專利名稱：褐藻酸寡糖在抗癡呆、抗糖尿病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種褐藻酸寡糖在治療老年性癡呆和糖尿病方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
老年性癡呆和糖尿病是目前嚴(yán)重危害人類健康的多發(fā)病和常見病，尤其是隨著世界老年人口的日益增多，其發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)，因此老年性癡呆和糖尿病的防治顯得越來(lái)越重要。目前用于老年性癡呆的防治藥物包括中樞興奮劑、改善膽堿能的物質(zhì)、腦血液循環(huán)改善劑、中草藥及吡咯烷酮類化合物等，多存在療效不確切、特異性不強(qiáng)，或毒副作用大、口服吸收差、不易透過(guò)血腦屏障，特別是治標(biāo)不治本的缺點(diǎn)，限制了他們的廣泛應(yīng)用。而臨床常用的糖尿病防治藥物主要包括胰島素和口服降糖藥物，多存在使用不便及毒副作用大等缺點(diǎn)，尤其是缺乏合適的用于II型糖尿病的有效藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗老年性癡呆和糖尿病作用的褐藻酸寡糖，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)上的不足。
褐藻酸寡糖用于制作抗老年性癡呆藥物。
褐藻酸寡糖用于制作抗糖尿病藥物。
本發(fā)明的藥物能大規(guī)模生產(chǎn)，價(jià)格低廉，用于制備抗老年性癡呆和糖尿病藥物。


及
具體實(shí)施例方式
附圖1為還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖縮短癡呆動(dòng)物尋找平臺(tái)潛伏期圖。
附圖2為還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖縮短癡呆動(dòng)物尋找平臺(tái)游泳路程圖。
附圖3為還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖縮短癡呆動(dòng)物第一次到達(dá)原平臺(tái)圖。
附圖4為還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖增加癡呆動(dòng)物穿越原平臺(tái)次數(shù)圖。
附圖5為還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖保護(hù)胰淀素?fù)p傷胰島β細(xì)胞圖。
本申請(qǐng)人在申請(qǐng)?zhí)枮?3138966.X、03138976.7、03138967.8的中國(guó)專利中分別披露了三種還原端1位為羧基褐藻酸寡糖的制備方法，用該方法制造出來(lái)的褐藻酸寡糖分別為還原端1位為羧基的古羅糖醛酸寡糖、還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖及還原端1位為羧基的甘古糖醛酸寡糖。這些寡糖均能大規(guī)模生產(chǎn)，價(jià)格低。經(jīng)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)得知，這些寡糖具有抑制老年性癡呆和糖尿病的作用。
實(shí)施例一 褐藻酸寡糖抗老年性癡呆療效觀察采用東莨菪堿腹腔注射所致癡呆的大鼠，觀察了藥物對(duì)癡呆動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能及相關(guān)生化指標(biāo)的影響，結(jié)果表明，還原端1位為羧基的古羅糖醛酸寡糖、還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖及還原端1位為羧基的甘古糖醛酸寡糖均能明顯改善癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，明顯升高癡呆大鼠大腦皮層及海馬內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)、ATPase等酶的活性，降低丙二醛(MDA)的含量。表明原端1位為羧基的古羅糖醛酸寡糖、還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖及還原端1位為羧基的甘古糖醛酸寡糖對(duì)老年性癡呆具有明顯的治療作用。
下面以還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖為例對(duì)實(shí)驗(yàn)材料與方法以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果作詳細(xì)說(shuō)明。
材料和方法1.藥品與試劑哈伯因由河南竹林眾生制藥公司豫中制藥廠生產(chǎn)。氫溴酸東莨菪堿注射液(批號(hào)020601)由上海禾豐制藥有限公司提供；SOD、GSH-PX和ATPase試劑盒購(gòu)自南京建成。
2.實(shí)驗(yàn)儀器Morris水迷宮由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所設(shè)計(jì)制作。
3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，雄性，體重220～250g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
實(shí)驗(yàn)方法1.給藥方案取大鼠60只，隨機(jī)分為六組對(duì)照組、模型組、還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖40、120、360mg/kg組及陽(yáng)性藥哈伯因40μg/kg組，每組10只。除對(duì)照組和模型組用生理鹽水灌胃外，其它各組給予相應(yīng)藥物，連續(xù)給藥37天。
2.Morris水迷宮行為測(cè)試(1)定位航行實(shí)驗(yàn)從第31天開始進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，連續(xù)測(cè)試5天。每次試驗(yàn)前30min腹腔注射東莨菪堿，注射量為0.75mg/kg，每天一次，將大鼠分別從兩個(gè)固定入水點(diǎn)面向池壁放入水中，記錄在2min內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)和游泳路程。
(2)空間探索實(shí)驗(yàn)定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，間隔1天，撤去平臺(tái)，將大鼠從一個(gè)入水點(diǎn)放入水中，測(cè)其2min內(nèi)在原平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間。
3.生化指標(biāo)測(cè)定游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將動(dòng)物斷頭處死，立即于冰上分離皮層和海馬，經(jīng)液氮速凍1小時(shí)后放入-80℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)將皮層和海馬分別用生理鹽水制成10％(重量百分濃度，下同)和5％勻漿，以3600轉(zhuǎn)/分的速度離心分離，將上清液進(jìn)行MDA、CuZn-SOD、GSH-PX、Na+K+-ATPase活性測(cè)定，均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(M±SE)表示，采用方差分析(ANOVA)和t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、行為學(xué)(1)定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果由附圖1和附圖2可以看出，隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠游泳潛伏期和游泳路程逐漸縮短，并且從第二天開始，東莨菪堿模型組與正常組相比，大鼠游泳逃避潛伏期和游泳路程明顯延長(zhǎng)(p＜0.01)；在訓(xùn)練的第五天還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖組和哈伯因組同模型組相比，大鼠的逃避潛伏期和游泳路程明顯縮短，表明還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖可明顯增強(qiáng)癡呆動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力。
(2)空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果由附圖3、4可以看出，在撤出平臺(tái)后，東莨菪堿模型組同正常對(duì)照組相比，大鼠在原平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間明顯縮短，穿越原平臺(tái)次數(shù)明顯增加(p＜0.01)，而還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖給藥組和陽(yáng)性藥哈伯因組大鼠在原平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間明顯延長(zhǎng)(p＜0.05，p＜0.01)，表明還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖可明顯增強(qiáng)癡呆動(dòng)物記憶能力。
2、生化實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(1)還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖對(duì)東莨菪堿所致記憶障礙大鼠海馬及皮層中ATP酶活性的影響。
與東莨菪堿組相比，還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖可明顯升高東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠海馬及皮層Na+，K+-ATP酶的活性(p＜0.05□p＜0.01□p＜0.001)(見表1)。
表1.還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖對(duì)東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠海馬和皮層Na+K+-ATP酶活性的影響(x±SE，n＝10)劑量Na+K+-ATP酶活性(umolpi/mg.prot.hr)組別(mg/kg) 海馬 皮層對(duì)照 -8.67±0.406.72±0.13模型 -4.90±0.21###4.12±0.44###還原端1位 40 8.06±0.37***6.62±0.25***為羧基甘露 120 6.30±0.57**6.97±0.45***糖醛酸寡糖 360 8.35±0.54***5.71±0.33***哈伯因 0.04 7.04±0.45***6.50±0.21***###p＜0.001，與對(duì)照組比較；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與模型組比較
(2)還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖對(duì)東莨菪堿所致記憶障礙大鼠大腦皮質(zhì)和海馬中SOD活性的影響。
如表2所示，還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖均可提高東莨菪堿所致記憶障礙大鼠大腦皮質(zhì)和海馬中的SOD活性(p＜0.05□p＜0.01□p＜0.001)。
表2.還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖對(duì)東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠海馬和皮層CuZn-SOD比活力的影響(x±SE，n＝10)劑量 CuZn-SOD比活力(NU/mg.prot.)組別(mg/kg)海馬皮層對(duì)照- 127.83±7.34125.71±8.32模型- 118.55±4.95##115.54±8.13##還原端1位為羧 40 124.67±7.25*130.47±8.94***基甘露糖醛酸寡 120119.54±7.42148.14±9.74***糖 360126.03±6.80**139.20±7.79***哈伯因 0.04 128.80±8.33114.10±5.97##P＜0.01，與對(duì)照組比較；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與模型組比較(3)還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖對(duì)東莨菪堿所致記憶障礙大鼠海馬及皮質(zhì)中GSH-PX活性的影響。
如表3所示，還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖可提高東莨菪堿所致記憶障礙大鼠大腦皮質(zhì)中GSH-PX的活性(p＜0.05，p＜0.01)。
表3.還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖對(duì)東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠海馬和皮層GSH-PX活力的影響(x±SE，n＝10)劑量GSH-PX活力(U/mg.prot.)組別(mg/kg) 海馬 皮層對(duì)照 -6.13±0.44 8.33±0.18模型 -5.63±0.38 7.18±0.29##還原端1位為羧基40 6.37±0.33 9.54±0.61**甘露糖醛酸寡糖 120 5.72±0.30 8.97±0.61*360 6.07±0.38 8.45±0.48*哈伯因 0.04 6.30±0.29 8.20±0.40*##p＜0.01，與對(duì)照組比較；*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較(4)還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖對(duì)東莨菪堿所致記憶障礙大鼠海馬及皮層中MDA含量的影響。
如表4所示，還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖可降低東莨菪堿所致記憶障礙大鼠大腦海馬中及皮層MDA的含量(p＜0.01，p＜0.001)。
表4.還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖對(duì)東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠海馬和皮層MDA含量的影響(x±SE，n＝10)劑量 MDA(nmol/mg prot.)組別(mg/kg) 海馬 皮層對(duì)照 - 2.35±0.21 3.25±0.11模型 - 4.46±0.21###4.16±0.12###還原端1位為羧基 402.65±0.14***3.24±0.16***甘露糖醛酸寡糖 120 1.83±0.09***3.64±0.14**360 1.17±0.05***2.69±0.16***哈伯因 0.04 2.48±0.18***4.36±0.11###p＜0.001，與對(duì)照組比較；**P＜0.01，***P＜0.001，與模型組比較實(shí)施例二 褐藻酸寡糖治療糖尿病療效觀察采用胰淀素(IAPP)導(dǎo)致的人胰島β細(xì)胞NIT株損傷模型，觀察了褐藻酸寡糖的保護(hù)作用。結(jié)果表明，褐藻酸寡糖可以明顯改善IAPP對(duì)細(xì)胞的毒性作用，增強(qiáng)細(xì)胞的存活，并且隨著藥物劑量的增加，這種改善作用越明顯。表明褐藻酸寡糖具有拮抗IAPP對(duì)胰島β細(xì)胞損傷的作用。
采用鏈脲霉素致NIH小鼠糖尿病模型，觀察了褐藻酸寡糖對(duì)糖尿病小鼠的治療作用。結(jié)果表明，給藥組小鼠血糖濃度明顯低于模型組，說(shuō)明褐藻酸寡糖對(duì)鏈脲霉素所致糖尿病模型小鼠具有一定的治療作用。
下面以還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖為例對(duì)實(shí)驗(yàn)材料與方法以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果作詳細(xì)說(shuō)明。
材料和方法1.藥品與試劑胰淀素(IAPP)及鏈脲霉素均購(gòu)自SIGMA公司。
2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NIH小鼠，雄性，體重18-22g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所動(dòng)物中心提供。
實(shí)驗(yàn)方法人胰島β細(xì)胞NIT株用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，細(xì)胞融合后，加入0、10、50、100μg/ml還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖，作用24小時(shí)，加入終濃度為30μM老化的胰淀素(IAPP)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，以MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活。結(jié)果表明，還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖預(yù)處理24小時(shí)可以明顯改善IAPP對(duì)細(xì)胞的毒性作用，增強(qiáng)細(xì)胞的存活，并且隨著藥物劑量的增加，這種改善作用越明顯(附圖5)，表明還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖具有拮抗IAPP對(duì)胰島β細(xì)胞損傷的作用。
體重18-22g雄性NIH小鼠60只，隨機(jī)分為正常組、模型組、還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖50、150、450mg/kg組及優(yōu)降糖5mg/kg組。試驗(yàn)當(dāng)天，除正常組外，其余動(dòng)物均腹腔注射鏈脲霉素150mg/kg。連續(xù)給予相應(yīng)藥物10天，第11天摘眼球取血，測(cè)血糖濃度。結(jié)果表明，各給藥組小鼠血糖濃度明顯低于模型組，說(shuō)明還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖對(duì)鏈脲霉素所致糖尿病模型小鼠具有一定的治療作用(見表5)。
表5.還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖對(duì)鏈脲霉素致糖尿病小鼠血糖的影響(x±SD，n＝10)劑量 動(dòng)物數(shù)血糖濃度組別(mg/kg) (只) (mg/dL)對(duì)照 -10150.6±36.8模型 -10312.4±89.2###還原端1位為羧基的50 10219.4±67.8*甘露糖醛酸寡糖150 10179.6±69.8**450 10162.5±3**優(yōu)降糖 510201.6±58.9**###P＜0.05，與對(duì)照組比；*P＜0.05，**p＜0.01與模型組比；用還原端1位為羧基的古羅糖醛酸寡糖和還原端1位為羧基的甘古糖醛酸寡糖分別代替實(shí)施例1和實(shí)施例2種的還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖，在其它條件不變的條件下作了類似的實(shí)驗(yàn)，取得了類似的結(jié)果，這里就不再作詳細(xì)的說(shuō)明了。
權(quán)利要求
1.褐藻酸寡糖用于制作抗老年性癡呆藥物。
2.褐藻酸寡糖用于制作抗糖尿病藥物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的藥物，其特征是所述的褐藻酸寡糖為還原端1位為羧基的古羅糖醛酸寡糖、還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖或還原端1位為羧基的甘古糖醛酸寡糖。
全文摘要
一種還原端1位為羧基的褐藻酸寡糖，采用東莨菪堿所致癡呆大鼠，證明了其對(duì)老年性癡呆和糖尿病具有明顯的抑制作用。所述的褐藻酸寡糖為還原端1位為羧基的古羅糖醛酸寡糖、還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖及還原端1位為羧基的甘古糖醛酸寡糖。這些寡糖均能大規(guī)模生產(chǎn)，價(jià)格低，作為老年性癡呆治療藥物將得到廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1562050SQ20041002382
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月24日
發(fā)明者耿美玉, 辛現(xiàn)良, 楊釗, 管華詩(shī), 孫廣強(qiáng), 胡金鳳, 范瑩 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)