專利名稱：一種治療腫瘤用的化療藥物的增敏增效劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種治療腫瘤用的化療藥物的增敏增效劑，特別是一種能與現(xiàn)有抗腫瘤化療藥物組合使用形成一類具有高抑瘤率的抗腫瘤藥物的增敏增效劑，為一種化合物的用途發(fā)明。
背景技術：
抗藥性是人們熟知的一種在疾病治療過程常見的失敗現(xiàn)象，但在治療腫瘤過程中，由于治療對象的特殊性，還容易出現(xiàn)多藥抗藥性而導致化療效果的降低和治療的失敗。
多藥抗藥性(multidrug resistance，簡稱MDR)是指癌細胞接觸一種來源于天然的抗腫瘤藥物并產(chǎn)生抗藥性的同時，對結構和作用機理不同的多種來源于天然的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉抗藥性。腫瘤病人在經(jīng)過化療后，往往會產(chǎn)生多藥抗藥性。多藥抗藥性是導致腫瘤化療失敗的主要原因，也是腫瘤化療急需解決的難題之一。多藥抗藥性的形成機理復雜。腫瘤細胞可通過不同途徑導致MDR的產(chǎn)生，同時，單個腫瘤細胞可同時存在多種抗藥性的機制。任何一種或多種機制聯(lián)合作用均可導致MDR的產(chǎn)生。
MDR的逆轉劑與抗瘤藥物合用，將會大幅度地提高化療藥物對MDR腫瘤的療效。實驗證明許多化合物或藥物具有體外逆轉MDR的作用，但由于它們的毒副作用很大，故均無臨床應用價值。所以作為臨床應用的MDR逆轉劑的藥物，至今尚未開發(fā)成功。因此，尋找低毒、不易產(chǎn)生MDR的物質或有效的MDR逆轉物質是腫瘤化療領域急需解決的問題，亦是廣大藥物研究者共同追求的方向。
正是由于尋找低毒、有效的MDR逆轉劑的研究遇到了困難，長期來沒有取得實質性的進展，使一部分科學家改變了思路，從另外一個角度入手，尋求一類治療腫瘤用的化療藥物的增敏增效劑。人們期望當這類化合物和抗腫瘤藥物合用時，不僅能提高腫瘤細胞，特別是多藥抗藥性的腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性，而且能顯著提高抗腫瘤藥物在治療過程中的抑瘤效果。這種期望有了實質性的進展。
中國專利申請(CN1444935A)公開了一種從茶葉中提取的水溶性的“表沒食子兒茶素沒食子酸酯(簡稱水溶性EGCG)在抗腫瘤藥物中的應用”，將它用作腫瘤化療藥物的增敏和增效劑，起到“良好的MDR逆轉作用”，顯著提高了現(xiàn)有抗腫瘤藥物的抑瘤功效，是一種有望進入臨床應用的天然的抗瘤的增敏增效劑。但是美中不足的是水溶性的EGCG本身很不穩(wěn)定，見光易分解，實驗證明在培養(yǎng)條件下，其穩(wěn)定存在時間少于一天；此外，發(fā)現(xiàn)水溶性的EGCG，其膜通透性較差，換句話說，它不易通過細胞膜進入胞內，從而影響了它的功效的發(fā)揮。因此，尋找一種穩(wěn)定性好，又易于進入腫瘤細胞內，并保持“良好的MDR逆轉作用”，作為治療腫瘤用的抗腫瘤化療藥物的增敏增效劑自然成了本發(fā)明的主攻方向。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點，提供一種治療腫瘤用的化療藥物的增敏增效劑，它不僅具有穩(wěn)定性好，膜通透性好的優(yōu)點，而且與現(xiàn)有的抗腫瘤藥物配伍使用時能產(chǎn)生良好的增敏和增效作用，顯著地提高腫瘤的治療效果。
發(fā)明人通過對從茶葉中提取的水溶性的表沒食子兒茶素沒食子酸酯〔(-)-epigallocatechin gallate，簡稱EGCG〕系統(tǒng)研究后發(fā)現(xiàn)，該提取物不僅具有抑制腫瘤細胞增殖的功效，同時能提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，或者說抑制了腫瘤細胞對化療藥物的抗藥性，提高了化療藥物的抗癌功效。但遺憾的是研究發(fā)現(xiàn)水溶性EGCG存在二大缺點其一是穩(wěn)定差，易分解，在體內存在時間短，藥效難以持久；其二是膜通透性差，不易被細胞吸收進入細胞內，或者說其生物利用度低，而且難以在靶點積聚達到有效的作用濃度，因而影響了它的功效的發(fā)揮。為此，發(fā)明人在長期從事水溶性EGCG研究工作的基礎上，構思對水溶性EGCG進行必要的結構性改造，通過烴化修飾，變成脂溶性EGCG，具有穩(wěn)定性好，膜通透性好的優(yōu)點。幸運的是，通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)由水溶性EGCG烴化成脂溶性EGCG是一種成熟的現(xiàn)有技術，其制備所得的脂(油)溶性EGCG作為一種抗氧化劑，被用于食品保鮮和護膚化妝品中，但未見有用于抗腫瘤藥物方面的報導。因此本發(fā)明系統(tǒng)地探索脂(油)溶性EGCG作為抗腫瘤藥物或與現(xiàn)有抗腫瘤藥物配伍作為治療腫瘤的化療藥物的增敏和增效劑的可能性，還是一項開拓性的工作，有著積極的創(chuàng)新意義。
本發(fā)明所說的一種治療腫瘤用的化療藥物的增敏增效劑，是指一類脂溶性的表沒食子兒茶素沒食子酸酯化合物，其分子通式為C22H35O11-R0，它是由從茶葉中提取的水溶性表沒食子兒茶素沒食子酸酯〔(-)-epigallocatechin gallate，簡稱EGCG〕和食用級不飽和脂肪酸烴化而成，簡稱脂溶性的EGCG。常用的優(yōu)選不飽和脂肪酸為食用級的亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸中的一種。
本發(fā)明所說的脂溶性EGCG為一類具有如下結構通式的化合物 其分子通式為C22H35O11-R0，分子量為696.9～769；
其中C22H35O11-為水溶性的EGCG母體(或稱親水相的EGCG基因)；R0-為C15～C18的脂(油)溶性的(或稱親油性)的不飽和脂肪酸羰基。
1.實驗證明脂溶性EGCG具有抑制腫瘤細胞存活的能力實驗1以藥物敏感性的細胞株KB-3-1腫瘤細胞為對象，進行濃度與存活率的研究。按照經(jīng)典的方法將含有不同濃度的脂溶性的EGCG的培養(yǎng)液加入事先接有同細胞量的96孔板中，在培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72h，用MTT法觀察細胞的存活率，并測定KB-3-1細胞產(chǎn)生半數(shù)抑制時脂溶性EGCG的濃度IC50值。
實驗結果如表1所示表1脂溶性EGCG對KB-3-1細胞存活的影響

實驗證明了脂溶性EGCG具有抑制藥物敏感性的KB-3-1細胞的生長能力，而且量效關系明顯。
實驗2以多藥抗藥性細胞株KB-A-1腫瘤細胞為對象進行濃度與存活率的研究。
按照經(jīng)典的方法將含有不同濃度的脂溶性EGCG的培養(yǎng)液加入事先接有相同細胞量的96孔板中，在培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72h，用MTT法觀察細胞的存活率，并測定產(chǎn)生半數(shù)抑制時的脂溶性EGCG濃度IC50值。
實驗結果如表2所示表2脂溶性EGCG對KB-A-1細胞存活的影響

實驗證明了脂溶性EGCG具有抑制多藥抗藥性的KB-A-1細胞的生長能力，且被抑制的程度與脂溶性EGCG的濃度成正比，量效關系明顯。
此外，從實驗1和2的結果可以進一步看出，多藥抗藥性細胞株KB-A-1細胞對脂溶性EGCG化合物的敏感性要比KB-3-1來得高因脂溶性EGCG對KB-A-1作用的IC50值為75.7μg/ml，而對KB-3-1作用的IC50值為113.4μg/ml，這不僅顯示了脂溶性EGCG對KB-A-1具有更高的敏感性，而且進一步提示當脂溶性EGCG與其他藥物并用時可能存在協(xié)同作用而增效，從而提高藥物的功效。
脂溶性EGCG之所以具有良好的抑制細胞的生長能力，可能基于脂溶性EGCG的膜通透性好的緣故，它易于進入細胞內，占據(jù)了細胞空間，阻斷了培養(yǎng)液向細胞提供的營養(yǎng)源，導致了細胞萎縮凋亡，存活率下降。
2.實驗證明脂溶性EGCG化合物對抗腫瘤藥物具有增效作用，從而提高了藥物在治療過程中的功效。
具體實驗的條件為(1)選用多藥抗藥性細胞株KB-A-1作為實驗對象；(2)配合實驗使用的藥物為三種抗癌藥阿霉素(簡稱DOX)、長春新堿、絲裂霉素，由于它們對多藥抗藥性細胞株KB-A-1細胞的半數(shù)抑制的濃度IC50分別為5.01、4.25、4.14μg/ml，均在微克水平，有著相近的效果，為了比較與行文方便，故本發(fā)明中選取阿霉素(簡稱DOX)作抗癌藥的代表；(3)為了更好地顯示脂溶性EGCG的增效作用，實驗中為了盡量減少脂溶性EGCG對KB-A-1細胞存活率的影響，選取脂溶性EGCG作用濃度為20μg/ml，遠低于IC50的濃度。
實驗3脂溶性EGCG對阿霉素向KB-A-1細胞內流入的影響將含有KB-A-1細胞密度為1×104cells/ml的培養(yǎng)液接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，待細胞貼壁長滿后分組實驗。為了觀察脂溶性EGCG對藥物阿霉素流入KB-A-1細胞內的影響，實驗按(a)5μg/ml阿霉素、(b)20μg/mlEGCG+5μg/ml阿霉素兩組并行進行，并分別在0，2h，3h時，將96孔板中培養(yǎng)液吸出分別換入(a)，(b)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)。到第4小時，將藥物吸凈，先用冰PBS洗3次，然后加入200μl的裂解液(50％乙酸+0.1N Hcl)，放入培養(yǎng)箱中溫浴20min后取出，用熒光酶標儀測定吸光值(OD值)，OD值的大小反映了細胞內的阿霉素的多少，觀察細胞內阿霉素的量來確定EGCG對阿霉素流入的影響。
實驗結果如表3所示表3脂溶性EGCG對KB-A-1細胞內阿霉素流入的影響

實驗表明當胞外存在(a)組藥物阿霉素時，阿霉素能順濃度差向胞內滲透，在1h內，胞內阿霉素增加了1.22倍。隨著時間的延長，阿霉素的轉移趨于平衡，4h后胞內的阿霉素增加1.59倍。在EGCG存在的情況下，阿霉素向細胞內流入速度增快，平衡時阿霉素含量亦相應增加，在實驗條件下，與單用阿霉素時相比胞內的阿霉素含量可增加3.1倍。
實驗4.脂溶性EGCG對KB-A-1細胞內阿霉素流出的影響由于KB-A-1細胞對進入胞內的阿霉素有一定的泵出能力，從而影響到細胞內的阿霉素的有效濃度，影響阿霉素的抑瘤率，為此探索脂溶性EGCG抑制KB-A-1對進入胞內的阿霉素的泵出能力，亦有著積極的意義。
將含有KB-A-1細胞密度為1×104cells/ml的培養(yǎng)液接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，待細胞貼壁長滿后分組實驗。按照流出實驗的要求，先吸出96孔板中的培養(yǎng)液加入阿霉素(5μg/ml)，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，使KB-A-1細胞內的阿霉素達到平衡的濃度，然后將阿霉素吸出，用PBS洗滌數(shù)遍后分別加入含EGCG的培養(yǎng)液(EGCG的濃度為20μg/ml)或正常培養(yǎng)液。分別在0、1、2、4h時取出樣品，用熒光酶標儀測定吸光值，通過考察細胞內的阿霉素的量來研究EGCG對KB-A-1細胞內阿霉素流出的影響，具體實驗結果見表4所示。
表4脂溶性EGCG對KB-A-1細胞內阿霉素流出的影響

由表4可見脂溶性EGCG對KB-A-1細胞內的阿霉素的流出有一定的抑制作用，雖然其抑制的力度不大，但從分子角度看表4的流出抑制和表3流入增加，這一進一出已足以使阿霉素在細胞中的量達到靶點濃度，從而發(fā)揮阿霉素殺滅KB-A-1細胞的功效，所以實驗3，4結果從一個側面顯示了脂溶性EGCG的增效作用。
3.實驗證明脂溶性EGCG與抗腫瘤藥物聯(lián)合使用，具有提高抗腫瘤藥物的抑瘤效果按常規(guī)方法建立裸鼠KB-A-1細胞實體瘤模型，然后隨機分組進行抑瘤試驗。
其中第1組為只給生理鹽水不施藥物的空白組；第2組為施5μg/ml的阿霉素藥物組；第3組為施40mg/kg脂溶性EGCG藥物組；第4組為施20mg/kg脂溶性EGCG+5μg/ml阿霉素藥物組；第5組為施40mg/kg脂溶性EGCG+5μg/ml阿霉素藥物組。
實驗結果如表5所示。
表5不同藥物組的抑瘤率

從實驗結果可以看出(1)以阿霉素為代表的現(xiàn)有的抗腫瘤藥面對KB-A-1細胞實體瘤，其平均抑瘤率僅為40.18％。
(2)脂溶性EGCG本身亦有一定的抑瘤效果，面對KB-A-1細胞實體瘤，其抑瘤率可達45.93％。
(3)脂溶性EGCG與抗腫瘤藥物阿霉素聯(lián)用具有更好的抑瘤效果，最高的是40mg/kg脂溶性EGCG+5μg/ml阿霉素藥物組，其抑瘤率高達75.06％。而且聯(lián)合用藥組(第4、第5組)實驗結果顯示脂溶性EGCG具有明顯的量效關系。
總之，從上述實驗結果足以證明①脂溶性EGCG有一定的抑瘤功能，盡管其抑瘤機理目前尚不清楚，需進一步探索。②脂溶性EGCG與現(xiàn)有的抗腫瘤(或抗癌)藥物聯(lián)合使用具有提高抗腫瘤藥物抑瘤效果，它作為抗腫瘤藥物的增敏增效劑應該不容置疑。③從脂溶性EGCG對KB-3-1細胞具有相對較高的半數(shù)抑制濃度IC50＝113.4μg/ml來判斷，脂溶性EGCG是一類低毒的化合物。
下面將結合實施例以進一步闡明本發(fā)明的脂溶性EGCG所具有的功效。
具體實施例方式
實施例1 脂溶性EGCG與阿霉素配伍使用時抑瘤效果首先按常規(guī)的方法建立裸鼠KB-A-1細胞實體瘤模型，然后分別隨機分組進行實施例1的抑瘤試驗。
以脂溶性EGCG與抗腫瘤藥物阿霉素組合使用進行抑瘤試驗的具體條件第1組為只給生理鹽水不施藥物的空白組；第2組為施5μg/ml的阿霉素藥物組；第3組為施40mg/kg脂溶性EGCG藥物組；第4組為施20mg/kg脂溶性EGCG+5μg/ml阿霉素藥物組；第5組為施40mg/kg脂溶性EGCG+5μg/ml阿霉素藥物組。
實驗結果如下表所示
表為實施例1的不同藥物組的抑瘤率

由實施例1表中第4、第5組實驗結果對比可見當脂溶性EGCG與阿霉素組合使用時，脂溶性EGCG有著明顯的量效關系，為臨床使用提供了科學依據(jù)。
實施例2 脂溶性EGCG與抗腫瘤藥物長春新堿配伍使用的抑瘤效果。
首先按常規(guī)的方法建立裸鼠KB-A-1細胞實體瘤模型，然后分別隨機分組進行抑瘤試驗。
以脂溶性EGCG與長春新堿配伍使用進行抑瘤試驗具體條件第1組位置給生理鹽水，不施藥物的空白組；第2組為施4μg/ml的長春新堿藥物組；第3組為施40mg/kg脂溶性EGCG藥物組；第4組為施20mg/kg脂溶性EGCG+4μg/ml長春新堿藥物組；第5組為施40mg/kg脂溶性EGCG+4μg/ml長春新堿藥物組。
實驗結果列于下表。
表為實施例2的不同藥物組的抑瘤率

由上表結果顯示脂溶性EGCG與長春新堿配伍使用同樣具有良好抑瘤作用，當按脂溶性EGCG40mg/kg+4μg/ml長春新堿配伍使用時，其抑瘤率高達75％以上，實驗表明脂溶性EGCG具有明顯的量效關系。
實施例3 脂溶性EGCG與抗腫瘤藥物絲裂霉素配伍使用的抑瘤效果。
首先按常規(guī)的方法建立裸鼠KB-A-1細胞實體瘤模型，然后分別隨機分組進行抑瘤試驗。
以脂溶性EGCG與抗腫瘤藥物絲裂霉素配伍使用，進行抑瘤試驗的具體條件第1組為只給生理鹽水不施藥物的空白組；第2組為施4μg/ml絲裂霉素的藥物組；第3組為施40mg/kg脂溶性EGCG藥物組；第4組為施20mg/kg脂溶性EGCG+4μg/ml絲裂霉素藥物組；
第5組為施40mg/kg脂溶性EGCG+4μg/ml絲裂霉素藥物組。
實驗結果列表如下表為實施例3的不同藥物組的抑瘤率

由實施例3中的第4、第5組實驗結果對比可見當脂溶性EGCG與絲裂霉素配伍使用時，脂溶性EGCG具有明顯的量效關系。當脂溶性EGCG40mg/kg+4μg/ml絲裂霉素配伍使用時，可獲得75％以上的高抑瘤率的效果。
總之，由實施例1～3再次證明，脂溶性EGCG作為多藥抗藥性腫瘤化療過程中抗腫瘤藥物的增敏和增效劑使用時，毋庸置疑地會產(chǎn)生良好的高抑瘤效果，大幅地提高了現(xiàn)有抗腫瘤藥物的療效。換句話說，脂溶性EGCG對于腫瘤細胞來說具有顯著的增敏作用，抑制或逆轉了它的抗藥性，對于現(xiàn)有的抗腫瘤藥物來說增加了它的療效，因此脂溶性EGCG作為治療腫瘤用的化療藥物的增敏和增效劑，具有顯著的抑瘤治療效果，有望推動化療藥物生產(chǎn)技術的進步。
權利要求
1.一種治療腫瘤用的化療藥物的增敏增效劑，所說的化療藥物的增敏增效劑為一類脂溶性的表沒食子兒茶素沒食子酸酯化合物，具有如下的結構通式 分子通式為C22H35O11-R0，分子量為696.9～769；其中R0為C15～C20的不飽和脂肪酸羰基。
2.如權利要求1所述的增敏增效劑，其特征在于其中所說的R0來自于一類食用級的不飽和脂肪酸，常用的優(yōu)選不飽和脂肪酸為亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸中一種。
3.如權利要求1、2所述的增敏增效劑，其特征在于它與任一抗腫瘤藥阿霉素，長春新堿，絲裂霉素配合使用時，能大劑量的投入，其投入量為20～40mg/kg。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療腫瘤用的化療藥物的增敏增效劑，所說的增敏增效劑為一類脂溶性的表沒食子兒茶素沒食子酸酯化合物，其分子通式為C
文檔編號A61K31/704GK1650856SQ20041008935
公開日2005年8月10日 申請日期2004年12月10日 優(yōu)先權日2004年12月10日
發(fā)明者顧國興, 劉建文, 魏東芝, 盧艷花, 王磊 申請人:華東理工大學, 上海碧能生物制品有限公司