專利名稱：：采用納米顆粒的熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)的制作方法采用納米顆粒的熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明一般性涉及在負(fù)載染料的不同納米顆粒之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，該染料具有合適的激發(fā)和發(fā)射光譜以便用于FRET檢測(cè)，尤其近紅外線FRET(NIRF)檢測(cè)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及新型顆粒的制備以及利用此類顆粒之間的FRET來(lái)檢測(cè)或可視化(visualize)生物相互作用(biologicalinteractions)的方法，和生物分子耙向用結(jié)構(gòu)部分用于測(cè)定生物分子的緊密接近度(closeproximity)的用途。本發(fā)明的背景光學(xué)型生物分子分析技術(shù)如光學(xué)微量滴定板讀數(shù)和光學(xué)分子成像方法，是研究特定生物分子的瞬間和空間動(dòng)力學(xué)以及這些分子在體外和體內(nèi)的實(shí)時(shí)相互作用的非常有效的手段。這些技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越多地用于探測(cè)蛋白質(zhì)功能和基因表達(dá)。光學(xué)型技術(shù)顯示出以下幾個(gè)方面的巨大優(yōu)點(diǎn)在功能成像中顯得重要的微微秒(picosecond)時(shí)間分辯率，對(duì)于體內(nèi)顯微鏡檢查來(lái)說(shuō)顯得重要的亞微米空間分辨率，單個(gè)分子敏感性，和最小限度的侵入。這些技術(shù)還提供了在分子成像中顯得重要的多個(gè)和可識(shí)別的探針的同時(shí)使用的潛力。它們還提供因?yàn)榕懦婋x輻射所帶來(lái)的安全性。由于激光技術(shù)的快速發(fā)展，復(fù)雜的重建算法和最初為非光學(xué)的層析成像模式如CT和MRI所開(kāi)發(fā)的成像軟件，這些技術(shù)在過(guò)去的十年中有顯著的發(fā)展。在迄今研究的各種光學(xué)成像技術(shù)中，近紅外線熒光(NIRF)成像法對(duì)于非侵入的體內(nèi)成像是特別重要的，這歸因于相對(duì)低的組織吸收率，近紅外線(NIR)光的最小限度的自身熒光，和高達(dá)6-8厘米的深度組織穿透(能力)。在近紅外線熒光成像中，激光或適當(dāng)過(guò)濾的光用作激發(fā)熒光的光源。激發(fā)光穿過(guò)身體組織。當(dāng)它遇到近紅外線熒光分子("造影劑"或"探針")時(shí)，激發(fā)光被吸收。該熒光分子然后發(fā)射出具有更長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光形式的光，因此在光譜上可與激發(fā)光區(qū)分。盡管生物組織被近紅外線光的良好穿透，但是普通的近紅外線熒光探針會(huì)受到許多的為其它造影劑所遇到的相同限制，其中包括低信噪比。許多的NIRF對(duì)比度增強(qiáng)型光學(xué)成像探針已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)并且在小型動(dòng)物中進(jìn)行評(píng)價(jià)。這些研究已經(jīng)確定了近紅外線光學(xué)成像法在診斷、分子表征和許多疾病模型的治療響應(yīng)的監(jiān)測(cè)上的用途。納米顆粒已經(jīng)越來(lái)越多地用于各種各樣的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用如藥物載體和成像劑。它們是工程材料，具有典型地小于lOOnm的尺寸，足夠小從而能夠到達(dá)身體的幾乎任何地方并且能夠容易地用各種的目標(biāo)配體、多模態(tài)成像法所用的多個(gè)成像結(jié)構(gòu)部分來(lái)衍生化，或負(fù)載造影劑的多個(gè)分子，從而為不同的成像模態(tài)提供在信號(hào)強(qiáng)度上的顯著提升。納米顆粒型成像探針的NIRF成像法快速地作為非侵入式癌癥檢測(cè)、診斷和治療應(yīng)用的先進(jìn)技術(shù)而出現(xiàn)。若考慮到小分子的內(nèi)部清除和非免疫屏蔽的化合物的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，納米顆粒型成像探針提供了與小分子或低分子量聚合物型探針相比的潛在優(yōu)點(diǎn)，如對(duì)于有效的腫瘤給藥(delivery)的長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間，因?yàn)樾√结樤隗w內(nèi)快速排泄。幾篇文獻(xiàn)報(bào)道具有特征性的量子點(diǎn)(QD)(Warren，C.W.etal.Science1998，281，2016-2018)，其由包封在新型的基于聚合物或類脂的層內(nèi)的半導(dǎo)體芯組成，可用于在動(dòng)物中癌癥成像的NIRF光學(xué)成像中。然而，大部分的QD由毒性物質(zhì)如鎘組成，并且還沒(méi)有確定QD是充分穩(wěn)定的以避免在身體內(nèi)變成毒性的。巧妙的納米探針的設(shè)計(jì)和合成使得NIRF成像得以成功。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)檢測(cè)的原理是以從激發(fā)給體染料分子到空間接近的受體染料分子上的能量轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)的。FRET可用于測(cè)定在大約1到8nm范圍內(nèi)的在分子水平上的距離，因?yàn)槟芰哭D(zhuǎn)移的效率E對(duì)于在給體和受體之間的距離R是非常敏感的并且按比例地衰減到R。6/(R。6+R6)，其中R。是物質(zhì)特定的Fdrster半徑，后者被定義為當(dāng)效率是50%時(shí)的距離并且典型地在幾個(gè)納米(低于10nm)的范圍內(nèi)。取決于受體分子的熒光量子效率，從給體分子轉(zhuǎn)移至受體分子的能量能夠通過(guò)內(nèi)部轉(zhuǎn)換進(jìn)行非輻射的松弛，因此導(dǎo)致給體能量的淬滅，或能夠利用受體分子的熒光而發(fā)射出來(lái)。在本說(shuō)明書(shū)的下面部分中，(a)能夠用作FRET的給體和受體的不同分子的對(duì)被稱作"FRET染料配對(duì)(dyepair)"，和(b)由包括FRET能的給體分子的一種納米顆粒和包括不同的FRET能的受體分子的第二種不同的納米顆粒組成的不同納米顆粒的對(duì)，該不同納米顆粒的對(duì)被稱作"FRET顆粒對(duì)"。在生物系統(tǒng)中，F(xiàn)RET用來(lái)檢測(cè)適當(dāng)標(biāo)記的生物分子的相互的空間接近性。FRET能夠用作檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的方法，例如作為檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)、受體-配體相互作用、核酸雜化、激素_受體相互作用或蛋白質(zhì)與核酸的結(jié)合的一種方法。該檢測(cè)本身通過(guò)測(cè)量在給體熒光或受體熒光的強(qiáng)度變化或光譜變化，或通過(guò)測(cè)量在給體熒光的衰減時(shí)間上的變化來(lái)進(jìn)行的。在這方面許多的應(yīng)用已描述在文獻(xiàn)中，如在免疫熒光分析中特定抗原的檢測(cè)(美國(guó)專利No.3，996，345;美國(guó)專利No.4，160，016;美國(guó)專利No.4，174，384;美國(guó)專利No.4，199，559)。用作標(biāo)記和附著于生物分子如熒光素、水溶性花青或若丹明上的有機(jī)染料分子例如是制造FRET染料對(duì)的傳統(tǒng)商購(gòu)材料。這些有機(jī)熒光染料的一般缺點(diǎn)是它們常常顯示出的光穩(wěn)定性對(duì)于許多應(yīng)用來(lái)說(shuō)是不夠的。特別地在氧氣或自由基存在下，這些染料中的一些在僅僅幾個(gè)百萬(wàn)光吸收/光發(fā)射周期之后不可逆地?fù)p壞或破壞。同時(shí)，一些熒光染料能夠?qū)τ谒鼈冟徑纳锊牧暇哂卸竞ψ饔?。此外，用作?biāo)記的熒光染料常常具有非常短的血循環(huán)時(shí)間，使得它們對(duì)于研究隨著時(shí)間的推移所發(fā)生的生物相互作用是不夠的。美國(guó)專利No.5，236，692;美國(guó)專利No.6，238，931;和美國(guó)專利No.6，251，687描述了使用在同一納米顆粒中具有FRET染料對(duì)的納米顆粒的方法。這些方法的目的是提供在激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)之間有大的凈差異(即，大的凈斯托克斯(Stokes)位移)以改進(jìn)熒光測(cè)量的信號(hào)與背景品質(zhì)因數(shù)的顆粒，其中該背景應(yīng)歸因于典型地具有相對(duì)小的斯托克斯位移的自身熒光。然而該FRET在相同顆粒中是恒定的并且無(wú)法提供在兩種不同的顆粒之間接近度的指標(biāo)，例如一種顆粒連接(attach)于一個(gè)生物分子上和另一種顆粒連接于另一個(gè)生物分子上。因此這些參考文獻(xiàn)描述了包括FRET染料對(duì)但不包括FRET顆粒對(duì)的顆粒。盡管此類方法已經(jīng)在它們的特殊應(yīng)用中實(shí)現(xiàn)一定程度的成功，但是仍然需要一種方法，其中包括FRET顆粒對(duì)的單獨(dú)、不同的明亮的熒光納米顆粒通過(guò)靶向生物分子以緊密接近地集合在一起并被檢測(cè)到。本發(fā)明的概述本發(fā)明通過(guò)所附權(quán)利要求來(lái)定義。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了可視化(visualize)在試樣中生物分子的緊密接近度的方法。該試樣用包括兩種或多種熒光顆粒的那一類型的FRET顆粒對(duì)進(jìn)行處理，該顆粒各包括具有30-50wt^的通式1單體的交聯(lián)聚合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>通式l，其中n是10到200。熒光顆粒中的一種包括能量給體分子和熒光顆粒的另一種包括能量受體分子。各熒光顆粒包括以共價(jià)鍵連接于外表面的一種或多種靶向用結(jié)構(gòu)部分。該試樣暴露于光源并通過(guò)例如光電二極管、光電倍增管或數(shù)字式攝象機(jī)檢測(cè)來(lái)自FRET顆粒對(duì)的發(fā)射光。附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的上述和其它目的，特征和優(yōu)點(diǎn)將從在附圖中舉例說(shuō)明的本發(fā)明的實(shí)施方案的以下更具體敘述清楚地了解。附圖的各元素相互之間不一定按比例。圖1顯示了負(fù)載染料的納米顆粒的吸收曲線并且舉例說(shuō)明當(dāng)這些顆粒的對(duì)用于形成選自于顆粒A和顆粒B，顆粒B和顆粒C，顆粒B和顆粒D，顆粒C和顆粒D中的FRET顆粒對(duì)時(shí)在吸收上的重疊。發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明下面是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的參考附圖的詳細(xì)說(shuō)明，在附圖中相同的參考編號(hào)表示在幾個(gè)附圖的每一個(gè)中的結(jié)構(gòu)的相同單元。本發(fā)明涉及通過(guò)使用能夠共同定位(co-locate)和進(jìn)行FRET的明亮熒光納米顆粒來(lái)可視化緊密接近的生物分子的新型方法，以及使用它們的診斷和藥物篩選方法。這些分析對(duì)于活組織檢查(biopsy)、體液、血液分析和組織樣品的醫(yī)用診斷以及小分子、肽、蛋白質(zhì)和siRNA的藥物篩選是重要的。FRET顆粒對(duì)能夠根據(jù)本發(fā)明用于進(jìn)行結(jié)合分析，抑制劑分析，受體_配體分析，細(xì)胞_相互作用物分析，激素相互作用分析，蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用分析，類脂(lipid)相互作用分析，糖蛋白相互作用分析，酶-底物相互作用分析，蛋白質(zhì)組(proteome)分析，染色體組分析，蛋白酶作用分析，泛素(ubiquitin)分析，細(xì)胞器官分析，siRNA分析，RNA分析，DNA分析，和用于分析以上任何一種的動(dòng)力學(xué)。根據(jù)本發(fā)明的納米顆?？梢猿尸F(xiàn)為生物學(xué)的貨物裝載型(cargo-laden)納米顆粒的形式，該納米顆粒已描述在懸而未決的、共同轉(zhuǎn)讓的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)No.11/732，424(2007年4月3日申請(qǐng))中，Leon等人，標(biāo)題"LOADEDLATEXOPTICALMOLECULARIMAGINGPR0BES"，它的公開(kāi)內(nèi)容被引入本說(shuō)明書(shū)供參考，和描述在前面提及的Harder等人的申請(qǐng)序列號(hào)No.11/400，935中。在此類納米顆粒中，熒光猝滅(fluorescencequenching)可以通過(guò)近紅外線熒光團(tuán)的自淬滅或通過(guò)從近紅外線熒光團(tuán)到猝滅劑的能量轉(zhuǎn)移來(lái)引起；和熒光活化可以通過(guò)在熒光活化位點(diǎn)上的酶分裂來(lái)誘導(dǎo)。FRET的檢測(cè)或測(cè)量必然需要成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)以提供所提純或構(gòu)造的樣品物質(zhì)的簡(jiǎn)單分析，或分辨復(fù)雜混合物的熒光組分，或兩者。盡管熒光檢測(cè)系統(tǒng)可以經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)而具有足夠的或最大的能力，但是支持檢測(cè)和測(cè)量的特殊FRET顆粒對(duì)的選擇則需要某些標(biāo)準(zhǔn)的考慮，就象本發(fā)明人所教導(dǎo)的。本領(lǐng)域中的那些技術(shù)人員將會(huì)理解，一些FRET分子可以支持一定水平的檢測(cè)和測(cè)量，如果該對(duì)具有合適的譜、是穩(wěn)固的熒光染料并且支持在溶液中的動(dòng)態(tài)平衡(它對(duì)于生產(chǎn)性(productive)FRET測(cè)量是重要的)。最低限度地生產(chǎn)性的(marginallyproductive)FRET測(cè)量是超過(guò)熒光信號(hào)/背景的固有限制的那種。然而，熒光顆粒不是可溶性分子，并且它們的尺寸、成分和溶液動(dòng)力學(xué)對(duì)于它們的FRET能力是關(guān)鍵的。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了FRET顆粒對(duì)的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，包括1.熒光染料激發(fā)光譜必須是充分地不相重疊的。2.熒光染料共振譜必須是充分地重疊。3.熒光必須是充分明亮的。4.在顆粒內(nèi)的熒光染料濃度必須足夠低以避免自淬滅。5.顆粒必須是足夠小的，因此足夠份的熒光分子是在最緊密顆粒靠近程度下的接近度之內(nèi)。6.熒光分子與顆粒的分布必須足以支持熒光染料接近度。7.熒光染料的分子取向必須是定向排列的或無(wú)規(guī)的以確保偏振光的足夠的共振吸收。8.顆粒必須是足夠小的以懸浮在溶液中，充分地分散以參與溶液動(dòng)力學(xué)，支持為了確定"分子"接近度的量度所需要的碰撞、締合和分裂的動(dòng)態(tài)平衡的基本要素(essential)。9.顆粒必須在溶液中是充分獨(dú)立的("可溶性"和非聚集的)以支持在溶液動(dòng)力學(xué)中的定量參與。其它質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是本領(lǐng)域中的那些技術(shù)人員已知的。然而，如果以上列出的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中的任何一種是缺少的、不知道的或最低限度的，則FRET顆粒對(duì)的生產(chǎn)能力也許不符合為了檢測(cè)或測(cè)量顆粒接近度所需要的信號(hào)/背景閾值。因此，對(duì)FRET顆粒對(duì)的質(zhì)量定性包括為候選顆粒對(duì)測(cè)量FRET的目前公開(kāi)的本發(fā)明方法。當(dāng)FRET顆粒對(duì)涉及用它們處理的試樣或樣品和用于檢測(cè)它們的測(cè)量裝置時(shí)，下面描述它們的幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。首先，F(xiàn)RET顆粒對(duì)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)應(yīng)該不會(huì)如此緊密地對(duì)應(yīng)于試樣或樣品的吸收或熒光以致于該試樣或樣品很大程度上混淆該FRET測(cè)量。其次，該顆粒必須具有足夠的光亮度和具有給體顆粒熒光和受體顆粒吸收的良好重疊，以實(shí)現(xiàn)有效的FRET而產(chǎn)生FRET顆粒對(duì)。第三，引入在顆粒中的染料必須分散在該顆粒內(nèi)以使得粒度不會(huì)在顆粒之間產(chǎn)生對(duì)FRET的相當(dāng)大的距離阻隔性。也就是說(shuō)，在顆粒中的染料必須隨機(jī)地分布于顆粒之內(nèi)，使得對(duì)于FRET對(duì)來(lái)說(shuō)，一些的染料處于與另一個(gè)顆粒中的染料之間相距的F6rster距離之內(nèi)以實(shí)現(xiàn)有效的fret。因此，在fret顆粒對(duì)的第一種顆粒內(nèi)的染料必須至少部分地足夠接近顆粒的表面或處在顆粒的表面上，以便允許在該顆粒的染料與FRET顆粒對(duì)的第二種顆粒的染料之間足夠小的分離，從而實(shí)現(xiàn)有效的FRET。第四，該顆粒必須能夠在表面上承載相同或不同的生物分子靶向用結(jié)構(gòu)部分，以便允許FRET顆粒對(duì)非常接近地結(jié)合于生物分子。第五，用于檢測(cè)熒光信號(hào)的儀器必須一般根據(jù)染料和所要可視化的試樣或樣品的參數(shù)來(lái)設(shè)計(jì)。這些點(diǎn)將更詳細(xì)地討論并且舉例說(shuō)明了在開(kāi)發(fā)采用FRET顆粒對(duì)的可視化技術(shù)中的一些錯(cuò)綜復(fù)雜的事情。通過(guò)使用現(xiàn)有方法，已經(jīng)在各染料之間實(shí)現(xiàn)FRET，據(jù)此典型地使用一種染料/每種生物分子靶向用結(jié)構(gòu)部分。這些單獨(dú)的染料對(duì)于染料消退(dyefade)是更敏感的，這歸因于對(duì)氧氣、自由基和PH變化的不穩(wěn)定性，并且常常通過(guò)各種生物過(guò)程迅速地從血液中清除。通過(guò)在顆粒中引入染料，多種染料分子可用于提高光亮度和穩(wěn)定性。納米顆粒的使用允許多種生物分子靶向用結(jié)構(gòu)部分連接于納米顆粒表面上以改進(jìn)對(duì)靶部位的結(jié)合和在試樣的各種組織之中的生物分布。本發(fā)明可用的染料是在400-1000nm范圍中發(fā)熒光的熒光、疏水性的染料。染料的種類包括，但不必然地限于氧雜菁(oxonol)，吡喃鎗(pyrylium)，方酸型(Squaric)，克酮酸型(croconic)，玫瑰紅酸(rodizonic)，聚偶氮噴丹烯(polyazaindacenes)或香豆素(co咖arin)，閃爍染料(scintillation)(通常噁唑和噁二唑)，芳基_和雜芳基_取代的聚烯烴(C2-C8烯烴部分)，部花菁，羰花菁，酞菁，噁嗪，羰基苯乙烯基，卟啉染料，二氟化硼絡(luò)合二吡咯亞甲基染料(dipyrrometheneborondifluoridedye)，二氟化硼絡(luò)合氮雜二吡咯亞甲基染料，和噁嗪染料?？捎糜诒景l(fā)明中的商購(gòu)熒光染料列于表1中和具體的染料結(jié)構(gòu)隨后對(duì)于染料1，染料2，染料3和染料4顯示在通式中。優(yōu)選的染料是羰花菁，酞菁或二氟化硼絡(luò)合氮雜二吡咯亞甲基。表1.商購(gòu)的熒光染料。高氯酸5-氨基-9-二乙基亞胺基苯并(a)吩噁嗪酮鎗鹽(5_Amino_9_diethyliminobenzo(a)phenoxazoniumPerchlorate)7-氨基-4-甲基羰基苯乙烯基7_氨基_4-甲基香豆素7_氨基-4-三氟甲基香豆素3-(2'-苯并咪唑基)_7-^^二乙基氨基香豆素3-(2'-苯并噻唑基)_7-二乙基氨基香豆素2_(4-聯(lián)苯基)-5-(4-叔丁基苯基)-1，3，4-噁二唑2_(4-聯(lián)苯基)-5-苯基-1，3，4-噁二唑2_(4-聯(lián)苯基)-6-苯基苯并噁唑-1，32，5-雙-(4-聯(lián)苯基)-1，3，4-噁二唑2，5-雙-(4-聯(lián)苯基)-噁唑4，4"'-雙_(2-丁基辛氧基)-對(duì)聯(lián)四苯對(duì)-雙(鄰_甲基苯乙烯基)-苯高氯酸5，9-二氨基苯并(a)吩噁嗪酮鎗鹽4_二氰基亞甲基-2-甲基-6-(對(duì)-二甲基氨基苯乙烯基)-4H-吡喃l，l'-二乙基-2，2'-羰花菁碘化物l，l'-二乙基-4，4'-羰花菁碘化物3，3'-二乙基-4，4'，5，5'-二苯并硫雜三羰花菁碘化物(3，3'-Diethyl-4，4'，5，5'-dibenzothiatricarbocyaninel，l'-二乙基-4，4'-二羰花菁碘化物l，l'-二乙基-2，2'-二羰花菁碘化物3，3'-二乙基-9，11--亞新戊基硫雜三羰花菁碘化物1，3'-二乙基-4，2'-喹啉基噁羰花菁碘化物1，3'-二乙基-4，2'-喹啉基硫雜羰花菁碘化物高氯酸3-二乙基氨基-7-二乙基亞胺基吩噁嗪酮鎗鹽7-二乙基氨基-4-7-二7-二3，3'3，3'3，3'3，3'4，6-2，2"2，2"7-二7-二7-二乙基氨基_4-三氟甲基香豆素-二乙基噁二碳花菁碘化物-二乙基硫雜羰花菁碘化物-二乙基硫雜二羰花菁碘化物-二乙基硫雜三羰花菁碘化物二甲基-7-乙基氨基香豆素'-二甲基-對(duì)聯(lián)四苯-二甲基-對(duì)-三聯(lián)苯甲基氨基-1-甲基_4-甲氧基-8-氮雜喹諾酮-2甲基氨基_4-甲基喹諾酮_2甲基氨基_4-三氟甲基香豆素高氯酸2-(4-(4-二甲氨基苯基)-1，3-丁二烯基)-3-乙基苯并噻唑鎗鹽高氯酸2-(6-(對(duì)-二甲氨基苯基)-2，4-亞新戊基-1，3，5-己三烯基)-3-甲基苯并噻唑鎗鹽高氯酸2-(4-(對(duì)-二甲氨基苯基)-1，3-丁二烯基)-1，3，3-三甲基_3H_噴哚鎗^!.3，3'-二甲基噁三羰花菁碘化物2，5-二苯基呋喃2，5-二苯基噁唑4，4'-二苯基均二苯乙烯高氯酸1-乙基-4-(4-(對(duì)_二甲氨基苯基)-1，3-丁二烯基)_吡啶鎗鹽高氯酸1-乙基-2-(4-(對(duì)_二甲氨基苯基)-1，3-丁二烯基)_吡啶鎗鹽高氯酸1-乙基-4-(4-(對(duì)_二甲氨基苯基)-1，3-丁二烯基)_喹啉鎗鹽高氯酸3-乙胺基-7-乙基亞胺基-2，8-二甲基吩噁嗪_5_鎗鹽高氯酸9-乙胺基-5-乙胺基-10-甲基-5H-苯并(a)吩噁嗪酮鎗鹽7-乙胺基-6_甲基-4-三氟甲基香豆素7-乙胺基-4-三氟甲基香豆素l，l''3，3，3'，3'-六甲基_4，4'，5，5'_二苯并_2，2'_口引哚三羰花菁碘化物l，l'，3，3，3'，3'_六甲基噴哚二羰花菁碘化物l，l'，3，3，3'，3'_六甲基噴哚三羰花菁碘化物2-甲基-5-叔丁基_對(duì)聯(lián)四苯3-(2'-N-甲基苯并咪唑基)-7-N，N-二乙基氨基香豆素2-(1-萘基)-5-苯基噁唑2，2'-對(duì)-亞苯基-雙(5-苯基噁唑)3，5，3""'，5〃"'-四-叔丁基-對(duì)-聯(lián)六苯3，5，3""，5〃"-四-叔丁基-對(duì)-五聯(lián)苯2，3，5，6-lH，4H-四氫_9_乙?；翰〈9，9a，l_gh>香豆素2，3，5，6-lH，4H-2，3，5，6-lH，4H-2，3，5，6_1H，4H-2，3，5，6_1H，4H-2，3，5，6_1H，4H-3，3'，2〃，3〃'2，5，2〃〃，5〃'對(duì)_三聯(lián)苯對(duì)聯(lián)四苯尼羅紅若丹明700噁嗪750若丹明800IR125IR144IR140IR132IR26IR5二苯基己二條二苯基丁二烯四苯基丁二烯萘芘(Pyrene)屈(Chrysene)紅熒烯(Rubrene)六苯并苯(Coronene)-9-羰基乙氧基喹嗪并-〈9，9a，l-gh>香豆素-8-甲基喹嗪并-〈9，9a，l->香豆素-9-(3-吡啶基)_喹嗪并_〈9，9a，l-gh>香豆素-8-三氟甲基喹嗪并-〈9，9a，l-gh>香豆素四氫喹嗪并_〈9，9a，l-gh>香豆素-四甲基-對(duì)四聯(lián)苯-四甲基-對(duì)-五聯(lián)苯FRET顆粒對(duì)的所需光譜性能的例子在圖1中給出。特別地，圖1顯示KODAKX-SIGHT549,650,691和761成像劑或納米顆粒的吸收特性。這些成像劑已經(jīng)由EastmanKodak公司在2007年2月28日至3月2日于加利福尼亞州舊金山市舉行的MolecularMedicineTri-Conference進(jìn)行了介紹。然而，本領(lǐng)域中的那些技術(shù)人員將會(huì)理解，本發(fā)明能夠使用的具有類似的光譜性能的其它此類納米顆粒。用于產(chǎn)生FRET顆粒對(duì)的優(yōu)選染料的例子在下面給出。染料l染料2染料3染料4然后從表II中所示的這些染料的合適結(jié)合制備四種FRET顆粒對(duì)。表II.FRET顆粒負(fù)載用的染料的例子<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>FRET顆粒給體_受體對(duì)的例子示于表III中。表111.FRET顆粒給體_受體對(duì)的例子<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>因此通過(guò)使用FRET顆粒對(duì)，能夠?qū)τ谌N不同的光譜選擇性檢測(cè)事件進(jìn)行可視化。也就是說(shuō)，可以使用三種不同的光譜選擇性生物分布圖像，即光譜選擇不參與FRET的給體顆粒的檢測(cè)事件、光譜選擇不參與FRET的受體顆粒的檢測(cè)事件，和當(dāng)FRET顆粒對(duì)處于緊密接近度時(shí)FRET的可視化。納米顆粒組裝體(assembly)的尺寸是在確定它們?cè)谏飳W(xué)組合物中的用處的另一個(gè)主要參數(shù)。在身體內(nèi)給藥后，大的顆粒被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)消除并且不能容易地輸送到疾病位點(diǎn)。參見(jiàn)，例如，Volkheimer，Pathologe14:247(1993);KwonandKataoka，Adv.Drug.Del.Rev.16:295(1995);Moghimietal.，"Nanomedicine:CurrentStatusandFutureProspects."FASEBJournal2005，19，311-330。大于lOOnm的顆粒容易被間質(zhì)巨噬細(xì)胞清除，而150nm或更大的顆粒容易積聚在肝臟中。同時(shí)，大的顆粒在細(xì)胞中的輸送和細(xì)胞內(nèi)的輸送是有限的或可忽略的。參見(jiàn)，例如，Labhasetwaretal.，Adv.DrugDel.Res.24:63(1997)。已經(jīng)表明，具有從500nm到超過(guò)1微米的尺寸的聚集陽(yáng)離子物質(zhì)在細(xì)胞轉(zhuǎn)染(transfection)中是無(wú)效果的。大的顆粒，特別地，帶陽(yáng)電荷的那些大顆粒在身體內(nèi)顯示出高毒性，部分地歸因于對(duì)肝臟的副作用和栓塞。參見(jiàn)，例如Volkheimer，Pathologe14:247(1993);KhopadeetalPharmazie51:558(1996);Yamashitaetal.，Vet.Hum.Toxico1，39:71(1997)。具有疏水性組成的顆粒將改進(jìn)染料光穩(wěn)定性和光亮度。具有親水性組成的顆粒將改進(jìn)生物分布和血循環(huán)時(shí)間。已經(jīng)嘗試其它方法來(lái)滿足具有核/殼結(jié)構(gòu)的顆粒的水溶性和水不溶性的需要，其中中心核是水不溶性的，外圍的殼是水溶性的，和該熒光分子包含在芯中。迄今已知的許多熒光納米顆粒是水不溶性的由熒光金屬如鑭系元素和鎘/硒組成的并且還顯示出毒性和弱的生物分布。為了克服這些缺陷，已經(jīng)使用一些方法在金屬納米顆粒或不溶性的芯周圍產(chǎn)生水溶性聚合物殼。這些聚合物殼增大納米顆粒的直徑并且在給體顆粒和受體顆粒之間的間距變得太大，無(wú)法進(jìn)行有效的FRET。該FRET顆粒對(duì)在表面上具有官能團(tuán)如胺，它可用于生物分子靶向用結(jié)構(gòu)部分的連接。本發(fā)明的FRET顆粒能夠用作承載生物學(xué)組分或藥物組分的載體。具體地說(shuō)，用作載體的FRET顆粒對(duì)不一定包封特定的治療或成像組分，而是用作生物組分或藥物組分的載體。生物組分或藥物組分包括治療劑，診斷劑，染料或輻射照相造影劑。該術(shù)語(yǔ)"診斷劑"包括能夠用作造影劑和因此在宿主中產(chǎn)生可檢測(cè)的指示信號(hào)的組分?？蓹z測(cè)的指示信號(hào)可以是Y射線-發(fā)射信號(hào)，放射性信號(hào)，反射波信號(hào)，熒光檢查信號(hào)，或生理信號(hào)，等等。在這里使用的術(shù)語(yǔ)生物醫(yī)學(xué)劑(biomedicalagent)包括有效治療生理失調(diào)的生物體活性物質(zhì)，藥物，酶，激素，甾類，重組體產(chǎn)物，等等。示例性的治療劑是抗生素，血栓溶解酶如尿激酶或鏈激酶，胰島素，生長(zhǎng)激素，化學(xué)治療劑如阿霉素和抗病毒藥如干擾素和無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷(acyclovir)。在酶降解之后，如通過(guò)蛋白酶或水解酶，該治療劑能夠隨著時(shí)間的推移被釋放出來(lái)。包括在本發(fā)明內(nèi)的是兩種或多種組合物，該組合物包括本發(fā)明所使用的納米顆粒的交聯(lián)聚合物，和合適的靶向分子以及給體和受體染料對(duì)。在這里使用的術(shù)語(yǔ)"靶向用結(jié)構(gòu)部分"指連接到本發(fā)明的聚合物網(wǎng)絡(luò)上的任何分子、原子或離子，它們?cè)鰪?qiáng)結(jié)合、輸送、積聚、停留時(shí)間、生物利用率或改善本發(fā)明的聚合物網(wǎng)絡(luò)或生物學(xué)活性組合物在體內(nèi)或細(xì)胞中的生物活性。靶向用結(jié)構(gòu)部分常常包括抗體，抗體的片段，或嵌合(chimeric)抗體分子，典型地對(duì)于某些細(xì)胞表面抗原具有特異性。靶向用結(jié)構(gòu)部分也可以是，例如，與細(xì)胞表面受體有特定的相互作用的激素，或具有細(xì)胞表面受體的藥物。例如，糖脂能夠用于靶向多糖受體。靶向用結(jié)構(gòu)部分也能夠是，例如酶，外源凝集素，或多糖。低分子量靶向用結(jié)構(gòu)部分，如葉酸和它們的衍生物，也可用于本發(fā)明中。該靶向用結(jié)構(gòu)部分也可以是多核苷酸，多肽，肽模擬物(p印tidomimetic)，碳水化合物(包括多糖)，它們的衍生物或通過(guò)組合化學(xué)法和生物學(xué)獲得的其它化學(xué)物質(zhì)。靶向用結(jié)構(gòu)部分能夠用于促進(jìn)本發(fā)明的FRET顆粒對(duì)的細(xì)胞內(nèi)輸送(例如輸送至細(xì)胞核)，通過(guò)使用例如融合肽作為耙向分子，由Soukchareunetal.，BioconjugateChem.，6，43，(1995)或Araretal.，BioconjugateChem.，6,43(1995)所述；染色體組型肽；或其它生物特異性基團(tuán)提供位點(diǎn)導(dǎo)向的到細(xì)胞中的輸送(尤其，從核內(nèi)體腔室(endosomiccompartments)離開(kāi)而進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中，或輸送到細(xì)胞核中)。所述組合物能夠進(jìn)一步包括生物學(xué)組分或藥物組分，這些組分包括識(shí)別特定靶細(xì)胞的靶向用結(jié)構(gòu)部分。細(xì)胞表面受體通過(guò)與用作載體的FRET顆粒對(duì)的所述FRET顆粒締合的靶向用結(jié)構(gòu)部分所進(jìn)行的識(shí)別和結(jié)合，能夠是所述組合物的特征。對(duì)于本發(fā)明，被FRET顆粒對(duì)的FRET顆粒攜帶的化合物可以被稱作"承載的"化合物。例如，包括識(shí)別如上所述的特定靶細(xì)胞的靶向用結(jié)構(gòu)部分的生物學(xué)或藥物組分是"承載的"化合物。這一特征利用了以下理解細(xì)胞表面結(jié)合事件常常是在導(dǎo)致一定范圍的事件(特別是受體媒介的(rec印tor-mediated)胞吞作用)的細(xì)胞級(jí)聯(lián)(cellularcascade)中的初始步驟。該術(shù)語(yǔ)"受體媒介的胞吞作用"("RME")—般描述了一種機(jī)理，根據(jù)該機(jī)理，受到因?yàn)榘邢蛴媒Y(jié)構(gòu)部分結(jié)合于位于細(xì)胞表面上的受體所催化，結(jié)合了受體的靶向用結(jié)構(gòu)部分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部(internalize)。許多蛋白質(zhì)和其它結(jié)構(gòu)經(jīng)由受體媒介的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞中，其中包括胰島素，表皮生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)激素，促甲狀腺激素，神經(jīng)生長(zhǎng)因子，降血鈣素，胰高血糖素，和許多其它類似物。受體媒介的胞吞作用獲得了將FRET顆粒對(duì)的所述FRET顆粒(可能含有其它生物學(xué)組分或藥物組分)輸送到細(xì)胞內(nèi)部的適宜機(jī)理。在RME中，靶向用結(jié)構(gòu)部分被位于細(xì)胞表面上的受體的結(jié)合，能夠引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，它包括胞吞響應(yīng)。因此，用作具有締合的靶向用結(jié)構(gòu)部分的載體的FRET顆粒對(duì)的FRET顆粒，能夠結(jié)合于細(xì)胞表面上和隨后內(nèi)陷(invaginate)并進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。能夠用作本發(fā)明可利用的靶向劑的那些結(jié)構(gòu)部分的代表性但非限制性的列表包括蛋白質(zhì)，肽，核酸衍生物(即tomers)，小的有機(jī)分子，毒素，白喉(diphtheria)毒素，假單胞細(xì)菌屬毒素，霍亂菌毒素，蓖麻毒，刀豆素A，勞氏肉瘤病毒，西門(mén)利克森林病毒，水泡性口膜炎病毒，腺病毒，輸鐵蛋白，低密度脂蛋白，運(yùn)鈷胺素蛋白，卵黃蛋白質(zhì)，表皮生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)激素，促甲狀腺激素，神經(jīng)生長(zhǎng)因子，降血鈣素，胰高血糖素，催乳激素，促黃體生成激素，甲狀腺激素，血小板衍生生長(zhǎng)因子，干擾素，兒茶酚胺，肽模擬物，糖脂，糖蛋白和多糖。現(xiàn)有這些結(jié)構(gòu)部分的同系物或片段也能夠使用。這些靶向用結(jié)構(gòu)部分能夠與FRET顆粒對(duì)的FRET顆粒相締合并用于將FRET顆粒對(duì)的FRET顆粒導(dǎo)向靶細(xì)胞，隨后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。沒(méi)有要求整個(gè)結(jié)構(gòu)部分用作靶向用結(jié)構(gòu)部分。已知與特定的受體或其它結(jié)構(gòu)相互作用的這些結(jié)構(gòu)部分的較小片段也能夠用作靶向用結(jié)構(gòu)部分?？贵w或抗體片段代表了一類的最普遍使用的靶向用結(jié)構(gòu)部分，后者能夠被利用來(lái)增強(qiáng)FRET顆粒對(duì)到細(xì)胞中的攝入?？贵w可以通過(guò)本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員已知的各種技術(shù)中的任何——禾中來(lái)制備。參見(jiàn)，例如，HarlowandLane，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory，1988?？贵w能夠通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來(lái)生產(chǎn)，其中包括單克隆抗體的產(chǎn)生或經(jīng)由抗體基因轉(zhuǎn)染到合適的細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主中，以便讓產(chǎn)生重組體抗體。在一種技術(shù)中，包括多肽的免疫原最初被注射到各種哺乳動(dòng)物(例如，小鼠，大鼠，兔，綿羊，或山羊)的任何一種的體內(nèi)。如果該多肽連接到載體蛋白質(zhì)如牛血清清蛋白或鑰孔血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin)，則可以引起優(yōu)異的免疫響應(yīng)。該免疫原被注射到動(dòng)物宿主中，優(yōu)選根據(jù)引入一種或多種增效免疫(劑)的預(yù)定日程表，并且該動(dòng)物定期抽血。為該多肽特定的多克隆的抗體然后通過(guò)例如采用連接于合適固體載體上的多肽的親和色譜法從此類抗血清中提純。為所述的抗原性多肽特定的單克隆抗體可通過(guò)例如使用KohlerandMilstein，Eur.J.Immunol.6:511-519，1976的技術(shù)和該技術(shù)的改進(jìn)形式來(lái)制備。單克隆抗體可以從正在生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞集落(hybridomacolonies)的上層清液中分離。另外，各種的技術(shù)可以利用來(lái)增強(qiáng)該產(chǎn)率，如該雜交瘤細(xì)胞系注射到合適脊椎動(dòng)物宿主如小鼠的腹膜腔中。然后從腹水流體或血液中收集單克隆抗體。通過(guò)普通技術(shù)如色譜法，凝膠過(guò)濾，沉淀和萃取法從抗體中除去污染物。本發(fā)明的多肽可用于在例如親和色譜步驟中的凈化過(guò)程。包括從非人免疫球蛋白衍生的抗原結(jié)合位點(diǎn)的許多"人類化(humanized)"抗體分子已經(jīng)有描述(Winteretal.(1991)Nature349:293-299;Lobuglioetal.(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA86:4220-4224)。這些"人類化"分子被設(shè)計(jì)以最小化對(duì)于嚙齒類動(dòng)物抗人類(antih咖an)抗體分子的不希望有的免疫響應(yīng)，該抗體會(huì)限制這些結(jié)構(gòu)部分在人受試者中治療應(yīng)用的持續(xù)時(shí)間和效率。Affibody⑧親和配體是研究試劑，通過(guò)使用蛋白質(zhì)工程設(shè)計(jì)技術(shù)所生產(chǎn)。它們是由以蛋白A的IgG結(jié)合疇當(dāng)中的一個(gè)的支架為基礎(chǔ)的三螺旋形束組成的小的、簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)。蛋白A是來(lái)自細(xì)菌金黃色葡萄球菌的表面蛋白質(zhì)。該支架具有作為親和配體的優(yōu)異特征，并且能夠被設(shè)計(jì)以高親合性結(jié)合于任何給定的靶蛋白上。該疇由58種氨基酸組成，其中的13種是隨機(jī)化分布的以產(chǎn)生具有許多配體變型的Affibody⑧庫(kù)。因此，該庫(kù)由具有相同骨架和不同表面結(jié)合性能的許多蛋白質(zhì)配體組成。在功能上，Affibody⑧分子模擬單克隆抗體。與抗體相比，Affibody⑧分子的最明顯的不同之點(diǎn)是小尺寸。Affibody⑧分子具有6kDa的分子量，而抗體的分子量是150kDa。盡管它的小尺寸，但是Affibody⑧分子的結(jié)合部位與抗體的結(jié)合部位相似。與抗體相比Affibody⑧分子的優(yōu)點(diǎn)包括它們的小尺寸、分子的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)、能夠經(jīng)受住寬范圍的分析條件(包括極端ph和升高的溫度)的它們的穩(wěn)固的物理性能，和它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)正確地折疊的能力。接合或直接偶聯(lián)到本發(fā)明所使用的fret顆粒上可通過(guò)c-末端半胱氨酸來(lái)促進(jìn)。Affibody⑧分子具有為親和純化、樣品制備和蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用所需要的有高度競(jìng)爭(zhēng)性的性能。維生素類和其它主要礦物和營(yíng)養(yǎng)物能夠用作耙向用結(jié)構(gòu)部分以增強(qiáng)FRET顆粒對(duì)被細(xì)胞的攝取。尤其，維生素類靶向用結(jié)構(gòu)部分能夠選自于葉酸，葉酸的葉酸受體結(jié)合用類似物，和其它葉酸受體_結(jié)合靶向用結(jié)構(gòu)部分，生物素，生物素的生物素受體_結(jié)合用類似物和其它生物素受體_結(jié)合靶向用結(jié)構(gòu)部分，核黃素，核黃素的核黃素受體_結(jié)合類似物和其它核黃素受體_結(jié)合用配體，和維生素Bl，維生素Bl的維生素Bl受體-結(jié)合用類似物和其它維生素Bl受體-結(jié)合靶向用結(jié)構(gòu)部分。被認(rèn)為觸發(fā)受體媒介的胞吞作用和因此根據(jù)目前公開(kāi)的方法也可使用的附加營(yíng)養(yǎng)物，是肉堿，肌醇，硫辛酸，煙酸，泛酸，吡哆醛，和抗壞血酸，和類脂可溶性維生素A，D，E和K。此外，現(xiàn)有技術(shù)中描述的"免疫脂質(zhì)體"(有抗體連接于脂質(zhì)體表面上的脂質(zhì)體)中的任何一種適合用于所述組合物中。因?yàn)椴皇侨康淖匀患?xì)胞膜具有生物學(xué)活性的生物素或葉酸受體，所以，所述組合物針對(duì)特殊細(xì)胞系的體外使用，能夠包括首先改變或另外改性該細(xì)胞系以確保生物學(xué)活性的生物素或葉酸受體的存在。因此，在細(xì)胞膜上生物素或葉酸受體的數(shù)量能夠通過(guò)在生物素或葉酸缺乏的底物上生長(zhǎng)細(xì)胞系以促進(jìn)生物素和葉酸受體產(chǎn)生，或通過(guò)對(duì)生物素或葉酸受體有響應(yīng)的蛋白質(zhì)或脫輔基蛋白的所插入外源基因的表達(dá)來(lái)增加。15RME不是唯一的方法，利用該方法所述FRET顆粒對(duì)能夠改變位置進(jìn)入到細(xì)胞中。通過(guò)讓合適的實(shí)體物質(zhì)(entity)連接于FRET顆粒對(duì)的FRET顆粒上而能夠利用的其它攝入方法，包括細(xì)胞膜孔隙的有利利用。細(xì)胞吞噬作用和胞飲機(jī)理也提供了理想的機(jī)理，利用該機(jī)理，F(xiàn)RET顆粒對(duì)的FRET顆粒能夠進(jìn)入細(xì)胞之內(nèi)。該識(shí)別結(jié)構(gòu)部分能夠進(jìn)一步包括發(fā)生酶催或電化學(xué)分裂的序列。該識(shí)別結(jié)構(gòu)部分能夠因此包括序列，該序列容易發(fā)生被細(xì)胞內(nèi)的各種位置上所存在的酶如蛋白酶類或限制核酸內(nèi)切酶(例如脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶)引起的分裂。細(xì)胞表面識(shí)別序列不是要求的。因此，雖然細(xì)胞表面受體靶向用結(jié)構(gòu)部分能夠用于為給定的細(xì)胞類型進(jìn)行靶導(dǎo)向，或用于誘導(dǎo)FRET顆粒對(duì)的所述FRET顆粒與細(xì)胞表面的締合，但是不要求細(xì)胞表面受體靶向用結(jié)構(gòu)部分存在于FRET顆粒對(duì)的FRET顆粒的表面上。為了將生物學(xué)組分或藥物組分組裝到用作載體的FRET顆粒對(duì)的所述FRET顆粒上，該組分能夠通過(guò)連接鍵(linkage)與FRET顆粒載體締合。"與...締合"是指該組分被FRET顆粒對(duì)的FRET顆粒所攜帶。該組分能夠以非共價(jià)鍵方式溶解和引入在FRET顆粒對(duì)的FRET顆粒中?！?，在所述的生物學(xué)組分或藥物組分與用作載體的FRET顆粒對(duì)的FRET顆粒之間形成連接鍵的任何方式都能夠使用。這能夠包括靶向用結(jié)構(gòu)部分與外源的分子之間，直接或經(jīng)由連接基團(tuán)間接地，共價(jià)、離子或氫鍵鍵接。該連接鍵典型地通過(guò)在該復(fù)合物(complex)的各自組分上的酸、醛、羥基、氨基或肼基之間的酰胺、酯或亞胺基鍵的形成，由生物學(xué)組分或藥物組分以共價(jià)鍵鍵接于用作載體的FRET顆粒對(duì)的FRET顆粒上來(lái)形成。現(xiàn)有技術(shù)中公認(rèn)的生物學(xué)上不穩(wěn)定的共價(jià)鍵如亞胺基鍵和有連接基-COOCH，-0-0-或-C00CH的所謂"活性"酯是優(yōu)選的。所述的生物學(xué)組分或藥物組分可以連接于預(yù)先形成的FRET顆粒上，或另外所述組分可以預(yù)先連接于可聚合的單元上和然后在FRET顆粒制備過(guò)程中直接聚合到FRET顆粒對(duì)的FRET顆粒上。氫鍵，例如，在核酸的互補(bǔ)鏈之間存在，也能夠用于連接鍵形成。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的生物學(xué)組分或藥物組分通過(guò)與在高度親水性大單體單元的末端的反應(yīng)活性化學(xué)單元反應(yīng)而連接于FRET顆粒對(duì)的FRET顆粒上。優(yōu)選這一反應(yīng)活性化學(xué)單元是胺。最優(yōu)選，該連接是經(jīng)由連接用聚合物(linkingpolymer)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。所述的生物學(xué)組分或藥物組分讓FRET顆粒對(duì)結(jié)合于生物分子上以可視化它們的緊密接近度。用于可視化具有FRET顆粒對(duì)的試樣的儀器應(yīng)該能夠通過(guò)給體顆粒、受體顆粒和FRET顆粒對(duì)的光譜選擇性檢測(cè)來(lái)產(chǎn)生至少三個(gè)檢測(cè)事件。這就需要具有光源的儀器，該光源能夠有選擇地激發(fā)各個(gè)FRET顆粒給體染料和FRET顆粒受體染料。對(duì)于優(yōu)選的FRET顆粒染料，分別有550nm，650nm，691nm和761nm的最大吸收值，這使得當(dāng)總是有給定的FRET顆粒對(duì)的兩種FRET顆粒存在時(shí)需要能夠有選擇地激發(fā)給定的FRET顆粒對(duì)的各個(gè)FRET顆粒的儀器。由成像所進(jìn)行的FRET檢測(cè)(即在多個(gè)的、空間分布的點(diǎn)上的檢測(cè))的合適系統(tǒng)是從CarestreamHealth，Inc.，Rochester,NewYork商購(gòu)的KodakImageStation4000匪Pro。該4000mmPro系統(tǒng)具有廣譜(即白光)光源，如氤光源，還有一組的激發(fā)濾光器。優(yōu)選的激發(fā)濾光器是傳輸在所選擇的光譜帶中的光的帶通干涉濾光器，例如具有520nm中心波長(zhǎng)的濾光器，它傳輸在510nm到530nm的光譜帶內(nèi)的光但阻斷在這一光譜帶之外的16全部光到達(dá)試樣或樣品。為了測(cè)量發(fā)射，優(yōu)選的儀器使用第二套的帶通干涉濾光器，后者讓來(lái)自給定的FRET顆粒對(duì)的所選擇FRET顆粒中的發(fā)射光通過(guò)但阻斷激發(fā)光和其它熒光信號(hào)。優(yōu)選的儀器具有在500nm和900nm之間有高敏感性的數(shù)字式攝象機(jī)，優(yōu)選包括冷卻式CCD檢測(cè)器，以及計(jì)算機(jī)和顯示所捕獲圖像的軟件。優(yōu)選的系統(tǒng)能夠接收位于微量滴定板中的試樣。所述的優(yōu)選的系統(tǒng)能夠用于可視化已經(jīng)用可構(gòu)成FRET顆粒對(duì)的至少兩種FRET顆粒處理過(guò)的試樣。該優(yōu)選的系統(tǒng)使用合適的帶通濾光器(激發(fā)和發(fā)射)以便在一個(gè)圖像中可視化FRET給體顆粒，和使用合適的濾光器(激發(fā)和發(fā)射)以便在第二個(gè)圖像中可視化FRET受體顆粒，和然后用于FRET給體顆粒的激發(fā)濾光器與用于FRET受體顆粒的發(fā)射濾光器一起用于在第三個(gè)圖像中可視化處于緊密接近度的那些顆粒。優(yōu)選的儀器能夠比較三個(gè)圖像并產(chǎn)生共同記錄的重疊。另外地，只有一個(gè)圖像可以被捕獲，即這樣一個(gè)圖像，依據(jù)它使得用于FRET給體顆粒的激發(fā)濾光器與用于FRET受體顆粒的發(fā)射濾光器一起用于可視化處于緊密接近度的那些顆粒。另一個(gè)合適的系統(tǒng)，如也可從CarestreamHealth,Inc.商購(gòu)的KodakIn-VivoImagingSystemFXPro,能夠通過(guò)將活的小動(dòng)物如小鼠成像進(jìn)行FRET檢測(cè)。用于FRET檢測(cè)的仍然另一個(gè)合適系統(tǒng)是微量滴定板讀數(shù)器，如可從加利福尼亞州Sunnyvale市的MolecularDevices公司商購(gòu)的SpectraMaxM5，它使用光電倍增管用于(微量滴定板)各個(gè)孔的順序熒光檢測(cè)。本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員個(gè)人將會(huì)認(rèn)識(shí)到使用微量滴定板讀數(shù)器的順序FRET檢測(cè)和用數(shù)字式攝象機(jī)成像的FRET檢測(cè)兩者的等效性。該SpectraMaxM5也將單色儀用于激發(fā)光源和檢測(cè)器兩者中。本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員個(gè)人將認(rèn)識(shí)到單色儀具有與干涉濾光器類似的光譜選擇性的能力。FRET檢測(cè)的另一個(gè)合適系統(tǒng)是微流體系統(tǒng)(microfluidicssystem),如通過(guò)可從馬薩i者塞州Lexington市的RainDanceTechnologies,Inc.商購(gòu)的RainStorm液滴型微流體技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員個(gè)人將會(huì)認(rèn)識(shí)到從位于微流體液滴中的試樣所進(jìn)行的FRET檢測(cè)與在位于微量滴定板中的試樣中所進(jìn)行的FRET檢測(cè)的等效性。實(shí)驗(yàn)部分實(shí)施例1.胺終端的聚乙二醇甲基丙烯酸酯鹽酸鹽的制備聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(Aldrich，Mn=875，335g)與100ml的甲醇混合，然后用半胱胺(Aldrich，5.8g)和二異丙基乙胺(許尼希堿)處理，然后在室溫下攪拌2天并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。將殘留物溶解在1L的乙酸乙酯中，然后用10XHC1水溶液萃取。收集水性層(aqueouslayer)，然后通過(guò)50%氫氧化鈉水溶液的添加來(lái)調(diào)節(jié)至堿性，隨后用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層在MgS(^上干燥，過(guò)濾和濃縮。殘留物溶解。這一物料用新鮮的二乙醚洗滌，然后潷析。該殘留物通過(guò)使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行濃縮，得到37g的鹽酸鹽形式的所需產(chǎn)物。該物質(zhì)通過(guò)NMR譜表征，如下H-NMR(300MHZ，CDC13):D1.18(d，3H)，1.93(bs，3H)，2.04(bs，2H)，2.43—2.77(bm，7H)，3.6-3.7(vbs，-CH2CH20_)，3.73(bt，2H)，3.29(bt，2H)，5.56(bs，1H)，6.12(bs，1H)。17實(shí)施例2.由甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(45%w/w)，二乙烯基苯(4%)，乙基苯乙烯(1%)，和實(shí)施例1的胺終端的聚乙二醇甲基丙烯酸酯鹽酸鹽(50%)組成的顆粒的制備500ml三頸圓底燒瓶用Ace#15玻璃絲(glassthread)在底部和用一系列配合接頭(adapter)加以改進(jìn)，該接頭允許1/16英寸ID特氟隆(Teflon)管的連接。該燒瓶(下面稱作"頭料(header)"燒瓶)裝配機(jī)械攪拌器、帶注射器針頭氮?dú)馊肟诘南鹉z隔片。該頭料含有甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(5.63g)，二乙烯基苯(0.63g，異構(gòu)體的混合物，80X純度，剩余部分是乙基苯乙烯異構(gòu)體)，胺終端聚乙二醇醚甲基丙烯酸酯鹽酸鹽(6.25g，Mn=940)。在裝配機(jī)械攪拌器、回流冷凝器、氮?dú)鈱?dǎo)入管、和橡膠隔片的1L三頸圓底燒瓶(下面稱作"反應(yīng)器")中加入2，2'-偶氮雙(N，N'-二亞甲基異丁脒)二鹽酸化物(0.06g)，氯化十六烷基吡啶鎗(0.31)，碳酸氫鈉(0.06g)和蒸餾水(78.38g)。該反應(yīng)器內(nèi)容物由蒸餾水(159.13g)、2，2'-偶氮雙(N，N'_二亞甲基異丁脒)二鹽酸化物(0.06g)、碳酸氫鈉(0.06g)和氯化十六烷基吡啶鎗(0.94g)組成。該頭料和反應(yīng)器內(nèi)容物都攪拌至均勻?yàn)橹?，然后用氮?dú)夤呐菝摽諝?0分鐘。將反應(yīng)器燒瓶置于6(TC的恒溫水浴中，然后使用QG6型實(shí)驗(yàn)室泵(FluidMeteringInc.Syossett，NY)經(jīng)過(guò)2小時(shí)將頭料燒瓶?jī)?nèi)容物加入到反應(yīng)器中。反應(yīng)混合物然后在6(TC下攪拌16小時(shí)。該膠乳用lOOccDowex88離子交換樹(shù)脂處理兩次，然后使用14K截滲膜(cutoffmembrane)滲析48小時(shí)，獲得312g的3.26%固體的透明膠乳。由準(zhǔn)彈性光散射法測(cè)得體積平均直徑是20.89nm，具有0.24的變化系數(shù)。實(shí)施例3-染料4的制備。該染料是通過(guò)使用高氯酸2，3，3-三甲基-l-十二烷基-3H-吲哚鎗鹽(4.28g，lOmmol)和雙苯胺(1.4g，5mmo1)在含有三乙胺(1.5g，15mmol)的40ml的乙酸酐中制備的。反應(yīng)時(shí)間是5分鐘。反應(yīng)被冷卻到25°C，然后被傾倒在2升的冰水中，同時(shí)進(jìn)行劇烈攪拌。水相被潷析掉，然后將油相溶于lOOmL的80/20二氯甲烷-甲醇中。該物質(zhì)在用80/20二氯甲烷-甲醇洗脫的硅膠柱上進(jìn)行色層分離。進(jìn)行溶劑的蒸發(fā)，在用無(wú)水硫酸鎂干燥之后，獲得純?nèi)玖?4g，32X產(chǎn)率)，在甲醇中有最大吸收747nm，有220，020的消光系數(shù)。實(shí)施例4:染料2的制備該染料是通過(guò)使用高氯酸2，3，3-三甲基-l-丁基-3H-噴哚鎗鹽(12g，38mmo1)和雙苯胺(5.4g，19moles)在含有三丁基胺(10.5g，57翻l)的100ml的乙酸酐中制備的。反應(yīng)進(jìn)行15分鐘，冷卻到25t:，然后傾倒在2000mL的冰水中，同時(shí)進(jìn)行劇烈攪拌。水相被潷析掉，油性產(chǎn)物在用90/10二氯甲烷-甲醇洗脫的硅膠柱上進(jìn)行色層分離。進(jìn)行溶劑的蒸發(fā)，在用無(wú)水硫酸鎂干燥之后獲得純?nèi)玖?8g，71%產(chǎn)率)，在甲醇中具有最大吸收637nm，具有259，500的消光系數(shù)。實(shí)施例5:顆粒負(fù)載染料4在弱光下，通過(guò)將O.0296g的染料4溶解在足夠的四氫呋喃中獲得29.8012g的最終溶液重量，來(lái)制備0.0903%w/w的染料儲(chǔ)備溶液。將1.9627g份的染料溶液添加到玻璃管形瓶中，用四氫呋喃稀釋到10.0g的最終重量。將10.0185g的實(shí)施例2的顆粒溶液添加到該管形瓶中，所得溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上抽提至約40-50%體積。殘留四氫呋喃通過(guò)兩次添加3-5ml蒸餾水和再次抽提掉揮發(fā)分的1/4到1/3而進(jìn)一步被除去。9.4467g的3.45%固體的荷載顆粒(LP-4)，該固體含有4.97X10—3mol染料/每克的固體膠乳。實(shí)施例6:顆粒負(fù)載染料2在弱光下，通過(guò)將0.0101g的染料2溶解在足夠的四氫呋喃中獲得25.1201g的最終溶液重量，來(lái)制備染料儲(chǔ)備溶液(0.0402%w/w)。將3.9146g份的染料溶液添加到玻璃管形瓶中，然后用四氫呋喃稀釋到10.Og的最終重量。將10.0451g的實(shí)施例2的顆粒溶液添加到該管形瓶中，然后溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上被抽提至約40-50體積％。殘留四氫呋喃通過(guò)兩次添加3-5ml蒸餾水和再次抽提掉揮發(fā)分的1/4到1/3而進(jìn)一步被除去。10.9030g的3.56%固體的荷載顆粒(LP-2)，該固體含有4.99X10—3mol染料/每克的固體膠乳。實(shí)施例7.山羊抗兔IgG標(biāo)記的FRET顆粒給體D的制備荷載膠乳(LP-2)的活化1.將400iiL荷載顆粒(LP-2)添加到在5ml有色管形瓶中所含的500yLPBS(O.IM磷酸鈉，O.15MNaCl，pH7.5，含有EDTA(用NaOH調(diào)節(jié)pH))緩沖液中。2.將2mg磺基-SMCC(PierceBiotechnology)溶解在152.7iiL干燥DMSO中。3.將X-SIGHT溶液與60.4iiL的磺基-SMCC溶液摻混。4.用攪拌棒在340的旋轉(zhuǎn)速度下在室溫下攪拌反應(yīng)混合物1個(gè)小時(shí)。同時(shí)準(zhǔn)備該柱。5.使用兩個(gè)NAP10柱。用移液管從柱中分出緩沖液，然后流過(guò)3倍柱體積的含有2毫摩爾濃度EDTA的10毫摩爾濃度緩沖液以進(jìn)行調(diào)理。將約0.5mL的來(lái)自步驟4的荷載膠乳反應(yīng)混合物裝入到各柱中，然后用10毫摩爾濃度的緩沖液洗脫以除去過(guò)量的連接劑(linker)。在已稱瓶重量(tared)的閃爍管中收集色帶。最終溶液體積應(yīng)該是大約lml?？贵w的活化1.用移液管將2.08ml的2.4mg/ml兔抗小鼠(Jackson)轉(zhuǎn)移到20ml玻璃管形瓶中。暫擱置。2.將9.6的DTT溶解在含有10mMEDTA的62iiLPBS中。3.將2.08mL抗體溶液與50yLDTT溶液摻混。4.用攪拌棒在室溫下攪拌1小時(shí)。5.將來(lái)自步驟4的溶液添加到2個(gè)Amicon30柱中。稱量2個(gè)天平管，用水調(diào)節(jié)重量直至它們彼此之間相差在lgm之內(nèi)。使用離心機(jī)在3000rpm下旋轉(zhuǎn)15分鐘，將每一個(gè)中的體積減少到約500iiL。6.將4.5(9)mL的含有2mMEDTA的pH7.2PBS緩沖液加入到含有來(lái)自步驟5的Ab溶液的每一個(gè)管中。在3000rpm下旋轉(zhuǎn)，將溶液體積減少到500yL。7.重復(fù)步驟6至IO次?；罨贵w到活化荷載膠乳的共價(jià)連接根據(jù)Ab與納米顆粒的比率二4:l來(lái)設(shè)置接合。假設(shè)Ab損失是30X，這導(dǎo)致24.1X10—9mol的Ab。為了達(dá)到Ab/顆粒二4:1，將全部的提純Ab溶液與56%的提純顆粒溶液摻混。測(cè)量混合物的體積，將含有10mMEDTA的0.1MPBS緩沖液添加進(jìn)去，達(dá)到4.5-7.5ml的最終體積。用攪拌棒在室溫下攪拌2小時(shí)。將接合溶液(7.5ml)加入到Amicon管中，在3000rpm下旋轉(zhuǎn)柱，以便將體積減少至大約500iiL。在五個(gè)10mL柱中加入Superdex200(9_10mL懸浮液)以達(dá)到4cm的最終凝膠床(體積)。兩個(gè)柱在1XPBS中平衡三次。1.將每批100iiL接合溶液加入到一個(gè)Superdex柱中。2.用lXPBS(lOmM磷酸鈉，O.15MNaCl，pH7.2)洗脫。3.對(duì)于各個(gè)柱收集約1ml的IgG標(biāo)記的FRET顆粒給體B樣品。實(shí)施例8.山羊抗兔IgG標(biāo)記的FRET顆粒受體D的制備荷載膠乳(LP-4)的活化1.將400iiL荷載顆粒(LP-4)添加到在5ml有色管形瓶中所含的500yLPBS(O.IM磷酸鈉，O.15MNaCl，pH7.5，含有EDTA(用NaOH調(diào)節(jié)pH))緩沖液中。2.將2mg磺基-SMCC(PierceBiotechnology)溶解在152.7iiL干燥DMSO中。3.將X-SIGHT溶液與60.4iiL的磺基-SMCC溶液摻混。4.用攪拌棒在340的旋轉(zhuǎn)速度下在室溫下攪拌反應(yīng)混合物1個(gè)小時(shí)。同時(shí)準(zhǔn)備該柱。5.使用兩個(gè)NAP10柱。用移液管從柱中分出緩沖液，然后流過(guò)3倍柱體積的含有2毫摩爾濃度EDTA的10毫摩爾濃度緩沖液，以進(jìn)行調(diào)理。將約0.5mL的來(lái)自步驟4的荷載膠乳反應(yīng)混合物裝入到各柱中，然后用10毫摩爾濃度的緩沖液洗脫以除去過(guò)量的連接劑。在已稱瓶重量的閃爍管中收集色帶。最終溶液體積應(yīng)該是大約lml?？贵w的活化1.用移液管將2.08ml的2.4mg/ml山羊_抗兔(Jackson)轉(zhuǎn)移到20ml玻璃管形瓶中。暫擱置。2.將9.6的DTT溶解在含有10mMEDTA的62iiLPBS中。3.將2.08mL抗體溶液與50yLDTT溶液摻混。4.用攪拌棒在室溫下攪拌1小時(shí)。5.將來(lái)自步驟4的溶液添加到2個(gè)Amicon30柱中。稱量2個(gè)天平管，用水調(diào)節(jié)重量直至它們彼此之間相差在lgm之內(nèi)。使用離心機(jī)在3000rpm下旋轉(zhuǎn)15分鐘，將每一個(gè)中的體積減少到約500iiL。6.將4.5(9)mL的含有2mMEDTA的pH7.2PBS緩沖液加入到含有來(lái)自步驟5的Ab溶液的每一個(gè)管中。在3000rpm下旋轉(zhuǎn)，將溶液體積減少到500yL。7.重復(fù)步驟6至IO次。活化抗體與活化荷載顆粒的共價(jià)連接1.根據(jù)Ab與納米顆粒的比率二4:l來(lái)設(shè)置接合。假設(shè)Ab損失是30X，這導(dǎo)致24.1X10—9mol的Ab。為了達(dá)到Ab/顆粒二4:1，將全部的提純Ab溶液與56%的提純顆粒溶液摻混。測(cè)量混合物的體積，將含有10mMEDTA的O.1MPBS緩沖液添加進(jìn)去，達(dá)到4.5-7.5ml的最終體積。用攪拌棒在室溫下攪拌2小時(shí)。2.將接合溶液(7.5ml)加入到Amicon管中，在3000rpm下旋轉(zhuǎn)柱，以便將體積減少至大約500iiL。3.在五個(gè)10mL柱中加入Superdex200(9-lOmL懸浮液)以達(dá)到4cm的最終凝膠床(體積)。4.兩個(gè)柱在1XPBS中平衡三次。5.將每批100iiL接合溶液加入到一個(gè)Superdex柱中。6.用lXPBS(10mM磷酸鈉，0.15MNaCl，pH7.2)洗脫。207.對(duì)于各個(gè)柱收集約1000iiL的FRET顆粒受體樣品。實(shí)施例9.使用FRET顆粒對(duì)的兔蛋白質(zhì)的可視化在96孔板(黑色澄明底部)中，在一個(gè)孔中添加5nM的兔抗小鼠IgG標(biāo)記的FRET顆粒給體B，在第二個(gè)孔中添加5nM的山羊抗兔IgG標(biāo)記的FRET顆粒受體D，和向第三個(gè)孔中添加由5nM的兔抗小鼠IgG標(biāo)記的FRET顆粒給體B和5nM的山羊抗兔IgG標(biāo)記的FRET顆粒受體D組成的FRET顆粒對(duì)B-D。通過(guò)將96孔板放入到KodakImageStation4000MMPro中和用具有20nm帶寬的650nm中心波長(zhǎng)激發(fā)濾光片曝光和用具有40nm帶寬的790nm發(fā)射濾光片記錄熒光圖像，來(lái)可視化該試樣。FRET顆粒給體B單獨(dú)具有在670nm的發(fā)射峰，因此在以790nm為中心的40nm發(fā)射光譜帶中觀察到來(lái)自FRET顆粒給體B的非常少的熒光。FRET顆粒受體D單獨(dú)在以650nm為中心的20nm激發(fā)光譜帶中具有非常少的吸收，因此在790nm觀察到來(lái)自FRET顆粒受體D的非常少的熒光。但是FRET顆粒對(duì)B-D通過(guò)抗體的靶向而緊密接近，因此被給體顆粒吸收的激發(fā)能被轉(zhuǎn)移到受體顆粒，導(dǎo)致分別與FRET顆粒給體B和FRET顆粒受體D相比，從FRET顆粒對(duì)B-D檢測(cè)到的熒光有54倍(fold)和142倍提高。表IV.顯示出兔抗小鼠IgG與山羊抗兔IgG的接近度的FRET顆粒對(duì)B_D的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>權(quán)利要求可視化在試樣中生物分子的緊密接近度的方法，該方法包括以下步驟用FRET顆粒對(duì)處理該試樣，該顆粒對(duì)包括兩種或多種熒光顆粒，各自包括具有30-50wt％的通式1單體的交聯(lián)聚合物通式1，其中n是10到200，至少一種的熒光顆粒包括能量給體染料和至少一種其它的熒光顆粒包括能量受體染料，和各熒光顆粒包括以共價(jià)鍵連接于外表面的一種或多種靶向用結(jié)構(gòu)部分；和將試樣暴露于光源和用檢測(cè)器記錄發(fā)射的光。FPA00001047049300011.tif2.權(quán)利要求l的方法，其中該光源包括激發(fā)濾光片和該檢測(cè)器包括發(fā)射濾光片。3.權(quán)利要求l的方法，其中該光源包括單色儀和該檢測(cè)器包括單色儀。4.權(quán)利要求l的方法，其中檢測(cè)器是光電倍增管。5.權(quán)利要求l的方法，其中檢測(cè)器是數(shù)字式攝像機(jī)。6.權(quán)利要求1的方法，其中顆粒具有10-100nm粒度。7.權(quán)利要求l的方法，其中該顆粒包括45wt^或更低的甲基丙烯酸甲氧基甲基酯作為共聚用單體。8.權(quán)利要求l的方法，其中該顆粒包括具有在500和900nm之間的吸收最大值的染料。9.權(quán)利要求1的方法，其中該顆粒包括至少一種染料，該染料選自于<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>10.權(quán)利要求1的方法，其中FRET顆粒對(duì)包括大約550nm和650nm，650nm和690nm，690nm和760nm，或650nm和760nm的吸收最大值。11.權(quán)利要求l的方法，其中靶向用結(jié)構(gòu)部分包括抗體。12.權(quán)利要求l的方法，其中靶向用結(jié)構(gòu)部分包括親和配體。13.權(quán)利要求l的方法，其中靶向用結(jié)構(gòu)部分包括肽。14.權(quán)利要求l的方法，其中靶向用結(jié)構(gòu)部分包括蛋白質(zhì)。15.權(quán)利要求l的方法，其中靶向用結(jié)構(gòu)部分包括藥物。16.權(quán)利要求l的方法，其中靶向用結(jié)構(gòu)部分包括葉酸和生物素。17.權(quán)利要求l的方法，其中靶向用結(jié)構(gòu)部分包括低聚核苷酸。18.權(quán)利要求l的方法，其中靶向用結(jié)構(gòu)部分包括毒素。19.權(quán)利要求l的方法，其中靶向用結(jié)構(gòu)部分包括配體同種型。全文摘要公開(kāi)了由胺官能化聚乙二醇組成的納米顆粒的結(jié)合物，其中一種顆粒含有具有第一種波長(zhǎng)激發(fā)最大值的熒光給體染料和至少一種附加顆粒含有具有第二種更高波長(zhǎng)激發(fā)最大值的第二種熒光染料，這些顆粒具有連接于它們的外表面上的相同或不同的生物分子靶向用結(jié)構(gòu)部分。文檔編號(hào)G01N33/58GK101796416SQ200880105993公開(kāi)日2010年8月4日申請(qǐng)日期2008年9月2日優(yōu)先權(quán)日2007年9月7日發(fā)明者D·L·維扎,J·W·哈德,R·帕皮內(nèi)尼,T·紀(jì),W·E·麥克勞克林申請(qǐng)人:卡爾斯特里姆保健公司