專(zhuān)利名稱(chēng)：一種醫(yī)用絲素蛋白材料的表面處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)用絲素蛋白材料的表面處理方法，屬于生物材料的表面改性技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
絲素蛋白材料作為天然生物蛋白，因它具有良好的生物相容性和良好的機(jī)械性能與物理性能，近年來(lái)受到生物材料界越來(lái)越多的關(guān)注和研究。由于絲素蛋白天賦的優(yōu)異性能有望被應(yīng)用與機(jī)體組織中，如作為人造韌帶、人造骨、人造血管等生物材料。
為了滿(mǎn)足醫(yī)用生物工程的需要，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN1475533A已成功地將絲素蛋白制成了二維薄膜和三維絲素管材料，并從物理角度解決了絲素蛋白材料的力學(xué)性能，而無(wú)需添加有害的有機(jī)溶劑和高分子物質(zhì)就可以得到力學(xué)性能優(yōu)異、不溶于水的絲素蛋白材料，繼而通過(guò)乙醇消毒和紫外線(xiàn)或γ射線(xiàn)滅菌后供臨床試用。但是作為醫(yī)用生物材料，絲素蛋白還必須經(jīng)得起醫(yī)用生物學(xué)的考驗(yàn)。粗看起來(lái)，現(xiàn)有的絲素蛋白材料似乎已能滿(mǎn)足醫(yī)用材料的要求，其實(shí)不然，如當(dāng)絲素蛋白作為人造韌帶、人造骨、人造血管進(jìn)入機(jī)體組織后，需要一個(gè)漫長(zhǎng)的適應(yīng)過(guò)程，這說(shuō)明絲素蛋白材料與機(jī)體組織細(xì)胞間的親和性還不夠，或者說(shuō)兩者的相容性還不能滿(mǎn)足要求，所以醫(yī)務(wù)工作者和患者均期望有關(guān)的生物材料工作者做出進(jìn)一步努力改變這種狀況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有醫(yī)用絲素蛋白材料所存在的缺點(diǎn)，提出了一種醫(yī)用絲素蛋白材料的表面處理方法，可大幅度改善絲素蛋白材料與機(jī)體組織細(xì)胞間的相容性，一旦絲素蛋白材料作為醫(yī)用生物材料被植入機(jī)體組織后，它就能讓機(jī)體組織細(xì)胞在材料的表面快速增殖生長(zhǎng)，并盡快的融為一體。
發(fā)明人從體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，絲素蛋白作為生物材料植入機(jī)體組織后之所以需要一個(gè)漫長(zhǎng)的適應(yīng)過(guò)程，因?yàn)樗鳛橐划愺w物質(zhì)進(jìn)入人類(lèi)機(jī)體組織，它需要一個(gè)馴化過(guò)程，即一方面需要機(jī)體組織排出體液，逐步消除材料表面痕量污染所造成的不良的信息污染；另一方面需要營(yíng)造一種機(jī)體組織細(xì)胞在材料生長(zhǎng)的條件；換句話(huà)說(shuō)，需要逐步提高絲素蛋白材料與機(jī)體組織之間的生物相容性。所以，如何預(yù)先在材料表面完成這個(gè)馴化過(guò)程，營(yíng)造機(jī)體組織細(xì)胞在絲素蛋白材料優(yōu)越的生長(zhǎng)條件，這就是本發(fā)明所創(chuàng)造的構(gòu)思。
本發(fā)明所說(shuō)的醫(yī)用生物材料的表面處理方法，主要包括如下兩個(gè)方面
(1)在超聲波和能發(fā)射遠(yuǎn)紅外線(xiàn)的電氣石的參與下，用活性水對(duì)材料進(jìn)行深層次的清洗，以消除材料內(nèi)的痕量污染，還材料固有的本性。
通常將加工成型的(如CN1475533A公開(kāi)的)醫(yī)用絲素蛋白材料(簡(jiǎn)稱(chēng)材料)按常規(guī)預(yù)處理，即先用酒精消毒、紫外線(xiàn)或γ射線(xiàn)滅菌處理，然后在無(wú)菌條件下，用雙蒸水反復(fù)浸泡數(shù)次，使殘留在材料表面上的酒精等雜質(zhì)盡量洗除。但是，通過(guò)上述清洗處理的材料內(nèi)仍然含有痕量的污染物，影響材料的固有本性，減少了它表面的應(yīng)有活性。
為此，本發(fā)明將經(jīng)過(guò)上述預(yù)處理材料置于盛有活性水的容器中，借助超聲波和能發(fā)射遠(yuǎn)紅外線(xiàn)的電氣石的作用，對(duì)材料進(jìn)行深層次清洗，將材料內(nèi)的痕量污染物予以清除，并恢復(fù)材料固有的本性，即恢復(fù)材料表面的氨基酸基團(tuán)固有的活性。
其中所說(shuō)的活性水，是指恢復(fù)水本身固有活性的水，它是一種PH＝7.4，締合度為6～8的小分子態(tài)的水，具有高的滲透力、溶解力、代謝力。
目前所說(shuō)的凈化水，包括采用一切凈化措施獲得的純凈水、蒸餾水、雙蒸水在內(nèi)，均是略帶酸性的、締合度大于36的大分子團(tuán)的水，因?yàn)樗械暮哿课廴疚?，影響了水的本性。由于這種痕量污染物，用常規(guī)的儀器很難檢測(cè)出來(lái)，因此有人稱(chēng)這種污染為信息污染，意思是污染物信息影響水的本性。
當(dāng)材料用活性水清洗時(shí)，活性水易滲透絲素蛋白材料的內(nèi)部，將污染垃圾帶出除去，還材料的本來(lái)面目——一種潔凈的活性的絲素蛋白。
其中，電氣石的作用在于使水在電氣石發(fā)出的遠(yuǎn)紅外線(xiàn)作用下始終保持PH＝7.4，締合度為6～8的小分子態(tài)，從而保持活性水固有的高效去污染能力，此外電氣石發(fā)射的遠(yuǎn)紅外線(xiàn)還具有活化絲素蛋白表面氨基酸分子的能力，有利于下一步的處理。
其中，超聲波的作用主要在于借助超聲波的能量作用以加速清洗速度，提高清洗效率，即在較短的時(shí)間內(nèi)完成材料的清洗過(guò)程。此外超聲波存在亦有利于活性水保持穩(wěn)定的小分子團(tuán)的尺度。
(2)用促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)對(duì)材料表面進(jìn)行改性處理，是促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)物質(zhì)中的酸性基團(tuán)與絲素蛋白材料表面上已被復(fù)活的賴(lài)氨酸、組氨酸等堿性氨基酸基團(tuán)耦合，使材料表面含有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)物質(zhì)，從而大大提高了材料與機(jī)體組織之間的親和性，創(chuàng)造適宜細(xì)胞在材料表面上生長(zhǎng)的優(yōu)化環(huán)境，是機(jī)體組織細(xì)胞在材料表面快速的增殖生長(zhǎng)，并融為一體。
將經(jīng)步驟(1)處理的材料，在無(wú)菌條件下取出瀝干，置于盛有含促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)物質(zhì)的溶液中，浸漬8～24小時(shí)，溶液中的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)物質(zhì)，由于其上酸性基團(tuán)的作用會(huì)自動(dòng)與材料表面上的堿性氨基酸基團(tuán)耦合，從而在材料表面(宏觀(guān)看)包圍了一層促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)物質(zhì)。取出后，在無(wú)菌條件下密封包裝，并保存于-20℃以下的冰箱中，備用。
其中所說(shuō)的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)物質(zhì)是指酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(簡(jiǎn)稱(chēng)為aFGF)或表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(簡(jiǎn)稱(chēng)為EGF)中的一種，用雙蒸水配制成濃度為20～200ng/ml的溶液，供表面處理用。
為了驗(yàn)證本發(fā)明所說(shuō)的經(jīng)表面處理的絲素蛋白材料的良好的生物學(xué)性質(zhì)，本發(fā)明將已處理過(guò)的絲素蛋白材料進(jìn)行了生物學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，方法如下1.首先將表面處理過(guò)的絲素蛋白材料置于培養(yǎng)瓶(或培養(yǎng)管)中，用動(dòng)物細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)基DMEM(為Dulbecco’s Modified Eagle Medium的簡(jiǎn)稱(chēng)，它是一種公知的培養(yǎng)基，故敘述從略)，在37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行浸潤(rùn)數(shù)小時(shí)。
2.倒出DMEM，然后接種含有動(dòng)物細(xì)胞的DMEM溶液，置于37℃的培養(yǎng)箱中，每隔24小時(shí)用倒置顯微鏡觀(guān)察計(jì)數(shù)一次細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
其中所說(shuō)的動(dòng)物細(xì)胞是貼壁依賴(lài)型的內(nèi)皮細(xì)胞如人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞，或表皮細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中的一種。接種溶液中細(xì)胞密度為(3.5～3.75)×105個(gè)/ml。
培養(yǎng)24小時(shí)后，用倒置顯微鏡觀(guān)察結(jié)果材料表面上的細(xì)胞生長(zhǎng)良好，均勻密布，形態(tài)呈紡錐形；用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)得細(xì)胞增至5.05×105個(gè)/ml。
培養(yǎng)48小時(shí)后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)得細(xì)胞增至6.0×105個(gè)/ml。
由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證明用本發(fā)明公開(kāi)的方法經(jīng)表面處理后的絲素蛋白材料，當(dāng)它作為細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)制材料時(shí)，由于有著良好的表面生長(zhǎng)條件，促使動(dòng)物細(xì)胞在表面快速生長(zhǎng)，可以從一個(gè)側(cè)面證明經(jīng)表面處理后的絲素蛋白材料有著優(yōu)良的生物相容性。因此亦可以這樣說(shuō)本發(fā)明的醫(yī)用絲素蛋白材料的表面處理方法，為細(xì)胞在表面增長(zhǎng)創(chuàng)造一種優(yōu)越的生態(tài)環(huán)境，有效的改善了絲素蛋白材料的表面生物學(xué)特性，當(dāng)它植入機(jī)體組織后，就能很快的和機(jī)體組織細(xì)胞融為一體，解決了醫(yī)學(xué)生物工程所存在的難題，從而有效的推進(jìn)了醫(yī)用生物材料制備技術(shù)的進(jìn)步。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例1.醫(yī)用絲素蛋白材料的精煉與表面處理。
1.取家蠶繭去蛹取蠶繭或收集絲織行業(yè)的廢蠶繭作原料，將10g清洗的絲繭原料放在濃度為0.5％的碳酸鈉溶液中煮沸，按絲繭與碳酸鈉溶液之間的重量比1∶100反復(fù)精練兩次，每次30分鐘(沸騰態(tài))，然后充分水洗至中性，在室溫下干燥得到精煉的絲素蛋白6.7g。
2.將上述精煉所得的絲素蛋白按重量比1∶10放置在濃度9M的氯化鈣溶液中，煮沸溶解，得絲素蛋白溶液。
3.用能截留分子量≥30,000Da聚醚砜膜對(duì)絲素蛋白溶液進(jìn)行超濾，操作壓力為1.0MPa，溫度為25℃。通過(guò)超濾不僅可以去除氯化鈣等雜質(zhì)和分子量較小的蛋白與多肽，同時(shí)能獲得分子量≥30,000Da的濃縮的絲素蛋白溶液A1200ml。用紫外分光光度法定量測(cè)定A1溶液中蛋白濃度為53.32mg/ml。
4.將上述溶液A1用蒸餾水稀釋至蛋白濃度(指分子量≥30,000Da的絲素蛋白)為26mg/ml，傾倒在培養(yǎng)瓶中，傾倒量以能完全覆蓋瓶底為度。將含有絲素蛋白溶液A1的培養(yǎng)瓶置于40℃的干燥箱中干燥24～48小時(shí)成膜，即得絲素蛋白膜材料，或者按CN1475533A專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)的方法，制成二維薄膜或三維管狀材料。
5.將步驟4所得絲素蛋白材料進(jìn)行常規(guī)的消毒滅菌處理。將絲素蛋白材料先用75％的酒精浸泡消毒30分鐘，再用紫外線(xiàn)或γ射線(xiàn)滅菌30分鐘。然后在無(wú)菌條件下用雙蒸水反復(fù)清洗絲素蛋白材料，盡可能的除去附著在絲素蛋白材料表面上殘留的酒精等雜質(zhì)(但是痕量的雜質(zhì)污染單純靠洗滌是去不掉的)。
6.對(duì)絲素蛋白材料進(jìn)行深層次的清洗和“活化”，還絲素蛋白材料固有的本質(zhì)本色。將活性水注入貯有絲素蛋白材料的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)管中，然后在無(wú)菌條件下引入超聲波探頭和能自動(dòng)發(fā)射遠(yuǎn)紅外線(xiàn)的電氣石構(gòu)件(或顆粒)，是水始終保持水分子活性態(tài)(即活性水的標(biāo)準(zhǔn)，PH＝7.4，締合度為6～8。)，并借超聲波的能量作用，不僅能快速的滲入絲素蛋白材料的內(nèi)部，載帶出痕量的污染雜質(zhì)，予以除去，而且能使絲素蛋白材料表面的氨基酸分子從污染信息的束縛中解放出來(lái)，得到“活化”，還純凈絲素蛋白固有的本色。
為了達(dá)到深層次清洗絲素蛋白材料的目的，視材料表面結(jié)構(gòu)的復(fù)雜情況不同，可按步驟6反復(fù)處理1～3次，每次至少半小時(shí)。處理完后，倒掉殘余的活性水或取出絲素蛋白材料在無(wú)菌條件下瀝干。注這里借用活化概念來(lái)形容被污染信息束縛中解脫出來(lái)的純凈的絲素蛋白的固有本質(zhì)，所以在活化外加上引號(hào)。
7.用促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)洗凈的絲素蛋白材料進(jìn)行表面處理。向存放有經(jīng)步驟6處理的絲素蛋白材料的培養(yǎng)瓶中，加入酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子aFGF的溶液，其濃度為20～200ng/ml，溶液加入量以能完全覆蓋絲素蛋白材料表面為度。在無(wú)菌條件下浸漬8～24小時(shí)，一般aFGF濃度高，則浸漬時(shí)間可短一些。aFGF上的酸性基團(tuán)能自動(dòng)與被“活化”的絲素蛋白材料表面上的堿性氨基酸分子耦合，是絲素蛋白材料表面含有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)物質(zhì)。
8.用體外細(xì)胞培養(yǎng)法來(lái)檢驗(yàn)或評(píng)估經(jīng)表面處理的材料的生物學(xué)特性，并預(yù)期材料與機(jī)體組織之間的親和性。其試驗(yàn)方法簡(jiǎn)述如下先將經(jīng)步驟7處理的材料，至于裝有DMEM溶液的培養(yǎng)瓶中，在37℃培養(yǎng)箱中放置12～24小時(shí)，使材料表面得到DMEM的浸潤(rùn)；然后倒去多余的DMEM，再在無(wú)菌條件下，接種用DMEM配置的人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞溶液，所接種的溶液中細(xì)胞濃度為3.5×105個(gè)/ml，同時(shí)放入無(wú)菌的電氣石微晶，使溶液中的水在電氣石自動(dòng)放射的紅外線(xiàn)作用下瞬間變成活性水，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，用倒置顯微鏡觀(guān)察，材料的表面細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈紡錐形，對(duì)于絲素蛋白薄膜材料試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，接種溶液量為3ml已足夠，此時(shí)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)得細(xì)胞密度為5.01×105個(gè)/ml，比未經(jīng)表面處理的材料，其細(xì)胞增長(zhǎng)速率至少提高一倍，說(shuō)明通過(guò)本發(fā)明處理的材料比未經(jīng)處理的材料更適合于細(xì)胞的生長(zhǎng)。
總之，從實(shí)施例中可以看出按照本發(fā)明所說(shuō)的表面處理方法，可以大大改善絲素蛋白材料表面的生物學(xué)特性，為機(jī)體組織細(xì)胞在材料表面的增長(zhǎng)創(chuàng)造了良好的生物學(xué)環(huán)境，從而推動(dòng)醫(yī)用生物材料的發(fā)展。
權(quán)利要求
1.一種醫(yī)用絲素蛋白材料的表面處理方法，包括將已通過(guò)酒精消毒、紫外線(xiàn)或γ射線(xiàn)滅菌后的材料先用雙蒸水反復(fù)清洗以盡量除去酒精等雜質(zhì)；然后用活性水進(jìn)行深層次清洗以除去材料內(nèi)的痕量污染物，使材料表面活化，還絲素蛋白固有的本色，最后使材料表面上耦合促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，創(chuàng)造適宜于細(xì)胞在材料表面上生長(zhǎng)的優(yōu)化的環(huán)境。其特征在于(1)所說(shuō)的用活性水進(jìn)行深層清洗是指在超聲波和能自動(dòng)發(fā)射遠(yuǎn)紅外的電氣石的存在下，用一種PH＝7.4，締合度為6～8的小分子團(tuán)的水清洗，利用活性水高滲透高凈化特性將絲蛋白的材料內(nèi)的痕量污染物予以清除，提高材料表面氨基酸“活性”，還絲素蛋白材料固有的本質(zhì)；其中電氣石作用在于使活性水始終保持PH＝7.4，締合度為6～8的小分子態(tài)，超聲波的作用除了能使水保持小分子團(tuán)尺度外，主要在于借助超聲波的能量加速清洗速度，提高清洗效率；(2)所說(shuō)的使材料表面耦合促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)，是指通過(guò)材料表面上堿性氨基酸基團(tuán)和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)物質(zhì)上的酸性基團(tuán)之間作用進(jìn)行自動(dòng)耦合，其中所說(shuō)的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)物質(zhì)是指酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(簡(jiǎn)稱(chēng)為aFGF)或表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(簡(jiǎn)稱(chēng)為EGF)中的一種，用雙蒸水配制成濃度為20～200ng/ml的溶液，在無(wú)菌條件下，將絲素蛋白的材料浸漬其中8～24小時(shí)，使材料表面上自動(dòng)耦合有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種醫(yī)用絲素蛋白材料的表面處理方法，首先通過(guò)一定條件下的深層次清洗，消除材料上的痕量污染，恢復(fù)絲素蛋白固有的本色，然后通過(guò)在材料表面耦合促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，使材料表面含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子，從而大大提高和改善了材料表面與機(jī)體組織之間親和性，創(chuàng)造了細(xì)胞在材料表面上生長(zhǎng)增殖的優(yōu)越環(huán)境，使機(jī)體組織與材料很快的融為一體，有力地推動(dòng)了制備生物材料工程的進(jìn)步。
文檔編號(hào)A61L29/16GK1651101SQ20041008935
公開(kāi)日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2004年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日
發(fā)明者徐殿勝, 陸兵, 夏杰, 謝菁 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)