專利名稱：帶有保護基的7－聚氨基烷基(氧)亞氨基甲基喜樹堿的制作方法
本文公開的發(fā)明涉及用作藥物的化合物，具體涉及含聚胺殘基的在C-7位具有取代基的喜樹堿衍生物，其中該胺殘基受保護基如Boc保護。本發(fā)明涉及它們的制備方法，它們作為具有拓樸異構(gòu)酶I抑制活性的活性劑的應(yīng)用和包含它們作為活性成分的藥物組合物。
發(fā)明
背景技術(shù)：
喜樹堿是由Wall等人，[J.Am.Chem.Soc.，1966，88，3888-3890]首次從中國土產(chǎn)的屬于藍果樹科的樹木喜樹(Camptotheca acuminata)中分離的生物堿。
該分子由在E環(huán)中具有內(nèi)酯的五環(huán)結(jié)構(gòu)組成，它是細胞毒性所必需的。
關(guān)于喜樹堿和涉及它們用作藥物的問題以及這些問題的解決的綜述，讀者參考以本申請人名義申請的EP 1 044 977。
目前聚胺作為醫(yī)藥化學(xué)中非常令人感興趣的主題已有一些時間。
腐胺、精脒和精胺是最深入研究的聚胺，因為它們天然存在于原核和真核細胞。它們在細胞生理學(xué)中的作用似乎是多重的，且在某些方面仍是未知的[J.Med.Chem.，2001，44，1-261。在生理學(xué)pH下，這些化合物作為聚陽離子存在，能夠與相當(dāng)多種細胞組分，例如RNA、DNA、核苷酸、蛋白質(zhì)和其它酸性生物物質(zhì)相互作用[J.CellBiochem.，1991，46，37-47]。
在腫瘤學(xué)中，聚胺成為研究對象是有許多原因的，即它們在生理學(xué)pH下的聚陽離子性質(zhì)、它們對細胞膜離子通道的影響和它們與多種重要的人腫瘤形式的轉(zhuǎn)錄因子的相互作用[Biochemistry 1999，38，14765-74]。
還已經(jīng)描述了聚胺與細胞毒性藥物，例如與苯丁酸氮芥的綴合[Cancer Res.，1992，52，4190-5]，其中已經(jīng)觀察到治療指數(shù)明顯改善，還作為一種形式的化學(xué)預(yù)防與3-吲哚基甲醇聯(lián)合[BMC-Cancer 2003，32，1471-2407]。
對受保護形式的聚胺衍生物的研究不那么頻繁，例如N-芐基-衍生物[J.Med.Chem.，2001，44，3653-64]。
聚胺可以與細胞毒性分子結(jié)合，以影響它們的細胞轉(zhuǎn)運例如精胺已與吖啶綴合[J.Med.Chem.，2002，45，5098-111]以促進在腫瘤細胞水平選擇性釋放后者。
還已將聚胺殘基插入喜樹堿(CPT)的7位，例如亞氨基甲基衍生物[Bioorganic & Medicina1 Chemistry Letters，2001，11，291-4]，具體而言，已在以本申請人的名義提交的國際專利申請WO 0053607中描述了由精胺衍生的化合物。
發(fā)明概述現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在7位通過亞氨基甲基或氧亞氨基甲基鍵被取代的喜樹堿(其中亞胺和肟基衍生自含有聚氨基烷基殘基的胺或羥胺(例如精胺、精脒、腐胺)，在以受保護的形式存在時表現(xiàn)出顯著的抗癌活性，明顯優(yōu)于未受保護形式的相同衍生物。
這種抗癌效力與目前用于腫瘤學(xué)臨床實踐的化合物相當(dāng)，因此作為本發(fā)明主題的衍生物的主要貢獻在于豐富可獲得用于抗擊癌癥的物質(zhì)。
作為本發(fā)明主題的化合物具有以下通式(I)
其中 m為數(shù)字0或1；Z和Z′可以相同或不同，為0-2的整數(shù)；Y和Y′可以相同或不同，為(CH2)n1、(CH2)n2-CH[NRVII(CH2)n4-NHRI]-(CH2)n3、CH2-CH[CH2-CH2]2-或(CH2)n2-N[(CH2)n4-NHRIV]-(CH2)n3；Y”選自H、環(huán)烷基C3-C7、(CH2)n5-N[CH2-CH2]2N-(CH2)n6NHRV、(CH2)n7-CH[CH2-CH2]2NRV；X為O或簡單的鍵；n-n8可以相同或不同，為0-5的整數(shù)；RI、RII、RIII、RIV和RV可以相同或不同，為它們所結(jié)合的氮的保護基、CO2RVI、CO2CH2Ar、CO2(9-芴基甲基)、(CH2)n5-NHCO2RVI、CH2Ar、COAr、(CH2)n5-NHCO2CH2Ar、(CH2)n5-NHCO2-(9-芴基甲基)；RVI為直鏈或支鏈(C1-C6)烷基；RVII為H或RI-RV；Ar為C6-C12芳族殘基，例如苯基，任選被一個或多個選自以下的基團取代鹵素、羥基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NRVIIIRIX，其中RVIII和RIX可以相同或不同，為氫、直鏈或支鏈(C1-C5)烷基；或者Ar為雜環(huán)基，該雜環(huán)基含有至少一個選自任選被(C1-C5)烷基取代的氮原子和/或氧和/或硫的雜原子；該雜環(huán)可以被一個或多個選自以下的基團取代鹵素、羥基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NRVIIIRIX，其中RVIII和RIX可以相同或不同，為氫、直鏈或支鏈(C1-C5)烷基；N1-氧化物、外消旋混合物、它們的單獨的對映異構(gòu)體、它們的單獨的非對映異構(gòu)體、E和Z型、它們的混合物和藥學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明包括使用具有上述通式(I)的化合物作為藥物，特別是用作拓樸異構(gòu)酶I抑制劑的藥物的活性成分。在源自拓樸異構(gòu)酶抑制活性的治療應(yīng)用中，我們應(yīng)該提及腫瘤以及病毒和寄生蟲感染。
本發(fā)明包括含有作為活性成分的式(I)化合物與藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑相混合的藥物組合物。
發(fā)明詳述當(dāng)提及各個RI、RII、RIII、RIV和RV時保護基意指有利于分子被細胞捕獲的基團。本發(fā)明的基礎(chǔ)是發(fā)現(xiàn)胺氮上的保護基對分子賦予有力的抗癌活性，且由于本發(fā)明者不愿拘泥于任何特定的理論考慮，認為該保護基應(yīng)該是親脂性大基團。優(yōu)選的保護基的實例為CO2RVI、CO2CH2Ar、CO2-(9-芴基甲基)、(CH2)n5-NHCO2RVI、(CH2)n5-NHCO2-CH2Ar、CH2Ar、COAr、(CH2)n5-NHCO2-(9-芴基甲基)，其中的可變基團如以上定義。
第一組特別優(yōu)選的化合物包括具有6元(term)內(nèi)酯環(huán)(m＝0)的式(I)化合物，且其中具體為-20S-(4-{[3-(7-喜樹堿亞基(camptothecinylidene)-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-(3-叔丁氧羰基-氨基丙基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20S-(4-{[3-(7-喜樹堿亞基-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20S-[3-(7-喜樹堿亞基-氨基)-丁基]-氨基甲酸的叔丁酯；-20S-7-[3-(N-叔丁氧羰基氨基)丙氧基亞氨基-甲基]-喜樹堿。
第二組優(yōu)選的化合物包括具有7-元內(nèi)酯環(huán)的式(I)化合物，其合成在[J.Med.Chem.1998，41，5410]中作了描述，且其中具體為-20RS-(4-{[3-(7-高喜樹堿亞基(homocamptothecinylidene)-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-(3-叔丁氧羰基氨基丙基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20RS-(4-{[3-(7-高喜樹堿亞基-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20RS-[3-(7-高喜樹堿亞基-氨基)-丁基]-氨基甲酸的叔丁酯；-20R，S-7-[3-(N-叔丁氧羰基氨基)丙氧基亞氨基-甲基]-高喜樹堿。
本發(fā)明公開的化合物為拓樸異構(gòu)酶I抑制劑，并因此用作藥物，特別用于治療受益于對該拓樸異構(gòu)酶的抑制的疾病。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的化合物表現(xiàn)出抗增殖活性，因此因它們的治療活性而被使用，并具有使它們適于藥物組合物制劑的物理化學(xué)性質(zhì)。
該藥物組合物包含至少一種式(I)化合物作為活性成分，其量用于產(chǎn)生明顯治療效果。本發(fā)明涵蓋的組合物完全是常規(guī)的，并通過使用在制藥工業(yè)中通常實踐的方法來獲得。根據(jù)選擇的給藥途徑，該組合物可以是固體或液體劑型，適于口、腸胃外或靜脈內(nèi)給藥。根據(jù)本發(fā)明的組合物包含活性成分和至少一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這些可以為特別有用的助劑，例如增溶劑、分散劑、助懸劑或乳化劑。
式(I)化合物還可以與其它活性成分，例如抗癌藥或其它具有抗寄生蟲或抗病毒活性的藥物聯(lián)合使用，既可作為分開的劑型又可以是單一的劑型。
根據(jù)本發(fā)明的化合物用作具有抗癌活性的藥物，例如對肺癌如非小細胞(non-microcytoma)肺癌，或結(jié)腸直腸和前列腺癌以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
以下實施例進一步例示本發(fā)明。
制備17-甲?；?喜樹堿往冷卻至0℃的在18mL CH2Cl2中的2.0g(4.73mmol)7-二甲基縮醛-喜樹堿的溶液加入12mL TFA和數(shù)滴H2O。室溫下一夜后反應(yīng)完全，并形成Rf＝0.42(CH2Cl2/MeOH 92∶8)的產(chǎn)物。在SiO2上用CH2Cl2/MeOH(從98∶2至92∶8)將反應(yīng)混合物色譜純化得到1.4g(3.72mmol；產(chǎn)率79％)預(yù)期產(chǎn)物，為一種黃色固體。
制備2N′，N″，N-三Boc-精胺根據(jù)在文獻[Tetrahedron Letters 1998，39，439-42]中所述的方法制備N′，N″，N-三Boc-精胺。
制備3N′，N″-二Boc-精脒用等同于關(guān)于精胺所公開的方法制備該化合物。
制備4N′-Boc-腐胺此化合物可商購得到。
實施例17-[(N′，N″，N-叔丁氧羰基)-精胺-亞氨基-甲基]-20S-喜樹堿[ST2544].
在100mL火焰燒瓶中將272mg(0.72mmol)7-甲酰基喜樹堿溶于20mL無水CH2Cl2。將44mg Yb(OTf)3(0.07mmol；0.1當(dāng)量)加到該溶液，然后將700mg(1.4mmol；2當(dāng)量)的三-Boc-精胺溶于12mL無水CH2Cl2和分子篩，將該反應(yīng)燒瓶避光保存。室溫下16小時后，加入1.9g(4.2mmol；相對于精胺為3當(dāng)量)的用異氰酸酯基官能化的樹脂(裝載2.2mmol/g)作為過量胺的清除劑。
將該反應(yīng)混合物在室溫下再放置16小時，然后用C鹽過濾以除去分子篩和清除劑樹脂；在真空下除去溶劑，并用制備HPLC色譜法(CH3CN/MeOH＝90∶10；8mL/分；RP-18，250×25mm，7μm)純化粗反應(yīng)產(chǎn)物，得到500mg(0.58mmol；產(chǎn)率81％)的產(chǎn)物，為一種黃色固體。
MS(IS)[MH]+＝860.8[M-1]-＝858.71H NMR(300MHz，CDCl3，δ)1.0-1.1(t，3H，CH3)，1.4-2.0(m，35H，3xtBu+4xCH2)，2.0-2.1(q，2H，CH2)，3.0-3.3(m，10H，5xCH2)，3.85-3.95(d，2H，CH2)，5.3-5.4(d，IH，CH)，2.55(s，2H，CH2)，5.75-5.85(d，1H，CH)，7.7-7.9(m，3H，3xCH)，8.25-8.35(d，1H，CH)，8.45-8.55(d，1H，CH)，9.4(s，1H，CH)。
13C NMR(75.4MHz，CDCl3，δ)8.0；28.6；28.7；31.8；47.0；52.7；66.6；72.9；79.5；97.8；118.9；126.2；127.6；128.5；139.3；130.8；146.2；149.9；150.0；152.9；155.7；157.6；174.0。
實施例27-[(N′，N ″-叔丁氧羰基)-精脒-亞氨基-甲基]-20S-喜樹堿[ST2598]。
用實施例1所公開的相同方法得到標(biāo)題產(chǎn)物。
產(chǎn)率＝22％MS(IS)[MH]+＝704.6[M+Na]+＝726.61H NMR(300MHz，CDCl3，δ)1.0-1.1(t，3H，CH3)，1.4-2.1(m，26H，2xtBu+4xCH2)，3.0-3.4(m，4H，2xCH2)，3.75-3.95(m，4H，2xCH2)，5.25-5.35(d，1H，CH)，5.55(s，2H，CH2)，5.75-5.85(d，1H，CH)，7.7-7.9(m，3H，3xCH)，8.25-8.35(d，1H，CH)，8.45-8.55(d，1H，CH)，9.4(s，1H，CH)。
13C NMR(75.4MHz，CDCl3，δ)8.0；28.6；28.7；32.1；47.4；51.7；52.9；53.6；66.7；69.7；72.9；79.7；98.0；98.4；119.0；122.5；123.1；126.4；127.7；128.6；130.2；130.4；131.0；131.3；146.4；150.1；153.1；156.0；156.4；157.9；174.2。
實施例37-[3-(N-叔丁氧羰基)-氨基-1-丙氧基亞氨基甲基]-20S-喜樹堿(ST2664)往在5ml無水THF中的-7-(3-氨基丙氧基亞氨基甲基)-20S-喜樹堿(20mg，0.045mmol)的懸浮液加入10mg(Boc)2O(1當(dāng)量)和7μlEt3N(1當(dāng)量)；使該混合物在室溫下反應(yīng)30小時，在該段時間結(jié)束時反應(yīng)幾乎完全。用TLC監(jiān)測反應(yīng)，用CH2Cl2∶CH3OH＝9∶1洗脫。
蒸發(fā)THF，并用CH2Cl2萃取固體；用水(二次)和鹽水(一次)洗滌有機相。用Na2SO4使溶液脫水，過濾，并將其干燥。得到16mg由E和Z異構(gòu)體的混合物組成的產(chǎn)物(產(chǎn)率64％)。
Rf0.38，在CH2Cl2∶CH3OH＝98∶2中。
M.p.141-142℃1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δ)0.87(t，H3-18E+H3-18Z)，1.37(s，H9叔丁基E)，1.30(s，H9叔丁基Z)，1.67(m，H2-19Z+-CH2CH2CH2-Z)，1.87(m，H2-19E+-CH2CH2CH2-E)，2-83(t，CH2-N-Z)，3.07(t，CH2-N-E)，4.12(t，CH2-O-Z)，4.35(t，CH2-O-E)，5.17(s，H-17-Z)，5.32(s，H-17-E)，5.40(s，H-5-E)，6.50(s，OH-E+OH-Z)，6.75(t，NH-Z)，6.90(t，NH-E)，7.25(s，H-14-Z)，7.32(s，H-14-E)，7.75(m，H-11-E+H-11-Z)，7.90(m，H-10-E+H-10-Z)，8.02(d，H-12-Z)，8.20(d，H-12-E+H-9-Z)，8.40(s，-CH＝N-Z)，8.6(d，H-9-E)，9.32(s，-CH＝N-E)。
E∶Z比率＝88∶22(根據(jù)NMR)。
實施例47-[N-(N’-叔丁氧羰基)-腐胺亞氨基-甲基]-20S-喜樹堿(ST2615)用與實施例1所述的相同合成方法得到標(biāo)題產(chǎn)物。
產(chǎn)率＝78％
MS(IS)[MH]+＝547.71H NMR(300MHz，CDCl3，δ)1.0-1.1(t，3H，CH3)，1.45(s，9H，tBu)，1.65-2.0(m，4H，2xCH2)，3.2-3.35(q，2H，CH2)，3.9-4.0(t，2H，CH2)，5.3-5.4(d，1H，CH)，5.55(s，2H，CH2經(jīng))，5.75-5.85(d，1H，CH)，7.7-7.9(m，3H，3xCH)，8.25-8.35(d，1H，CH)，8.45-8.55(d，1H，CH)，9.4(s，1H，CH)。
實施例57-[4-(N-叔丁氧羰基)-哌啶基-甲基亞氨基甲基-20S-喜樹堿(ST2665)往在5ml CH2Cl2中的7-甲?；矘鋲A(60mg，0.159mmol)的懸浮液(在CaCl2上蒸餾并在篩上保存)加入119mg(0.477mmol，3當(dāng)量)1-Boc-4-氨基甲基哌啶鹽酸鹽、40μl吡啶和6mg Yb(OTf)3(相對于醛為10wt％)，使該混合物于室溫下反應(yīng)5天(TLCCH2Cl2∶CH3OH＝98∶2)。
用快速色譜法(洗脫劑CH2Cl2∶CH3OH＝99∶1)純化產(chǎn)物。黃色固體。產(chǎn)率20％。M.p.200℃分解。反應(yīng)產(chǎn)物的Rf0.37，在CH2Cl2∶CH3OH＝96∶4中。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6；δ)0.87(t，CH2CH3)，1.32(s，叔丁基)，1.67-2.00(m，CH2CH3+2-CH2-pip.+-CH pip.)，2.55-2.85(m，-CH2-pip.)，3.80(m，-CH2-N)，3.97(m，-CH2-pip.)，5.35(s，H-17)，5.42(s，H-5)，6.50(s，OH)，7.35(s，H-14)，7-70-7.80(m，H-11)，7.85-7.95(m，H-10)，8.20(dd，H-12)，8.72(dd，H-9)，9.42(s，-CH＝N)。
實施例67-[(N′，N″-二-芐氧基羰基)-精脒亞氨基甲基]-20S-喜樹堿[ST2729]。
用與實施例所述的相同合成方法得到標(biāo)題產(chǎn)物。
產(chǎn)率＝35％MS(IS)[MH]+＝772.9[M+Na]+＝794.91H NMR(300MHz，CDCl3，δ)1.0-1.1(t，3H，CH3)，1.4-2.1(m，8H，4xCH2)，3.2-3.6(m，6H，3xCH2)，3.95(s，2H，CH2)，5.1-5.2(d，4H，2xCH2)，5.4-5.9(m，4H，2xCH2)，7.2-7.45(m，10H，10xCH)，7.7-7.9(m，3H，3xCH)，8.25-8.5(m，2H，2xCH)，9.4(s，1H，CH)。
13C NMR(75.4MHz，CDCl3，δ)8.0；27.2；31.7；41.0；52.8；66.5；66.6；67.2；72.9；98.0；118.9；122.8；126.2；127.4；127.8；128.0；128.2；128.5；130.3；130.9；136.7；146.0；150.0；152.9；156.3；156.7；157.7；174.0實施例77-[3-(4-叔丁氧羰基)氨基丁基]-叔丁氧羰基氨基-丙氧基亞氨基甲基]-20S-喜樹堿[ST2872]由N-Boc-4-氨基丁醇(500mg)，經(jīng)甲磺酰化，然后與乙醇胺反應(yīng)，進行游離NH基團的Boc保護，與N-羥基苯鄰二甲酰亞胺進行Mitsunobu反應(yīng)，并進行肼解，制備N″，N-(二叔丁氧羰基)-氨基丁基氨基乙氧基胺(NMR(CDCl3)4.65(NHBoc)，3.9(CH2-O)，3.3-3.6(Boc-N-CH2和-ONH2)，3.05-3.25(CH2NHBoc和CH2N-Boc)，1.45-1.55(CH2-CH2)，1.45(18H，2Boc)(200mg)。
將7-甲?；矘鋲A(55mg，0.145mmol)溶于2ml乙醇，加入在1ml乙醇中的100mg N″，N-(二叔丁氧羰基)-氨基丁基氨基乙氧基胺，并回流8小時。
蒸發(fā)并用二氯甲烷MeOH(97∶3)進行硅膠色譜處理得到51mg(50％)標(biāo)題化合物，mp 153℃，Rf0.2，在CH2Cl2∶MeOH(97∶3)中，NMR(DMSO-d6)9.4(s，CH＝)，8.851H-NMR(300MHz，CDCl3，δ)0.87(t，H3-18E+H3-18Z)，1.45-1.65(m，BOC E+BOC Z+-CH2CH2-Z+CH2CH2-E)，1.87(m，H2-19E+H2-19Z)，2-80-3.65(m，3CH2-N-Z+3CH2-N-E)，4.25-4.35(m，CH2-O-Z)，4.40-4.52(m，CH2-O-E)，4.60(brs，NH)，5.10(brs，-NH)，5.20-5.45(m，H-17-Z+H-17-E+H-5-z)，5.65-5.75(m，H-5-E)，7.65-7.75(m，H-14-Z+H-14-E+2Ar Z)，7.75-7.85(m，2Ar-E)，7.90(d，lArZ)，8.05(s，-CH＝N-Z)，8.25-8.35(m，2ArE+1 Ar Z)，9.05(s，-CH＝N-E)。
E∶Z比率＝55∶45(根據(jù)NMR)。
對NCI-H460細胞的細胞毒性將NCI-H460細胞非小細胞肺癌細胞保存在包含10％FCS和1％谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基中。如下進行細胞毒性試驗以分析分子活性。將250μl體積的細胞接種于96孔平板，并在37℃下與標(biāo)量濃度的產(chǎn)物一起在含有5％CO2的潮濕氣氛下培養(yǎng)2小時。在培養(yǎng)結(jié)束時，通過翻轉(zhuǎn)該平板并加入無菌緩沖鹽水溶液(PBS)三次來移出分子。將包含10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基(200μl)加到孔中，并將該平板再培養(yǎng)72小時。在培養(yǎng)結(jié)束時，再次翻轉(zhuǎn)該平板，并在紙上干燥，然后加入200μl PBS和50μl 80％TCA。將該平板在冰上再培養(yǎng)至少1小時。通過翻轉(zhuǎn)該平板來移出TCA，并首先在紙上干燥該平板，然后通過浸泡在蒸餾水中并翻轉(zhuǎn)來洗滌三次。首先在紙上干燥該平板，然后在60℃的恒溫調(diào)節(jié)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10分鐘。首先在紙上干燥平板，然后在60℃恒溫調(diào)節(jié)的培養(yǎng)器中干燥10分鐘。將200μl在1％乙酸中的4％硫代若丹明(sulforodamine)B加到所有的孔。將該平板在室溫下再培養(yǎng)30分鐘。通過翻轉(zhuǎn)來移出硫代若丹明B，通過在1％乙酸中浸泡三次來洗滌該平板，然后首先在吸墨紙上干燥，隨后在60℃恒溫器中干燥10分鐘。最后，將200μl Tris堿10mM加到所有的孔，并將該平板攪拌至少20分鐘。用Multiskan分光光度計在540nm下測定光學(xué)密度。用產(chǎn)物一起培養(yǎng)能夠以依賴于濃度的方式抑制增殖。表1顯示IC50值(抑制50％細胞存活的產(chǎn)物濃度]。ST2544和ST2598表現(xiàn)出對所用的肺癌細胞系具有類似的、非常強有力的細胞毒性。
結(jié)果顯示在下表中。
表1喜樹堿衍生物的細胞毒性

對釀酒酵母模型的體外和體內(nèi)效果為鑒定克服在釀酒酵母模型中由拓樸異構(gòu)酶I DNA上的點突變誘導(dǎo)的對喜樹堿的耐藥的喜樹堿衍生物，平行地使用體外和體內(nèi)系統(tǒng)。
關(guān)于體內(nèi)系統(tǒng)，用作為對照的YCpGAL1質(zhì)粒和不同的含有突變體的質(zhì)粒(YCpGAL1-hT OP1G363C、YCpGAL1-hTOP1K720E、YCpGAL-1hTOP1A653 P)轉(zhuǎn)化酵母株EKY3(top 1Δ)，所述突變體證明對喜樹堿耐藥。在接近酶的活性位點(酪氨酸723)存在許多突變，其它突變在對應(yīng)于非常保守的區(qū)域的大約363位周圍。
在進行酵母轉(zhuǎn)化之前，酵母是未冷凍的，并在含有無菌固體YPDa培養(yǎng)基(每升10g酵母提取物、20g胨、20g右旋糖、0.7g腺嘌呤、20g葡萄糖、20g瓊脂)的90-mm平板上用無菌彎曲玻璃棒進行平板接種。在培養(yǎng)箱中在30℃下48-72小時后形成菌落。
在轉(zhuǎn)化前一天，用無菌Gilson管尖(tip)取單一酵母菌落樣品，并接種在5ml無菌液體YPDA培養(yǎng)基(不含瓊脂的上述培養(yǎng)基)中。該菌落在攪拌和30℃下生長過夜。之后一天，用無菌液體YPDA培養(yǎng)基稀釋5ml飽和培養(yǎng)物，并在30℃下生長至在600nm下光密度為1.0。將該細胞在4000xg和室溫下離心5分鐘，并將沉淀重懸在25ml含有Tris-EDTA(TE)10mM pH 7.5、EDTA 1mM和乙酸鋰100mM的(T/E)溶液。將該酵母懸浮液在4000xg和室溫下離心5分鐘。將該沉淀重懸在相同的前述新鮮溶液(大約500μl)，以具有2×109細胞/ml。為完成轉(zhuǎn)化，將200μg載體DNA、1μg質(zhì)粒DNA和200μl感受態(tài)細胞置于Eppendorf分光光度計。加入1.2ml含有PEG 40％的TE/乙酸鋰溶液，并將該酵母懸浮液于30℃下攪拌30分鐘。通過以下方法產(chǎn)生熱休克將酵母懸浮液在42℃下放置15分鐘，然后將其置于選擇性平板，即含有完全極限培養(yǎng)基(CM)的不含尿嘧啶的平板(每升1.3g含有多種氨基酸但缺少尿嘧啶的dropout粉末、1.7g不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿、5g硫酸銨、20g葡萄糖和20g瓊脂)。在30℃下培養(yǎng)該平板直至轉(zhuǎn)化。
在用喜樹堿衍生物處理酵母(體內(nèi)斑點試驗)之前，用Gilson管尖將轉(zhuǎn)化的菌落接種在5ml無菌液體CM培養(yǎng)基中。菌落在攪拌和30℃下生長過夜。在第二天，在600nm下測定菌落的光密度，并稀釋菌落以得到0.3的光密度。由此第一稀釋液在96孔平板中得到10倍系列稀釋(1∶10，1∶100，1∶1000)。吸取5μl的每種稀釋液至90-mm含有固體CM培養(yǎng)基的平板。對于對照加入2％葡萄糖和2％半乳糖，而對于用喜樹堿衍生物處理的稀釋液加入2％半乳糖和45μM濃度的產(chǎn)物。將菌落在30℃下培養(yǎng)48-72小時，并進行肉眼分析。
評價喜樹堿衍生物ST2544和ST2598的效果。拓樸異構(gòu)酶I野生型DNA表現(xiàn)為對ST2544和ST2598敏感的表型，而突變酶G363C和A653P證明對受試衍生物耐藥。但是，K720E突變體表現(xiàn)出對ST2544衍生物敏感的表型。
結(jié)果表示在下表中。
表2體內(nèi)喜樹堿衍生物存在下釀酒酵母的生長

從左至右各符號表示4份系列酵母稀釋液的生長。
+釀酒酵母存活；-釀酒酵母致死。
ST2544抗MKN-28人胃癌的效果在第0天將腫瘤碎片接種在兩脅。在腫瘤剛可觸及時開始治療。根據(jù)方案q4dx4通過口服途徑和靜脈內(nèi)施用分子。在治療期間，每天檢查動物的死亡率。每天觀察小鼠的身體外觀、行為以及總體和局部臨床體征。記錄任何由常態(tài)的偏離。在整個治療期間對所有動物稱重以計算由治療導(dǎo)致的體重降低百分率。
在最后治療之后20天評價經(jīng)治療的腫瘤相對于對照腫瘤的腫瘤體積抑制％。為測定藥物的抗腫瘤活性，每二周用游標(biāo)卡尺測定腫瘤直徑。使用公式TV(mm3)＝[長度(mm)×寬度(mm)2]/2，其中的寬度和長度分別是每個腫瘤的最短和最長的直徑。
當(dāng)腫瘤達到大約2g的重量時，通過頸部脫位處死小鼠。計算LCK(log細胞殺死)作為效力指數(shù)，以評價在治療結(jié)束時分子效果的持續(xù)。結(jié)果在表3中報道。
表3p.o.或i.v.施用的ST2544(q4dx4)在s.c.荷有MKN-28人胃癌的無胸腺裸鼠中的抗腫瘤活性

ST2544通過口服途徑遞送時在4和2mg/kg(q4dx4)下表現(xiàn)出對腫瘤生長的明顯抑制，因為TVI＞50％，而它在靜脈內(nèi)給藥時在4mg/kg(q4dx4)下有效(TVI＝66％)。以4mg/kg口服后觀察到在治療結(jié)束時所測定的對腫瘤生長的效果的持續(xù)(LCK＝1)。
權(quán)利要求
1.具有通式(I)的化合物， 其中 m為數(shù)字0或1；Z和Z′可以相同或不同，為0-2的整數(shù)；Y和Y′可以相同或不同，為(CH2)n1、(CH2)n2-CH[NRVII(CH2)n4-NHRI]-(CH2)n3、CH2-CH[CH2-CH2]2-或(CH2)n2-N[(CH2)n4-NHRIV]-(CH2)n3；Y”選自H、環(huán)烷基C3-C7、(CH2)n5-N[CH2-CH2]2N-(CH2)n6NHRV、(CH2)n7-CH[CH2-CH2]2NRV；X為0或簡單的鍵；n-n8可以相同或不同，為0-5的整數(shù)；RI、RII、RIII、RIV和RV可以相同或不同，為它們所結(jié)合的氮的保護基、CO2RVI、CO2CH2Ar、CO2(9-芴基甲基)、(CH2)n5-NHCO2RVI、CH2Ar、COAr、(CH2)n5-NHCO2CH2Ar、(CH2)n5-NHCO2-(9-芴基甲基)；RVI為直鏈或支鏈(C1-C6)烷基；RVII為H或RI-RV；Ar為C6-C12芳族殘基，例如苯基，任選被一個或多個選自以下的基團取代鹵素、羥基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NRVIIIRIX，其中RVIII和RIX可以相同或不同，為氫、直鏈或支鏈(C1-C5)烷基；或者Ar為雜環(huán)基，該雜環(huán)基含有至少一個選自任選被(C1-C5)烷基取代的氮原子和/或氧和/或硫的雜原子；該雜環(huán)可以被一個或多個選自以下的基團取代鹵素、羥基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NRVIIIRIX，其中RVIII和RIX可以相同或不同，為氫、直鏈或支鏈(C1-C5)烷基；N1-氧化物、外消旋混合物、它們的單獨的對映異構(gòu)體、它們的單獨的非對映異構(gòu)體、E和Z型、它們的混合物和藥學(xué)上可接受的鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該保護基為親脂性大基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該保護基選自CO2RVI、CO2CH2Ar、CO2-(9-芴基甲基)、(CH2)n5-NHCO2RVI、(CH2)n5-NHCO2CH2Ar、(CH2)n5-NHCO2-(9-芴基甲基)，其中RVI如以上定義。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中該保護基選自叔丁氧羰基、芐氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一項的化合物，其中m為0。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，選自-20S-(4-{[3-(7-喜樹堿亞基-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-(3-叔丁氧羰基氨基丙基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20S-(4-{[3-(7-喜樹堿亞基-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20S-[3-(7-喜樹堿亞基-氨基)-丁基]-氨基甲酸的叔丁酯；-20S-7-[3-(N-叔丁氧羰基氨基)丙氧基亞氨基-甲基]-喜樹堿。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一項的化合物，其中m為1。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的化合物，選自-20RS-(4-{[3-(7-高喜樹堿亞基-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-(3-叔丁氧羰基氨基丙基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20RS-(4-{[3-(7-高喜樹堿亞基-氨基)-丙基]-叔丁氧羰基-氨基}-丁基)-氨基甲酸的叔丁酯；-20RS-[3-(7-高喜樹堿亞基-氨基)-丁基]-氨基甲酸的叔丁酯；-20R，S-7-[3-(N-叔丁氧羰基氨基)丙氧基亞氨基-甲基]-高喜樹堿。
9.含有作為活性成分的至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-8的化合物與至少一種藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑相混合的藥物組合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8的化合物作為藥物的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-8的化合物用于制備具有拓樸異構(gòu)酶1抑制活性的藥物的應(yīng)用。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的應(yīng)用，用于制備具有抗癌活性的藥物。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的應(yīng)用，用于制備具有抗寄生蟲活性的藥物。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的應(yīng)用，用于制備具有抗病毒活性的藥物。
全文摘要
公開具有通式(I)的化合物，其中的基團如在本文以下的描述中定義，其特征在于在亞胺/肟殘基上存在聚胺取代基，這種胺基團又受適宜的保護基保護。該化合物被賦予有力的拓撲異構(gòu)酶I抑制活性，因此用作治療腫瘤以及病毒和寄生蟲感染的藥物。
文檔編號A61P35/00GK1918170SQ200480019789
公開日2007年2月21日 申請日期2004年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月14日
發(fā)明者G·吉安尼尼, S·潘克, M·O·廷緹, C·匹薩諾, L·維茨, L·米爾里尼, F·祖尼諾 申請人:希格馬托制藥工業(yè)公司, 研究和治療腫瘤國家研究所