專利名稱：癌癥化療藥物所引起的毒性的抑制劑以及含有該抑制劑的癌癥化療藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明有關(guān)于一種用于癌癥化療藥物所引起的毒性的抑制劑，以及有關(guān)于一種含有該抑制劑的抗癌組合物。
背景技術(shù)：
癌癥是一種造成全世界每年七百萬人死亡的嚴(yán)重疾病，且有資料報(bào)導(dǎo)在1997年，僅在美國便新增150萬名癌癥患者。依照此種情況發(fā)展，癌癥很快地將成為死亡原因的榜首。因此，目前發(fā)展出多種治療癌癥的方法，例如放射線治療、手術(shù)治療以及基因療法等。但最常用的其中一種方法是施用癌癥化學(xué)治療藥物。
雖然抗癌藥物是一種借著正常細(xì)胞與癌細(xì)胞對藥物敏感性的差異而選擇性地作用于癌細(xì)胞上的化療藥物，但仍會(huì)對正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性。
順鉑(cisplatin)(順-二氨二氯鉑[II]，cis-diamminedichloroplatinum[II])，是一種代表性的鉑系化療藥物。此藥劑已被廣泛地應(yīng)用在許多癌癥病例上，例如卵巢癌、膀胱癌、肺癌、子宮頸癌與睪丸癌(Rosenberg B.，Cancer 552303-2315，1985)。已知順鉑會(huì)借著造成DNA股鏈內(nèi)或股鏈間交聯(lián)并在癌細(xì)胞中產(chǎn)生DNA加成物(DNA additives)而具有抗癌效果。然而，當(dāng)使用量超過限制劑量時(shí)，順鉑會(huì)造成諸如聽覺喪失、神經(jīng)毒性與腎毒性等不良副作用(Mollman et al.，1998；Screnci and McKeage，1999)，而當(dāng)使用較高劑量的順鉑則會(huì)造成肝毒性(Cerosimo R.J.，Ann.Pharm.，27438-441，1993；Cavalli F.et al.，Cancer Treat.Rep.，622125-2126，1978；Pollera C.F.et al.，J.Clin.Oncol.，5318-319，1987)。
因此，需要研發(fā)出一種抗癌藥物，其含有最低毒性的藥劑或含有能抑癌癥化療藥物所引起的毒性的抑制劑，以幫助化療藥物能安全使用并發(fā)揮適當(dāng)效果。順鉑與谷胱甘肽酯(glutathione ester)合并使用時(shí)可能有效抑制順鉑所引起的腎毒性(Babu E.et al.，Mol.Cell Biochem.，1447-11，1995)。且借著服用食品性的抗氧化劑來抑制順鉑毒性的方法目前頗受大眾關(guān)注(Appenroth D.et al.，Arch.Toxicol.，71677-683，1997；Bogin E.et al.，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.，32843-851，1994；and Rao M.et al.，J.Biochem.，125383-390，1999)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的技術(shù)在于解決上述問題，也就是提供一種能抑制癌癥化療藥物引起諸如腎、肝毒性等毒性的抑制劑，以及含有該毒性抑制劑的抗癌藥物。
在本發(fā)明中，會(huì)造成毒性的化療藥物范例包括但不局限于順鉑(順-二氨二氯鉑[II])、碳鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、奈達(dá)鉑(nedaplatin)及上述這些藥物的混合物。
此外，本發(fā)明提供一種包含一癌癥化療藥物與束骨姜黃醇(xanthorrhizol)的抗癌組合物，其中束骨姜黃醇能抑制該癌癥化療藥物所引起的毒性。


本發(fā)明較佳實(shí)施例的上述及其它的特征、態(tài)樣與優(yōu)點(diǎn)將藉由本文詳細(xì)敘述內(nèi)容及所附圖示作更完整的描述。所附圖示如下第1圖顯示NF-κB(A圖)及AP-1(B圖)對DNA的結(jié)合活性，以評估束骨姜黃醇對于順鉑誘發(fā)性肝毒性的作用效果。NF-κB及AP-1對DNA的結(jié)合活性是使用肝組織與電泳移動(dòng)偏向分析法(EMSA，electrophoretic mobility shift assay)來加以評估。該實(shí)心箭頭所指位置分別為NF-κB及AP-1與DNA所形成的復(fù)合體位置，且該空心箭頭所指位置為未結(jié)合寡聚核苷酸探針。該電泳條帶(band)的密度是利用RFLP掃描軟體來進(jìn)行測量。
第2圖顯示COX-2與iNOS基因的mRNA表達(dá)量。NF-κB依賴性基因COX-2以及iNOS的mRNA表達(dá)量是使用特定的引物對并藉由半定量式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所測得。β-肌動(dòng)蛋白與GAPDH則作為對照組之用。
第3圖顯示DDRT-PCR與半定量式RT-PCR的結(jié)果。(A)圖顯示因順鉑而提高基因表達(dá)量的兩個(gè)基因S100A9與Kin，而(B)圖顯示因順鉑而減少基因表達(dá)量的兩個(gè)基因Clpx與CP。各個(gè)基因的mRNA表達(dá)量是利用半定量式RT-PCR及對各基因具有特異性的引物對來加以確認(rèn)，且GAPDH基因則作為對照組。
具體實(shí)施例方式
以下將對癌癥化療藥物誘導(dǎo)性毒性抑制劑以及含有該抑制劑的抗癌組合物做更詳細(xì)的敘述。
本發(fā)明的束骨姜黃醇是作為癌癥化療藥物引起毒性的抑制劑的活性成分，其最早是由German Rimpler于1970年自束骨姜黃(Curcuma xanthorrhiza)中所分離出來的一種倍半萜類化合物(sesquiterpene compound)。
束骨姜黃醇會(huì)隨著施用劑量而限制大鼠子宮的張力性收縮(Ponce-Monter H.，et al.，Phytother.Res.，13202-205，1999)，并且對諸如突變種鏈球菌等口腔細(xì)菌具有殺菌效果(Hwang J.K.，F(xiàn)itoterapia，71321-323，2000；Hwang J.K.，Planta Med.，66196-197，2000)。除此之外，已知束骨姜黃醇能有效治療或預(yù)防癌癥。
本案發(fā)明人發(fā)現(xiàn)到束骨姜黃醇具有顯著抑制諸如腎毒性與肝毒性等由癌癥化療藥物所引起的毒性的能力，并進(jìn)行反復(fù)的研究以研發(fā)該類藥物。
可從束骨姜黃(Curcuma xanthorrhiza Roxb)中萃取出具有下列式1結(jié)構(gòu)的束骨姜黃醇。在印尼地區(qū)，姜科植物(Zingiberaceae)曾是藥用植物。諸如有機(jī)溶劑萃取、超臨界流體萃取(supercritical fluid extraxtion)、微波式萃取與超聲波萃取等數(shù)種萃取方法均可用來萃取束骨姜黃醇，例如參閱韓國專利公開案2000-73295號與PCT專利案WO88/05304號中所敘述的方法。
式1 (+)-束骨姜黃醇(Xanthorrhizol)如上所述，束骨姜黃醇對于施用癌癥化療藥物后所產(chǎn)生如肝毒性及腎毒性等副作用具有出色的抑制能力。而這些引起的副作用能被束骨姜黃醇所抑制的化療藥物范例包括但不局限于鉑系抗癌藥物(platinum-based anticancer drug)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、博萊霉素(bleomycin)與阿霉素(doxorubicin)，特別是對于由諸如順鉑(順-二氨二氯鉑[II])、碳鉑、奧沙利鉑、奈達(dá)鉑等鉑系抗癌藥物所引起的肝毒性及腎毒性的抑制作用更具效果。束骨姜黃醇是透過抑制這些化療藥物所產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)的作用來影響癌癥化療藥物。
評估束骨姜黃醇對代表性的鉑系化療藥物順鉑所引起肝毒性與腎毒性的抑制效果的方法如下所示。
將順鉑注射至小鼠腹腔內(nèi)。經(jīng)過一段時(shí)間后，測量該小鼠的體重，并確認(rèn)毒性的誘發(fā)情形。將該小鼠以乙醚麻醉后收集心臟中的血液，并評估該血液中與肝毒性及腎毒性誘發(fā)相關(guān)的生化標(biāo)記(biochemical marker)。將小屬的腎臟與脾臟取出秤重以進(jìn)行比較。
測量血清中某些酶的活性能夠顯示出用來診斷多種疾病的資訊。肝臟中存在著相當(dāng)高量的轉(zhuǎn)氨酶(aminotransferase)，但血液中僅有少許的轉(zhuǎn)氨酶。然而，肝毒性會(huì)提高血液中的轉(zhuǎn)氨酶濃度。施用過順鉑后的不正常肝臟會(huì)從受傷的肝細(xì)胞中將谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)胺酶(GPT，glutamate-pyruvate transaminase)與谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)胺酶(GOT，glutamate-oxaloacetate transaminase)釋放到血液中。在腹腔注射順鉑之前先行口服束骨姜黃醇的小鼠組別的GPT與GOT血中濃度，明顯低于僅施用順鉑的小鼠組別的GPT與GOT血中濃度。
也測量腎臟比重(specific gravity)的變化，以評估束骨姜黃醇對于順鉑誘發(fā)性腎毒性的的抑制效果。相較于未施打順鉑的對照組小鼠而言，施打高劑量順鉑的小鼠組別的腎臟比重會(huì)提高。然而，這些在施打順鉑前數(shù)天先行口服束骨姜黃醇的小鼠的腎臟比重則幾乎沒有變化。
此外，順鉑誘發(fā)性腎毒性會(huì)增加活性氧物質(zhì)，降低腎臟的排泄與過濾效率，并發(fā)生體重變化。由于過濾功能降低，使得血液中的尿素氮(urea nitrogen)與肌酸酐(creatinine)濃度升高。而這些在注射順鉑前先行口服束骨姜黃醇的小鼠組別的尿素氮血中濃度，明顯低于僅施用順鉑的小鼠組別的尿素氮血中濃度。
已知施用諸如順鉑等鉑系化療藥物會(huì)活化或抑制諸如核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB，nuclear factor-κB)與活化子蛋白1(AP-1，activator protein-1)等轉(zhuǎn)錄因子，且這些轉(zhuǎn)錄因子的活化作用，特別是NF-κB，會(huì)造成諸如環(huán)氧化酶(COX-2，cyclooxygenase-2)與誘導(dǎo)性氧化氮合成酶(iNOS，inducible nitric oxidesynthase)等NF-κB依賴性基因的活化作用。這些基因均為已知與發(fā)炎反應(yīng)及毒性有關(guān)的致發(fā)炎基因(pro-inflammatory genes)(Nanji，A.A.，et al.，2003.Am.J.Physiol.Gastronintest.Liver Physiol.284，G321-27；Reilly，T.P.，et al.，Chem.Res.Toxicol.14，1620-1628；以及，Gardner，C.R.，et al.，Hepatology27，748-754)。
姜黃素(curcumin)的生理作用已知與其能抑制這些已活化的轉(zhuǎn)錄因子有密切關(guān)聯(lián)，特別是能抑制以活化的NF-κB，因此在本文使用姜黃素作為本發(fā)明的比較實(shí)施例(Han，S.S.，et al.，2002.J.Biochem.Mol.Biol.35，337-342與Nanji，A.A.，et al.，2003.Am.J.Physiol.Gastronintest.Liver Physiol.284，G321-27)。
我們于本發(fā)明中確認(rèn)順鉑對NF-κB的活化作用。并于本發(fā)明中也確認(rèn)COX-2與iNOS基因會(huì)受到順鉑的影響而提高mRNA的表達(dá)。在施用順鉑之前，不論是使用束骨姜黃醇或姜黃素做先行治療會(huì)抑制上述這些基因的mRNA表達(dá)。束骨姜黃醇能同時(shí)抑制順鉑所誘導(dǎo)的COX-2與iNOS基因的mRNA表達(dá)，但姜黃素僅能抑制COX-2基因的表達(dá)。此結(jié)果意味著束骨姜黃醇能有效治療順鉑所引起的肝毒性。
除此之外，為了證明這些表達(dá)有所差異的基因與束骨姜黃醇對于順鉑誘發(fā)性肝毒性的預(yù)防有所關(guān)聯(lián)，故進(jìn)行差異顯示性反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(DDRT-PCR，Differential-display reverse transcription-PCR)，來分析這些基因并鑒定出有7個(gè)基因的表達(dá)受到順鉑的影響而增加，且有五個(gè)基因的表達(dá)則受順鉑影響而降低。
這些基因中，因順鉑而使S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100A9)的mRNA表達(dá)量提高的原因可解釋為順鉑會(huì)降低AP-1的DNA結(jié)合活性，因而降低S100A9 mRNA的表達(dá)(Gebhardt，C.，et al.，2002，Oncigene 214366-4276)。曾有文獻(xiàn)暗示過此S100A9基因會(huì)影響細(xì)胞骨架與細(xì)胞形狀的改變、信息傳遞作用以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)節(jié)作用(Kerkhoff，C.，et al.，J.Biol.Chem.27432672-32679；與SchaferB.W.，et al.，Trends Biochem.Sci.21134-140)。順鉑所引起的S100A9 mRNA的異常表達(dá)最后會(huì)涉及鈣離子(Ca2+)調(diào)節(jié)作用的損害，且順鉑誘導(dǎo)性肝毒性可能與鈣離子恒定作用受到干擾有高度關(guān)聯(lián)。與姜黃素對照下，施用束骨姜黃醇被認(rèn)為能解除順鉑對于AP-1基因的抑制作用，因而降低A100A9的mRNA表達(dá)量，且最終在對順鉑誘導(dǎo)性肝炎上得到想要的作用效果。
Rec-A蛋白(Kin)的抗原決定簇是一種核蛋白，其會(huì)與細(xì)菌的RecA蛋白產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)(cross-immunoreactivity)并能有效地結(jié)合至彎曲的DNA上(Tissier，A.et al.，Biochimie 77，854-860)。此種基因交互作用可能涉及真核細(xì)胞中的DNA修復(fù)及錯(cuò)誤重組作用。順鉑誘導(dǎo)Kin基因的mRNA表達(dá)增加會(huì)提高Kin蛋白的量(Angulo J.F.，et al.，Mutat.Res.，217123-134)。曾有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)過，由于暴露在順鉑下的大鼠肝臟細(xì)胞中的DNA修復(fù)活性增強(qiáng)，因此接受順鉑治療的老鼠體內(nèi)有較多Kin mRNA可能是為了修復(fù)順鉑在肝臟中造成DNA受損的緣故。而與束骨姜黃醇會(huì)影響iNOS表達(dá)的結(jié)果一致的是，預(yù)先接受束骨姜黃醇治療可大幅地降低因順鉑所造成Kin基因的mRNA表達(dá)量提高的情形。此結(jié)果表示束骨姜黃醇具有抑制順鉑所誘發(fā)的毒性的能力。
施用順鉑也會(huì)在線粒體中產(chǎn)生顯著的改變。順鉑會(huì)抑制老鼠肝臟中呼吸鏈的復(fù)合體I與復(fù)合體II的活性(Rosen M.，et al.，Int.J.Exp.Pathol.7361-74)，并會(huì)造成線粒體喪失膜電位，因而影響整個(gè)線粒體的功能(Kruidering M.et al.，Exp.Nephrol.2334-344)。
肝毒性問題中的線粒體功能障礙也可用另一個(gè)基因小鼠細(xì)菌酪蛋白水解蛋白酶(ClpX，caseinolytic protease X)異常表達(dá)來解釋。ClpX蛋白除了表現(xiàn)自身的ATP水解酶活性(ATPase activity)之外，還能作為具組織特異性的哺乳動(dòng)物線粒體伴護(hù)蛋白(chaperone)參與在線粒體蛋白的恒定作用中(Santagata S.et al.，J.Biol.Chem.27416311-16319)。ClpX基因表達(dá)量的降低會(huì)導(dǎo)致線粒體不穩(wěn)定，但預(yù)先施以束骨姜黃醇治療則能把ClpX mRNA的表達(dá)量維持在如同未施用順鉑時(shí)的程度。此結(jié)果也暗示著使用束骨姜黃醇能降低因施用順鉑所造成的毒性。
銅藍(lán)蛋白(CP，ceruloplasmin)是一種血清α2-醣蛋白，其所含有的銅量超過脊椎動(dòng)物血漿中總銅含量的95％(Takahashi N.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81390-394)。銅藍(lán)蛋白在血漿中借著與血漿中的銅緊密結(jié)合而作為一種保護(hù)性的抗氧化物質(zhì)，并會(huì)抑制離子依賴性的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)(ion-dependent lipidperoxidation)與抑制羥基自由基的形成。有趣的是，施用順鉑會(huì)導(dǎo)致血漿中包括銅藍(lán)蛋白在內(nèi)等抗氧化蛋白濃度下降。此結(jié)果可能顯示出用來抵抗因常用抗癌藥物所造成的氧化損傷的抗氧化防護(hù)機(jī)制運(yùn)作失常(Weijl N.I.et al.，Ann.Oncol.91331-1337)。我們證實(shí)了以束骨姜黃醇進(jìn)行預(yù)先治療能輕微恢復(fù)銅藍(lán)蛋白的mRNA表達(dá)，因此暗示著束骨姜黃醇可作為化療藥物引起的毒性的抑制劑。我們使用姜黃素作為比較范例，但姜黃素并未展現(xiàn)出如上述般的效果。
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與事實(shí)證明，能認(rèn)為束骨姜黃醇在抑制癌癥化療藥物所引起諸如肝毒性及腎毒性等不良副作用上有良好效果，且束骨姜黃醇的抑制毒性效果優(yōu)于也可作為毒性抑制劑的姜黃素。
可透過各種不同途徑來施用束骨姜黃醇。施用途徑包括但不局限于口服、局部用藥、皮下注射、皮膚吸收、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮膚內(nèi)、病灶內(nèi)、眼球內(nèi)、肺內(nèi)與脊椎內(nèi)等用藥途徑。也可將束骨姜黃醇配制成溶液、懸浮液、乳化物、錠劑、膠囊與持續(xù)釋放系統(tǒng)劑型。
束骨姜黃醇的劑量可根據(jù)所使用的癌癥化療藥物的劑量與種類、患者的年齡與性別等因素進(jìn)行調(diào)整。束骨姜黃醇可在施用癌癥化療藥物之前或其后單獨(dú)使用，也可與癌癥化療藥物共同組合成一抗癌組合物而一起施用。
每劑量所施用的束骨姜黃醇量可根據(jù)患者的病情、鉑系化療藥物劑量、用藥周期與某些情況而做調(diào)整。較佳者，束骨姜黃醇的施用劑量約為順鉑總用藥重量的0.01至10倍重，并以順鉑總用藥重量的0.1至5倍重為較佳。
本發(fā)明提供一種含有一癌癥化療藥物與束骨姜黃醇的抗癌組合物，其中該束骨姜黃醇會(huì)抑制因該癌癥化療藥物所引起的毒性。該束骨姜黃醇在該組合物中的量較佳約為該癌癥化療藥物量的0.01至10倍，更佳者為該癌癥化療藥物量的0.1至5倍。
含束骨姜黃醇的癌癥化療藥物毒性抑制劑以及內(nèi)含該束骨姜黃醇的抗癌組合物更可包含多種藥學(xué)可接受添加劑與稀釋劑。添加劑與稀釋劑包括但不局限于常用的填充劑、結(jié)合劑、潤滑劑、濕潤劑、懸浮劑、溶劑、分散劑、控制釋放劑、香料、色素或膜衣等。
為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員了解本發(fā)明，在下述內(nèi)容中對本發(fā)明做詳細(xì)描述。然而，下述實(shí)施例僅作為示范，非意欲于限制本發(fā)明范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不偏離本發(fā)明精神與范圍或不損及必要優(yōu)點(diǎn)下做出各種變化。
以下實(shí)施例結(jié)果是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差值(SE)的方式來顯示。并利用斯氏t-測驗(yàn)法(Student t-test)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，且實(shí)驗(yàn)的意義程度均設(shè)定在P值小于0.05。
實(shí)施例1設(shè)計(jì)動(dòng)物模型比較束骨姜黃醇及姜黃素對順鉑所誘發(fā)的肝毒性與腎毒性的抑制效果。每一實(shí)驗(yàn)組別均含10只鼠齡5周的雄性IRC小鼠。使這些小鼠連續(xù)四天口服束骨姜黃醇與姜黃素，其中束骨姜黃醇的劑量為每日口服100或200微克/千克且溶于玉米油中；姜黃素的劑量則為每日口服200毫克/千克且溶于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中。而這些喂食不含任何藥物的玉米油的小鼠則作為負(fù)對照組(negtive control)。在最后一次施用束骨姜黃醇與姜黃素經(jīng)三個(gè)小時(shí)后，以45毫克/千克劑量的順鉑(溶于PBS中)注射至小鼠腹腔內(nèi)，且僅注射PBS緩沖溶液的小鼠則作為負(fù)對照組。注射16小時(shí)后，秤取小鼠體重，并使用乙醚麻醉這些小鼠以取得血液及肝臟樣本，并分別切取小鼠的腎臟與脾臟進(jìn)行秤量。此實(shí)驗(yàn)中的實(shí)施例與比較實(shí)施例的用藥途徑與劑量顯示于表一。
表一 實(shí)施例2血清生化參數(shù)測量將取自心臟的血液樣本于室溫下放置2小時(shí)，然以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘以取得血清，并將這些血清保存于低溫下以進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。測量這些血清中的谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)胺酶(GPT)、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)胺酶(GOT)、血中尿素氮(BUN)與肌酸酐，所得結(jié)果顯示于表二。
GPT(谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)胺酶)與GOT(谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)胺酶)定量法利用Reitman與Frankel于1957年所敘述的方法來測量GPT與GOT的活性。其測量原理是根據(jù)下列反應(yīng)式α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid)+丙胺酸(alanine)→谷氨酸(glutamate)+丙酮酸(pyruvate)。GPT酶借著上述反應(yīng)所產(chǎn)生的丙酮酸與2，4-二硝基苯胼(2，4-dinitrophenyl hydrazine)反應(yīng)，反應(yīng)后所形成的顏色的濃度與酶活性有關(guān)。以505納米的波長來測量產(chǎn)物的吸光值(absorbance)。用來測量GPT與GOT活性的試劑可購自Sigma Chemical Co.(St.Louis，U.S.A.)。由于溶血(hemolyzed)后血清中所含的GOT與GPT量高于正常血清中的含量，因此這些未溶血的血清用量必須盡可能使用至所允許的最大量。由于超過五天后，GPT與GOT的活性即使在低溫下也可能會(huì)減低，因此這些分離出來的血清樣本儲(chǔ)存在4℃并須在五天內(nèi)使用。
將1毫升(ml)的丙胺酸-α-酮戊二酸物質(zhì)加入試管中并在37℃預(yù)熱2-3分鐘。在每個(gè)含有物質(zhì)的試管中加入0.2毫升的血清樣本后，于37℃水浴中反應(yīng)30分鐘。隨后，于試管中添加1毫升的2，4-二硝基苯胼在室溫下反應(yīng)20分鐘。于每管試管中添加10毫升的0.4N氫氧化鈉水溶液混合均勻。之后，以蒸餾水的吸光值做為比較來讀取各試管中溶液的GPT吸光值。測定GOT時(shí)，則先將天門冬胺酸-α-酮戊二酸物質(zhì)于37℃預(yù)熱2-3分鐘，并于各試管中加入0.2毫升的血清樣本于37℃下反應(yīng)60分鐘后，讀取其吸光值。
血中尿素氮的定量法尿素氨的含量則利用Faweett等人于1957年所敘述的方法來加以測量。其是使用分析血中尿素氨濃度的試劑組來進(jìn)行測量，并利用其在570納米波長下的吸光值來測定尿素水解后所形成的氨量(NH3)。
將0.5毫升的尿素水解酶(urease)溶液加入試管中并混入10微升(μl)的血清樣本后，置于37℃水浴中反應(yīng)5-10分鐘。將1毫升的酚-硝普鹽溶液(phenolnitroprusside solution)與1毫升的堿性次氯酸鹽溶液(alkaline hypochloridesolution)加入試管中溫和地混合后，加入5毫升的蒸餾水。之后，以蒸餾水做為對照組來讀取各反應(yīng)的吸光值。用來測定尿素氮的試劑可購自Sigma ChemicalCo.(St.Louis，U.S.A.)，并使用標(biāo)準(zhǔn)校正曲線(standard calibration curve)。
肌酸酐(creatinine)定量法肌酸酐的含量是利用Jaffe等人于1886年所敘述的方法來測定，其是使肌酸酐代謝物與堿性苦味酸鹽(alkaline picrate)反應(yīng)后會(huì)產(chǎn)生黃色物質(zhì)，并利用500納米的波長來測量其吸光值，且使用標(biāo)準(zhǔn)校正曲線。
將3毫升的堿性苦味酸鹽溶液與0.3毫升的血清樣本于37℃下混合反應(yīng)20分鐘后測量其吸光值(A1)。此處以蒸餾水作為負(fù)對照組。在每個(gè)試管中加入0.1毫升的酸性溶液(硫酸與醋酸混合物)后于37℃水浴中反應(yīng)5分鐘。之后以蒸餾水作為負(fù)對照組來讀取吸光值(A2)。并將吸光值(A1)減去吸光值(A2)后所得的吸光值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)校正曲線來判斷該樣本的肌酸酐含量。用來測量肌酸酐的試劑可購自Sigma Chemical Co.(St.Louis，U.S.A)。
表二

*P＜0.0b；**P＜0.01；***P＜0.0001在表二中，K.W/B.W是指腎臟重量/體重的比值，S.W/B.W則是脾臟重量/體重，而BUN則代表血中尿素氮。
如表二所顯示的，相較于僅接受順鉑注射的組別而言，該接受腹腔順鉑注射前四天先行口服束骨姜黃醇(200毫克/千克)治療的組別顯示出明顯降低的GPT濃度，且接受口服束骨姜黃醇治療的效果更優(yōu)于預(yù)先接受姜黃素的效果。該施用高劑量順鉑的組別的腎臟比重也高于未施用順鉑的組別。但在注射順鉑前，先行口服四天姜黃素與束骨姜黃醇的組別的腎臟比重則會(huì)與對照組小鼠腎臟比重相當(dāng)，且束骨姜黃醇降低腎臟比重的效果優(yōu)于姜黃素的效果。
相較于僅施打順鉑的組別，這些在施用順鉑前先行服用四天束骨姜黃醇(200毫克/千克)的小鼠組別的血中尿素氮含量也顯著降低。而當(dāng)該施打順鉑的組別因引發(fā)腎毒性而使血中肌酸酐濃度升高的同時(shí)，這些在施用順鉑前先行服用束骨姜黃醇(200毫克/千克)的小鼠組別的血中肌酸酐含量卻明顯下降。
實(shí)施例3評估束骨姜黃醇對NF-κB與AP-1的影響執(zhí)行電泳移動(dòng)偏向分析法(EMSA，electrophoretic mobility shift assay)以評估束骨姜黃醇對NF-κB與AP-1的作用效果。將上述實(shí)施例1中所制備的實(shí)施例1、實(shí)施例2、比較實(shí)施例1與比較實(shí)施例2的肝臟組織于液態(tài)氮下磨成粉末。隨后，將粉末狀的肝臟組織與500微升冷的低張壓緩沖液均質(zhì)混合，其中該低張壓緩沖液內(nèi)含10mM HEPES(pH 7.8)、10mM氯化鉀、1.5mM氯化鎂(MgCl2)、0.5mM DTT、0.2mM PMSF。于該均質(zhì)物中加入125微升的10％NP-40溶液，隨后以12,000×g的轉(zhuǎn)速離心該混合物一分鐘。將離心下來的沉淀物以100微升的上述緩沖液與12.5微升的10％NP-40清洗一次，再次離心后，將沉淀物重新分散在50微升的冷的20mMHEPES緩沖液(pH7.8)中，且該20mM HEPES緩沖液中含有420mM氯化鈉、1.5mM氯化鎂、0.2mM EDTA、0.5mM DTT、0.2mM PMSF與20％甘油。將重新分散后的溶液以12000×g的轉(zhuǎn)速于4℃下離心5分鐘。收集含有諸多核蛋白的上清液，并分析其蛋白濃度后保存于-70℃。不論是NF-κB寡聚核苷酸探針(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’；Promega，Wisconsin)或AP-1(c-Jun)寡聚核苷酸探針(5’CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3’；Promega，Wisconsin)均使用T4聚核苷酸激酶來標(biāo)記上[γ-32P]ATP，并以Nich管柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)來純化經(jīng)標(biāo)記后的探針。于含有5微升的反應(yīng)緩沖液(incubation buffer)、10微克的細(xì)胞核萃出物以及100,000cpm的標(biāo)記探針的25微升混合物中進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，其中該反應(yīng)緩沖液中含有10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM氯化鈉、1mM DTT、1mM EDTA、4％(v/v)甘油與0.1微克/毫升的超聲波震蕩后的鮭魚精子DNA。將混合物置于室溫下反應(yīng)50分鐘，分別在樣本與比較樣本中混入3微升的載入緩沖液(loadingbuffer；含250mM Tris-HCl(pH7.5)、0.2％溴酚藍(lán)與40％甘油)后，以6％的非變性聚丙酰胺膠片于150伏特(V)電壓進(jìn)行電泳分析2小時(shí)。最后，將電泳膠片干燥后以X光底片曝光。此結(jié)果顯示于第1圖。
如第1圖所示，使用順鉑進(jìn)行治療，NF-κB蛋白的DNA結(jié)合活性會(huì)提高，但相反地，AP-1蛋白的DNA結(jié)合活性則下降。然而，若預(yù)先施用束骨姜黃醇與姜黃素進(jìn)行治療則會(huì)抑制因順鉑誘導(dǎo)的NF-κB結(jié)合活性。若在相同的用藥劑量下，束骨姜黃醇對于抑制順鉑誘導(dǎo)的NF-κB結(jié)合活性的效果遠(yuǎn)強(qiáng)于姜黃素的抑制效果。而預(yù)先施用束骨姜黃醇可使被順鉑所抑制的AP-1蛋白的DNA結(jié)合活性恢復(fù)50％。但預(yù)先施用姜黃素卻不會(huì)使受到順鉑抑制的AP-1蛋白的DNA結(jié)合活性有所改變。
實(shí)施例4評估束骨姜黃醇在基因表達(dá)上的影響總RNA的分離與Dnase I剪切將實(shí)施例1中所制備的實(shí)施例1、2與比較實(shí)施例1、2的肝臟組織于液態(tài)氮下磨成粉末。隨后，使用TRIzolTM試劑(Life technologies，Austria)將粉末狀的肝臟組織進(jìn)行均質(zhì)混合。將均質(zhì)混合后的樣本置于室溫下反應(yīng)5分鐘，以使樣本中的核蛋白復(fù)合體徹底分離。于這些樣本中加入0.2倍樣本體積的氯仿(chloroform)，并激烈搖晃這些樣本15秒，再令其反應(yīng)2-3分鐘后，以12000×g的轉(zhuǎn)速于4℃下離心15分鐘。取出上層水相并加入等體積的異丙醇以沉淀出該水相中的總RNA，并將含有異丙醇的混合物置于4℃下10分鐘后，以12000×g的轉(zhuǎn)速于4℃下離心10分鐘。離心所得的RNA沉淀物以75％的乙醇清洗、干燥后溶于不含RNase(RNA水解酶)的水中。為了避免所獲得的RNA被染色體DNA所污染，分別于各個(gè)總RNA樣本中加入10單位的DNase I(DNA水解酶I，GenHunter Corp.，Nashville，USA)置于37℃下反應(yīng)30分鐘后，使用TRIzol試劑分離出不含DNA的RNA樣本。利用260與280納米的波長來計(jì)算總RNA及經(jīng)過DnaseI處理過后總RNA的濃度與純度。
DDRT-PCR使用RNAimage試劑組(GenHunter Corp.，Nashville，USA)來進(jìn)行差異顯示性反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(DDRT-PCR，Differential-display reversetranscription-PCR)。從每個(gè)組別的DNaseI處理過的總RNA庫中分別取出200納克(ng)置于含有5單位/微升的MMLV-反轉(zhuǎn)錄酶、20μM dNTP混合物與0.2μM接有鳥嘌呤核苷酸的寡聚dT引物(guanosine-anchored oligo(dT)primer(HT11-G)的反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其中該反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液含有25mMTris-HCl(pH8.3)、37.6mM氯化鉀、1.5毫克的氯化鎂以及5mM DTT。將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物以1∶10的倍率稀釋后用來進(jìn)行PCR反應(yīng)。之后，在含有2μM dNTP、0.2μM HT11-G、0.2μM引物(從H-AP1至H-AP10)、0.2μl的α-[32P]dATP(2000Ci/mmol)以及0.05單位/微升的AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer)的PCR緩沖液中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(總體積為20微升)，其中該P(yáng)CR緩沖液成分為10mMTris-HCl(pH8.4)、50mM氯化鉀、1.5mM氯化鎂與0.001％明膠。PCR儀器(GeneAmp PCRSystem9700，Perkin-Elmer)的溫度循環(huán)儀的設(shè)定如下94℃持續(xù)30秒、40℃持續(xù)2分鐘、72℃持續(xù)30秒，循環(huán)40次，且最終于72℃下持續(xù)5分鐘以進(jìn)行延長反應(yīng)后結(jié)束循環(huán)。在60瓦的固定功率下，以6％的變性聚丙酰胺膠片電泳3.5小時(shí)來分離標(biāo)記有33P的PCR產(chǎn)物。將電泳后的膠體貼在3M紙上于80℃下真空干燥1小時(shí)。將干燥的膠片置于自動(dòng)放射顯影板(autoradiogram)以進(jìn)行曝光與顯像。
克隆與DNA測序從干燥后的膠體切下感興趣的cDNA片段，并使用煮沸的水將這些cDNA片段從膠體上沖出，并再次利用與PCR反應(yīng)相同的引物對及PCR條件來進(jìn)行DDRT-PCR。并根據(jù)制造商所提供的操作方法利用PCR-TRAP克隆系統(tǒng)(GenHunter)將再次擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物克隆至PCR-TRAP載體中。并委托Takara Korea Biomedical公司(Suwon，Korea)測序含有這些DNA插入片段的質(zhì)粒，并將測序所得到的序列于國家生物資訊中心(NCBI)所提供的GenBank網(wǎng)站中利用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸-核苷酸比對程序(BLAST program，blastn)進(jìn)行序列比對，以及利用Fasta3程序?qū)λ械腅MBL基因庫進(jìn)行比對。
設(shè)計(jì)引物與反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行半定量式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(semiquantitive RT-PCR)來確認(rèn)DDRT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為了設(shè)定最適當(dāng)?shù)腜CR擴(kuò)增條件，利用引物線上(on-line)設(shè)計(jì)程序來設(shè)計(jì)針對感興趣基因的引物(Rozen與Skaletsky，2000)。本發(fā)明中所使用的引物對顯示于表三中。
表三


使用1微克的總RNAs、1μM寡聚dT15引物以及Ominiscript ReverseTranscriptase試劑組(Qiagen，California)合成出第一鏈cDNA。隨后，使用TaqPCR Master Mix試劑組(Qiagen)，以0.5微升的第一鏈cDNA及20pmol的引物(參閱表一)來進(jìn)行PCR反應(yīng)。該P(yáng)CR反應(yīng)條件為于94℃下反應(yīng)3分鐘以進(jìn)行最初的變性作用，之后進(jìn)行三步驟的循環(huán)分別為在94℃下變性40秒、53℃下退火40秒與72℃下進(jìn)行延伸1分鐘，共循環(huán)30次，最后于72℃下進(jìn)行延伸10分鐘。將擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物以1.2％瓊酯膠進(jìn)行電泳。將膠體以溴化乙錠(ethidium bromide)染色后，置于UV transilliminator下照射UV光并以Polaroid DS-34快速照相系統(tǒng)(Kodak，USA)拍攝照片。所得結(jié)果分別顯示于第2與3圖中。
第2圖所示是利用半定量式RT-PCR來評估這些NF-κB依賴性基因COX-2與iNOS的mRNA表達(dá)量。且兩種管家基因β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)與GAPDH是用來將各種mRNA的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化(normalized)。如第2圖所示，該兩基因COX-2與iNOS會(huì)因?yàn)槭┯庙樸K而高度表達(dá)，但若施用同樣劑量的束骨姜黃醇與姜黃素進(jìn)行預(yù)先治療，則可將因順鉑誘發(fā)的高COX-2mRNA的表達(dá)量降回最初的表達(dá)程度。預(yù)先施以束骨姜黃醇進(jìn)行治療會(huì)抑制順鉑所誘發(fā)的iNOX mRNA表達(dá)，但預(yù)先施用姜黃素則無法抑制順鉑所誘發(fā)的iNOX mRNA表達(dá)。
如第3圖所示，進(jìn)行DDRT-PCR以鑒定這些與束骨姜黃醇在順鉑誘發(fā)肝毒性的保護(hù)效果上有關(guān)聯(lián)而表達(dá)程度有所差異的基因。借著使用10組引物組合鑒定出7種會(huì)受順鉑影響而增加基因表達(dá)量的基因(見表四)，以及5種受順鉑影響而降低基因表達(dá)量的基因(見表五)。借著半定量RT-PCR，確認(rèn)出施行束骨姜黃醇預(yù)先治療會(huì)分別使因順鉑而提高表達(dá)的兩基因S100A9與kin，以及因順鉑而減少表達(dá)的兩基因ClpX與CP的mRNA表達(dá)量復(fù)原。且此結(jié)果顯示出束骨姜黃醇的作用效果優(yōu)于姜黃素的效果。
表四


表五

工業(yè)上的應(yīng)用如前所述，由于束骨姜黃醇展現(xiàn)出對化療藥物所引起諸如肝毒性與腎毒性等不良副作用的絕佳抑制效果，因此束骨姜黃醇能有效作為癌癥化療藥物引起的毒性的抑制劑。而內(nèi)含一癌癥化療藥物與束骨姜黃醇的抗癌組合物可在該癌癥化療藥物有效作用的同時(shí)，也將副作用降至最小。
序列表<110>樸光均(PARK，Kwang-Kyun)生物關(guān)懷有限公司(BIOCARE CO.，LTD.)<120>癌癥化療藥物所引起的毒性的抑制劑以及含有該抑制劑的癌癥化療藥物組合物<150>KR10-2003-0040937<151>2003-06-24<160>16<170>Kopatent In 1.71<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析COX-2基因表達(dá)的前置引物<400>1ggagagacta tcaagatagt gatc24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析COX-2基因表達(dá)的后置引物<400>2atggtcagta gacttttaca gctc24<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>3aagttcagca acaaccccac 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析iNOS基因表達(dá)的后置引物<400>4tcctgaacgt agacct tggg20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析S100A9基因表達(dá)的前置引物<400>5aggacctgga cacaaaccag 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析S100A9基因表達(dá)的后置引物<400>6tcatttccca gaacaaaggc 20<210>7<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析Kin基因表達(dá)的前置引物<400>7gacaactgtt gctggcttca20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析Kin基因表達(dá)的后置引物<400>8tggtcccaaa gagcttgact20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析ClpX基因表達(dá)的前置引物<400>9gcgcagagct cctcttagaa20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析ClpX基因表達(dá)的后置引物
<400>10cttctcagcc tctgcttgct 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析Cp基因表達(dá)的前置引物<400>11tgctctgaac ccgagaaagt 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析Cp基因表達(dá)的后置引物<400>12ccagagggag cataat tcca20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析β-肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)的前置引物<400>13tacaatgagc tgcgtgtggc 20<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于分析β-肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)的后置引物<400>14atgtcacgca cgatttccc 19<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析GAPDH基因表達(dá)的前置引物<400>15ctgcaccacc aactgcttag20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析GAPDH基因表達(dá)的后置引物<400>16gcctctcttg ctcagtgtcc20
權(quán)利要求
1.一種抑制癌癥化療藥物所誘發(fā)的毒性的抑制劑，其含有束骨姜黃醇作為活性成分。
2.如權(quán)利要求1所述的抑制劑，其特征在于，該毒性為肝毒性或腎毒性。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抑制劑，其特征在于，該癌癥化療藥物是鉑系抗癌藥物，其選自于由順鉑(順-二氨二氯鉑[II])、碳鉑、奧沙利鉑、奈達(dá)鉑及上述這些藥物的混合物所構(gòu)成的組中。
4.一種包含癌癥化療藥物與束骨姜黃醇的抗癌組合物，其特征在于，該束骨姜黃醇抑制該癌癥化療藥物所誘發(fā)的毒性。
5.如權(quán)利要求4所述的抗癌組合物，其特征在于，該癌癥化療藥物是鉑系抗癌藥物，其選自于由順鉑(順-二氨二氯鉑[II])、碳鉑、奧沙利鉑、奈達(dá)鉑及上述這些藥物的混合物所構(gòu)成的組中。
6.如權(quán)利要求4或5所述的抗癌組合物，其特征在于，該束骨姜黃醇的重量為該癌癥化療藥物重量的0.01倍至10倍。
全文摘要
本發(fā)明公開內(nèi)容是有關(guān)一種用于癌癥化療藥物所引起諸如肝、腎等毒性的抑制劑，以及含有該抑制劑的癌癥化療組合物。該化療藥物毒性抑制劑中含有一種活性成分束骨姜黃醇(Xanthorrhizol)。束骨姜黃醇展現(xiàn)出抑制癌癥化療藥物因劑量問題所產(chǎn)生諸如肝毒性或腎毒性等有害作用的絕佳能力。
文檔編號A61K33/24GK1842326SQ200480024279
公開日2006年10月4日 申請日期2004年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月24日
發(fā)明者樸光均, 鄭媛允, 弘傾玉, 黃在寬 申請人:生物關(guān)懷有限公司, 樸光均