專利名稱：脈絡寧注射制劑及其制備方法和它的質量控制方法
技術領域：
本發(fā)明是一種脈絡寧注射制劑及其制備方法和它的質量控制方法，屬于藥品的技術領域。
背景技術：
脈絡寧注射液以傳統(tǒng)中藥金銀花、牛膝、玄參、石斛為原料制成，具有養(yǎng)陰清熱、補益肝腎、活血化瘀的功效，是治療脈管炎、腦血栓及其后遺癥等血栓閉塞性疾病的中藥復方靜脈注射劑，目前臨床上還用于治療冠心病心絞痛、動脈硬化癥、糖尿病足壞死、新生兒硬腫癥、突發(fā)性耳聾等疾病。雖然脈絡寧注射液具有良好的臨床應用效果，然而目前市售的脈絡寧注射液存在著療效不夠好、穩(wěn)定性欠性，久置易出現(xiàn)混濁等缺點。究其原因，主要是由于工藝不夠成熟、缺乏一定的科學性所致。中國專利公報公開了“脈絡寧靜脈注射液的工藝方法”，申請?zhí)?2107848.X，在使用過程中發(fā)現(xiàn)注射液貯存過程中藥物的有效成分不穩(wěn)定，特別是在光線照射的情況下，產品有效成分會發(fā)生變化、影響正常的使用；“注射用脈絡寧及口服固體制劑的制備方法”申請?zhí)?3119593.8為粉針注射制劑，但其制備方法比較落后，采用了毒性較大的甲醇、氯仿作為提取溶劑，所以得到的產品質量不理想；以牛膝、玄參、石斛、金銀花四味藥材制成的中藥注射劑脈絡寧注射制劑對治療心腦血管疾病有很好的療效，為了更好的控制該制劑的質量，保證用藥的安全性，更好的指導生產，使工藝控制更加嚴格合理，使消費者能全面認識產品質地，迫切需要研究控制該注射制劑質量的方法；目前，以牛膝、玄參、石斛、金銀花四味藥材制成的中藥注射劑僅僅用薄層掃描法控制石斛中濱蒿內酯的含量，方法落后，檢測指標單一，不能全面反應產品的質量。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種脈絡寧注射制劑及其制備工藝，這種產品可以在保證治療效果的前提下，使產品質量更加穩(wěn)定，可以長期存儲，不會發(fā)生變質現(xiàn)象，這樣方便運輸、儲存、使用等，通過對制備方法的調整以及對制備過程中填充劑的選擇，得到的產品其起效迅速、療效確切、安全性及穩(wěn)定性好；本發(fā)明的另外一個目的還在于提供一種脈絡寧注射制劑的質量控制方法，包括性狀、鑒別、檢查、指紋圖譜、含量測定等項目，檢測指標合理，檢測方法簡單易行，以便更好的控制該制劑的質量，保證用藥的安全性，能夠更好的指導生產，使生產工藝控制更加嚴格合理，使消費者能全面認識產品質地。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的脈絡寧注射制劑，按照重量組分計算它由金銀花10-80、牛膝15-85、玄參15-80、石斛20-85加適量填充劑制備成粉針制劑或者是凍干粉針制劑。準確的說，它由金銀花50g 牛膝50g 玄參50g 石斛50g加適量填充劑制備成粉針制劑或者是凍干粉針制劑。加入的輔料是甘露醇、葡聚糖、乳糖或甘氨酸其中的一種或兩種以上的混合物。本發(fā)明的制備方法是將處方中的四味藥物粉碎，加4-8倍量水浸泡1-4小時，煎煮1-3次，每次0.5-3小時，過濾，合并濾液，濃縮至相對密度1.16，加乙醇至含醇量為60-70％，靜置，取上清液，回收乙醇并濃縮至相對密度1.36，加乙醇至含醇量為70-90％，靜置，取上清液，回收盡乙醇，加注射用水，充分攪拌，在10℃以下冷藏5-20小時，減壓濾過，取其澄清液，加入填充劑甘露醇、葡聚糖、乳糖、甘氨酸其中的一種或兩種以上混合物1-20mg/ml，用NaOH溶液調節(jié)PH值4-9，然后將精配液經0.1-0.45μm的微孔濾膜過濾，灌裝，冷凍干燥，即得成品。準確的說，將四味藥物粉碎加6倍量水浸泡2小時，煎煮2次，每次1.5小時，過濾，合并濾液，濃縮至相對密度1.16，加乙醇至含醇量為60％，靜置，取上清液，回收乙醇并濃縮至相對密度1.36，加乙醇至含醇量為80％，靜置，取上清液，回收盡乙醇，加注射用水，，充分攪拌，在0℃冷藏14小時，減壓濾過，取其澄清液，加入甘露醇5mg/ml，用NaOH溶液調節(jié)PH值9，然后將精配液經0.22μm的微孔濾膜過濾，灌裝，冷凍干燥，即得成品。脈絡寧注射制劑的質量控制方法，該質量控制方法主要包括性狀、鑒別、檢查、指紋圖譜、含量測定等項目，它將牛膝對照藥材、齊墩果酸、蛻皮甾酮、玄參對照藥材、哈巴俄苷、肉桂酸、石斛對照藥材、金銀花對照藥材、綠原酸中全部或部分品種作為質量控制的檢測指標、鑒別方法的檢測指標、含量測定方法的檢測指標及制劑指紋圖譜研究的檢測指標。該方法應包括以下具體項目的全部或部分內容性狀該注射制劑應為無色至黃棕色澄明液體或粉末。
鑒別牛膝 方法1采用薄層色譜法，一般使用硅膠G或硅膠GF254或硅膠H為薄層板，點樣量為0.5～30ul之間某一體積，以牛膝對照藥材、蛻皮甾酮、齊墩果酸中全部或部分品種作為對照品(藥材)，樣品前處理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法。展開劑可以為氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些種類試劑按照一定比例配制而成，檢視條件包括日光下、紫外光燈(254或365nm)下檢視、氨氣熏后再置紫外光燈(254或365nm)下檢視、或噴以2～30％硫酸乙醇、或噴以磷鉬酸試液等溶液顯色的方法。
方法2采用高效液相色譜法，樣品前處理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法。一般使用C8或C18類型填料的色譜柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸、庚烷磺酸鈉、二甲基甲烷等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，測定本品中的蛻皮甾酮或齊墩果酸，檢測波長在203～350nm范圍內。
玄參方法1采用薄層色譜法，一般使用硅膠G或硅膠GF254或硅膠H為薄層板，點樣量為0.5～30ul之間某一體積，以玄參對照藥材、哈巴俄苷、肉桂酸中全部或部分品種作為對照品(藥材)，樣品前處理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法。展開劑可以為氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些種類試劑按照一定比例配制而成，檢視條件包括日光下、紫外光燈(254或365nm)下檢視、氨氣熏后再置紫外光燈(254或365nm)下檢視、或噴以2～30％硫酸乙醇、或噴以磷鉬酸試液等溶液顯色的方法。
方法2采用高效液相色譜法，樣品前處理同上。一般使用C8或C18類型填料的色譜柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸、庚烷磺酸鈉、二甲基甲烷等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，測定本品中的哈巴俄苷或肉桂酸，檢測波長在203～350nm范圍內。
石斛采用薄層色譜法，一般使用硅膠G或硅膠GF254或硅膠H為薄層板，點樣量為0.5～30ul之間某一體積，以石斛對照藥材作為對照，樣品前處理包括先以水或乙醇或醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法。展開劑可以為氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些種類試劑按照一定比例配制而成，檢視條件包括日光下、紫外光燈(254或365nm)下檢視、氨氣熏后再置紫外光燈(254或365nm)下檢視、或噴以2～30％硫酸乙醇、或噴以磷鉬酸試液等溶液顯色的方法。
金銀花方法1采用薄層色譜法，一般使用硅膠G或硅膠GF254或硅膠H為薄層板，點樣量為0.5～30ul之間某一體積，以金銀花對照藥材、綠原酸中全部或部分品種作為對照品(藥材)，樣品前處理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法。展開劑可以為醋酸丁酯、氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些種類試劑按照一定比例配制而成，檢視條件包括日光下、紫外光燈(254或365nm)下檢視、氨氣熏后再置紫外光燈(254或365nm)下檢視、或噴以2～30％硫酸乙醇、或噴以磷鉬酸試液等溶液顯色的方法。
方法2采用高效液相色譜法，樣品前處理同上。一般使用C8或C18類型填料的色譜柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸或磷酸、庚烷磺酸鈉、二甲基甲烷等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，測定本品中的綠原酸，檢測波長在203～400nm范圍內。
檢查包括pH值、裝量差異、澄明度、無菌、不溶性微粒、蛋白質、鞣質、樹脂、草酸鹽、鉀離子、重金屬、砷鹽、農藥殘留等項目或部分項目，具體檢測方法與中國藥典附錄收載的保持一致，另外關于鉀離子、重金屬、砷鹽的檢測方法還包括以微波消解法處理樣品，進而采用原子吸收法、等離子發(fā)射光譜(ICP-AES)或電感耦合等離子質譜(ICP-MS)法進行測定的方法。
有關項目的限度要求如下(1)pH值在4～9之間，或其中部分范圍；(2)重金屬不得過百萬分之二十；(3)砷鹽不得過百萬分之二；(4)有機氯農藥殘留總量不得過百萬分之一。
指紋圖譜采用高效液相色譜法，樣品前處理包括直接濾過取樣、以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或正丁醇提取后再濃縮等方法，使用C8或C18類型填料的色譜柱，以某比例(0.1～5％)的甲酸甲醇溶液、某比例(0.1～5％)的甲酸水溶液、甲醇、乙腈、水、等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，以梯度洗脫的方法分離，檢測波長在205～450nm范圍內，流速0.5～1.5ml/min，以齊墩果酸、蛻皮甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、綠原酸中部分品種作為特征指紋峰或內標物峰，標示出該品種注射液合計約8～12個共有峰，并分別說明了其藥材歸屬。
含量測定方法1采用高效液相色譜法，樣品前處理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法。一般使用C8或C18類型填料的色譜柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸或磷酸、庚烷磺酸鈉、二甲基甲烷等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，測定本品中蛻皮甾酮或齊墩果酸的含量，檢測波長在203～350nm范圍內。
方法2采用高效液相色譜法，樣品前處理同上。一般使用C8或C18類型填料的色譜柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸、庚烷磺酸鈉、二甲基甲烷等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，測定本品中哈巴俄苷或肉桂酸的含量，檢測波長在203～350nm范圍內。
方法3采用高效液相色譜法，樣品前處理同上。一般使用C8或C18類型填料的色譜柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸或磷酸、庚烷磺酸鈉、二甲基甲烷等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，測定本品中的綠原酸，檢測波長在203～400nm范圍內。
準確的說脈絡寧注射制劑的質量控制方法，包括以下具體項目的全部內容性狀本品應為無色至黃棕色澄明液體或粉末。
鑒別 牛膝方法1采用薄層色譜法，使用硅膠G為薄層板，點樣量為0.5ul，蛻皮甾酮作為對照品，樣品前處理為醋酸乙酯提取后再濃縮。展開劑為氯仿-甲醇(11∶34)，氨氣熏后再置紫外光燈254下檢視，噴以2～30％硫酸乙醇，供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點。
方法2采用高效液相色譜法，樣品前處理為醋酸乙酯提取后再濃縮，使用C18類型填料的色譜柱，以甲醇-水(23∶14)為流動相，蛻皮甾酮作為對照品，檢測波長為243nm，供試品色譜中，與對照品色譜相同時間處，出相同色譜峰。
玄參方法1采用薄層色譜法，一般使用硅膠G為薄層板，點樣量為0.7ul，以肉桂酸作為對照品，樣品前為直接點樣，展開劑為丙酮-二氯甲烷-醋酸乙酯(2∶54∶13)，供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點。
方法2采用高效液相色譜法，樣品前處理同上，C18類型填料的色譜柱，以甲醇-乙腈(32∶17)為流動相，以肉桂酸作為對照品，檢測波長278nm，供試品色譜中，與對照品色譜相同時間處，出相同色譜峰。
石斛采用薄層色譜法，使用硅膠G為薄層板，點樣量為1.0ul，以石斛對照藥材作為對照，樣品前處理為乙醇提取后再濃縮，展開劑可以為氯仿-丙酮-甲酸(5∶27∶10)紫外光燈(365nm)下檢視，供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點。
金銀花方法1采用薄層色譜法，用硅膠G為薄層板，點樣量為0.5ul之間某一體積，以綠原酸為對照品，直接點樣，展開劑為醋酸丁酯-氯仿-水(20∶13∶2)，供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點。
方法2采用高效液相色譜法，樣品前處理同上。使用C18類型填料的色譜柱，以甲醇-水(10∶21)為流動相，以綠原酸為對照品，檢測波長324nm范圍內供試品色譜中，與對照品色譜相同時間處，出相同色譜峰。
檢查包括pH值、裝量差異、澄明度、無菌、不溶性微粒、蛋白質、鞣質、樹脂、草酸鹽、鉀離子、重金屬、砷鹽、農藥殘留等項目或部分項目，具體檢測方法與中國藥典附錄收載的保持一致，另外關于鉀離子、重金屬、砷鹽的檢測方法還包括以微波消解法處理樣品，進而采用原子吸收法、等離子發(fā)射光譜(ICP-AES)或電感耦合等離子質譜(ICP-MS)法進行測定的方法。
有關項目的限度要求如下(1)pH值在4～9之間，或其中部分范圍；(2)重金屬不得過百萬分之二十；(3)砷鹽不得過百萬分之二；(4)有機氯農藥殘留總量不得過百萬分之一。
指紋圖譜 采用高效液相色譜法，樣品前處理包括直接濾過取樣、以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或正丁醇提取后再濃縮等方法，使用C8或C18類型填料的色譜柱，以某比例(0.1～5％)的甲酸甲醇溶液、某比例(0.1～5％)的甲酸水溶液、甲醇、乙腈、水、等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，以梯度洗脫的方法分離，檢測波長在205～450nm范圍內，流速0.5～1.5ml/min，以齊墩果酸、蛻皮甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、綠原酸中部分品種作為特征指紋峰或內標物峰，標示出該品種注射液合計約8～12個共有峰，并分別說明了其藥材歸屬。
含量測定 方法1采用高效液相色譜法，樣品前處理為醋酸乙酯提取后再濃縮，使用C18類型填料的色譜柱，以甲醇-水(23∶14)為流動相，蛻皮甾酮作為對照品，檢測波長為243nm，測定供試品中蛻皮甾酮含量。
方法2采用高效液相色譜法，樣品前處理同上，C18類型填料的色譜柱，以甲醇-乙腈(32∶17)為流動相，檢測波長278nm，以肉桂酸作為對照品，測定供試品中，測定對照品肉桂酸的。
方法3采用高效液相色譜法，樣品前處理同上。使用C18類型填料的色譜柱，以甲醇-水(10∶21)為流動相，以綠原酸為對照品，檢測波長324nm，測定供試品中綠原酸的含量。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術，采用水提，兩次醇沉法，可明顯提高有效成分的收率和產品的療效。另外將脈絡寧注射液冷凍干燥為凍干粉針，有效解決了注射液貯存過程中的穩(wěn)定性問題。申請人在實驗過程中分別采用微波提取法、超聲波提取法、水提醇沉法提取藥物中的有效成分，并以每100g原藥材中濱蒿內酯的含量為檢測指標，結果發(fā)現(xiàn)微波法提取法為0.053mg；超聲提取法為0.071mg；水提醇沉法為0.088mg。盡管微波法提取的有效成分和其它方法相比有一點差距，但是并不影響產品質量和產量也容易實施；超聲提取法的問題在于不容易實施；所以申請人認為采用水提醇沉法提取技術具有提取時間短的優(yōu)點，能夠降低生產成本、也比較適合藥品工業(yè)化生產的需要；本發(fā)明中凍干前在溶液中加入填充劑，是因為脈絡寧注射制劑中的有效成分濱蒿內酯在水中的溶解性不高，在冷凍干燥時會與水蒸氣一起飛散，或干后變成絨毛狀的松散結構；因此在凍干前在溶液中加入填充劑，可使之形成團塊結構；本發(fā)明采用0.1-0.45μm的微孔濾膜過濾，可有效濾除藥液中的細菌。采用冷凍干燥對藥液進行干燥，是因為用噴霧干燥法與冷凍干燥法兩種方法相比較，發(fā)現(xiàn)冷凍干燥方法從分散度、溶解性、熱原去除等方面優(yōu)于噴霧干燥法。與現(xiàn)有技術相比本發(fā)明提供的制劑具有養(yǎng)陰清熱、補益肝腎、活血化瘀的功效，可以治療脈管炎、腦血栓及其后遺癥等血栓閉塞性疾??；臨床上還用于治療冠心病心絞痛、動脈硬化癥、糖尿病足壞死、新生兒硬腫癥、突發(fā)性耳聾等疾?。黄淦鹦а杆?、療效確切、安全性及穩(wěn)定性好。本發(fā)明提供的制備方法和質量控制方法能更好的控制這種中藥注射制劑的產品質量，保證用藥的安全性，使用這種質量控制方法后，能夠保證藥物制成品的質量，從生產開始、選用原材料，到每一個生產過程的工藝步驟均必須嚴格按照工藝規(guī)程執(zhí)行，否則產品就有可能不滿足質量要求；我們在進行試驗時發(fā)現(xiàn)執(zhí)行這種方法，要求選用優(yōu)等的道地藥材，否則制成品會出現(xiàn)不合格的情況；更有利于指導生產，使工藝控制更加嚴格合理，讓消費者全面認識產品品質、放心使用這類藥品。本發(fā)明選取的齊墩果酸、蛻皮甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、綠原酸是這類藥物中重要的有效活性成分，對控制藥品質量是十分必要的。蛻皮甾酮具促進RNA和蛋白質的合成；影響糖代謝；促進脂類代謝；免疫調節(jié)；影響中樞神經系統(tǒng)作用等，具有較高的藥用價值，齊墩果酸具有護肝、降糖、降脂、抗炎、抗氧化作用，兩者是牛膝的主要活性成分。哈巴俄苷為玄參中含量較高的成分，具有抗慢性炎癥、降壓、鎮(zhèn)痛、解痙、抗乙肝病毒及免疫促進作用，是玄參的特征性有效成分之一。金銀花是常用中藥，其主要有效成分為綠原酸，具有抗炎、抗病毒、降血脂、免疫調節(jié)、保肝利膽之功效等。以牛膝、玄參、石斛、金銀花四味藥材制成的中藥注射液主要功能是清熱養(yǎng)陰，活血化瘀，抗炎解毒，用于血栓閉塞性脈管炎，靜脈血栓形成，動脈硬化性閉塞癥，腦血栓形成及后遺癥等心腦血管疾病。檢測以上成分對控制產品質量有重大意義，直接關系到臨床藥效，所以本發(fā)明選定了一系列的成分作為檢測的指標，通過性狀、鑒別、檢查、指紋圖譜、含量測定等項目的檢測全面合理控制產品質量，采用這樣的技術手段，達到了發(fā)明的目的。
申請人進行了一系列實驗，以證明利用本發(fā)明提供的藥物具有比較好的治療效果實驗例1穩(wěn)定性實驗金銀花的主要成分為綠原酸，對熱不穩(wěn)定，特別是在光線照射的情況下，發(fā)生分解變化影響療效。將脈絡寧水針和粉針劑置于37℃恒溫箱中，放置3和個月后分別測定綠原酸的含量。
綠原酸含量mg/ml0月3月 6月水針0.365 0.2570.118粉針 0.368 0.3540.342由實驗1可知，脈絡寧粉針比水針穩(wěn)定。
實驗例2賦形劑的篩選為使結晶均勻，色澤一致，質地良好，具有理想的物理強度和較快的溶解度，進行了賦形劑的篩選。
賦形劑 用量％ 外觀 溶解性甘露醇 0.2潔白，結構強度好加入溶媒后10秒即溶解氯化鈉 0.2潔白，結構強度好加入溶媒后振搖1分鐘溶解磷酸氫二鈉 0.2有硬殼，脆散加入溶媒后振搖1分鐘不能完全溶解甘氨酸 0.2粉粒粗，脆散加入溶媒后振搖2分鐘溶解申請人還進行了一系列實驗，可以證明利用本發(fā)明提供的質量控制方法能更好的控制這種中藥注射制劑的產品質量，得到的藥物具有有效的效果；實驗例3蛻皮甾酮對小鼠腦缺氧的保護作用1、動物與試劑 昆明種小鼠，♂，18-22g；蛻皮甾酮，純度95％，用時用蒸餾水配至所需濃度。
2、小鼠急性腦缺氧實驗小鼠30只隨機分組，ip蛻皮甾酮各劑量或等容量蒸餾水連續(xù)3d，末次給藥8h后各組均sc亞硝酸鈉800mg/kg，記錄注射后至呼吸停止的時間。另取小鼠30只，分組及給藥同上。末次給藥8h后各組均ip氰化鉀4.5mg/kg，記錄注射后各組小鼠昏睡潛伏期及持續(xù)時間。
實驗結果蛻皮甾酮14.4mg/kg，延長亞硝酸鈉致缺氧小鼠的生存時間，使氰化鉀致小鼠昏睡持續(xù)時間縮短，對昏睡潛伏期無影響(表1)。
藥物生存時間 昏睡潛伏期昏睡持續(xù)時間蒸餾水對照組8.2±0.9 5.1±5.2 6.4±4.6蛻皮甾酮7.2mg/kg9.4±1.6 4.8±5.2 4.5±3.5蛻皮甾酮14.4mg/kg 9.8±1.2 8.7±6.5 1.6±1.73、小鼠腦組織內丙二醛含量測定方法將氰化鉀致腦缺氧小鼠斷頭處死，取小鼠大腦，采用硫代巴比妥酸比色法，測定每克組織丙二醛生成量。
實驗結果氰化鉀4.5mg/kg顯著提高腦組織丙二醛含量，表明腦缺氧能促進腦組織過氧化脂質的生成。蛻皮甾酮7.2mg/kg，14.4mg/kg均能對抗由氰化鉀引起的腦組織丙二醛含量的升高，表明蛻皮甾酮抑制腦缺氧致腦組織過氧化脂質的生成(表2)。
Drug(mg/kg)n Content of MDA(nmol/g)Control10140.5±14.1PC 10254.6±44.9Ecd(7.2)+PC(4.5) 9 204.7±45.8Ecd(14.4)+PC(4.5) 9 162.7±55.7Control對照組 PC氰化鉀Ecd蛻皮甾酮通過實驗1的結果表明蛻皮甾酮對小鼠腦缺氧的保護作用。
實驗例4哈巴俄苷對陰虛小鼠免疫功能的影響動物6～8周齡的LACA雄性小鼠，體重(22±3)g供試品Hps(哈巴俄苷)由玄參中提取、分離得到。整體給藥用生理鹽水配成所需濃度，皮下注射。體外給藥用完全RPMI-1640培養(yǎng)液配成10g/L，微孔濾器過濾除菌，-20℃保存，使用前用完全RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。
主要試劑(1)RPMI-1640、MTT(四甲基偶氮唑鹽)、ConA(刀豆蛋白A)、POPO[(1，4雙-苯基口惡唑基-2)-苯](2)CAMP、CGMP試劑盒，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> (3)甲狀腺素動物分組與模型 將動物隨機分為對照組(Control)、陰虛模型組(YD)、給藥組(Hps組)，每組動物數(shù)目見表。對照組小鼠每只每日灌服0.6ml自來水，皮下注射0.1ml生理鹽水；陰虛模型組小鼠每只每日灌服0.6ml甲狀腺素(30mg/L)，皮下注射生理鹽水0.1ml；給藥組小鼠每只每日灌服0.6ml甲狀腺素(30mg/L)，Hps(3g/L)，持續(xù)5d，第6天處死動物。
結果1、體內給藥對陰虛小鼠ConA誘導的脾淋巴細胞增殖的影響陰虛小鼠脾淋巴細胞對ConA誘導的增殖反應與正常對照組比較顯著下降[陰虛組SI(刺激因子＝刺激孔A值/對照孔A值)值2.04±0.46，正常組SI值3.48±1.09，P＜0.05]。小鼠皮下注射Hps后，Hps可促進陰虛小鼠T淋巴細胞增殖(注射Hps組SI值3.01±0.81，P＜0.05)。
2、體內給藥對陰虛小鼠脾淋巴細胞產生IL-2能力的影響從表1可見陰虛小鼠脾淋巴細胞產生IL-2水平降低P＜0.05)。小鼠皮下注射Hps后，Hps可促進陰虛小鼠脾淋巴細胞產生IL-2(P＜0.05)，并恢復正常水平。
表1 化合物Hpd、Hps對陰虛小鼠脾淋巴細胞上清中IL-2活性的影響(x±s，n＝8)DilutiionGroups 1∶2 1∶4 1∶8Control 0.33±0.02 0.24±0.010.14±0.03YD 0.24±0.01 0.16±0.020.08±0.04YD+Hps 0.33±0.01 0.23±0.030.14±0.013、體內給藥對陰虛小鼠血漿CAMP、CGMP含量的影響從表2可見陰虛小鼠CAMP、CGMP的含量升高，CAMP/CGMP的值也升高(P＜0.05)。Hps可降低陰虛小鼠CAMP、CGMP的含量及CAMP/CGMP的值(P＜0.05)，并可恢復正常水平。
表2 Hps對陰虛小鼠血清CAMP、C(MP的影響(x±s，n＝10)C(nmol/L)Groups CAMP CGMPCAMP/CGMPControl44.51±3.408.07±0.35 5.26±0.21YD169.40±5.2121.95±0.367.74±0.12YD+Hps58.21±6.25 10.21±0.355.70±0.16由實驗4可證明哈巴俄苷為玄參產生滋陰作用的物質基礎之一。
實驗3、4表明蛻皮甾酮、哈巴俄苷均具有很強的藥理活性，是藥材的特征性有效成分之一。
實驗例5不同產地的牛膝中齊墩果酸、蛻皮甾酮的含量選用不同產地的牛膝(n＝5)，用高效液相色譜法測定其齊墩果酸、蛻皮甾酮含量的平均值，結果見表。
產地 蛻皮甾酮％齊墩果酸％河南武勝0.196 1.84山東泰安0.090 1.48河北安國0.053 1.72
實驗例6玄參不同加工品中哈巴俄苷、肉桂酸的含量選用玄參(n＝5)不同加工品，用高效液相色譜法測定其哈巴俄苷、肉桂酸含量的平均值，結果見表。
部位 哈巴俄苷％肉桂酸％主根(切片曬干) 0.021 0.013須根(曬干) 0.238 0.008根莖(切片曬干) 0.111 0.011地上部分(曬干) 未檢出未檢出實驗例7不同產地的金銀花中綠原酸的含量選用不同產地的金銀花(n＝3)，用高效液相色譜法測定其綠原酸的含量，結果見表。
綠原酸％品種 產地 123忍冬科植物忍冬 山東日照 7.077.56 6.01山東平邑 5.505.12 4.87山東蒙陰 3.893.56 3.01山東沂南 7.417.58 7.69實驗5、6、7表明不同產地、不同加工品的藥材有效成分含量差異很大，如果不對其檢測，就無法防止用劣質低等藥材投料，不能從根本控制產品質量。
實驗例8該方制劑對血小板聚集的作用動物wistar大鼠，♂兼用，體重(264±44)g儀器MPG-30型血小板聚集儀實驗1組除石斛外其余三位采用三等藥材制成的注射液，經檢測濱蒿內酯含量合格實驗2組四味藥材均采用一等品制成的注射液，經檢測齊墩果酸、蛻皮甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、綠原酸含量合格血小扳聚集實驗♂大鼠，禁食12h，戊巴比妥鈉(40mg/kg)ip麻醉后，由股靜脈恒速給藥(0.001mL/g/min)，給藥停止后5min由腹主動脈取抗凝血，按常規(guī)方法制備PRP(富血小板血漿)和PPP(貧血小板血漿)，血小板濃度調為2.2×105-2.5×105個·mL-1，分別以ADP，凝血酶或膠原為誘導劑，進行血小板聚集實驗，ADP終濃度為0.5×106-1×106mol·mL-1，凝血酶終濃度為0.05-0.07U·mL-1，膠原終濃度為0.05-0.15mL貯備液/mL。
血小扳聚集率組別 劑量/gnADP 凝血酶 膠原生藥·kg-1溶媒對照組 -- 1067.1±7.1 76.5±7.2 70.1±5.51組 108 58.0±5.9 69.7±6.8 67.2±4.92組 109 41.0±12.5 51.9±25.4 54.2±12.0阿司匹林組 20mg/kg1041.9±16.1 52.0±22.3 55.1±13.9實驗8表明僅僅檢測濱蒿內酯的含量不能有效的控制產品的質量。
具體的實施方式本發(fā)明的實施例1取金銀花50g 牛膝50g 玄參50g 石斛50g，將處方中的四味藥物粉碎，加4倍量水浸泡1小時，煎煮1次、3小時，過濾得濾液，濃縮至相對密度1.16，加乙醇至含醇量為60-70％，靜置，取上清液，回收乙醇并濃縮至相對密度1.36，加乙醇至含醇量為70-90％，靜置，取上清液，回收盡乙醇，加注射用水，充分攪拌，在10℃以下冷藏5小時，減壓濾過，取其澄清液，加入填充劑0.2％甘露醇，用NaOH溶液調節(jié)PH值4-9，然后將精配液經0.1-0.45μm的微孔濾膜過濾，灌裝，冷凍干燥，即得成品。使用方法肌注，每日一次，15天為一療程。
本發(fā)明的實施例2取金銀花80g 牛膝85g 玄參80g 石斛85g將處方中的四味藥物粉碎，加8倍量水浸泡4小時，煎煮3次，每次0.5小時，過濾，合并濾液，濃縮至相對密度1.16，加乙醇至含醇量為60-70％，靜置，取上清液，回收乙醇并濃縮至相對密度1.36，加乙醇至含醇量為70-90％，靜置，取上清液，回收盡乙醇，加注射用水，充分攪拌，在10℃以下冷藏20小時，減壓濾過，取其澄清液，加入填充劑甘氨酸，用NaOH溶液調節(jié)PH值4-9，然后將精配液經0.1-0.45μm的微孔濾膜過濾，灌裝，冷凍干燥，即得成品。
本發(fā)明的實施例3取金銀花10g 牛膝15g 玄參15g 石斛20g將處方中的四味藥物粉碎加6倍量水浸泡2小時，煎煮2次，每次1.5小時，過濾，合并濾液，濃縮至相對密度1.16，加乙醇至含醇量為60％，靜置，取上清液，回收乙醇并濃縮至相對密度1.36，加乙醇至含醇量為80％，靜置，取上清液，回收盡乙醇，加注射用水，，充分攪拌，在0℃冷藏14小時，減壓濾過，取其澄清液，加入葡聚糖和甘氨酸的混合物，用NaOH溶液調節(jié)PH值9，然后將精配液經0.22μm的微孔濾膜過濾，灌裝，冷凍干燥，即得成品。
本發(fā)明的質量控制方法的實施例脈絡寧注射制劑的質量控制方法的內容為[性狀]本品應為無色至黃棕色澄明液體或粉末。
牛膝方法1采用薄層色譜法，使用硅膠G為薄層板，點樣量為0.5ul，蛻皮甾酮作為對照品，樣品前處理為醋酸乙酯提取后再濃縮。展開劑為氯仿-甲醇(11∶34)，氨氣熏后再置紫外光燈254下檢視，噴以2～30％硫酸乙醇，供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點。
方法2采用高效液相色譜法，樣品前處理為醋酸乙酯提取后再濃縮，使用C18類型填料的色譜柱，以甲醇-水(23∶14)為流動相，蛻皮甾酮作為對照品，檢測波長為243nm，供試品色譜中，與對照品色譜相同時間處，出相同色譜峰。
玄參方法1采用薄層色譜法，一般使用硅膠G為薄層板，點樣量為0.7ul，以肉桂酸作為對照品，樣品前為直接點樣，展開劑為丙酮-二氯甲烷-醋酸乙酯(2∶54∶13)，供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點。
方法2采用高效液相色譜法，樣品前處理同上，C18類型填料的色譜柱，以甲醇-乙腈(32∶17)為流動相，以肉桂酸作為對照品，檢測波長278nm，供試品色譜中，與對照品色譜相同時間處，出相同色譜峰。
石斛 采用薄層色譜法，使用硅膠G為薄層板，點樣量為1.0ul，以石斛對照藥材作為對照，樣品前處理為乙醇提取后再濃縮，展開劑可以為氯仿-丙酮-甲酸(5∶27∶10)紫外光燈(365nm)下檢視，供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點。
金銀花 方法1采用薄層色譜法，用硅膠G為薄層板，點樣量為0.5ul之間某一體積，以綠原酸為對照品，直接點樣，展開劑為醋酸丁酯-氯仿-水(20∶13∶2)，供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點。
方法2采用高效液相色譜法，樣品前處理同上。使用C18類型填料的色譜柱，以甲醇-水(10∶21)為流動相，以綠原酸為對照品，檢測波長324nm范圍內供試品色譜中，與對照品色譜相同時間處，出相同色譜峰。
包括pH值、裝量差異、澄明度、無菌、不溶性微粒、蛋白質、鞣質、樹脂、草酸鹽、鉀離子、重金屬、砷鹽、農藥殘留等項目或部分項目，具體檢測方法與當時現(xiàn)行版的中國藥典附錄收載的保持一致，另外關于鉀離子、重金屬、砷鹽的檢測方法還包括以微波消解法處理樣品，進而采用原子吸收法、等離子發(fā)射光譜(ICP-AES)或電感耦合等離子質譜(ICP-MS)法進行測定的方法。
有關項目的限度要求如下(1)pH值在4～9之間，或其中部分范圍；(2)重金屬不得過百萬分之二十；(3)砷鹽不得過百萬分之二；(4)有機氯農藥殘留總量不得過百萬分之一。
采用高效液相色譜法，樣品前處理包括直接濾過取樣、以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或正丁醇提取后再濃縮等方法，使用C8或C18類型填料的色譜柱，以某比例(0.1～5％)的甲酸甲醇溶液、某比例(0.1～5％)的甲酸水溶液、甲醇、乙腈、水、等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，以梯度洗脫的方法分離，檢測波長在205～450nm范圍內，流速0.5～1.5ml/min，以齊墩果酸、蛻皮甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、綠原酸中部分品種作為特征指紋峰或內標物峰，標示出該品種注射液合計約8～12個共有峰，并分別說明了其藥材歸屬。
方法1采用高效液相色譜法，樣品前處理為醋酸乙酯提取后再濃縮，使用C18類型填料的色譜柱，以甲醇-水(23∶14)為流動相，蛻皮甾酮作為對照品，檢測波長為243nm，測定供試品中蛻皮甾酮含量≥5mg/ml。
方法2采用高效液相色譜法，樣品前處理同上，C18類型填料的色譜柱，以甲醇-乙腈(32∶17)為流動相，檢測波長278nm，以肉桂酸作為對照品，測定供試品中，測定肉桂酸的≥0.5mg/ml。
方法3采用高效液相色譜法，樣品前處理同上。使用C18類型填料的色譜柱，以甲醇-水(10∶21)為流動相，以綠原酸為對照品，檢測波長324nm，測定供試品中綠原酸的含量≥0.3mg/ml。
臨床藥效脈絡寧治療冠心病的療效觀察一、對象與方法1、藥物脈絡寧凍干粉針按照本發(fā)明的方法制備。
脈絡寧注射液按照常規(guī)工藝制備。
2、對象30例患者隨機分為兩組，脈絡寧凍干粉針組15例，其中男性9例，女性6例，年齡44-81歲；脈絡寧注射液組15例，男性8例，女性7例，年齡46-80歲。冠心病診斷均符合1979年全國冠心病防治診斷標準。
3、方法30例患者均臥床休息和對癥治療(如強心、利尿、擴血管)。各組分別給予脈絡寧注射液或脈絡寧凍干粉針，每日一次，15天為一療程。
4、觀察指標及評定標準記錄兩組患者治療心電圖、超聲心動圖變化；心率、血壓及自覺癥狀；心功能指標變化。心電圖療效按《衛(wèi)生部一類藥物臨床研究指導原則》評價；心功能分級按美國紐約心臟協(xié)會分級標準。
二、結果1、一般癥狀及臨床療效頭昏、胸悶、心悸、胸痛、氣急5項中3項以上有明顯改善者為顯效1項以上明顯改善者為有效；其余為無效。脈絡寧凍干粉針組顯效4例，有效10例，無效1例，總有效率為93.3％。脈絡寧注射液組顯效2例，有效9例，無效4例，總有效率為73.3％。
2、心電圖變化治療前脈絡凍干粉針寧組中11例和脈絡寧注射液組中10例有ST-T改變及心率失常。治療后脈絡寧凍干粉針組顯效4例，有效5例，總有效率81.8％；脈絡寧注射液組顯效2例，有效5例，總有效率70％。
3、超聲心動圖指標變化兩組超聲心動圖檢測指標變化見表1。
表1超聲心動圖療效檢測指標凍干粉針組注射液組治療前 治療后 治療前 治療后SV50.12±3.570.26±4.71 50.56±3.658.13±4.12CO3.34±1.135.12±1.25 3.21±1.324.54±1.17CI2.81±1.303.68±1.05 2.70±1.223.12±1.13EF47.40±2.12 69.71±1.81 46.46±1.36 57.15±2.104、心動功能改善情況治療后脈絡寧凍干粉針組心功能改善I級以上患者為10例，總有效率66.7％；脈絡寧注射液組心功能改善I級以上患者為6例，總有效率為40％；兩組之間有明顯差異。
三、討論本發(fā)明得到的脈絡寧凍干粉針對冠心病患者心功能、心電圖特征及其臨床癥狀的治療作用優(yōu)于現(xiàn)有的脈絡寧注射液。
權利要求
1.一種脈絡寧注射制劑，其特征在于按照重量組分計算它由金銀花10-80、牛膝15-85、玄參15-80、石斛20-85加適量填充劑制備成粉針制劑或者是凍干粉針制劑。
2.按照權利要求1所述的脈絡寧注射制劑，其特征在于它由金銀花50g牛膝50g 玄參50g 石斛50g加適量填充劑制備成粉針制劑或者是凍干粉針制劑。
3.按照權利要求1或2所述的脈絡寧注射制劑，其特征在于加入的輔料是甘露醇、葡聚糖、乳糖或甘氨酸其中的一種或兩種以上的混合物。
4.如權利要求1所述的脈絡寧注射制劑的制備方法，其特征在于將處方中的四味藥物粉碎，加4-8倍量水浸泡1-4小時，煎煮1-3次，每次0.5-3小時，過濾，合并濾液，濃縮至相對密度1.16，加乙醇至含醇量為60-70％，靜置，取上清液，回收乙醇并濃縮至相對密度1.36，加乙醇至含醇量為70-90％，靜置，取上清液，回收盡乙醇，加注射用水，充分攪拌，在10℃以下冷藏5-20小時，減壓濾過，取其澄清液，加入填充劑甘露醇、葡聚糖、乳糖、甘氨酸其中的一種或兩種以上混合物1-20mg/ml，用NaOH溶液調節(jié)PH值4-9，然后將精配液經0.1-0.45μm的微孔濾膜過濾，灌裝，冷凍干燥，即得成品。
5.按照權利要求4所述的脈絡寧注射制劑的制備方法，其特征在于比較準確的制備方法是將處方中的四味藥物粉碎加6倍量水浸泡2小時，煎煮2次，每次1.5小時，過濾，合并濾液，濃縮至相對密度1.16，加乙醇至含醇量為60％，靜置，取上清液，回收乙醇并濃縮至相對密度1.36，加乙醇至含醇量為80％，靜置，取上清液，回收盡乙醇，加注射用水，，充分攪拌，在0℃冷藏14小時，減壓濾過，取其澄清液，加入甘露醇5mg/ml，用NaOH溶液調節(jié)PH值9，然后將精配液經0.22μm的微孔濾膜過濾，灌裝，冷凍干燥，即得成品。
6.如權利要求1或2所述的脈絡寧注射制劑的質量控制方法，該質量控制方法主要包括性狀、鑒別、檢查、指紋圖譜、含量測定等項目，其特征在于將牛膝對照藥材、齊墩果酸、蛻皮甾酮、玄參對照藥材、哈巴俄苷、肉桂酸、石斛對照藥材、金銀花對照藥材、綠原酸中全部或部分品種作為質量控制的檢測指標、鑒別方法的檢測指標、含量測定方法的檢測指標及制劑指紋圖譜研究的檢測指標。
7.按照權利要求6所述的脈絡寧注射制劑的質量控制方法，其特征在于該方法應包括以下具體項目的全部或部分內容性狀該注射制劑應為無色至黃棕色澄明液體或粉末；鑒別牛膝采用薄層色譜法，一般使用硅膠G或硅膠GF254或硅膠H為薄層板，點樣量為0.5～30ul之間某一體積，以牛膝對照藥材、蛻皮甾酮、齊墩果酸中全部或部分品種作為對照品(藥材)，樣品前處理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法，展開劑可以為氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些種類試劑按照一定比例配制而成，檢視條件包括日光下、紫外光燈(254或365nm)下檢視、氨氣熏后再置紫外光燈(254或365nm)下檢視、或噴以2～30％硫酸乙醇、或噴以磷鉬酸試液等溶液顯色的方法；玄參采用薄層色譜法，一般使用硅膠G或硅膠GF254或硅膠H為薄層板，點樣量為0.5～30ul之間某一體積，以玄參對照藥材、哈巴俄苷、肉桂酸中全部或部分品種作為對照品(藥材)，樣品前處理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法，展開劑可以為氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些種類試劑按照一定比例配制而成，檢視條件包括日光下、紫外光燈(254或365nm)下檢視、氨氣熏后再置紫外光燈(254或365nm)下檢視、或噴以2～30％硫酸乙醇、或噴以磷鉬酸試液等溶液顯色的方法；石斛采用薄層色譜法，一般使用硅膠G或硅膠GF254或硅膠H為薄層板，點樣量為0.5～30ul之間某一體積，以石斛對照藥材作為對照，樣品前處理包括先以水或乙醇或醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法，展開劑可以為氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些種類試劑按照一定比例配制而成，檢視條件包括日光下、紫外光燈(254或365nm)下檢視、氨氣熏后再置紫外光燈(254或365nm)下檢視、或噴以2～30％硫酸乙醇、或噴以磷鉬酸試液等溶液顯色的方法；金銀花采用薄層色譜法，一般使用硅膠G或硅膠GF254或硅膠H為薄層板，點樣量為0.5～30ul之間某一體積，以金銀花對照藥材、綠原酸中全部或部分品種作為對照品(藥材)，樣品前處理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法，展開劑可以為醋酸丁酯、氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些種類試劑按照一定比例配制而成，檢視條件包括日光下、紫外光燈(254或365nm)下檢視、氨氣熏后再置紫外光燈(254或365nm)下檢視、或噴以2～30％硫酸乙醇、或噴以磷鉬酸試液等溶液顯色的方法；檢查包括pH值、裝量差異、澄明度、無菌、不溶性微粒、蛋白質、鞣質、樹脂、草酸鹽、鉀離子、重金屬、砷鹽、農藥殘留等項目或部分項目，具體檢測方法與中國藥典附錄收載的保持一致，另外關于鉀離子、重金屬、砷鹽的檢測方法還包括以微波消解法處理樣品，進而采用原子吸收法、等離子發(fā)射光譜(ICP-AES)或電感耦合等離子質譜(ICP-MS)法進行測定的方法；其中(1)pH值在4～9之間，或其中部分范圍；(2)重金屬不得過百萬分之二十；(3)砷鹽不得過百萬分之二；(4)有機氯農藥殘留總量不得過百萬分之一；指紋圖譜采用高效液相色譜法，樣品前處理包括直接濾過取樣、以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或正丁醇提取后再濃縮等方法，使用C8或C18類型填料的色譜柱，以某比例(0.1～5％)的甲酸甲醇溶液、某比例(0.1～5％)的甲酸水溶液、甲醇、乙腈、水、等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，以梯度洗脫的方法分離，檢測波長在205～450nm范圍內，流速0.5～1.5ml/min，以齊墩果酸、蛻皮甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、綠原酸中部分品種作為特征指紋峰或內標物峰，標示出該品種注射液合計約8～12個共有峰，并分別說明了其藥材歸屬；含量測定采用高效液相色譜法，樣品前處理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法，一般使用C8或C18類型填料的色譜柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸或磷酸、庚烷磺酸鈉、二甲基甲烷等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，測定本品中蛻皮甾酮或齊墩果酸的含量，檢測波長在203～350nm范圍內。
8.按照權利要求6或7所述的脈絡寧注射制劑的質量控制方法，其特征在于該方法中對于牛膝的鑒別可以采用高效液相色譜法，樣品前處理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法，一般使用C8或C18類型填料的色譜柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸、庚烷磺酸鈉、二甲基甲烷等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，測定本品中的蛻皮甾酮或齊墩果酸，檢測波長在203～350nm范圍內；對于玄參的鑒別方法可采用高效液相色譜法，使用硅膠G或硅膠GF254或硅膠H為薄層板，點樣量為0.5～30ul之間某一體積，以玄參對照藥材、哈巴俄苷、肉桂酸中全部或部分品種作為對照品(藥材)，樣品前處理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法，一般使用C8或C18類型填料的色譜柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸、庚烷磺酸鈉、二甲基甲烷等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，測定本品中的哈巴俄苷或肉桂酸，檢測波長在203～350nm范圍內；對于金銀花的鑒別方法可以采用高效液相色譜法，使用硅膠G或硅膠GF254或硅膠H為薄層板，點樣量為0.5～30ul之間某一體積，以金銀花對照藥材、綠原酸中全部或部分品種作為對照品(藥材)，樣品前處理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法，一般使用C8或C18類型填料的色譜柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸或磷酸、庚烷磺酸鈉、二甲基甲烷等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，測定本品中的綠原酸，檢測波長在203～400nm范圍內；對于含量測定可以采用高效液相色譜法，樣品前處理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法，一般使用C8或C18類型填料的色譜柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸、庚烷磺酸鈉、二甲基甲烷等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，測定本品中哈巴俄苷或肉桂酸的含量，檢測波長在203～350nm范圍內；對于含量測定還可以采用高效液相色譜法，樣品前處理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再濃縮等方法，一般使用C8或C18類型填料的色譜柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸或磷酸、庚烷磺酸鈉、二甲基甲烷等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，測定本品中的綠原酸，檢測波長在203～400nm范圍內。
9.按照權利要求6或7所述的脈絡寧注射制劑的質量控制方法，其特征在于該方法應包括以下具體項目的全部或部分內容性狀本品應為無色至黃棕色澄明液體或粉末。鑒別牛膝采用薄層色譜法，使用硅膠G為薄層板，點樣量為0.5ul，蛻皮甾酮作為對照品，樣品前處理為醋酸乙酯提取后再濃縮，展開劑為氯仿-甲醇(11∶34)，氨氣熏后再置紫外光燈254下檢視，噴以2～30％硫酸乙醇，供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點；玄參采用薄層色譜法，一般使用硅膠G為薄層板，點樣量為0.7ul，以肉桂酸作為對照品，樣品前為直接點樣，展開劑為丙酮-二氯甲烷-醋酸乙酯(2∶54∶13)，供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點；石斛采用薄層色譜法，使用硅膠G為薄層板，點樣量為1.0ul，以石斛對照藥材作為對照，樣品前處理為乙醇提取后再濃縮，展開劑可以為氯仿-丙酮-甲酸(5∶27∶10)紫外光燈(365nm)下檢視，供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點；金銀花采用薄層色譜法，用硅膠G為薄層板，點樣量為0.5ul之間某一體積，以綠原酸為對照品，直接點樣，展開劑為醋酸丁酯-氯仿-水(20∶13∶2)，供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點；檢查包括pH值、裝量差異、澄明度、無菌、不溶性微粒、蛋白質、鞣質、樹脂、草酸鹽、鉀離子、重金屬、砷鹽、農藥殘留等項目或部分項目，具體檢測方法與中國藥典附錄收載的保持一致，另外關于鉀離子、重金屬、砷鹽的檢測方法還包括以微波消解法處理樣品，進而采用原子吸收法、等離子發(fā)射光譜(ICP-AES)或電感耦合等離子質譜(ICP-MS)法進行測定的方法；其中(1)pH值在4～9之間，或其中部分范圍；(2)重金屬不得過百萬分之二十；(3)砷鹽不得過百萬分之二；(4)有機氯農藥殘留總量不得過百萬分之一；指紋圖譜采用高效液相色譜法，樣品前處理包括直接濾過取樣、以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或正丁醇提取后再濃縮等方法，使用C8或C18類型填料的色譜柱，以某比例(0.1～5％)的甲酸甲醇溶液、某比例(0.1～5％)的甲酸水溶液、甲醇、乙腈、水、等其中部分品種溶劑在合適比例條件下為流動相，以梯度洗脫的方法分離，檢測波長在205～450nm范圍內，流速0.5～1.5ml/min，以齊墩果酸、蛻皮甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、綠原酸中部分品種作為特征指紋峰或內標物峰，標示出該品種注射液合計約8～12個共有峰，并分別說明了其藥材歸屬；含量測定采用高效液相色譜法，樣品前處理為醋酸乙酯提取后再濃縮，使用C18類型填料的色譜柱，以甲醇-水(23∶14)為流動相，蛻皮甾酮作為對照品，檢測波長為243nm，測定供試品中蛻皮甾酮含量。
10.按照權利要求6或7所述的脈絡寧注射制劑的質量控制方法，其特征在于對于牛膝的鑒別方法采用高效液相色譜法，樣品前處理為醋酸乙酯提取后再濃縮，使用C18類型填料的色譜柱，以甲醇-水(23∶14)為流動相，蛻皮甾酮作為對照品，檢測波長為243nm，供試品色譜中，與對照品色譜相同時間處，出相同色譜峰；對于玄參的鑒別方法采用高效液相色譜法，使用硅膠G為薄層板，點樣量為1.0ul，以石斛對照藥材作為對照，樣品前處理為乙醇提取后再濃縮，C18類型填料的色譜柱，以甲醇-乙腈(32∶17)為流動相，以肉桂酸作為對照品，檢測波長278nm，供試品色譜中，與對照品色譜相同時間處，出相同色譜峰；對于金銀花的鑒別方法采用高效液相色譜法，用硅膠G為薄層板，點樣量為0.5ul之間某一體積，以綠原酸為對照品，直接點樣，使用C18類型填料的色譜柱，以甲醇-水(10∶21)為流動相，以綠原酸為對照品，檢測波長324nm范圍內供試品色譜中，與對照品色譜相同時間處，出相同色譜峰；在進行含量測定中可以采用高效液相色譜法，樣品前處理為醋酸乙酯提取后再濃縮，使用C18類型填料的色譜柱，以甲醇-乙腈(32∶17)為流動相，檢測波長278nm，以肉桂酸作為對照品，測定供試品中，測定肉桂酸的含量；或者采用高效液相色譜法，樣品前處理為醋酸乙酯提取后再濃縮，使用C18類型填料的色譜柱，以甲醇-水(10∶21)為流動相，以綠原酸為對照品，檢測波長324nm，測定供試品中綠原酸的含量。
全文摘要
本發(fā)明是一種脈絡寧注射制劑及其制備方法和它的質量控制方法，脈絡寧注射制劑由金銀花、牛膝、玄參、石斛制備成，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明將脈絡寧注射液冷凍干燥為凍干粉針，有效解決了注射液貯存過程中的穩(wěn)定性問題，本發(fā)明具有養(yǎng)陰清熱、補益肝腎、活血化瘀的功效，可以治療脈管炎、腦血栓及其后遺癥等血栓閉塞性疾?。慌R床上還用于治療冠心病心絞痛、動脈硬化癥、糖尿病足壞死、新生兒硬腫癥、突發(fā)性耳聾等疾??；本發(fā)明提供的質量控制方法能更好的控制這種中藥注射制劑的產品質量，保證用藥的安全性。
文檔編號A61P9/00GK1679648SQ200410022289
公開日2005年10月12日 申請日期2004年4月9日 優(yōu)先權日2004年4月9日
發(fā)明者于文勇 申請人:北京奇源益德藥物研究所