專利名稱：一種新型二氮芳辛類化合物在制備抗腫瘤和抗真菌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術中抗腫瘤和抗真菌藥物的應用，尤其涉及一種新型的二氮芳辛類化合物2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛，在制備抗腫瘤和抗真菌藥物中的應用。
背景技術：
粘細菌是最高等的原核生物類群，具有復雜的多細胞行為和形態(tài)發(fā)生，在細胞分化、發(fā)育和生物進化研究中占有重要地位。近年來，粘細菌作為一類可產生豐富次級代謝物的微生物類群日趨受到重視。在原核生物中按已發(fā)現(xiàn)生物活性物質的數(shù)量，粘細菌僅排在放線菌和芽孢桿菌之后。目前從粘細菌中已發(fā)現(xiàn)大約600多種生物活性物質，約占微生物來源的總數(shù)的3.5％。需要特別指出的是，目前從放線菌等微生物中篩選新生物活性物質的重復幾率越來越高，而粘細菌在這方面具有獨特的優(yōu)勢。就目前情況看，在溶細菌群粘細菌中55％的菌株可產生生物活性物質，而溶纖維素群粘細菌甚至高達96％，甚至比著名的鏈霉菌還高。堆囊菌(Sorangium)是粘細菌中唯一能夠降解纖維素的種，但存在著大量細胞形態(tài)、子實體發(fā)育形態(tài)明顯差異的菌株。這些有差異的菌株在次級代謝產物的合成上也表現(xiàn)明顯的差異，存在很強的菌株特異性。從已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的纖維堆囊菌的代謝產物的化學結構多樣性和生物學活性機制獨特性看，這是一個很好的天然藥物篩選資源。
粘細菌產生的生物活性物質種類繁多，作用水平在多個層次上，作用機理也多種多樣。根據(jù)作用機理的不同，主要分為以下幾類呼吸抑制，核酸合成抑制，蛋白質合成抑制，干擾蛋白質磷酸化系統(tǒng)，干擾金屬離子運輸，作用于脂類代謝，干擾糖類利用和作用于細胞壁。堆囊菌的代謝產物，主要的作用對象是真核生物，不但對各種真菌，而且對腫瘤細胞也有普遍的活性。其中，1993年赫弗勒等報道從纖維堆囊菌中分離出新的16元大環(huán)內酯類化合物埃博霉素，被認為是目前最為成功的抗癌藥物紫杉醇的替代品而進入臨床試驗階段，引起了人們的廣泛關注。
本發(fā)明涉及的二氮芳辛類化合物2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-酚)-[1，5]-二氮芳辛在生物體中研究很少，通過粘細菌發(fā)酵得到該類化合物，以及該類化合物在制備抗腫瘤和抗真菌藥物中的應用未見報道。

發(fā)明內容本發(fā)明的目的即是針對上書不足，提供一種新型的二氮芳辛類化合物2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛，用于制備抗腫瘤和抗真菌藥物。達到開發(fā)用于制備治療肝癌，宮頸癌，腎癌和白血病的藥物，以及制備治療人、動物和植物真菌感染藥物的目的。
本發(fā)明涉及的一種新型的二氮芳辛類化合物，特指2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛在制備抗腫瘤藥物中的應用。
本發(fā)明涉及的二氮芳辛類化合物，分子式為C28H20N4O2S2；化學名稱為2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛，英文名稱為2，6-bis-(6-mercapto-pyridin-3-yl)-4，8-bis-(phenol-4-yl)-[1，5]-diazocine。
化學結構如下所示 其中，上述的二氮芳辛類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征是所說的抗腫瘤藥物是用于治療人類各種腫瘤的藥物。
其中，上述的二氮芳辛類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征是所說的抗腫瘤藥物是用于治療人類宮頸癌，腎癌，肝癌，成纖維細胞癌和白血病的藥物。
本發(fā)明涉及的二氮芳辛類化合物，特指2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛在制備抗真菌藥物中的應用。
其中，上述的二氮芳辛類化合物在制備抗真菌藥物中的應用，其特征是所說的抗真菌藥物是用于治療人、動物和植物真菌感染的藥物。
其中，上述的二氮芳辛類化合物在制備抗真菌藥物中的應用，其特征是所說的抗真菌藥物是用于治療人、動物和植物因凍土毛霉，黑根霉，淡黃鏈霉菌，粗糙脈孢菌，米曲霉，擬康氏木霉，棉花枯萎病菌，土豆疫病菌，蘋果斑點病菌和鐮刀菌所造成的感染及并發(fā)癥的藥物。
本發(fā)明涉及的二氮芳辛類化合物，特指2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛在引發(fā)腫瘤細胞凋亡、制備高效、低毒抗腫瘤藥物中的應用。
為了更好地理解本發(fā)明的實質，下面用二氮芳辛類化合物的藥理及生物實驗的結果來說明其在制備抗真菌和抗腫瘤藥物中的應用。
本發(fā)明涉及一種新型的二氮芳辛類化合物在制備治療人、動物和植物真菌感染的藥物方面的應用。
使用微量定量檢測法(MQQA)檢測該化合物的體外抑制真菌活性。從平板培養(yǎng)物中挑取菌體至5ml的無菌水中，晃勻，制備成為菌體懸液并用紫外檢測儀檢測菌懸液的濃度，這些測試菌可以是凍土毛霉(Mucor biemalis 3.40)，黑根霉(Rhizopus nigricans)，淡黃鏈霉菌(Streptomyces flaveolus)，粗糙脈孢菌(Neuropora crssa)，米曲霉(Aspergillas oryzae)，擬康氏木霉(Trichoderma S28)，棉花枯萎病菌，鐮刀菌(Fusarium sp.3)，土豆疫病菌或者蘋果斑點病菌。每孔中分別加入150ul檢測培養(yǎng)培養(yǎng)液(TF培養(yǎng)液)，10ul樣品溶液和50ul菌懸液，對照加入10ul磷酸緩沖液(PBS)，調零組加入150ulTF液10ulPBS和50ul無菌水。30℃培養(yǎng)18小時，以對照出現(xiàn)明顯可見的生長為準。每孔加入四唑鹽(MTT)溶液4ul，置于37℃培養(yǎng)4小時。取出板振蕩，加入150ul二甲基亞砜(DMSO)振蕩溶解搖勻，直接用微板光譜儀儀于570nm下檢測。依照加入的不同樣品濃度最終得出最小抑菌濃度值(MIC)。
實驗結果表明，化合物2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛能夠有效的抑制真菌的生長(結果見附表1)。對于一些動物或植物的致病真菌，該化合物可以在很低的濃度下發(fā)生明顯的抑制作用。例如對于凍土毛霉(Mucor biemalis3.40)的MIC值為12.5μg/ml；對于蘋果斑點病菌的MIC值為100μg/ml；對于粗糙脈孢菌(Neuropora crssa)的MIC值為25μg/m，說明該化合物可以被制備成為抗真菌藥物。
表1. 2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛對于真菌的抑制作用表真菌 MICs凍土毛霉(Mucor biemalis 3.40)12.5μg/ml黑根霉(Rhizopus nigricans) 50μg/ml淡黃鏈霉菌(Streptomyces25μg/mlflaveolus)粗糙脈孢菌(Neuropora crssa) 25μg/ml米曲霉(Aspergillas oryzae) 100μg/ml擬康氏木霉(Trichoderma S28) 200μg/ml棉花枯萎病菌 50μg/ml土豆疫病菌 200μg/ml蘋果斑點病菌 100μg/ml鐮刀菌(Fusarium sp.3)420μg/ml本發(fā)明涉及一種新型的二氮芳辛類化合物在誘發(fā)腫瘤細胞的凋亡，制備治療肝癌，宮頸癌，腎癌和白血病的藥物方面的應用。
采用MTT法測定化合物對于多株腫瘤細胞的體外抑制活性。MTT為3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基-四唑溴鹽，活細胞內的琥珀酯脫氫酶可使黃色的MTT還原，產生藍紫色顆粒?；罴毎麛?shù)越多，代謝越旺盛，琥珀酸脫氫酶的產生亦越多。在底物量一定的情況下，反應產物越多。在一定范圍內，藍紫色顆粒形成量與活細胞數(shù)成正比，所以可根據(jù)藍紫色顆粒的多少來推斷活細胞的數(shù)量，并由存活細胞數(shù)即可推算出死亡細胞數(shù)。依照加入的不同樣品濃度最終得出半效作用濃度值(IC50)。
實驗結果表明，化合物2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛能夠有效的抑制腫瘤細胞的生長(結果見附表2)。對于宮頸癌細胞，腎癌細胞，肝癌細胞，成纖維癌細胞和白血病細胞均在較低濃度下可發(fā)生明顯的殺傷作用。尤其對于宮頸癌細胞和肝癌細胞的IC50值均小于30ng/ml。說明該化合物可以被制備成為抗腫瘤藥物。
表2. 2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛對于腫瘤細胞的抑制作用表腫瘤細胞株IC50宮頸癌細胞Hela19ng/ml血液癌細胞HL-60 120ng/ml腎癌細胞Vero62ng/ml肝癌細胞Bel 7402 27ng/ml成纖維癌細胞L929 41ng/ml利用各種檢測手段，確定該化合物能夠誘發(fā)腫瘤細胞的凋亡。凋亡檢測的指標有很多種，但都有其局限性，一般選用兩種以上的指標綜合分析來證明凋亡。我們選擇了形態(tài)學觀察和瓊脂糖凝膠電泳測定梯狀條帶兩種方法。針對凋亡細胞的特殊形態(tài)生化改變，利用倒置顯微鏡，普通光學顯微鏡(伊紅-蘇木精染色，Giemsa染色)，熒光顯微鏡(吖啶橙染色，Hoechest33258染色)，電子顯微鏡觀察。細胞凋亡時主要生化特征是其染色質DNA在核小體連接處斷裂，形成180~200 bp或其整倍數(shù)的寡核苷酸，因此瓊脂糖凝膠電泳測定梯狀條帶(DNA ladder)是主要方法。
實驗結果表明，化合物2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛能夠有效的誘導腫瘤細胞凋亡，尤其是宮頸癌細胞(Hela)，腎癌細胞(Vero)和肝癌細胞(Bel-7402)[見圖2]。說明該類化合物具有開發(fā)成為高效、低毒的抗腫瘤藥物的潛力。
通過動物實驗，經(jīng)給接種有S180瘤株的小鼠口服試驗樣品(化合物2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛)10天，樣品組小鼠均生長發(fā)育正常，被毛濃密而光澤，運動活潑，鼻腔、空腔、耳道、眼、肛門及生殖器官未見異常，并且測定抑瘤率的結果樣品組與陽性對照組(順鉑)相當[見圖3]。
本發(fā)明的創(chuàng)造性在于，研發(fā)了一種新型的二氮芳辛類化合物，特指2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛，以及其在制備抗腫瘤和抗真菌藥物中的應用潛力，為該化合物的應用和粘細菌資源的開發(fā)打下了堅實的基礎。


圖12，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的化學結構圖22，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛作用于Bel-7402細胞誘發(fā)凋亡形成的DNA梯度照片。
其中1，DNA梯度標準(200，400，600，800，1000，1200，1400，1600，1800，2000 bp)；2，70ng/ml化合物濃度作用結果；3，35ng/ml化合物濃度作用結果；4，空白對照(正常細胞)。
圖32，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛作用于小鼠后得到的S180實體瘤照片。
其中1~4，陰性對照組(蒸餾水)；5~6，陽性對照組(順鉑)；7~92，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛作用組具體實施方式
實施例1下面通過實施例1說明如何證明2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛對于真菌的抑制作用(以毛霉為例)。
1.供試菌凍土毛霉(Mucor biemalis 3.40)2.TF培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨1％；葡萄糖1％；瓊脂1.6％；pH7.03.2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛濃度梯度的獲得按照培養(yǎng)板的分配情況，對原液進行十倍系列梯度稀釋，最小稀釋度應達到10-6，使得測定的MIC落入測定范圍4.在96孔板的每一孔中分別加入150μl培養(yǎng)液，10μl2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛溶液和50μl毛霉孢子懸液，每個藥物濃度重復三個以上。
5.30℃培養(yǎng)18小時，以對照組出現(xiàn)肉眼明顯可見的生長為準。每孔加入MTT溶液4μl，置于30℃培養(yǎng)4小時。
6.將剩余液體離心(1000g，10min)，除去上清，加入150μl DMSO，震蕩溶解，使用微板光譜儀在570nm下檢測。
7.計算得出2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛對于凍土毛霉的MIC為12.5μg/ml。
實施例2下面通過實施例2說明如何證明2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛對于腫瘤細胞的抑制作用(以肝癌細胞Bel-7402為例)。
1.細胞株Bel-7402(貼壁細胞)2.2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛溶液配制配制濃度從0.12mg/ml到0.03mg/ml梯度減少。
3.PBS配制KCl 0.2g/l；KH2PO40.2g/l；NaCl 8.0g/l；Na2HPO4.7H2O 1.56g/l。D-Hanks溶液KCl 0.4g/l；KH2PO40.06g/l；NaCl 8.0g/l；Na2HPO4.7H2O0.06g/l；NaHCO30.35g/l；酚紅0.02g/l。
MTT配制保存液濃度為5mg/ml，添加的最終濃度為0.4mg/ml。過濾除菌備用，-70℃保存。使用時，加入MEM培養(yǎng)基，作1∶10稀釋，過濾除菌。
4.將細胞接入培養(yǎng)瓶中，37℃，5％CO2培養(yǎng)兩天，使細胞濃度達到106個/ml。在96孔細胞培養(yǎng)板的每孔中加入細胞培養(yǎng)懸液0.10ml，37℃，5％CO2培養(yǎng)12小時。加入20μl/孔的2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛溶液，對照加入等體積的D-Hanks’液，37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)4天。
5.直接棄去上清液。加入MTT溶液100μl/孔，調零組加入MEM培養(yǎng)基100μl/孔。37℃，5％CO2條件孵育4小時。離心(250g，5min)，吸棄上清液。加入分析純DMSO(150μl/孔)，輕搖5~10min，直到藍色顆粒全部溶解，溶液變?yōu)樗{紫色。迅速于570nm波長處測各孔的OD值。
6.記錄結果，計算得出2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛對于Bel-7402的IC50為27ng/ml，說明2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛對腫瘤細胞(肝癌細胞Bel-7402)有明顯的抑制作用。
實施例3下面通過實施例3說明如何證明2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]二氮芳辛能夠誘導腫瘤細胞的凋亡發(fā)生(以宮頸癌細胞Hela為例)。
1.將2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛添加到Hela的培養(yǎng)液中，濃度為35ng/ml，孵育72小時。
2.在1.5ml微量離心管中，離心沉淀1×106-2×106個Hela細胞，將待測細胞用PBS洗2遍，去除上清液；加入400μl細胞裂解液和2μl蛋白酶K，混勻，于37℃水浴保溫1小時，加入2μl RNA酶，再保溫1小時。
3.在臺式離心機中，室溫14,000rpm離心10分鐘，將上清液轉移到另一潔凈的微量離心管中；用酚∶氯仿＝1∶1、酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1的溶液和氯仿等份各抽提1次，每次一小時(每次轉移上清液至新的離心管)。
4.在上清液中加入1/5體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冷乙醇，混勻后于-20℃沉淀過夜；4℃12000rpm離心15分鐘，棄上清液；用70％乙醇洗滌沉淀，然后于-4℃12000rpm離心15min，棄乙醇，室溫晾干，加入22μl TE緩沖液，37℃保溫1小時。
5.加4μl樣品緩沖液，混勻，立即加到含有質量濃度為0.5g/L溴化乙啶的質量分數(shù)為1.8％的瓊脂糖樣品孔中，室溫，電壓2V/cm，于0.5×TBE電泳緩沖液中電泳2小時，紫外燈下照相并記錄實驗結果。
6.結果顯示，正常細胞的DNA電泳后之出現(xiàn)一條距加樣孔很近的大分子條帶；化合物作用后的Hela的DNA電泳表現(xiàn)為排列成梯狀的數(shù)條條帶(ladder)，分子質量為180~200 bp或其整數(shù)倍，從而證明了該化合物可以引發(fā)Hela細胞的凋亡過程。
實施例4下面通過實施例4說明如何通過小鼠實驗證明2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛對于腫瘤細胞的抑制作用。
實驗動物成年健康KM小鼠(昆明鼠)100只，合格證號2000 08 001，雌雄各半，體重20±2克，購于魯抗醫(yī)藥集團。動物稱重，編號，隨機分為5組，每組10只，體重差異小于4克，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。其中兩組分別為陽性對照組和陰性對照組。
1.腫瘤細胞株S180，購于山東省醫(yī)科院藥物研究所2.陽性對照順鉑，常溫將順鉑配成2mg/ml溶液，4℃保存。陰性對照蒸餾水。
樣品將提純的2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛，配成2mg/ml懸液，4℃保存。
3.接種腫瘤于每只小鼠右腹股溝皮下注射0.2ml S180腫瘤細胞稀釋液。
4.48小時后灌喂給藥，樣品組與對照組的每只小鼠均灌胃0.3ml。
5.連續(xù)灌喂10天，觀察小鼠特征變化，包括行為活動、被毛、精神狀態(tài)、口腔、鼻腔、耳道、肛門、生殖器官是否正常，以及腫瘤生長及小鼠死亡的情況。
6.第11天稱重后脫椎處死小鼠，解剖剝離瘤塊，稱量瘤塊的重量，計算腫瘤抑制率。
按照以下公式計算抑瘤率腫瘤抑制率(％)＝(對照組平均瘤重—給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重7.試驗結果組 別 處死平均體重平均瘤重腫瘤抑制g(X±SD) g(X±SD) 率陰性對照組25.25±0.980.692±0.121樣品組28.31±1.020.237±0.071 65.75％陽性對照組23.47±2.320.251±0.055 63.73％ρ＜0.058.結論經(jīng)口給接種S180瘤株的小鼠試驗樣品10天，樣品組小鼠均生長發(fā)育正常，被毛濃密而光澤，運動活潑，鼻腔、空腔、耳道、眼、肛門及生殖器官未見異常。抑瘤率樣品組與陽性對照組(順鉑)相當[見圖3]。
權利要求
1.一種新型的二氮芳辛類化合物，特指2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛在制備抗腫瘤藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的二氮芳辛類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征是所說的抗腫瘤藥物是用于治療人類各種腫瘤的藥物。
3.如權利要求2所述的二氮芳辛類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征是所說的抗腫瘤藥物是用于治療人類宮頸癌，腎癌，肝癌，成纖維細胞癌和白血病的藥物。
4.一種新型的二氮芳辛類化合物，特指2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛在制備抗真菌藥物中的應用。
5.如權利要求4所述的二氮芳辛類化合物在制備抗真菌藥物中的應用，其特征是所說的抗真菌藥物是用于治療人、動物和植物真菌感染的藥物。
6.如權利要求5所述的二氮芳辛類化合物在制備抗真菌藥物中的應用，其特征是所說的抗真菌藥物是用于治療人、動物和植物因凍土毛霉，黑根霉，淡黃鏈霉菌，粗糙脈孢菌，米曲霉，擬康氏木霉，棉花枯萎病菌，土豆疫病菌，蘋果斑點病菌和鐮刀菌所造成的感染及并發(fā)癥的藥物。
7.一種新型的二氮芳辛類化合物，特指2，6-二-(6-巰基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛在引發(fā)腫瘤細胞凋亡、制備高效、低毒抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了新型的二氮芳辛類化合物2，6－二－(6－巰基－3－吡啶)－4，8－二－(4－苯酚)－[1，5]－二氮芳辛，及其在制備抗腫瘤和抗真菌藥物中的應用。本發(fā)明及其涉及的化合物在開發(fā)用于制備治療肝癌，宮頸癌，腎癌和白血病的藥物，以及制備治療人、動物和植物真菌感染藥物中具有重要的意義和應用前景。
文檔編號A61P35/00GK1557322SQ20041002347
公開日2004年12月29日 申請日期2004年2月11日 優(yōu)先權日2004年2月11日
發(fā)明者李越中, 胡瑋 申請人:山東大學