專(zhuān)利名稱(chēng)：新生隱球菌多糖中的寡糖及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有生物活性的可藥用的寡糖。
背景技術(shù)：
根據(jù)目前所知，新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)是肺的病原菌，能引起病人的隨機(jī)感染，損害病人的神經(jīng)系統(tǒng)，已經(jīng)成為世界上第四致死的病因。新生隱球菌的多糖有四種，它們的主鏈都是α-(1-3)-連接的甘露糖，在甘露糖的2位連接有木糖和葡萄糖醛酸，多糖簡(jiǎn)稱(chēng)為GXM，這四種多糖結(jié)構(gòu)有如下的結(jié)構(gòu)式 這些多糖起作用部位很可能就是它們的重復(fù)單元-寡糖，制備這些寡糖，就可能獲得多糖所具備的活性，從而將其應(yīng)用于藥物。本發(fā)明就是首次揭示A類(lèi)多糖寡糖的制備。
發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明的首要目的是提供一種GXM寡糖；該寡糖具有下述結(jié)構(gòu)式[I] 式中[Rx]n為所述寡糖的主鏈，Rx為糖基，Rx包括相同或不同的糖基，n為3-6的整數(shù)；(R1)m為所述寡糖的側(cè)鏈，R1為單糖或寡糖，可相同或不同，m為0-4的整數(shù)；
R2為非還原端，R3為還原端，其中R2為H，R3選自H和碳原子數(shù)為1-18的烴基；所述的主鏈糖基Rx之間的連接為1→3連接，所述的側(cè)鏈糖基R1與主鏈糖基Rx的連接為1→2連接。
所述的側(cè)鏈R1在主鏈的糖基上緊密并排排列。
所述的側(cè)鏈R1可在主鏈的糖基上由一個(gè)或至少一個(gè)主鏈糖基隔開(kāi)排列所述R3選自碳原子數(shù)為1-18的烴基。
所述的主鏈糖基Rx為甘露糖、葡萄糖、半乳糖。
所述的主鏈Rx均為甘露糖基。
所述的寡糖包括4糖、5糖6糖7糖8糖。
所述的寡糖主鏈包括α-Man-1→3-α-Man-1→3-Man或α-Man-1→3-α-Man-1→3-α-Man-1→3-Man。
所述的6糖包括下列幾式 R＝C1-18 alkyl，or C2-18 alkenyl
所述的寡糖的制備，用4，6異丙叉基或4，6-芐叉基保護(hù)的甘露糖為關(guān)鍵中間體，首先選擇性地在它的3位上接糖基，然后再在它的2位上接糖基。用這種方法，可以先制備出1-3連接的、2位空出的甘露糖主鏈，然后在其2位再連上所需的支鏈，就能得到6糖。以下兩個(gè)反應(yīng)序列分別描述6糖6(附

圖1)和6糖4(附圖2)的制備。
所述的寡糖的用途，它用于制備診斷用試劑。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
實(shí)施例1六糖6的制備。按反應(yīng)式進(jìn)行。其策略是先構(gòu)筑三糖主鏈，用區(qū)選偶聯(lián)的方法，使糖基供體8與糖基受體9偶聯(lián)得到雙糖10，偶聯(lián)的3位區(qū)選性由10乙?；玫?1來(lái)證明。雙糖10在堿性下脫乙?；玫诫p糖受體12，與單糖供體13偶聯(lián)得到三糖14，三糖14的結(jié)構(gòu)也是通過(guò)乙酰化得到15來(lái)證明的。三糖14再與木糖供體16偶聯(lián)，即得到五糖17。將17的異丙叉基水解再苯甲?；玫?8，選擇性地脫除18的乙?；玫轿逄鞘荏w19。使19與葡萄糖醛酸的供體20偶聯(lián)，得到六糖21，使21脫掉保護(hù)基，就得到GXM(A類(lèi))六糖。
以下為一些關(guān)鍵中間體及產(chǎn)物的鑒定數(shù)據(jù)三糖14[α]D+91.7(c 1.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.95-7.34(m，15H，3PhH)，5.94(dd，1H，J3，4＝J4，5＝10.0Hz，H-4)，5.75(dd，1H，J2，3＝3.3Hz，J3，4＝10.0Hz，H-3)，5.53(dd，1H，J1，2＝1.8Hz，J2，3＝3.3Hz，H-2)，5.43(d，1H，J1，2＝1.8Hz，H-1)，5.31(d，1H，J1，2＝1.0Hz，H-1)，4.71(d，1H，J2，1＝1.0Hz，H-1)，3.36(s，3H，OCH3)，2.17(s，3H，COCH3)，1.56，1.45(2s，6H，isopropylidene)，1.37(s，6H，isopropylidene).13C NMR(100MHz，CDCl3)169.5(COCH3)，166.3，165.6，163.6(5C，5 COPh)，101.2，100.8，(2C，2 Me2C)99.9，99.4，98.3(3C，3 C-1)，54.8(OCH3)，29.1，28.9(2C，CH3CCH3)，20.6(COCH3)，19.2，19.0(2C，CH3CCH3).Anal.Calcd forC48H56O20C，60.50；H，5.92.FoundC，60.45；H，5.66.
三糖15[α]D+82.6(c 1.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.10-7.23(m，15H，3PhH)，6.04(dd，1H，J3，4＝J4，5＝10.0Hz，H-4)，5.64(dd，1H，J2，3＝3.2Hz，J3，4＝10.0Hz，H-3)，5.45(dd，1H，J1，2＝2.0Hz，J2，3＝2.9Hz，H-2)，5.40(dd，1H，J1，2＝1.3Hz，J2，3＝3.4Hz，H-2)，5.32(d，1H，J1，2＝1.7Hz，H-1)，5.22(dd，1H，J1，2＝1.3Hz，J2，3＝2.9Hz，H-2)，5.10(d，1H，J1，2＝1.2Hz，H-1)，4.67(dd，1H，J2，3＝2.9Hz，J3，4＝12.1Hz，H-3)，4.63(d，1H，J1，2＝1.2Hz，H-1)，3.36(s，3H，OCH3)，2.31，2.18，2.07(3s，9H，3 COCH3)，1.56，1.52(2s，6H，isopropylidene)，1.37(s，6H，isopropylidene).Anal.Calcd forC52H60O22C，60.22；H，5.83.FoundC，60.47；H，5.61.
五糖18[α]D-58.6(c 1.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.11-7.34(m，65H，13PhH)，5.94(dd，1H，J3，4＝J4，5＝10.0Hz，H-4，Manp)，5.77(dd，1H，J2，3＝3.2Hz，J3，4＝10.0Hz，H-3，Manp)，5.71(dd，J1，2＝J2，3＝6.3Hz，H-2，Xylp)，5.59(dd，1H，J3，4＝J4，5＝10.0Hz，H-4，Manp)，5.54(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.9Hz，H-4，Manp)，5.18(d，1H，J1，2＝0.7Hz，H-1，Manp)，5.16(dd，1H，J1，2＝1.0Hz，J2，3＝3.0Hz，H-2，Manp)，4.99(d，1H，J1，2＝0.8Hz，H-1，Manp)，4.80(d，1H，J1，2＝4.8Hz，H-1，Xylp)，4.53(d，1H，J1，2＝10Hz，H-1，Manp)，4.45(d，1H，J1，2＝6.1Hz，H-1，Xylp)，3.19(s，3H，OCH3)，1.90(s，3H，COCH3).13C NMR(100MHz，CDCI3)168.9(COCH3)，166.0，165.9，165.8，165.4，165.3，165.3，165.3，165.2，165.1，165.0，164.9，164.7，164.6(13C，13 COPh)，99.7，99.7，99.7，99.0，98.5(5C，5C-1)，54.8(OCH3)，20.3(COCH3)；Anal.Calcd for C122H104O38C，67.27；H，4.81.FoundC，67.45；H，5.96.
保護(hù)的六糖21[α]D-22.5(c 0.5，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ6.00(dd，1H，J3，4＝J4，5＝10.0Hz，H-4，Manp)，5.71(dd，1H，J2，3＝3.2Hz，J3，4＝10.0Hz，H-3，Manp)，5.15(d，1H，J1，2＝1.0Hz，H-1，Manp)，4.96(d，1H，J1，2＝0.9Hz，H-1，Manp)，4.75(d，1H，J1，2＝4.9Hz，H-1，Xylp)，4.60(d，1H，J1，2＝4.8Hz，H-1，Xylp)，4.56(d，1H，J1，2＝1.0Hz，H-1，Manp)，4.04(d，1H，J1，2＝6.6Hz，H-1，GluAp)，3.69(s，3H，COOCH3)，3.23(s，3H，OCH3)，1.96，1.92，1.31(3s，9H，3 COCH3).13C NMR(100MHz，CDCl3)167.0，168.5，168.5，168.3(3 C，3 COCH3，COOMe)，165.9，165.9，165.9，165.4，165.4，165.4，165.3，165.2，165.1，165.0，164.9，164.6，164.6(13 C，13COPh)，100.9(C-1，JC1，H1＝175Hz，Manp)，100.3(C-1，JC1，H1＝163Hz，GluAp)，99.9(C-1，JC1，H1＝164Hz，Xylp)，99.5(C-1，JC1，H1＝163Hz，Xylp)，98.5(C-1，JC1，H1＝172Hz，Manp)，95.2(C-1，JC1，H1＝176Hz，Manp)，54.8(OCH3)，52.3(COOCH3)，20.5，20.3，20.2(COCH3)；Anal.Calcd forC133H118O46C，65.13；H，4.85.FoundC，65.45；H，4.66.
目的物六糖22(相當(dāng)于6，R＝Me)[α]D+99.6(c 0.5，H2O)；1H NMR(D2O，400MHz)δ5.11(s，1H，H-1，Manp)，4.75(s，1H，H-1，Manp)，4.31(s，1H，H-1，Manp)，4.29(d，1H，J1，2＝8.0Hz，H-1，GluAp)，4.12(d，1H，J1，2＝8.9Hz，H-1，Xylp)，4.10(d，1H，J1，2＝9.2Hz，H-1，Xylp)，3.33(s，3H，OCH3)；13C NMR(100MHz，D2O)174.1(-COONH4)，103.4，103.3，103.2，102.5，100.3，100.2(6 C-1)，79.0，78.5，78.4，78.3，78.3，76.4，76.2，75.9，75.8，73.6，73.4，73.2，72.9，72.9，70.7，70.3，69.5，69.5，68.4，67.0，66.7，66.5，65.4，65.3，61.5，60.6，60.6，56.6(O-CH3).MALDI-TOF MS Calcd forthe ammoniumsalt of 16，C35H61O30N975.8[M].found975.8(M)；980.9(M-NH4++Na+).
實(shí)施例2六糖4的制備。按反應(yīng)式進(jìn)行。首先使木糖供體16與2位為羥基的甘露糖受體23偶聯(lián)，得到雙糖24，使其1位活化，得到雙糖供體25，使25與受體26選擇性地在3位偶聯(lián)得到三糖27，使27再與一個(gè)木糖供體偶聯(lián)，得到四糖28，將其芐叉基水解掉，苯甲?；玫?9，然后活化29的1位，得到四糖供體30，使30與單糖受體31選擇性地在3位偶聯(lián)，得到五糖32，先乙?；?，再將芐叉基水解掉，再苯甲?；玫?3，用2％MeCOCl-MeOH選擇性地脫掉乙?；?，得到五糖受體34，使34與葡糖醛酸供體20偶聯(lián)，得到保護(hù)的六糖35，最后在甲醇-氨-水中脫掉保護(hù)基，即得到目標(biāo)六糖36(相當(dāng)于六糖4，R＝Me)。以下為一些關(guān)鍵中間體及產(chǎn)物的鑒定數(shù)據(jù)三糖27[α]D+66.3(c 1.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ5.86(m，1H，OCH2CH＝CH2)，5.83(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.9Hz，H-4，Manp)，5.64(dd，1H，J2，3＝3.1Hz，J3，4＝9.9Hz，H-3，Manp)，5.62(s，1H，PhCHO2)5.45(dd，1H，J2，3＝J3，4＝8.6Hz，H-3，Xylp)，5.32(dd，1H，J1，2＝6.6Hz，J2，3＝8.6Hz，H-2，Xylp)，5.30(d，1H，J1，2＝1.5Hz，H-1，Manp)，5.05(m，1H，H-4，Xylp)，4.87(d，1H，J1，2＝1.3Hz，H-1，Manp)，4.47(dd，1H，J1，2＝1.6Hz，J2，3＝3.2Hz，H-2，Manp)，4.41(d，1H，J1，2＝6.6Hz，H-1，Xylp).
四糖28[α]D+81.1(c 1.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ5.92(dd，1H，J2，3＝3.0Hz，J3，4＝9.8Hz，H-3，Manp)，5.85(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.8Hz，H-4，Manp)，5.66(dd，1H，J1，2＝J2，3＝4.0Hz，H-2，Xylp)，5.52(s，1H，PhCHO2)，5.66(dd，1H，J1，2＝J2，3＝5.8Hz，H-2，Xylp)，5.38(dd，1H，J1，2＝1.2Hz，H-1，Manp)，5.32(dd，1H，J2，3＝4.0Hz，J3，4＝8.2Hz，H-3，Xylp)，5.25-5.17(m，2H，OCH2CH＝CH2)，5.04(m，1H，H-4，Xylp)，4.83(d，1H，J1，2＝0.7Hz，H-1，Manp)，4.60(d，1H，J1，2＝4.1Hz，H-1，Xylp)，4.19(d，1H，J1，2＝6.0Hz，H-1，Xylp).五糖33[α]D+6.6(c 1.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ5.90(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.9Hz，H-4，Manp)，5.71(dd，1H，J2，3＝3.3Hz，J3，4＝9.8Hz，H-3，Manp)，5.70(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.8Hz，H-4，Manp)，5.64(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.8Hz，H-4，Manp)，5.38-5.33(m，4H)，5.22(dd，J1，2＝J2，3＝5.7Hz，H-2，Xylp)，5.18(dd，J1，2＝J2，3＝5.9Hz，H-2，Xylp)，5.06(s，1H，H-1，Manp)，5.01(d，1H，J1，2＝0.6Hz，H-1，Manp)，4.98(m，1H，H-4，Xylp)，4.70(d，1H，J1，2＝0.8Hz，H-1，Manp)，4.40(d，1H，J1，2＝6.0Hz，H-1，Xylp)，3.84(d，1H，J1，2＝5.8Hz，H-1，Xylp)，3.23(s，3H，OCH3)，2.04(s，3H，COCH3).13C NMR(100MHz，CDCl3)170.3(COCH3)，166.0，165.9，165.8，165.4，165.3，165.3，165.1，165.1，164.9，164.8，164.6，164.5，164.4(13C，13 COPh)，99.7，98.6，98.6，98.4，98.4(5C，5C-1)，55.1(OCH3)，20.9(COCH3)；Anal Calcd for C122H104O38C，67.27；H，4.81.FoundC，67.09；H，5.72.
保護(hù)的六糖35[α]D-31.3(c 0.5，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ6.55(dd，2H，J1，2＝J2，3＝7.7Hz，2H-2，Xylp)，6.09(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.6Hz，H-4，Manp)，6.01(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.8Hz，H-4，Manp)，5.77(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.7Hz，H-4，Manp)，5.29(d，1H，J1，2＝0.7Hz，H-1，Manp)，5.15(d，1H，J1，2＝0.8Hz，H-1，Manp)，4.96(d，1H，J1，2＝0.9Hz，H-1，Manp)，4.81(d，1H，J1，2＝8.0Hz，H-1，Xylp)，4.75(d，1H，J1，2＝7.8Hz，H-1，Xylp)，4.43(d，1H，J1，2＝0.6Hz，H-1，Manp)，4.03(d，1H，J1，2＝8.4Hz，H-1，G1uAp)，3.52(s，3H，COOCH3)，3.19(s，3H，OCH3)，2.19，2.13，2.01(3s，9H，3 COCH3).13C NMR(100MHz，CDCl3)171.3，170.9，169.7，169.2(4C，3 COCH3，COOMe)，167.2，167.1，166.1，166.0，165.8，165.4，165.3，165.3，165.2，165.2，165.2，165.0，164.5(13C，13 COPh)，102.6，100.6，100.4，99.6，98.9，98.2(6C，6C-1)，54.7(OCH3)，52.7(COOCH3)，20.7，20.6，20.5(COCH3)；Anal.Calcd for C133H118O46C，65.13；H，4.85.FoundC，65.00；H，4.96.六糖36(相當(dāng)于六糖4，R＝Me)1H NMR(D2O，400MHz)δ5.08(s，1H，H-1，Manp)，4.73(s，1H，H-1，Manp)，4.31(s，1H，H-1，Manp)，4.28(d，1H，J1，2＝7.5Hz，H-1，GluAp)，4.12(d，1H，J1，2＝8.9Hz，H-1，Xylp)，4.10(d，1H，J1，2＝9.2Hz，H-1，Xylp)，3.33(s，3H，OCH3)；13C NMR(100MHz，D2O)174.0(-COONH4)，103.5，103.3，103.1，102.7，100.2，100.1(6C-1)，56.6(O-CH3).MALDI-TOF MS Calcd for the ammonium salt of 37，C35H61O30N975.8[M].found975.8(M)；980.7(M-NH4++Na+).
用相似的方法可制備出末端為H(即六糖1，2，3)，及末端為C2-18的飽和或不飽和鏈的六糖(即六糖4，5，6)，或比六糖更大的糖。
權(quán)利要求
1.一種寡糖，其特征在于，該寡糖具有下述結(jié)構(gòu)式[I] 式中[Rx]n為所述寡糖的主鏈，Rx為糖基，Rx包括相同或不同的糖基，n為3-6的整數(shù)；(R1)m為所述寡糖的側(cè)鏈，R1為單糖或寡糖，可相同或不同，m為0-4的整數(shù)；R2為非還原端，R3為還原端，其中R2為H，R3選自H和碳原子數(shù)為1-20的烴基；所述的主鏈糖基Rx之間的連接為1→3連接，所述的側(cè)鏈糖基R1與主鏈糖基Rx的連接為1→2連接。
2.權(quán)利要求1所述的寡糖，其特征在于，所述的側(cè)鏈R1在主鏈的糖基上緊密并排排列。
3.權(quán)利要求1所述的寡糖，所述的側(cè)鏈R1可在主鏈的糖基上由一個(gè)或至少一個(gè)主鏈糖基隔開(kāi)排列
4.權(quán)利要求1所述的寡糖，其特征在于，所述R3選自碳原子數(shù)為1-18的烴基。
5.權(quán)利要求1所述的寡糖，其特征在于，所述的主鏈糖基Rx為甘露糖、葡萄糖、半乳糖。
6.權(quán)利要求4所述的寡糖，其特征在于，所述的主鏈Rx均為甘露糖基。
7.權(quán)利要求1所述的寡糖，其特征在于，所述的寡糖包括4糖、5糖、6糖、7糖、8糖。
8.權(quán)利要求1所述的寡糖，其特征在于，所述的寡糖主鏈包括α-Man-1→3-α-Man-1→3-Man或α-Man-1→3-α-Man-1→3-α-Man-1→3-Man。
9.權(quán)利要求1所述的寡糖，其特征在于，所述的6糖包括下列幾式
10.權(quán)利要求9所述的寡糖，其特征在于，所述的6糖包括下列幾式 R＝C1-18 alkyl，or C2-18 alkenyl
11.權(quán)利要求9，10所述的寡糖的制備，其特征在于，用4，6異丙叉基或4，6-芐叉基保護(hù)的甘露糖為關(guān)鍵中間體，首先選擇性地在它的3位上接糖基，然后再在它的2位上接糖基。用這種方法，可以先制備出1-3連接的、2位空出的甘露糖主鏈，然后在其2位再連上所需的支鏈，就能得到6糖。以下兩個(gè)反應(yīng)序列分別描述6糖6(附圖1)和6糖4(附圖2)的制備
12.權(quán)利要求9，10所述的寡糖的用途，其特征在于，它用于制備診斷用試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及新生隱球菌多糖中的寡糖(GXM多糖中的寡糖)，該寡糖的主鏈為1，3α－連接的甘露糖，其側(cè)鏈為甘露糖2位連接的木糖及葡萄糖醛酸。這些寡糖可用于制備診斷用疫苗。
文檔編號(hào)A61K31/715GK1510038SQ0215857
公開(kāi)日2004年7月7日 申請(qǐng)日期2002年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月26日
發(fā)明者孔繁祚, 張建軍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心