的添加劑，尤其是高度親核的疊氮化物離子發(fā)生反應(yīng)。后來，通過用呋喃基和三甲氧基苯基亞單元取代苯基乙炔基以分別產(chǎn)生發(fā)光的銪和釤以及鋱和鏑螯合物而解決了上述問題[US專利申請11/004，061;US專利申請10/928，143]。公開的氮雜大環(huán)仍具有一些缺點(diǎn)芳族發(fā)色團(tuán)降低了其在水中的溶解性。而且，呋喃基衍生物的激發(fā)最大值僅僅稍高于300nm;在研發(fā)更簡單和更廉價(jià)的檢測儀器并且降低背景發(fā)光信號的顯著性的同時(shí)，較高的激發(fā)波長是人們所希望的。此外，生物材料，例如核酸和芳族氨基酸吸收較短的波長。人們還提出了連接于長波敏化劑上的氮雜大環(huán)，例如芳族雜環(huán)[例如，US6，344，360，W02006/039505,W02007/055700，J.Chem.Soc.PerkinTrans2，2002，348]。但是，這類螯合物的發(fā)射光譜通常裂分為若干個(gè)峰。進(jìn)而這樣又導(dǎo)致問題a)如果必須在例如多標(biāo)記試驗(yàn)中使用窄的濾波器，則量子產(chǎn)額相對較低，b)在以時(shí)間-分辨熒光能轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)的應(yīng)用中，額外的發(fā)射帶會(huì)產(chǎn)生背景信號，c)強(qiáng)的長波發(fā)射線限制NIR受體的使用。雖然有機(jī)螯合劑及其取代基對鑭系(III)螯合物的光物理性質(zhì)具有顯著影響，但是在對這些影響進(jìn)行估計(jì)時(shí)并沒有可用的一般規(guī)則。US4，761，4S1中已經(jīng)提出，在被芳族結(jié)構(gòu)部分的苯基和萘基取代的2，6-[N，N-二(羧基烷基)氨基烷基]吡啶中，釋放電子的取代基對其與鑭系離子的螯合物的光物理性質(zhì)具有有利的影響。但是其并未給出試驗(yàn)證據(jù)。后來，據(jù)顯示對于各種鋱(III)和鏑(III)螯合物而言是這種情況[US專利申請11/004，061]，但是相應(yīng)的銪(III)螯合物實(shí)際上是不發(fā)光的[Heomiil&等人，J.Biochem.Biophys.Methods,1993，26，283]。此夕卜，與US4，761，481中提出的情況相反，據(jù)顯示在芳族結(jié)構(gòu)部分中具有釋放電子的氨基取代基的鑭系螯合物具有低量子產(chǎn)額[Takalo等人，Helv.Chim.Acta,1993，76，877]。在若干種應(yīng)用中，需要的是螯合物與生物活性分子的共價(jià)軛合。最通常的是使生物活性分子的氨基或巰基與標(biāo)記物的異硫氰酸、馬來酰亞胺或N-羥基琥珀酰亞胺衍生物在溶液中反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)[Fichna，J.，Janecka，A.，BioconjugateChem.，2003，14，3]。由于在幾乎所有的生物分子標(biāo)記中，反應(yīng)都是采用過量的活化標(biāo)記來進(jìn)行的，因此費(fèi)力的純化步驟是不可避免的。尤其地，如果需要連接若干個(gè)標(biāo)記分子，或者在若干反應(yīng)性類似的官能團(tuán)存在下如果需要位置-特定的標(biāo)記，則對希望的生物分子軛合物進(jìn)行分離和表征都非常困難，且實(shí)際上通常是不可能的。所述生物分子軛合物被用在許多應(yīng)用，例如同系淬滅試驗(yàn)中，這種軛合物必須非常純，因?yàn)榧词股倭康臒晒怆s質(zhì)也會(huì)顯著提高發(fā)光背景和降低檢測靈敏度。因此，非常希望將生物分子軛合在固相上，這是因?yàn)橥ㄟ^洗滌方式可以除去大部分雜質(zhì)而生物分子仍舊固定在固體載體上，而且一旦將其釋放在溶液中，則僅需要一種色譜純化法。大生物分子，例如蛋白質(zhì)的溶液相標(biāo)記是不可避免的。在這些情況下，標(biāo)記反應(yīng)必須是選擇性的，而且生物分子軛合物的純化必須是盡可能有效的。發(fā)明目的和概述在本發(fā)明中，據(jù)觀察具有呋喃基吡啶基亞單元的鑭系螯合物的光物理性質(zhì)可以被呋喃環(huán)上的供電子取代基所調(diào)節(jié)。進(jìn)而螯合物的水溶性可以被所述呋喃環(huán)上的羧酸或磺酸官能增強(qiáng)。采用相應(yīng)的噻吩衍生物也可以實(shí)現(xiàn)同樣的效果。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供可用于標(biāo)記在時(shí)間_分辨熒光光譜學(xué)中用作探針的生物分子的螯合劑及其鑭系螯合物，其中發(fā)色團(tuán)包含至少一個(gè)被呋喃基或噻吩基取代的吡啶基，其中所述呋喃基或噻吩基被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的供電子基團(tuán)取代，并且任選地被羧酸或磺酸基，或所述酸的酯、酰胺或鹽取代。本發(fā)明的一個(gè)方面提供具有不同的螯合鑭系離子的發(fā)熒光的螯合物。本發(fā)明的一個(gè)方面提供適用于在溶液中標(biāo)記生物分子的螯合物或螯合劑。另一個(gè)目的是提供適用于在于固相上進(jìn)行合成的同時(shí)標(biāo)記低聚肽、低聚核苷酸和其他分子的螯合物和螯合劑。另一個(gè)目的是提供用本發(fā)明的螯合物和螯合劑標(biāo)記的生物分子和固體載體。因此，根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種螯合物，其包含-鑭系離子，1^3+-包含一個(gè)或多個(gè)芳族單元的發(fā)色結(jié)構(gòu)部分，其中至少一個(gè)所述芳族單元為被呋喃基或噻吩基取代的吡啶基，其中所述呋喃基或噻吩基被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的供電子基團(tuán)取代，并且任選地被羧酸或磺酸基，或所述酸G的酯、酰胺或鹽取代，其中所述發(fā)色結(jié)構(gòu)部分彼此直接相連接而形成三聯(lián)吡啶基，或者彼此通過環(huán)狀或非環(huán)狀的含N烴鏈相連接，-包含至少兩個(gè)羧酸或膦酸基團(tuán)，或者所述酸的酯、酰胺或鹽的螯合部分，所述螯合部分直接或者通過環(huán)狀或非環(huán)狀的含N烴鏈與發(fā)色結(jié)構(gòu)部分的芳族單元連接，禾口-直接或者通過連接體L連接于發(fā)色結(jié)構(gòu)部分或螯合部分上的反應(yīng)性基團(tuán)A，所述反應(yīng)性基團(tuán)A使得能夠與固相上的生物分子或官能團(tuán)結(jié)合。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種螯合劑，其包含-包含一個(gè)或多個(gè)芳族單元的發(fā)色結(jié)構(gòu)部分，其中至少一個(gè)所述芳族單元為被呋喃基或噻吩基取代的吡啶基，其中所述呋喃基或噻吩基被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的供電子基團(tuán)取代并且任選地被羧酸或磺酸酯或所述酸G'的酰胺取代，其中所述發(fā)色結(jié)構(gòu)部分彼此直接相連接而形成三聯(lián)吡啶基，或者彼此通過環(huán)狀或非環(huán)狀的含N烴鏈相連接，-包含至少兩個(gè)羧酸或膦酸基團(tuán)，或者所述酸的酯或酰胺的螯合部分，所述螯合部分直接或者通過環(huán)狀或非環(huán)狀的含N烴鏈與發(fā)色結(jié)構(gòu)部分的芳族單元連接，禾口-直接或者通過連接體L連接于發(fā)色結(jié)構(gòu)部分或螯合部分上的反應(yīng)性基團(tuán)A，所述反應(yīng)性基團(tuán)A使得能夠與固相上的生物分子或官能團(tuán)結(jié)合。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種與本發(fā)明的螯合物或螯合劑軛合的生物分子。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種與本發(fā)明的螯合物、螯合劑或標(biāo)記的生物分子軛合的固體載體。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種標(biāo)記的低聚肽或有機(jī)分子，其是通過在固相上于低聚肽合成器上，將適當(dāng)?shù)母鶕?jù)本發(fā)明的螯合劑引入到低聚肽結(jié)構(gòu)中，之后脫保護(hù)以及任選地引入金屬離子而合成得到的。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明涉一種標(biāo)記的低聚核苷酸，其是通過在固相上于低聚肽合成器上，將適當(dāng)?shù)母鶕?jù)本發(fā)明的螯合劑引入到低聚核苷酸結(jié)構(gòu)中，之后脫保護(hù)以及任選地引入金屬離子而合成得到的。發(fā)明詳述定義如本文中定義的，"供電子基團(tuán)"指烷基和烷氧基。烷基可以為直鏈或支鏈的，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基和仲丁基。烷氧基可以為直鏈或支鏈的，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基和仲丁氧基。如果吸電子基團(tuán)與呋喃或噻吩環(huán)之間被一個(gè)或多個(gè)亞甲基分隔，則供電子基團(tuán)還可以連接在所述吸電子基團(tuán)，如羥基、羧酸和磺酸基上。螯合物具有下述結(jié)構(gòu)的螯合劑和基于其上的金屬螯合物是新的發(fā)色結(jié)構(gòu)部分為包含一個(gè)或多個(gè)被呋喃基或噻吩基取代的吡啶基的二價(jià)芳族結(jié)構(gòu)，其中所述呋喃基或噻吩基具有另外的取代基。被呋喃基或噻吩基取代的吡啶基能夠吸收光或能量，將激發(fā)能轉(zhuǎn)移至螯合的鑭系離子中，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光。除了被呋喃基或噻吩基取代的吡啶基或多個(gè)這樣的基團(tuán)之外，發(fā)色單元還可以包含未取代的吡啶基、含有其他取代基的吡啶基和/或其他芳族基團(tuán)。在合成策略中使用例如，3-(二羥基硼烷基)呋喃或3-(二羥基硼烷基)噻吩衍生物分別代替2-(二羥基硼烷基)呋喃或2-(二羥基硼烷基)噻吩衍生物作為試劑，則可以通過其C2原子，或者通過其C3原子將所述呋喃基或噻吩基連接在吡啶環(huán)上。在本文的具體實(shí)施例所闡明的化合物中，吡啶基的4-位具有呋喃或噻吩取代基。吡啶環(huán)的其他位置也可用于取代。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述發(fā)色結(jié)構(gòu)部分包含1、2或3個(gè)吡啶基，其中至少其中之一被呋喃基或噻吩基取代，其中所述呋喃基或噻吩基被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的供電子基團(tuán)所取代。在特殊的實(shí)施方案中，所述供電子基團(tuán)為直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基和仲丁基。所述吡啶基可以彼此直接相連接而形成三聯(lián)吡啶基。可選地，所述吡啶基可以通過含N的烴鏈彼此相連接。所述含N烴鏈可以為環(huán)狀或非環(huán)狀的。在特殊的實(shí)施方案中，所述含N烴鏈為環(huán)狀的。本發(fā)明的包含3個(gè)發(fā)色結(jié)構(gòu)部分并且其中的發(fā)色結(jié)構(gòu)部分通過環(huán)狀含N烴鏈彼此相連接的化合物，例如基于氮雜冠醚的化合物適用于以能量轉(zhuǎn)移或淬滅為基礎(chǔ)的試驗(yàn)，這是因?yàn)樵谄浒l(fā)射譜中615nm附近處的峰是主要的。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，發(fā)色結(jié)構(gòu)部分包含1、2或3個(gè)羧酸或磺酸基團(tuán)，或所述酸G的酯、酰胺或鹽。所述羧酸或磺酸基團(tuán)提高了所述螯合物的水溶性。其還可以用于將所述螯合物共價(jià)或非共價(jià)偶合在生物活性分子和固體載體上。為了使螯合劑或螯合物共價(jià)結(jié)合在生物分子或固體載體上，所述螯合劑或螯合物必須包含反應(yīng)性基團(tuán)A。但是，還存在無需這種共價(jià)結(jié)合的應(yīng)用。本發(fā)明的螯合化合物還可以用在無需螯合物中具有反應(yīng)性基團(tuán)的應(yīng)用中。這種技術(shù)的一個(gè)例子例如在Blomberg等人的J.ImmunologicalMethods,1996，193，199中進(jìn)行了說明。無需其中具有反應(yīng)性基團(tuán)A的另一個(gè)例子是嗜曙紅細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞的分離[W02006/072668]。在這種應(yīng)用中，帶正電和帶負(fù)電的螯合物分別與帶負(fù)電和帶正電的細(xì)胞表面相結(jié)合。其中無需連接體的再一個(gè)例子是簡單地使螯合物膨脹至聚合物中而制備高度發(fā)光的小球[例如，Soukka等人，Anal.Chem.，2001，73，2254]。雖然在許多應(yīng)用中，原則上反應(yīng)性基團(tuán)A應(yīng)該直接連接在發(fā)色基團(tuán)或者螯合部分上，但是出于空間原因人們希望在反應(yīng)性基團(tuán)A和發(fā)色基團(tuán)或螯合部分之間分別具有連接體L。所述連接體L還可以通過酰胺鍵連接在羧酸或磺酸基團(tuán)G上。在應(yīng)當(dāng)將所述螯合物用在固相合成低聚肽和低聚核苷酸的情況下，所述連接體特別重要，但標(biāo)記的生物分子在溶液中時(shí)其也是人們所希望的。14根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，連接體L由l-10個(gè)結(jié)構(gòu)部分形成，每個(gè)結(jié)構(gòu)部分選自亞苯基、含有1-12個(gè)碳原子的亞烷基、乙炔二基(-CeC-)、乙烯二基(-C=C-)、醚(-0-)、硫醚(-S-)、酰胺(-C0-NH-，-CO-NR'-，-NH-C0-和-NR'-C0-)、羰基(-C0-)、酯(-C00-和-00C-)、二硫化物(-SS-)、磺酰胺(_S02-NH-，_S02_NR'-)、砜(_S02_)、磷酸酯(-O-PO廠O-)、二氮雜(-N=N-)，和叔胺，其中R'表示含有少于5個(gè)碳原子的烷基。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述反應(yīng)性基團(tuán)A選自異硫氰酸酯、溴代乙酰胺基、碘代乙酰胺基、馬來酰亞胺基、4，6-二氯-l，3，5-三嗪-2-基氨基、吡啶基二硫基、硫酯、氨基氧基、疊氮化物、酰肼、氨基、炔、聚合基團(tuán)，和羧酸和?；栈蚱浠钚怎?。在微米顆?；蛘呒{米顆粒的制備過程中，如果螯合物或者螯合劑應(yīng)當(dāng)與所述顆粒相連，則所述反應(yīng)性基團(tuán)A為可聚合基團(tuán)，例如甲基丙烯酰基。欲聚合為顆粒的鑭系螯合物必須能夠溶于有機(jī)溶劑。從本發(fā)明的螯合物結(jié)構(gòu)中刪除羧酸或磺酸基團(tuán)G可以增強(qiáng)該特性。此外，這樣可以將第三個(gè)供電子基團(tuán)引入到所述螯合物的呋喃基或噻吩亞單元中。如果使用銅(I)催化的Huisgen-Sharpless偶極[2+3]環(huán)加成反應(yīng)將所述螯合物或螯合劑連接在包括納米材料、生物分子和各種有機(jī)分子的固體載體上，則反應(yīng)性基團(tuán)A必須為疊氮化物或端炔。已經(jīng)提出[US5，985，566]，使用與鉑衍生物連接的標(biāo)記分子可以滿意地轉(zhuǎn)化低聚核苷酸、DNA、RNA、低聚肽、蛋白質(zhì)和脂類。在核酸中，這些分子主要在鳥嘌呤殘基的N7位上反應(yīng)。在這種情況下，反應(yīng)性基團(tuán)A為HNNHA-Pt、其中A'為裂解配體，如Cl、(CH3)2S0、H2(^PN03?；鶊F(tuán)A-L-可以以不同方式連接在分子上。其可以連接于螯合部分、將芳族單元連接在一起的含N鏈，或者芳族單元上。在最后提及的那種情況下，基團(tuán)A-L-直接或者通過羧酸或磺酸衍生物G連接于呋喃或噻吩取代基上。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述螯合的金屬離子1^3+為銪(ni)、釤(ni)、鋱(in)或鏑(III)。在特殊的實(shí)施方案中，所述螯合的金屬離子Ln3+為銪(III)和釤(III)。示例性的本發(fā)明的特殊螯合物為下列結(jié)構(gòu)15<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中W和f為相同和不同的供電子基團(tuán)，L、G、R'和A如上述定義，對于呋喃基和噻吩基而言Z分別為0和S。在特殊的實(shí)施方案中，所述螯合物選自下列結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其中R1和R2為相同或不同的供電子基團(tuán)，L、G禾PA如上述定義，對呋喃基和噻吩基而言Z分別為O和S。用于合成肽的螯合劑根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的螯合劑適用于合成低聚肽。在該應(yīng)用中，反應(yīng)性基團(tuán)A通過連接體L與螯合劑相連，A為羧酸或其鹽、?；u或酯或氨基酸殘基-(^(朋13)14，其中R3為暫時(shí)的保護(hù)基，R4為羧酸或其鹽、?；u或酯。示例性的螯合劑為下列結(jié)構(gòu)其中R、I^、L和Z如上述定義，A為羧酸或其鹽、酰基鹵或酯或氨基酸殘基-CH(NHR3)R、其中R3為暫時(shí)的保護(hù)基，R4如之前的定義為羧酸或其鹽、酰基鹵或酯，A為羧酸或其鹽、?；u或酯或氨基酸殘基-CH(NHR"R、其中RS為選自Fmoc(芴基甲氧基羰基)、Boc(叔丁氧基羰基)或Bsmoc(l，l-二氧代苯并[b]噻吩-2-基甲氧基羰基)的暫時(shí)的保護(hù)基，W為羧酸或其鹽、?；u或酯，R〃為烷基酯或烯丙基酯，R〃'為烷基且G'為羧酸或磺酸酯或酰胺。在特殊的實(shí)施方案中，所選螯合劑為下列結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>其中R1、R2、L、G'和Z如之前的定義，A為羧酸或其鹽、?；u和酯和氨基酸殘基-(^(朋13)14，其中R3為暫時(shí)的保護(hù)基，R4為羧酸或其鹽、?；u和酯，且其中R3為選自Fmoc(荷基甲氧基羰基)、Boc(叔丁氧基羰基)或Bsmoc(l，l-二氧代苯并[b]噻吩_2_基甲氧基羰基)的暫時(shí)的保護(hù)基，R〃為羧酸的烷基酯或烯丙基酯，G'為羧酸或磺酸酯或酰胺。在肽合成器的幫助下可以將螯合劑引入到生物分子中?？梢栽诨罨瘎┐嬖谙聦Ⅱ蟿┡己现吝B接有氨基的固體載體或固定的氨基酸上。當(dāng)縮合步驟完成時(shí)，選擇性地除去標(biāo)記試劑的暫時(shí)的氨基保護(hù)基，而物質(zhì)仍舊連接至固體載體上(例如，在Fmoc-保護(hù)基的情況下用哌啶)。然后，按照上述方式使螯合劑或其他試劑(例如，適當(dāng)保護(hù)的氨基酸、類固醇、半抗原或有機(jī)分子)進(jìn)行第二次偶合。當(dāng)完成了希望的分子的合成時(shí)，從固體載體上分離所述物質(zhì)并脫保護(hù)。純化可以通過HPLC技術(shù)來完成。最后，通過加入已知量的鑭系(III)離子將純化的配體轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的鑭系(III)螯合物。用于合成低聚核苷酸的螯合劑根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的螯合劑適用于合成低聚核苷酸。在這種情況下，反應(yīng)性基團(tuán)A通過連接體L與螯合劑連接，而A為-Z2-0-PZ3-0-R5其中，氧原子中的一個(gè)任選地被硫代替，Z3為氯或NR6R7，R5為保護(hù)基，R6和R7為包含1-8個(gè)碳原子的烷基，Z2為不存在或者為嘌呤堿或嘧啶堿基團(tuán)，或者為適用于合成改性19低聚核苷酸的任何其他改性基質(zhì)的基團(tuán)。所述基質(zhì)通過i)被經(jīng)保護(hù)的羥基甲基取代的烴鏈，或者ii)呋喃環(huán)或吡喃環(huán)或適用于合成改性低聚核苷酸的任何改性的呋喃或吡喃環(huán)與氧原子連接。在低聚核苷酸合成器的幫助下可以將螯合劑引入到低聚核苷酸中。us6，949，639和ep1308452中公開了一種有用的方法。所述專利申請公開了在鏈組合過程中將期望數(shù)量的軛合基團(tuán)直接連接在低聚核苷酸結(jié)構(gòu)中的方法。在合成核苷和無環(huán)核苷低聚核苷酸構(gòu)建塊的策略中，關(guān)鍵反應(yīng)是Mitsunobu烷基化反應(yīng)，該反應(yīng)可以向無環(huán)核苷或核苷中引入各種螯合劑，最后將其引入低聚核苷酸中。在鏈組合過程中引入螯合劑。在合成之后，脫保護(hù)步驟中轉(zhuǎn)化為鑭系螯合物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，Z2為下述堿中任一種的基團(tuán)胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺苷、鳥嘌呤或胞嘧啶，并且所述堿通過i)被經(jīng)保護(hù)的羥基甲基取代的烴鏈，或者ii)在4-位上具有經(jīng)保護(hù)的羥基甲基并且任選在其2-位上具有羥基、被保護(hù)的羥基或改性羥基的呋喃環(huán)與氧原子連接。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，反應(yīng)性基團(tuán)_Z2-0-p(NR6r7)-o-R5選自其中-為連接體L的位置，匿Tr為二甲氧基三苯甲基。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，用于該用途的螯合劑選自下面公開的具體結(jié)構(gòu)其中R〃為羧酸的烷基酯或烯丙基酯，R〃'為烷基，且其中R、f，L和G'如之前的定義，A如前述定義為_Z2-0-P(NR6R7)-0-R5。在特殊的實(shí)施方案中，所述螯合劑選自下列具體結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>其中r〃為烷基酯或烯丙基酯或羧酸，且其中r、r、l和g'如之前的定義，a如前述定義為-z2-o-p(nr6r7)-o-r5。為了制備與單一的標(biāo)記分子相連接的低聚核苷酸軛合物，可以從所述結(jié)構(gòu)中刪除z2。生物分子與本發(fā)明的螯合劑或螯合物軛合的生物分子為低聚肽、低聚核苷酸、dna、rna、改性低聚_或多核苷酸，例如一硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和/或糖_或堿改性的低聚-或多核苷酸、蛋白質(zhì)、低聚糖、多聚糖、磷脂、pna、lna、抗體、類固醇、半抗原、藥物、受體結(jié)合配體和凝集素。固體載體軛合物本發(fā)明的螯合物、螯合劑和生物分子可以軛合在固體載體上。所述固體載體可以為適用于固相合成低聚核苷酸或低聚肽的顆粒，例如納米顆粒或微米顆粒、載玻片、板或樹脂。在螯合物或螯合劑具有聚合基團(tuán)作為反應(yīng)性基團(tuán)的情況下，可以在制備顆粒的同時(shí)將螯合物或螯合劑引入到固體載體，例如顆粒內(nèi)[Org.Biomol.Chem.，2006，4，1383]。如果使用銅(I)催化的Huisgen-Sharpless反應(yīng)進(jìn)行衍生化，則將螯合物連接于疊氮化物基團(tuán)上并用端炔對固體載體進(jìn)行衍生化，或者反之亦然。22與固體載體共價(jià)或者非共價(jià)地軛合的生物分子為標(biāo)記的低聚肽，其是通過在固相上于低聚肽合成器上，將螯合劑引入到低聚肽結(jié)構(gòu)中，之后脫保護(hù)和任選地引入金屬離子而合成得到的?？蛇x地，與固體載體共價(jià)和非共價(jià)地軛合的生物分子為標(biāo)記的低聚核苷酸，其是通過在固相上于低聚核苷酸合成器上，將螯合劑引入到低聚核苷酸結(jié)構(gòu)中，之后脫保護(hù)以及任選地引入金屬離子而合成得到的。可選地，與固體載體共價(jià)或非共價(jià)軛合的生物分子為用本發(fā)明的螯合物標(biāo)記的DNA、RNA、低聚肽、低聚核苷酸、多肽、多核苷酸或蛋白質(zhì)。附圖簡述圖1說明了6，6'，6〃-[(八氫-lH-l，4，7-三偶氮寧-l，4，7-三基)三(亞甲基)]三[4-(4-羧基-3，5-二甲基呋喃-2-基)吡啶-2-羧酸]的銪螯合物(14c)的激發(fā)和發(fā)射光譜。通過下列非限制性實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行闡述。實(shí)施例將通過下列實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步地闡釋。試驗(yàn)部分所用的結(jié)構(gòu)和合成途徑在方案1-7中進(jìn)行了描述。方案1和2說明了發(fā)色團(tuán)6a-c和11的合成。實(shí)施例1-17中給出了試驗(yàn)細(xì)節(jié)。方案2還說明了以可商購獲得的3-甲基噻吩-2-羧酸為原料制備6-溴甲基-4-(4'-甲基-5'-乙氧基羰基噻吩_2'_基)吡啶-2-羧酸乙酯的合成途徑。方案3-7說明了螯合物14a-c、22-24、29和32的合成。實(shí)施例18-38和40-44中給出了試驗(yàn)細(xì)節(jié)。實(shí)驗(yàn)步驟在填充了硅膠60(Merck)的柱上進(jìn)行吸附柱色譜。在Brucker250，JeolLA-600光譜儀上記錄NMR譜，對于^而言其分別在250和600MHz處操作。將Me^i用作內(nèi)標(biāo)。偶合常數(shù)以Hz給出。在AppliedBiosystemsMarinerESI-T0F儀上記錄電噴霧質(zhì)譜。使用配備了二極管陣列檢測器的ShimadzuLC10AT儀、餾分收集器和反向柱(LiChrocart125-3PurospherRP-18e5ym)進(jìn)行HPLC純化。流動(dòng)相(緩沖液A):0.02M乙酸三乙銨(pH7.0);(緩沖液B):A于50X(v/v)乙腈中。梯度0-lmin95%A，l-31min內(nèi)由95%A至100%B。流速為0.6mLmin—、所有的干燥溶劑都來自Merck，且以收到時(shí)的原樣使用。在PerkinElmerLS-55儀上記錄熒光光譜。實(shí)施例14-碘吡啶-2，6-二羧酸二乙酯(1)的合成50。C下將4-溴吡啶-2，6-二羧酸二乙酯(8.36g，27.7mmol)、57%(w/w)的氫碘酸水溶液(31.05g，138.4,1)和EtOH(67mL)的混合物攪拌lh并用NaHC03溶液中和。用CH2Cl2(2x300mL)將產(chǎn)物從水相中萃取出來。用Na2S04干燥合并的有機(jī)部分并蒸發(fā)至干。產(chǎn)率為5.24g(54%)。ESI-TOF-MS[M+H]+:CuH13IN04+的計(jì)算值為349.99，實(shí)測值為349.99。力NMR(600MHz，CDC13):S8.63(s，2H);4.50(q，J=7.2Hz，4H);1.46(t，J=7.2Hz，6H)。實(shí)施例26-羥基甲基-4-碘吡啶-2-羧酸乙酯(2)的合成40°C下將化合物1(5.24g，15.0,1)溶解在EtOH(270ml)中。小心地加入NaBH4(0.57g，15.Ommol)并攪拌混合物40分鐘。用28%(w/w)的氫碘酸水溶液將pH調(diào)節(jié)至3以使反應(yīng)停止。用飽和NaHC03溶液中和混合物并蒸發(fā)至干。將剩余物懸浮在水(150mL)中，用10%EtOH/CH2Cl2溶液(3x150ml)從水相中萃取出產(chǎn)物。用Na2S04干燥合并的有機(jī)餾分并蒸發(fā)至干。經(jīng)硅膠(石油醚，bp40-60°C/乙酸乙酯2:5)純化得到2.89g(63%)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+H]+:C9HnIN03+的計(jì)算值為307.98，實(shí)測值為307.98。丄HNMR(600MHz,CDC13):S8.37(s，lH);7.95(s，lH);4.83(d，J=3.0Hz，2H);4.47(q，J=7.2Hz，2H);3.29(s，1H);1.44(t，J=7.2Hz，3H)。實(shí)施例36-(四氫吡喃-2-基氧基甲基)-4-碘吡啶-2-羧酸乙酯(3)的合成室溫下將2(2.89g，9.4mmo1)、3，4-二氫-2H-吡喃(1.19g，14.lmmol)、吡啶對甲苯磺酸鹽(0.236g，0.94mmo1)和CH2C12(50ml)的混合物攪拌過夜。蒸除溶劑，在硅膠上純化產(chǎn)物(石油醚，bp40-60°C/乙酸乙酯2:5)，得到3.18g(86%)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+H]+:C14H19IN04+的計(jì)算值為392.04，實(shí)測值為392.04。力NMR(600MHz，CDC13):S8.36(d，J=1.5Hz，lH);8.08(d，J=1.5Hz，lH);4.96(d，J=14.3Hz，1H);4.77(t，J=3.6Hz，1H);4.70(d，J=14.8Hz，1H);4.47(q，J=7.2Hz，2H);3.91-3.84(m，1H);3.59-3.54(m，1H);1.94-1.86(m，1H);1.84—1.78(m，1H);1.77-1.71(m，lH);1.66-1.54(m，3H);1.43(t，J=7.2Hz，3H)。實(shí)施例46-(四氫吡喃-2-基氧基甲基)-4-(4'-甲氧基羰基_5'-甲基呋喃_2'-基)吡啶-2-羧酸乙酯(4a)的合成用氬氣將3(220mg，0.56mmol)、2-甲基-3-呋喃羧酸甲酯(315mg，2.25,1)、K0Ac(110mg，1.12mmo1)、四丁基碘化銨(208mg，0.56mmo1)、Pd(0Ac)2(6.3mg，0.028mmo1)、三-2-呋喃基膦(13.0mg，0.056mmo1)和干DMF(3.8ml)的混合物脫除空氣并在120°C下攪拌24h。過濾和蒸發(fā)之后，在硅膠上純化產(chǎn)物(5%EtOH/CH^l2+l^三乙胺)，得到150mg(66%)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+H]+:C21H26N07+的計(jì)算值為404.17，實(shí)測值為404.17。實(shí)施例56-(四氫吡喃-2-基氧基甲基)-4-(4'-甲氧基羰基-呋喃_2'-基)吡啶_2-羧酸乙酯(4b)的合成按照實(shí)施例4中針對化合物4a所作的描述合成標(biāo)題化合物，但是使用3-呋喃羧酸甲酯。實(shí)施例66-(四氫吡喃-2-基氧基甲基)-4-(3'，5'-二甲基-4'-乙氧基羰基呋喃-2'_基)吡啶-2-羧酸乙酯(4c)的合成將3(3.7g，9.5,1)、乙酰乙酸乙酯(1.2mL，9.5,1)和按照J(rèn).Org.Chem.，2005，70，6980中公開的方式合成的甲基丙_2_炔基碳酸酯(1.lg，9.5mmo1)的混合物溶解在干DMF(97mL)中并用氬氣脫除空氣。加入Pd(PPh3)4(0.56g，0.48mmol)2C03(2.6g，19rnrno1)，在85t:、黑暗下將混合物攪拌過夜。過濾混合物，將剩余物蒸發(fā)至干。將剩余物溶24解在CH2C12中，用飽和NaHC03洗滌溶液。在硅膠上純化(石油醚，bp40-60°C/乙酸乙酯5:l)，得到1.lg(27%)標(biāo)題化合物。ESI-T0F-MS[M+H]+:C23H3。N07+的計(jì)算值為432.20，實(shí)測值為432.22。丄HNMR(600MHz,CDC13):S8.23(d，J=1.2Hz，1H);7.89(s，lH);5.03(d，J=14.lHz，1H);4.82(m，1H);4.79(m，1H);4.51(q，J=7.lHz，2H);4.35(q，J=7.lHz，2H);3.94-3.88(m，1H);3.58-3.55(m，1H);2.66(s，3H);2.53(s，3H);1.94—1.51(m，6H);1.45(t，J=7.0Hz，3H);1.40(t，J=7.2Hz，3H)。實(shí)施例76-羥基甲基-4-(4'-甲氧基羰基_5'-甲基呋喃_2'-基)吡啶_2-羧酸乙酯(5a)的合成室溫下將4a(300mg，0.74mmol)、對甲苯磺酸單水合物(141mg，0.74,1)和EtOH(30mL)的混合物攪拌4h。蒸除溶劑并在硅膠上純化產(chǎn)物(5%EtOH/CH2Cl2+l%三乙胺)，得到148mg(63%)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+H]+:C16H18N06+的計(jì)算值為320.11，實(shí)測值為320.13。實(shí)施例86-羥基甲基-4-(4'-甲氧基羰基呋喃_2'_基)吡啶-2-羧酸乙酯(5b)的合成采用實(shí)施例7中公開的方法將4b轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物。實(shí)施例94-(3'，5'-二甲基-4'-乙氧基羰基呋喃_2'_基)_6_(羥基甲基)吡啶-2-羧酸乙酯(5c)的合成將化合物4c(1.llg，2.57mmo1)溶解在乙醇(84mL)中并加入對甲苯磺酸單水合物(0.49g，2.57mmo1)。在室溫下將混合物攪拌過夜。在硅膠上進(jìn)行純化(石油醚，bp40-60°c/乙酸乙酯/三乙胺io:i:i—5:2:i—3:5:i)，得到o.69g(77%)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+H]+:C18H22N06+的計(jì)算值為348.14，實(shí)測值為348.15。丄HNMR(600MHz，CDC13):S8.23(s，lH);7.69(s，lH);4.89(s，2H);4.49(q，J=7.2Hz，2H);4.35(q，J=7.2Hz，2H);2.65(s，3H);2.53(s，3H);1.46(t，J=7.2Hz，3H);1.39(t，J=7.2Hz，3H)。實(shí)施例106-(溴甲基)-4-(4'-甲氧基羰基_5'-甲基呋喃_2'-基)吡啶_2-羧酸乙酯(6a)的合成在(TC下攪拌三溴化磷(125mg，0.46mmo1)和干DMF的混合物，直至形成白色沉淀。加入5a(148mg，0.46mmo1)在DMF(6mL)禾PCH2C12(0.2mL)混合物中所形成的溶液。在室溫下攪拌混合物lh，并用飽和NaHC03溶液中和。蒸除溶劑，產(chǎn)物在硅膠上純化(石油醚，bp40-60。C/乙酸乙酯2:5)，得到113mg(64%)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+H]+:計(jì)算值為382.02，實(shí)測值為382.02。實(shí)施例116-(溴甲基)-4-(4'-甲氧基羰基呋喃_2'_基)吡啶-2-羧酸乙酯(6b)的合成采用實(shí)施例10中公開的方法將5b轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物。實(shí)施例126-(溴甲基)-4-(3'，5'-二甲基-4'-乙氧基羰基呋喃_2'-基)吡啶_2-羧酸乙酉旨(6c)的合成采用實(shí)施例10中公開的方法將5c轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物。在硅膠上純化(石油醚，bp40-60°C/乙酸乙酯5:1)，得到0.28g(36%)標(biāo)題化合物。ESI-T0F-MS[M+H]+:C18H21BrN05+的計(jì)算值為410.06，實(shí)測值為410.06。力NMR(600.13MHz，CDC13):S8.24(d，J=1.2Hz，1H);7.85(d，J=1.2Hz，1H);4.68(s，2H);4.52(q，J=7.1Hz，2H);4.35(q，J=7.1Hz，2H);2.66(s，3H);2.54(s，3H);1.46(t，J=7.0Hz，3H);1.40(t，J=7.0Hz，3H)。實(shí)施例136-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧基甲基)-4-溴吡啶-2-羧酸乙酯(7)的合成將預(yù)干燥的6-羥基甲基-4-溴吡啶-2-羧酸乙酯(1.4g，5.4翻l)和咪唑(1.lg，6.5mmo1)溶解在干DMF(l.7mL)中。逐份加入TBDPS-氯化物(1.78g，6.5mmo1)，并使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行3h。用Et20(50mL)稀釋反應(yīng)混合物并用水和飽和NaHC03洗滌。在Na2S04上干燥有機(jī)相并蒸發(fā)至干。在硅膠上純化(石油醚，bp40-60°C/乙酸乙酯5:2)，得到2.5g(92%)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+H]+:C25H29BrN03Si+的計(jì)算值為520.09，實(shí)測值為520.06。^NMR(600MHz，CDC13):S8.14(d，J<lHz，1H);8.04(d，J<lHz，1H);7.66(d，J=9.4Hz，4H);7.43(m，2H);7.38(t，J=9.4Hz，4H);4.93(s，2H);4.44(q，J=7.1Hz，2H);1.39(t，J=7.1Hz，3H);1.15(s，9H)。實(shí)施例146-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧基甲基)-4-(5'-羧基噻吩_2'-基)-吡啶_2-羧酸乙酯(8)的合成將化合物7(0.97g，1.94mmo1)、5_(二羥基硼烷基)_2_噻吩羧酸(0.4g，2.33,1)、Cs2C03(0.82g，2.52,1)和(PPh3)4Pd(45mg，3.88iimol)溶解在干DMF(7mL)中并用氬氣脫除空氣。將反應(yīng)加熱至95t:并使其進(jìn)行一夜。使反應(yīng)混合物冷卻至室溫并過濾除去所有的固體物質(zhì)。真空除去揮發(fā)物并在硅膠上純化粗產(chǎn)物(10%MeOH/CH2Cl2+0.1%HOAc)，得到0.25g(20%)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+H]+:C3。H32N05SSi+的計(jì)算值為546.18，實(shí)測值為546.61。實(shí)施例156-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基甲基)-4-(5'-乙氧基羰基噻吩_2'-基)吡啶-2-羧酸乙酯(9)的合成將化合物8(200mg，0.37mmol)溶解在二氯甲烷(200iiL)中。加入DCC(83mg，0.44mmo1;預(yù)溶解在0.5mLTHF中)和催化量的DMAP，在室溫下攪拌混合物5分鐘，之后加入干燥的EtOH(64iiL，0.55mmo1)。使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行3h，之后濾除形成的DCU并將濾液蒸發(fā)至干。在硅膠上純化(石油醚，bp40-60°C/乙酸乙酯5:3)，得到73mg(35X)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+H]+:C32H36N05SSi+的計(jì)算值為574.21，實(shí)測值為574.35。實(shí)施例166-羥基甲基-4-(5'-乙氧基羰基噻吩_2'_基)吡啶-2-羧酸乙酯(10)的合成將化合物9(70mg，0.12mmol)溶解在干THF(2mL)中。加入TBAF(64mg，0.24mmol)并在室溫下攪拌混合物5h。將混合物蒸發(fā)至干并在硅膠上純化(5XMeOH/CH2Cg，得到25mg(61%)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+H]+:C16H18N05S+的計(jì)算值為336.09，實(shí)測值為336.12。實(shí)施例176-溴甲基-4-(5'-乙氧基羰基噻吩_2'_基)吡啶-2-羧酸乙酯(11)的合成使用實(shí)施例10中公開的方法將化合物10轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物。在硅膠上純化(5%MeOH/CH2Cl2)，得到20mg(67%)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+H]+:C16H17BrN04S+的計(jì)算值為398.01，實(shí)測值為398.03。實(shí)施例181，4，7_三{[6'-乙氧基羰基-4'_(4"-甲氧基羰基_5〃-甲基呋喃_2〃-基)吡啶-2'-基]甲基卜l，4，7-三氮雜環(huán)壬烷(12a)的合成在室溫下將6a(30mg，0.078mmol)、l，4，7-三氮雜環(huán)壬烷(3.4mg，0.026mmo1)、K2C03(18.lmg，O.13,1)、MeCN(l.2mL)和CH2C12(0.2mL)的混合物攪拌過夜。蒸除溶劑并用制備性TLC(10XEtOH/CH2Cl2+l%TEA)純化產(chǎn)物，得到24mg(89%)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+H]+:C54H61N6015+的計(jì)算值為1033.42，實(shí)測值為1033.42。實(shí)施例191，4，7_三{[6'-乙氧基羰基_4'-(4〃-甲氧基羰基-呋喃-2〃-基)妣啶-2'_基]甲基卜l，4，7-三氮雜環(huán)壬烷(12b)的合成使用實(shí)施例18中公開的方法將6b轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物。實(shí)施例201，4，7_三{[6'-乙氧基羰基_4'-(3〃，5〃-二甲基_4〃_乙氧基羰基呋喃_2〃-基)吡啶_2'_基]甲基卜l，4，7-三氮雜環(huán)壬烷(12c)的合成。采用實(shí)施例18中公開的方法將6c轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物。用制備性TLC(石油醚，bp40-60°C/乙酸乙酯/三乙胺3:5:1)進(jìn)行純化，得到30mg(47%)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+H]+:C57H67N6015+的計(jì)算值為1075.47，實(shí)測值為1075.50。丄HNMR(600MHz，CDC13):S8.21(s，3H);7.99(s，3H);4.33(q，J=7.1Hz，6H);4.03-3.97(m，6H);4.00(s，9H);3.02(bs，8H);2.94(bs，4H);2.57(s，3H);2.55(s，6H);2.48(s，3H);2.46(s，6H);1.38(t，J=7.0Hz，9H)。實(shí)施例216，6'，6〃-[(八氫-lH-l，4，7-三偶氮寧-l，4，7-三基)三(亞甲基)]三[4-(4-羧基-5-甲基呋喃-2-基)]吡啶-2-羧酸(13a)的合成將12a溶解在0.5MKOH/MeOH(1.6mL)中并加入0.2mL水。在室溫下將混合物攪拌過夜并蒸發(fā)至干。實(shí)施例226，6'，6〃-[(八氫-lH-l，4，7-三偶氮寧-l，4，7-三基)三(亞甲基)]三[4-(4-羧基-呋喃-2-基)吡啶-2-羧酸](13b)的合成使用實(shí)施例21中公開的方法將12b轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物。實(shí)施例236，6'，6〃-[(八氫-lH-l，4，7-三偶氮寧-l，4，7-三基)三(亞甲基)]三[4-(4-羧基-3，5-二甲基呋喃-2-基)吡啶-2-羧酸](13c)的合成采用實(shí)施例21中公開的方法將12c轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物。實(shí)施例246，6'，6〃-[(八氫-lH-l，4，7-三偶氮寧-l，4，7-三基)三(亞甲基)]三銪(III)(14a)的合成將13a(23ymol)溶解在水(2mL)中并用6MHC1-溶液將pH調(diào)節(jié)至9。加入0.2M的檸檬酸銪(III)(0.12mL)，并在室溫下攪拌混合物72h。用1MHC1-溶液將pH調(diào)節(jié)至4，從而沉淀出產(chǎn)物。ESI-T0F-MS[M-H]—:C45H38EuN6015—的計(jì)算值為1055.16，實(shí)測值為1055.12。實(shí)施例256，6'，6〃-[(八氫-lH-l，4，7-三偶氮寧-l，4，7-三基)三(亞甲基)]三[4-(4-羧基呋喃-2-基)吡啶-2-羧酸]銪(III)(14b)的合成使用實(shí)施例24中公開的方法將13b轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物。實(shí)施例266，6'，6〃-[(八氫-lH-l，4，7-三偶氮寧-l，4，7-三基)三(亞甲基)]-三銪(III)(14c)的合成采用實(shí)施例24中公開的方法將13c轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物。ESI-T0F-MS[M+Na]+:C48H45EuN6Na015+的計(jì)算值為1121.20，實(shí)測值為1121.20。實(shí)施例272-(甲氧基羰基)-8-(三苯甲基氧基)辛酸甲酯(15)的合成將甲氧基鈉(1.42g，26.2mmo1)溶解在干燥MeOH(90mL)中。加入丙二酸二甲酯(3.0mL，26.2mmo1)，在室溫下攪拌混合物1小時(shí)。加入(6-溴己氧基)三苯基甲烷(3.7g，8.7mmo1)并將混合物回流過夜。將混合物冷卻只室溫并加入50mL10%擰檬酸。然后在室溫下攪拌混合物5分鐘。用CH2Cl2(3xl00mL)萃取產(chǎn)物并蒸發(fā)至干。將剩余物溶解在CH2C12中并用N^S04干燥。在硅膠上純化(石油醚，bp40-60°C/乙酸乙酯10:1)，得到2.3g(56%)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+Na]+:C3。H34Na05+的計(jì)算值為497.23，實(shí)測值為497.17。力畫R(250MHz，CDC13):S7.46-7.42(m，6H)，7.33-7.19(m，9H)，3.73(s，6H)，3.34(t，J=7.6Hz，1H)，3.03(t，J=6.6Hz，2H)，1.88(q，J=7.2，2H)，1.60(五重峰，2H)，1.41-1.25(m，6H)。實(shí)施例288-羥基-2-(甲氧基羰基)辛酸甲酯(16)的合成將(1.0g，7.9mmo1)溶解在MeOH(100mL)中。加入化合物15(4.5g，9.5mmo1)，在5(TC下攪拌混合物1小時(shí)。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干。將剩余物溶解在(^(:12中并用10%Na2S03(40mL)洗滌。用化2504干燥有機(jī)相并蒸發(fā)至干。在硅膠上純化(石油醚，bp40-60°C/乙酸乙酯10:1—5:3)，得到1.96g(89%)標(biāo)題化合物。ESI-T0F-MS[M+H]+:CuH2105+的計(jì)算值為233.14，實(shí)測值為233.16。實(shí)施例292-(甲氧基羰基)-8-(4-硝基苯氧基)辛酸甲酯(17)的合成將化合物16(1.92g，8.3mmol)、4-硝基苯酚(1.39g，10.0,1)和三苯基膦(2.62g，10.Ommol)溶解在干燥THF(lOOmL)中并用氬氣脫除空氣。在氬氣下分10份加入偶氮二羧酸二異丙酯(2.0mL，10.0mmol)，在室溫下攪拌混合物3天。將混合物蒸發(fā)至干并在硅膠上純化(CH2C12)，得到2.6g(89%)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+H]+:C17H24N07+的計(jì)算值為354.15，實(shí)測值為354.22。丄HNMR(600MHz,CDC13):S8.20(d，2H);6.94(d，2H);4.04(t，J=6.4Hz，2H);3.74(s，6H);3.37(t，J=7.6Hz，1H);1.92(q，J=7.6Hz，2H);1.81(五重峰，J=7.OHz，2H);1.48(五重峰，2H);1.43-1.33(m，4H)。實(shí)施例302-[6-(4-氨基苯氧基)己基]丙烷-l，3-二醇(18)的合成將化合物17(1.19g，3.4,1)溶解在干燥的THF(50mL)中。加入LiBH4(0.44g，20.2mmo1)并將混合物回流過夜。使混合物冷卻至室溫并加入MeOH(10mL)。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物30分鐘。將混合物蒸發(fā)至干。加入飽和NaHC03水溶液，將混合物回流1小時(shí)。使混合物冷卻至室溫，之后過濾。用水洗滌沉淀物并在硅膠上純化(10%MeOH/CH^g，得到O.60g(67%)標(biāo)題化合物。ESI-TOF-MS[M+H]+:C15H26N03+的計(jì)算值為268.19，實(shí)測值為268.20。力NMR(600MHz，CDC13):S6.63(d，J=8.7Hz，2H);6.49(d，J=8.7Hz，2H);4.56(s，2H);3.79(t，J=6.4Hz，2H);3.35(m，4H);1.74(m，lH);1.63(五重峰，2H);1.37(五重峰，2H);1.31-1.22(m，6H)。實(shí)施例312-{6-[4-(叔丁氧基羰基氨基)苯氧基]己基}丙烷-l，3-二醇(19)的合成將化合物18(0.55g，2.lmmol)溶解在干燥的DMF中。加入三乙胺(0.36mL，2.5mmo1)和Boc酐(0.53mL，2.3mmo1)，在5(TC下攪拌混合物1小時(shí)。將混合物蒸發(fā)至干。將剩余物溶解在混于CH2C12(50mL)中的30%MeOH中，用飽和NaHC03水溶液洗滌。分離有機(jī)相，水相用CH2Cl2(2x50mL)萃取。用Na2S04干燥有機(jī)相。在硅膠上純化(30%MeOH/CH2C12)，得到0.23g(30%)標(biāo)題化合物。NMR(600MHz，CDC13):S7.24(d，2H);6.82(d，2H);3.91(t，J=6.4Hz，2H);3.81(d，2H);3.65(t，2H);1.78-1.72(m，3H);1.51(s，9H);1.45(五重峰，2H);1.35(五重峰，4H);1.25-1.24(m，2H)。實(shí)施例321，4，7_三(2-硝基苯磺酰基)-9-{6-[4-(叔丁氧基羰基-氨基)苯氧基]己基卜l，4，7-三氮雜環(huán)癸烷(20)的合成將化合物19(0.21mg，0.57mmo1)溶解在干燥的THF(8mL)中。加入三苯基膦和全(對硝基苯磺?；?二亞乙基三胺(0.38g，0.57mol)，用氬氣將混合物脫除空氣。在氬氣下分10份加入偶氮二羧酸二異丙酯(0.34mL，1.71rnrno1)。在室溫下將混合物攪拌過夜。將混合物蒸發(fā)至干。將剩余物溶解在CH2C12中，用飽和NaHC03水溶液洗滌。用Na2S04干燥有機(jī)相并在硅膠上純化(CH2C12)，得到0.35g(63%)標(biāo)題化合物。ESI-T0F-MS[M+H]+:C42H52N7015S3+的計(jì)算值為990.27，實(shí)測值為990.27。實(shí)施例331，4，7_三{[6'-(乙氧基羰基)_4'-(4〃-乙氧基羰基-3〃，5〃-二甲基呋喃-2〃_基)吡啶-2'-基]甲基}_9-{6-[4-(叔丁氧基羰基氨基)苯氧基]己基}_1，4，7-三氮雜環(huán)癸烷(21)的合成將化合物20(0.12g，0.12mmo1)溶解在干燥的DMF中。力Q入Cs2C03(0.27g，0.84mmol)，用氬氣將混合物脫除空氣。加入3-(3-巰基苯基)丙酰胺基甲基聚苯乙烯(0.24g，樹脂容量1.54mmol/g)，在室溫下攪拌混合物3.5h。額外加入0.24g3-(3-巰基苯基)丙酰胺甲基聚苯乙烯，在室溫下將混合物攪拌過夜。過濾混合物，將剩余物蒸發(fā)至干。將3-(3-巰基苯基)丙酰胺基甲基聚苯乙烯(0.24g)和(:820)3(0.14g，0.43mmol)加入到干燥的DMF(2mL)中。用氬氣將混合物脫除空氣。將對硝基苯磺?；Ｗo(hù)的化合物溶解在干燥的DMF(2mL)中，將溶液加入到3-(3-巰基苯基)丙酰胺基甲基聚苯乙烯混合物中。在室溫下攪拌混合物3天。過濾混合物并將濾液蒸發(fā)至干。將剩余物溶解在干燥的DMF(4mL)中。加入Cs2C03(0.16g，0.49,1)和6c(R4=Et)(0.15g，0.36,1)，室溫下將混合物攪拌過夜。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干。將剩余物溶解在CH^l2中并用水洗滌。有機(jī)層用化2504干燥。產(chǎn)物用制備性TLC(10XEt0H/CH2Cl2)純化，得到39mg(23%)標(biāo)題化合物。ESI-T0F-MS[M+H]+:C78Hi。。N70j的計(jì)算值為1422.71，實(shí)測值為1422.73。實(shí)施例346，6'，6〃_{{9-[6-(4-氨基苯氧基)己基]十氫-l，4，7-三氮雜環(huán)癸五烯(triazecine)-l，4，7-三基)三(亞甲基)}三[4-(4-羧基_3，5_二甲基呋喃-2-基)吡啶_2-羧酸]銪(III)(22a)的合成將化合物21(7mg，4.9ymol)溶解在乙酸乙酯(700yL)中并加入37%HC1(300iiL)。在室溫下攪拌混合物2小時(shí)。將混合物蒸發(fā)至干。將剩余物溶解在0.5MK0H/Me0H(lmL)中。加入溶于水(100iiL)中的10MK0H，在室溫下攪拌溶液3天。真空下從反應(yīng)混合物中除去甲醇，用1MHCl將pH調(diào)節(jié)至8。加入0.2M的檸檬酸銪(III)(30yL)，在室溫下將混合物攪拌過夜。產(chǎn)物經(jīng)HPLC純化。ESI-T0F-MS[M-2H]2—:C61H62EuN70162—的計(jì)算值為650.67，實(shí)測值為650.71。實(shí)施例356，6'，6〃_{{9-{6-[4-(4，6-二氯-1，3，5-三嗪基氨基)苯氧基]己基}十氫-1，4，7-三氮雜環(huán)癸五烯-1，4，7-三基}三(亞甲基)}三[4-(4-羧基-3，5-二甲基呋喃_2-基)吡啶-2-羧酸]銪(III)(22b)的合成將化合物22a(2.5mg，1.7iimol)溶解在lmL0.1MCH3C00Na(p朋.5)中。將氰尿酰氯(0.4mg，2.liimol)溶解在丙酮(lmL)中并加入O.3mL水。合并溶液，用O.1M的NaOH-溶液將pH調(diào)節(jié)至6.5，室溫下攪拌混合物2小時(shí)。用1M的HC1將pH調(diào)節(jié)至4，從而使產(chǎn)物沉淀出來。用丙酮洗滌沉淀物2次并在真空干燥器中干燥。ESI-T0F-MS[M-2H]2—-CmHmC^EuN^Ow2—的計(jì)算值為724.14，實(shí)測值為724.09。實(shí)施例362-{4，7-雙{[4-(4-羧基_3，5_二甲基呋喃_2_基)]_6_羧基吡啶_2_基甲基}-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-1-基甲基}-4-[4-(4-氨基丁基)氨基羰基-3，5-二甲基呋喃-2-基]吡啶-2-羧酸銪(ni)23的合成室溫下攪拌化合物14c(5iimol)、l，4-二氨基丁烷(0.45mg，5iimol)、EDAC(1.lmg，5.5iimol)和N-羥基丁二酰亞胺(0.5mg)在1.2mLDMF/水(4:1)中的混合物。產(chǎn)物經(jīng)HPLC純化。ESI-T0F-MS[M+2H]2+的計(jì)算值為585.16，實(shí)測值為585.17。實(shí)施例372-{4，7_雙{[4-(4-羧基-3，5-二甲基呋喃-2-基)]-6-羧基吡啶-2-基甲基}_1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-1-基甲基}-4-{4-[4-(4，6-二氯-1，3，5-三嗪基)氨基丁基]氨基羰基-3，5-二甲基呋喃_2-基}吡啶-2-羧酸銪(111)24的合成將化合物23(4.5mg，3.9iimol)溶解在lmL0.1M的CH3C00Na(p朋.5)中。將氰尿酰氯(0.8mg，4.2iimo1)溶解在丙酮(lmL)中并加入O.3mL水。合并溶液，用O.1MNaOH-溶液將pH調(diào)節(jié)至6.5，在室溫下攪拌混合物20分鐘。用1MHC1將pH調(diào)節(jié)至3，從而使產(chǎn)物發(fā)生沉淀。用2mL丙酮洗滌沉淀物2次并在真空干燥器中干燥。ESI-T0F-MS[M-H]—:C2。H15EuN301(lS—的計(jì)算值為643.99，實(shí)測值為643.40。實(shí)施例38用螯合物24標(biāo)記PT66抗磷酸化酪氨酸。向化合物24(100mM，在NaHC03水溶液中，pH8.3)的水溶液中加入抗體(0.8mg)，用NaHC03將pH調(diào)節(jié)至9.3。使反應(yīng)在4°C、黑暗下進(jìn)行一夜。開始在Centricon30漏斗(4500rpm，進(jìn)行30分鐘，使用50mMTSA作為洗脫劑(4xlmL))上純化標(biāo)記的抗體，之后在S印hadexG50DNA等級(50cmxlcm)上使用50mMTSA作為洗脫劑經(jīng)柱色譜純化。將含有希望的產(chǎn)物的餾分合并(用熒光光度計(jì)判斷)，并用0.2iim過濾器過濾。實(shí)施例39激酶試驗(yàn)室溫下將陽性對照(2nMEu-標(biāo)記的PT66和10mM磷?；碾模簧锼鼗鵢e_氨基己?；?Glu-Pro-Gln-Tyr(P03H2)-Glu-Glu-Ile-Pro-Ile-Tyr-Leu-OH;Bachem)和陰性對照(2nMEu-標(biāo)記的PT66+20nMSA-Alexa647;4.3Alexa/SA)培養(yǎng)30分鐘。在Victor3多標(biāo)記計(jì)數(shù)器(PerkinElmerLAS)上，使用50ys延遲/100ysTR窗，分別在665nm和615nm測量能量轉(zhuǎn)移信號和銪信號。在665nm處的能量轉(zhuǎn)移信號<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>在615nm處的Eu信號<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實(shí)施例403，4-二甲基噻吩-2-羧酸乙酯，26的合成。采用US6，559，993和US2004/0147765中公開的方法制備標(biāo)題化合物。于是在氬氣下將硫醚25(10.8，52.4,1)和2，3-丁二酮(2.25g，26.2,1)溶解在干THF(20mL)中。滴加NaOEt的乙醇溶液(20%，m/v;1.5eq)，在65。C下加熱混合物2.5h并冷卻至室溫。經(jīng)水處理之后在Na^(^上干燥產(chǎn)物并在硅膠上純化，得到2.5g5-(乙氧基羰基)-3，4-二甲基噻吩-2-羧酸，將其溶解在喹啉中。加入銅(0.30g)，在室溫下將混合物充氣30分鐘，隨后在14(TC下加熱過夜。經(jīng)水處理之后干燥產(chǎn)物并在硅膠上純化。化合物26:工HNMR(CDC13):S7.08(1H，s);4.33(2H，q，J7.2);2.47(3H，s);2.18(3H，s);1.38(3H，t，J7.2)。ESI-TOF-MS[M+H]+:C9H1302S+的計(jì)算值為185.06，實(shí)測值為185.07。實(shí)施例411，4，7_三{[6'-甲氧基羰基_4'-(4〃-乙氧基羰基-3〃，5〃-二甲基噻吩_2〃-基)吡啶_2'_基]甲基卜l，4，7-三氮雜環(huán)壬烷(28)的合成。用氬氣將化合物27(0.lmmol)、化合物26(3.Ommol)、乙酸鈀(0.15mmo1)、三呋喃基膦(0.30mmol)、乙酸鉀(0.6mmo1)、四丁基碘化銨(0.3mmo1)和DMF(5mL)的混合物脫除空氣，并在10(TC、黑暗下攪拌過夜。過濾反應(yīng)混合物、蒸發(fā)至干并在涂敷了硅膠的制備性TLC板上純化產(chǎn)物。ESI-TOF-MS[M+H]+:C56H64N6012S3+的計(jì)算值為1207.49，實(shí)測值為1207.50。實(shí)施例426，6'，6〃-[(八氫-lH-l，4，7-三偶氮寧-l，4，7-三基)三(亞甲基)]-三銪(III)(29)的合成采用實(shí)施例24中公開的方法將化合物28轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物。ESI-T0F-MS[M-2H]2—:C48H43EuN6012S32—的計(jì)算值為572.07，實(shí)測值為572.02。實(shí)施例432，2'，2〃，2〃'_{[6-(三氟乙酰氨基氨基己基]雙(亞甲基)雙4_[(4〃-乙氧基羰基-3〃，5"-二甲基呋喃_2〃_基)吡啶-6，2-二基)]雙(亞甲基次氮基)}四(乙酸)四(乙酯)31的合成。采用實(shí)施例41中描述的方法，通過化合物30與2，4-二甲基呋喃-3-羧酸乙酯之間的反應(yīng)得到標(biāo)題化合物。實(shí)施例442，2'，2〃，2〃'_{[6_氨基己基亞氨基]雙(亞甲基)雙[4-(4"-羧基_3"，5〃-二甲基呋喃_2〃-基)]吡啶-6，2-二基-)]雙(亞甲基次氮基)}四(乙酸)銪(III)，32的合成。采用實(shí)施例21中公開的方法將化合物31轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物。ESI-T0F-MS[M-H]—:C42H48EuN6014—的計(jì)算值為1013.24，實(shí)測值為1013.25。2，2'，2〃，2〃'_{[6-(4，6_二氯_1，3，5_三嗪基)氨基甲基亞氨基]雙(亞甲基)雙[4-(4"-羧基-3〃，5"-二甲基呋喃_2〃-基)]吡啶-6，2-二基-)]雙(亞甲基次氮基M四(乙酸)銪(ni)，33的合成。采用實(shí)施例37中描述的方法將化合物32轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物。ESI-T0F-MS[M-H]—:C45H47Cl2EuN9014—的計(jì)算值為1160.18，實(shí)測值為1160.25。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>方案3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage37</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>氛尿酰氣方案4續(xù)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>方案7某些本發(fā)明的螯合物的光物理性質(zhì)示于表l中。用LS-55發(fā)光光譜儀(PerkinElmerInstruments,Connecticut,USA)測量激發(fā)和發(fā)射光譜以及在TS緩沖液(50mMtris，150mMNaCl，pH7.75)中的熒光壽命，確定了所述螯合物的光物理性質(zhì)。根據(jù)預(yù)期的熒光強(qiáng)度用適當(dāng)?shù)臐舛冗M(jìn)行測量。表1.合成的螯合物的光物理性質(zhì)化合物激發(fā)最大值/ran發(fā)射波長/nma)32861814b33061714a33861814c347618b)316616c)31761641<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>a)6，6'，6〃_[(八氫_1H_1，4，7_三偶氮寧-1，4，7_三基)三(亞甲基)]-三[(呋喃_2-基)吡啶_2-羧酸]銪(III)，按照WO2005/021538中公開的方式合成b)2，2'，2〃，2〃'-{[4-(噻吩_2'_基)吡啶_2，6_二基]雙(亞甲基次氮基)}_四(乙酸)銪(III)，按照Latva等在J.Luminescence,1997，35，149中公開的方式合成。c)2，2'，2〃，2〃'-{[4-(呋喃_2'_基)吡啶_2，6_二基]雙(亞甲基次氮基)}四-(乙酸)銪(ni)，按照W02005/021538中公開的方式合成。d)2，2'，2〃，2〃'_{[6_氨基己基亞氨基]雙(亞甲基)雙[4_(2_呋喃基)吡啶-6，2-二基)]雙(亞甲基次氮基)}四(乙酸)銪(ni)，按照W02005/021538中公開的方式合成。應(yīng)該理解，本發(fā)明的方法可以結(jié)合至多個(gè)實(shí)施方案的形式中，而本文中僅僅公開了很少的一些。雖然實(shí)施例主要以呋喃衍生物給出，但是同樣的合成步驟還可以用于相應(yīng)的噻吩衍生物。雖然本文僅提供了銪(III)螯合物的合成，但是很清楚地技術(shù)人員使用本文中公開的方法用希望的鑭系(in)鹽代替銪(in)鹽能夠制備相應(yīng)的釤(ni)、鋱(in)和鏑(III)螯合物。所屬領(lǐng)域熟練技術(shù)人員明顯可見，還存在其他實(shí)施方案，并且其并不偏離本發(fā)明的精神。因此，描述的實(shí)施方案是說明性的，其不應(yīng)構(gòu)成限制。權(quán)利要求螯合物，其包含-鑭系離子，Ln3+，-發(fā)色結(jié)構(gòu)部分，-包含至少兩個(gè)羧酸或膦酸基團(tuán)，或所述酸的酯、酰胺或鹽的螯合部分，所述螯合部分直接或者通過環(huán)狀或非環(huán)狀的含N烴鏈連接于發(fā)色結(jié)構(gòu)部分的芳族單元，-直接或者通過連接體L而連接于發(fā)色結(jié)構(gòu)部分或螯合部分上的反應(yīng)性基團(tuán)A，所述反應(yīng)性基團(tuán)A使得能夠與固相上的生物分子或官能團(tuán)結(jié)合，或者為不存在，其中i)所述反應(yīng)性基團(tuán)A選自異硫氰酸酯、溴代乙酰胺基、碘代乙酰胺基、馬來酰亞胺基、4，6-二氯-1，3，5-三嗪-2-基氨基、吡啶基二硫基、硫酯、氨基氧基、疊氮化物、酰肼、氨基、炔、可聚合基團(tuán)，和羧酸或其?；u或活性酯，或其中A′為裂解配體，如Cl、(CH3)2SO、H2O和NO3，其中-為連接體L的位置，ii)所述連接體L由1-10個(gè)結(jié)構(gòu)部分形成，每個(gè)結(jié)構(gòu)部分選自亞苯基、含有1-12個(gè)碳原子的亞烷基、乙炔二基(-C≡C-)、乙烯二基(-C＝C-)、醚(-O-)、硫醚(-S-)、酰胺(-CO-NH-，-CO-NR′-，-NH-CO-和-NR′-CO-)、羰基(-CO-)、酯(-COO-和-OOC-)、二硫化物(-SS-)、磺酰胺(-SO2-NH-，-SO2-NR′-)、砜(-SO2-)、磷酸酯(-O-PO2-O-)、二氮雜(-N＝N-)，和叔胺，其中R′表示含有少于5個(gè)碳原子的烷基，iii)所述發(fā)色結(jié)構(gòu)部分包含一個(gè)或多個(gè)芳族單元，其中所述芳族單元中的至少一個(gè)為被呋喃基或噻吩基取代的吡啶基，其中所述呋喃基或噻吩基被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的供電子基團(tuán)取代，并且任選地被羧酸或磺酸基或所述酸G的酯、酰胺或鹽取代，并且其中所述發(fā)色結(jié)構(gòu)部分彼此直接相連接而形成三聯(lián)吡啶基，或者彼此通過環(huán)狀或非環(huán)狀的含N烴鏈相連接。FPA00001045399500011.tif2.根據(jù)權(quán)利要求1的螯合物，其選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中R1和R2為供電子基團(tuán)，L、G、R'和A如權(quán)利要求1中所定義，并且對呋喃基和噻吩基而言Z分別為O或S。3.根據(jù)權(quán)利要求1的螯合物，其選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R1和R2為供電子基團(tuán)，L、G、R'和A如權(quán)利要求1中所定義，并且對呋喃基和噻吩基而言Z分別為O或S。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的螯合物，其中鑭系離子Ln3+為銪、釤、鋱或鏑。5.根據(jù)權(quán)利要求4的螯合物，其中所述鑭系離子Ln3+為銪或釤。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的螯合物，其中所述供電子基團(tuán)選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基和仲丁氧基。7.螯合劑，其包含-發(fā)色結(jié)構(gòu)部分，-包含至少兩個(gè)羧酸或膦酸或所述酸的酯或酰胺的螯合部分，所述螯合部分直接或者通過環(huán)狀或非環(huán)狀的含N烴鏈連接于發(fā)色結(jié)構(gòu)部分的芳族單元，_直接或者通過連接體L連接于發(fā)色結(jié)構(gòu)部分或螯合部分上的反應(yīng)性基團(tuán)A，所述反應(yīng)性基團(tuán)A使得能夠與固相上的生物分子或官能團(tuán)結(jié)合，其中i)所述反應(yīng)性基團(tuán)A為羧酸或其鹽、酰基鹵或酯，或氨基酸殘基-CH(NHR3)R4，其中R3為暫時(shí)的保護(hù)基，R4為羧酸或其鹽、?；u或酯，ii)所述連接體L由l-10個(gè)結(jié)構(gòu)部分形成，每個(gè)結(jié)構(gòu)部分選自亞苯基、含有1-12個(gè)碳原子的亞烷基、乙炔二基(-cec-)、乙烯二基(-C=C-)、醚(-o-)、硫醚(-s-)、酰胺(-co-NH-，-CO-NR'-，-NH-CO-和-NR'-C0-)、羰基(-C0-)、酯(-C00-和-00C-)、二硫化物(-SS-)、磺酰胺(_S02-NH-，-SO廠NR'-)、砜(_S02-)、磷酸酯(_0-P02-0-)、二氮雜(_N=N-)，和叔胺，其中R'表示含有少于5個(gè)碳原子的烷基，iii)所述發(fā)色結(jié)構(gòu)部分包含一個(gè)或多個(gè)芳族單元，其中至少一個(gè)芳族單元為被呋喃基或噻吩基取代的吡啶基，其中所述呋喃基或噻吩基被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的供電子基團(tuán)取代，并且任選地被羧酸或磺酸酯或所述酸G'的酰胺所取代，并且其中所述發(fā)色結(jié)構(gòu)部分彼此直接相連接而形成三聯(lián)吡啶，或者彼此通過環(huán)狀或非環(huán)狀的含N烴鏈相連接。8.根據(jù)權(quán)利要求7的螯合劑，其中所述供電子基團(tuán)R1和R2選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基和仲丁氧基。9.根據(jù)權(quán)利要求7的螯合劑，其選自其中W和R2為供電子基團(tuán)，L和G'如權(quán)利要求7中定義，保護(hù)基R3選自Fmoc、Boc或Bsmoc，R〃為烷基酯或烯丙基酯，R〃'為烷基，并且其中Z為0或S。10.根據(jù)權(quán)利要求7的螯合劑，其選自其中R1和R2為供電子基團(tuán)，L和G'如權(quán)利要求7中所定義，保護(hù)基R3選自Fmoc、Boc或Bsmoc，R〃為烷基酯或烯丙基酯，并且其中Z為0或S。11.螯合劑，其包含-發(fā)色結(jié)構(gòu)部分，-包含至少兩個(gè)羧酸或磷酸或所述酸的酯或酰胺的螯合部分，所述螯合部分直接或者通過環(huán)狀或非環(huán)狀的含N烴鏈連接于發(fā)色結(jié)構(gòu)部分的芳族單元上，_直接或通過連接體L連接于所述發(fā)色結(jié)構(gòu)部分或螯合部分上的反應(yīng)性基團(tuán)A，所述反應(yīng)性基團(tuán)A使得能夠與固相上的生物分子或官能團(tuán)結(jié)合，其中i)所述反應(yīng)性基團(tuán)A為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>氧原子中的一個(gè)或兩個(gè)任選地被硫代替，Z3為氯或NR6R7，R5為保護(hù)基，R6和f為包含1-8個(gè)碳的烷基，Z2為不存在或者為嘌呤堿或嘧啶堿，或者適用于合成改性低聚核苷酸的任何其他改性堿的基團(tuán)，所述堿通過a)被經(jīng)保護(hù)的羥甲基取代的烴鏈，或者b)呋喃環(huán)或吡喃環(huán)或適用于合成改性低聚核苷酸的任何改性呋喃或吡喃環(huán)與氧原子連接，ii)連接體L由1-10個(gè)結(jié)構(gòu)部分形成，每個(gè)結(jié)構(gòu)部分選自亞苯基、含有1-12個(gè)碳原子的亞烷基、乙炔二基(-C三C-)、乙烯二基(-C=C-)、醚(-0-)、硫醚(-S-)、酰胺(-C0-NH-，-CO-NR'-，-NH-CO-和-NR'-C0-)、羰基(-C0-)、酯(-C00-和-00C-)、二硫化物(-SS-)、磺酰胺(_S02-NH-，-SO廠NR'-)、砜(_S02-)、磷酸酯(_0-P02-0-)、二氮雜(_N=N-)，和叔胺，其中R'表示含有少于5個(gè)碳原子的烷基，iii)所述發(fā)色結(jié)構(gòu)部分包含一個(gè)或多個(gè)芳族單元，其中至少一個(gè)芳族單元為被呋喃基或噻吩基取代的吡啶基，其中所述呋喃基或噻吩基被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的供電子基團(tuán)取代，并且任選地被羧酸或磺酸酯或所述酸G'的酰胺取代，并且其中所述發(fā)色結(jié)構(gòu)部分彼此直接相連接而形成三聯(lián)吡啶基，或者彼此通過環(huán)狀或非環(huán)狀的含N烴鏈相連接。12.根據(jù)權(quán)利要求11的螯合劑，其中所述供電子基團(tuán)選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基和仲丁氧基。13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的螯合劑，其中Z2為下述任一種堿的基團(tuán)胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺苷、鳥嘌呤或胞嘧啶，并且所述堿通過i)被經(jīng)保護(hù)的羥甲基取代的烴鏈，或者ii)在其4-位上具有被保護(hù)的羥甲基并且任選在其2-位上具有羥基、被保護(hù)的羥基或改性羥基的呋喃環(huán)與氧原子連接。14.根據(jù)權(quán)利要求12的螯合劑，其中-Z2-0-P(NR6R7)-0-R5選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中_為連接體L的位置，匿Tr為二甲氧基三苯甲基。15.根據(jù)權(quán)利要求11的螯合劑，其選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中R〃為羧酸的烷基酯或烯丙基酯，R〃'為烷基，并且其中W和R2為供電子基團(tuán)，L和G'如權(quán)利要求11中所定義，A為如權(quán)利要求14中所定義的-Z2-0-P(NR6R7)-0-R5，Z為0或S。16.根據(jù)權(quán)利要求11的螯合劑，其選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中R〃為羧酸基的烷基酯或烯丙基酯，W和R2為供電子基團(tuán)，L和G'如權(quán)利要求ll中所定義，A為如權(quán)利要求14中所定義的-Z2-0-P(NR6R7)-0-R5，Z為0或S。17.與根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的螯合物軛合的生物分子。18.與根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的螯合物軛合的生物分子，其中所述生物分子選自低聚肽、低聚核苷酸、DNA、RNA、改性低聚-或多核苷酸、蛋白質(zhì)、低聚糖、多糖、磷脂、PNA、LNA、抗體、類固醇、半抗原、藥物、結(jié)合受體的配體和凝集素。19.根據(jù)權(quán)利要求18的生物分子，其中所述改性的低聚-或多核苷酸為一硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和/或糖_或堿改性的低聚_或多核苷酸。20.固體載體，其與根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的螯合物軛合。21.根據(jù)權(quán)利要求20的固體載體，其中所述螯合物被共價(jià)或非共價(jià)地固定在所述固體載體上。22.根據(jù)權(quán)利要求21的固體載體，其與螯合物軛合，其中所述固體載體選自適用于固相低聚核苷酸或低聚肽合成的納米顆粒、微米顆粒、載玻片、板或樹脂。23.標(biāo)記的生物分子，其是通過在固相上于低聚肽合成器上，將根據(jù)權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的螯合劑引入到低聚肽結(jié)構(gòu)中，之后脫保護(hù)以及任選地引入金屬離子而合成得到的。24.標(biāo)記的低聚核苷酸，其是通過在固相上于低聚核苷酸合成器上，將根據(jù)權(quán)利要求11-18中任一項(xiàng)的螯合劑引入到低聚核苷酸結(jié)構(gòu)中，之后脫保護(hù)以及任選地引入金屬離子而合成得到的。[24.固體載體，其與根據(jù)權(quán)利要求22的標(biāo)記的低聚肽軛合或者與根據(jù)權(quán)利要求23的標(biāo)記的低聚核苷酸軛合，其中所述低聚肽或低聚核苷酸被共價(jià)或非共價(jià)地固定在所述固體載體上。25.固體載體，其與用本發(fā)明的螯合物標(biāo)記的DNA、RNA、低聚肽、低聚核苷酸、多肽、多核苷酸和蛋白質(zhì)軛合。全文摘要本發(fā)明涉及一組新的螯合劑、新的螯合物、用所述螯合物或螯合劑標(biāo)記的生物分子以及與所述螯合物、螯合劑或標(biāo)記的生物分子軛合的固體載體。尤其地，本發(fā)明涉及可用于固相合成低聚核苷酸或低聚肽的新的螯合劑，和如此獲得的低聚核苷酸和低聚肽。文檔編號G01N33/58GK101796047SQ200880105962公開日2010年8月4日申請日期2008年9月5日優(yōu)先權(quán)日2007年9月5日發(fā)明者J·佩烏拉拉赫蒂,J·凱托拉,J·霍維寧,L·亞科拉,P·利蒂,V-M·穆卡拉申請人:華萊克有限公司