本發(fā)明涉及一種亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖及其制劑的制備方法，屬于中藥制藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

銀杏外種皮，俗稱白果衣，我們?cè)趯?duì)銀杏外種皮進(jìn)行綜合研究的過程中首先提取分離得到了銀杏外種皮多糖（Ginkgo biloba exocarp polysaccharide，GBEP），并發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有直接抑制作用，而且還具有免疫促進(jìn)等藥理學(xué)活性，其膠囊制劑曾作為醫(yī)院制劑在臨床應(yīng)用于腫瘤患者多年。但用傳統(tǒng)工藝（ZL00134363.7）制備的GBEP由于水溶性問題而限制了液體劑型的選擇，例如不宜制備口服液；在制備過程中于乙醇沉淀前對(duì)濃縮液采用鹽溶液處理可以去除一些難溶性物質(zhì)，增加提取物水溶液的澄明度，但后續(xù)要進(jìn)行透析處理（ZL201010251068.9），因而顯著延長了制備時(shí)間，也增加了經(jīng)濟(jì)成本。如何改進(jìn)工藝、減少工序進(jìn)而達(dá)到提高GBEP溶解性的目的，一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員努力解決的技術(shù)難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖及其制劑的制備方法。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖的制備方法，包括以下步驟：

（1）將被乙醇浸泡過的銀杏外種皮置于煮提鍋中常規(guī)加水煎煮 2 - 3 次并分別過濾，將濾液合并減壓濃縮至比重在 1.21 – 1.30，將乙醇緩慢加入濃縮液中，使乙醇終濃度在60 - 80%（V/V），邊加邊快速攪動(dòng)，靜置后將沉淀物再用高濃度乙醇洗滌數(shù)次后真空干燥或冷凍干燥，得銀杏外種皮多糖粗粉；

（2）開啟氣流粉碎機(jī)，調(diào)節(jié)分級(jí)機(jī)頻率為25-50Hz，啟動(dòng)引風(fēng)機(jī)，待風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)平衡后，打開空氣壓縮機(jī)，壓縮空氣冷卻、除水除油后送至貯氣罐，待貯氣罐中空氣壓力達(dá)0.4MPa時(shí)，將銀杏外種皮多糖粗粉以1.0-3.0kg/h的速度進(jìn)料，進(jìn)料結(jié)束后在進(jìn)氣壓力為0.7MPa下粉碎5-30min，重復(fù)2-5次，即可得到亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖制劑的制備方法，其特征是將上述方法制備的亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖加入少量賦型劑或矯味劑和防腐劑制成抗腫瘤膠囊制劑或抗腫瘤口服液制劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提取、分離的工序少，采用氣流粉碎機(jī)對(duì)銀杏外種皮多糖粗粉進(jìn)行粉碎，由于氣流超細(xì)粉碎的壓縮氣體是在絕熱膨脹下進(jìn)行,在低溫或室溫狀態(tài)下皆可進(jìn)行粉碎,速度快,瞬間即可完成，一般不改變粉體的活性成分。經(jīng)過粉碎后的銀杏外種皮多糖粒徑達(dá)到亞微米級(jí)，藥理活性增強(qiáng)，效價(jià)強(qiáng)度提高，且其水溶液穩(wěn)定，除了可制成固體劑型，還可直接制成液體劑型。該方法操作簡(jiǎn)單,適合工業(yè)化大生產(chǎn)。

1、粒徑測(cè)定

精密稱取粉碎前和粉碎后的GBEP各2.5mg，分別溶于蒸餾水，定容至50 ml，得到濃度為50 μg/mL的GBEP水溶液。取該水溶液置于具塞試管中，超聲20min后，采用馬爾文激光粒度儀，測(cè)定粒徑。結(jié)果顯示，粉碎前的銀杏外種皮多糖粗粉的粒徑為1.5-2.0μm，而采用該方法制得的銀杏外種皮多糖粒徑達(dá)到亞微米級(jí)，為200-300nm。

2、水溶性測(cè)定

粉碎前的GBEP在1.5%（W/V）濃度下肉眼觀察完全溶解于水，而粉碎后的GBEP在2.0%（W/V）濃度下肉眼觀察完全溶解于水，提示水溶性提高。

3、ζ電位測(cè)定

精密稱取粉碎前和粉碎后的GBEP各2.5mg，分別溶于蒸餾水，定容至50 ml，得到濃度為50 μg/mL的GBEP水溶液。取50μg/mL的GBEP水溶液置于具塞試管中，超聲20min后，采用馬爾文激光粒度儀，測(cè)定ζ電位。結(jié)果顯示，粉碎前的銀杏外種皮多糖ζ電位為(-14)-(-11) mV，而采用該方法制得的銀杏外種皮多糖ζ電位為(-26)-(-24) mV，提示粉碎后的銀杏外種皮多糖水溶液更穩(wěn)定。

4、肽多糖含量的測(cè)定

采用苯酚硫酸法測(cè)多糖含量：精密稱取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品適量，用蒸餾水配成1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，再進(jìn)一步稀釋為不同濃度。精密量取濃度為30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、150μg/ml、180μg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5ml于6支10ml具塞試管中，加入50mg/ml的重蒸酚溶液1ml，混合均勻后，加入5ml濃硫酸，混合均勻，沸水浴15min，冷水浴30min。用紫外分光光度計(jì)于490nm處測(cè)定吸光度，對(duì)葡萄糖溶液濃度和吸光度進(jìn)行線性回歸，建立回歸方程。取供試品溶液0.5ml，按上述操作測(cè)吸光度值，代入回歸方程，計(jì)算出多糖含量。

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量：精密稱取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品適量，用蒸餾水配成100μg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，再進(jìn)一步稀釋為不同濃度。精密量取濃度為20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5ml分別于5支10ml具塞試管，再加入2.5ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻后，放置5～10min，待其充分反應(yīng)后，用紫外分光光度計(jì)于595nm處測(cè)定吸光度，對(duì)牛血清白蛋白溶液濃度和吸光度進(jìn)行線性回歸，建立回歸方程。取供試品溶液0.5ml，按上述操作測(cè)吸光度值，代入回歸方程，計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。

采用紅外光譜分析儀進(jìn)行定性分析。結(jié)果顯示銀杏外種皮多糖含酰胺鍵，提示為肽多糖。肽多糖含量%=(多糖含量+蛋白質(zhì)含量)%。

粉碎前的銀杏外種皮多糖其多糖含量為36%、蛋白質(zhì)含量為28%，所以肽多糖含量為36%+28%=64%。采用該方法制得的亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖其多糖含量為38%、蛋白質(zhì)含量為27%，所以肽多糖含量為38%+27%=65%，提示粉碎前后銀杏外種皮多糖抗腫瘤有效部位含量基本保持不變。

5、藥效研究

取處于對(duì)數(shù)生長期的B16細(xì)胞，用胰蛋白酶消化、Hank’s液洗滌后，用含10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞至1×10⁵/ml。向96孔培養(yǎng)板各孔中分別加入上述細(xì)胞懸液100μl，在5%CO₂、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入用含10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液配制的不同濃度的樣品各100μl，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h加入MTT（終濃度5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液，加入酸化異丙醇，振蕩10min，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定各孔的OD值。按公式“抑制率=(1-藥物孔OD值/對(duì)照孔OD值)×100%”，計(jì)算體外對(duì)B16細(xì)胞增殖的抑制率。結(jié)果見表1。

表1 銀杏外種皮多糖對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用

表1結(jié)果顯示，銀杏外種皮多糖在10-320μg/ml劑量下對(duì)黑色素瘤細(xì)胞具有直接抑制作用，隨著劑量增加，其抑制作用也逐漸增強(qiáng)。而且，粉碎后的銀杏外種皮多糖的半數(shù)抑制濃度IC₅₀（μg/ml）顯著低于粉碎前的，說明效價(jià)強(qiáng)度更高。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

取被乙醇浸泡過的干銀杏外種皮50千克，置于煮提鍋中加水1000千克煎煮，當(dāng)煎煮液達(dá)95℃時(shí)維持煎煮1小時(shí)，過濾后繼續(xù)加水重復(fù)上述煎煮方法1 次并過濾，將2次的濾液合并，于70℃減壓濃縮至比重為1.21，將95％的乙醇緩慢加入濃縮液中，使乙醇終濃度為60％，邊加邊快速攪動(dòng)，靜置6小時(shí)后將沉淀物離心甩干，再用高濃度乙醇（體積濃度98%以上）洗滌2次后真空干燥或冷凍干燥，得到銀杏外種皮多糖粗粉。開啟氣流粉碎機(jī)，將分級(jí)機(jī)頻率設(shè)為40Hz，啟動(dòng)引風(fēng)機(jī)和空氣壓縮機(jī)，待貯氣罐中空氣壓力達(dá)0.4MPa時(shí)，取銀杏外種皮多糖粗粉800g，以1.0kg/h的速度進(jìn)料。加料結(jié)束后在進(jìn)氣壓力為0.7MPa下粉碎5min，重復(fù)3次。制得的亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖粒徑為235.0nm，在2.0%（W/V）濃度下肉眼觀察完全溶解于水，ζ電位為-25.9mV。采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分別檢測(cè)其多糖及蛋白質(zhì)含量，結(jié)果分別為38%及27%，肽多糖總含量為65%。采用MTT法體外檢測(cè)對(duì)B16細(xì)胞增殖的影響，接種細(xì)胞24h后加入不同濃度的亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖，繼續(xù)培養(yǎng)48h檢測(cè)。結(jié)果顯示，亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖終濃度在320μg/ml，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制B16黑色素瘤細(xì)胞生長，且隨著劑量增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，抑制率（%）分別76，69，55，47，33及21，半數(shù)抑制濃度IC₅₀（μg/ml）為103.9。取亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖干粉100g，加入賦型劑50g，拌勻，按每粒150mg裝入空心膠囊，制成亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖膠囊制劑。

實(shí)施例2

取被乙醇浸泡過的干銀杏外種皮100千克，置于煮提鍋中加水1500千克煎煮，當(dāng)煎煮液達(dá)98℃時(shí)維持煎煮0.5小時(shí)，過濾后繼續(xù)加水重復(fù)上述煎煮方法2 次并過濾，將3次的濾液合并，于70℃減壓濃縮至比重為1.30，將95％的乙醇緩慢加入濃縮液中，使乙醇終濃度在70％，邊加邊快速攪動(dòng)，靜置10小時(shí)后 將沉淀物離心甩干，再用高濃度乙醇洗滌3次后真空干燥或冷凍干燥，得到銀杏外種皮多糖粗粉。開啟氣流粉碎機(jī)，將分級(jí)機(jī)頻率設(shè)為50Hz，啟動(dòng)引風(fēng)機(jī)和空氣壓縮機(jī)，待貯氣罐中空氣壓力達(dá)0.4MPa時(shí)，取銀杏外種皮多糖粗粉1500g，以3.0kg/h的速度進(jìn)料。加料結(jié)束后在進(jìn)氣壓力為0.7MPa下粉碎20min，重復(fù)5次。制得的亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖粒徑為261.5nm，在2.0%（W/V）濃度下肉眼觀察完全溶解于水，ζ電位為-24.4mV。采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分別檢測(cè)其多糖及蛋白質(zhì)含量，結(jié)果分別為36%及25%，肽多糖總含量為61%。采用MTT法體外檢測(cè)對(duì)B16細(xì)胞增殖的影響，接種細(xì)胞24h后加入不同濃度的亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖，繼續(xù)培養(yǎng)48h檢測(cè)。結(jié)果顯示，亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖終濃度在320μg/ml，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制B16黑色素瘤細(xì)胞生長，且隨著劑量增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，抑制率（%）分別為73，68，54，46，32及20，半數(shù)抑制濃度IC₅₀（μg/ml）為112.8。取亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖干粉100g溶解于純凈水中，按藥物質(zhì)量要求加入適量矯味劑及防腐劑，搖勻，按10ml規(guī)格裝瓶，制成亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖口服液制劑。

實(shí)施例3

取被乙醇浸泡過的干銀杏外種皮80千克，置于煮提鍋中加水1500千克煎煮，當(dāng)煎煮液達(dá)99℃時(shí)維持煎煮0.5-1小時(shí)，過濾后繼續(xù)加水重復(fù)上述煎煮方法2-3 次并過濾，將數(shù)次的濾液合并，于70℃減壓濃縮至比重為1.25，將90％的乙醇緩慢加入濃縮液中，使乙醇終濃度在80％，邊加邊快速攪動(dòng)，靜置8小時(shí)后將沉淀物離心甩干，再用高濃度乙醇洗滌2次后真空干燥或冷凍干燥，得到銀杏外種皮多糖粗粉。開啟氣流粉碎機(jī)，將分級(jí)機(jī)頻率設(shè)為25Hz，啟動(dòng)引風(fēng)機(jī)和空氣壓縮機(jī)，待貯氣罐中空氣壓力達(dá)0.4MPa時(shí)，取銀杏外種皮多糖粗粉500g，以2.0kg/h的速度進(jìn)料。加料結(jié)束后在進(jìn)氣壓力為0.7MPa下粉碎30min，重復(fù)2次。制得的亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖粒徑為249.5nm，在2.0%（W/V）濃度下肉眼觀察完全溶解于水，ζ電位為-25.4mV。采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分別檢測(cè)其多糖及蛋白質(zhì)含量，結(jié)果分別為36%及27%，肽多糖總含量為63%。采用MTT法體外檢測(cè)對(duì)B16細(xì)胞增殖的影響，接種細(xì)胞24h后加入不同濃度的亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖，繼續(xù)培養(yǎng)48h檢測(cè)。結(jié)果顯示，亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖終濃度在320μg/ml，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制B16黑色素瘤細(xì)胞生長，且隨著劑量增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，抑制率（%）分別為75，69，54，47，32及21，半數(shù)抑制濃度IC₅₀（μg/ml）為107.2。取亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖干粉200g溶解于純凈水中，按藥物質(zhì)量要求加入適量矯味劑及防腐劑，搖勻，按5ml規(guī)格裝瓶，制成亞微米級(jí)銀杏外種皮多糖口服液制劑。