專利名稱：氨基酸負(fù)載的三苯甲醇樹脂，其生產(chǎn)方法，及其應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
存在各種使用固相肽合成以構(gòu)造具有生物活性的肽和其它治療劑的技術(shù)。目前，用于構(gòu)造肽的可選樹脂是在1％DVB聚苯乙烯上的氯三苯甲基氯接頭。這些樹脂已知為CTC樹脂和是水分敏感的且非常昂貴。2’CTC可以在$13,500/Kg價(jià)格下以100g規(guī)模購(gòu)自ArgonautTechnologies，Inc.(Argonaut樹脂和試劑目錄，2002第170頁(yè))。然而，肽治療的進(jìn)步要求更大、合理定價(jià)數(shù)量的樹脂以合成商業(yè)數(shù)量的治療肽，生物活性物質(zhì)，和成本有效的CTC樹脂替代物。
雖然CTC樹脂的高成本和此肽構(gòu)造平臺(tái)的其它缺點(diǎn)，本領(lǐng)域已嘗試改進(jìn)制備CTC固體載體的技術(shù)。參見(jiàn)，The Advanced Chem TechHandbook，William D.Bennett等人，1998，第341頁(yè)，該處建議對(duì)亞硫酰氯(SOCl2)使用2eq.的吡啶。吡啶具有毒性和惡臭氣味。Orosz等人報(bào)導(dǎo)了過(guò)量三甲基甲硅烷基氯和二甲亞砜的使用和隨后采用AcCl的處理。參見(jiàn)，Orsoz等人，Tetrahedron Letters 39(1998)3241-3242。Orsoz工藝昂貴。也要求廣泛洗滌以除去二甲亞砜(DMSO)殘余物。Harre等人公開了采用過(guò)量N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和接著二氯甲烷(DCM)洗滌樹脂和然后采用SOCl2處理。Harre也指出與此特定反應(yīng)相關(guān)的問(wèn)題。參見(jiàn)，Harre等人，Reactive and Functional Polymers，41(1999)111-114。Sanghvi等人(US6239220)在實(shí)施例1中公開了使用乙酰氯(AcCl)的二甲氧基三苯甲醇向二甲氧基三苯甲基氯的轉(zhuǎn)化。
US專利No.5,563,220的實(shí)施例2描述了2-氯苯甲酰氯的過(guò)夜使用以形成酮樹脂，隨后將該酮樹脂轉(zhuǎn)化成醇樹脂。通過(guò)采用乙酰氯的處理將醇樹脂轉(zhuǎn)化成氯化物形式。這些工藝要求預(yù)先CTC樹脂在其上負(fù)載氨基酸。本領(lǐng)域需要在生物活性物質(zhì)和肽治療劑產(chǎn)生中消除CTC樹脂的使用的工藝。
申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)一種生產(chǎn)固體負(fù)載的氨基酸樹脂的方法，該方法克服了本領(lǐng)域中存在的問(wèn)題且滿足有效生產(chǎn)大規(guī)模數(shù)量的堅(jiān)強(qiáng)工藝的要求。此外，與使用CTC負(fù)載的樹脂的方法相比，本發(fā)明的方法導(dǎo)致基本降低的循環(huán)時(shí)間，降低的原材料使用量和避免了與水分敏感固體相關(guān)的處理問(wèn)題，且在一個(gè)變化方案中，完全消除了CTC樹脂的使用。
在本發(fā)明之前，在非親核堿如二異丙基乙胺存在下，通過(guò)接觸CTC樹脂與N-保護(hù)的氨基酸，如FMOC-亮氨酸，用第一氨基酸負(fù)載初始樹脂。DCM是典型的選擇溶劑。此負(fù)載導(dǎo)致了通過(guò)2’氯三苯甲基連接到樹脂上的初始氨基酸。僅在CTC中引入用于生產(chǎn)氯化物的水分敏感和昂貴物質(zhì)，以活化樹脂從而與氨基酸反應(yīng)。先前教導(dǎo)的是必須將氯三苯甲基樹脂轉(zhuǎn)化成氯化物形式用于負(fù)載(US5198531)。本領(lǐng)域沒(méi)有教導(dǎo)或清楚地提出聚合物結(jié)合的取代或未取代三苯甲醇的直接負(fù)載。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供制備沒(méi)有氯三苯甲基氯接頭-樹脂的生物活性物質(zhì)或治療劑的方法。該方法包括反應(yīng)活化的N-保護(hù)氨基酸或活化的氨基酸衍生物與取代或未取代的三苯甲醇樹脂，以獲得樹脂-CT-AA產(chǎn)物；解保護(hù)，和然后反應(yīng)樹脂-CT-AA產(chǎn)物與生物活性物質(zhì)或治療劑的其它構(gòu)件，以獲得該生物活性物質(zhì)或治療劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，也在此提供由本方法產(chǎn)生的產(chǎn)物。在仍然進(jìn)一步的變化方案中，提供用于產(chǎn)生治療或其它生物活性物質(zhì)的底物。
本發(fā)明的這些和其它目的從發(fā)明詳述，和從說(shuō)明書的其它部分來(lái)看是顯然的。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種生產(chǎn)固體負(fù)載的氨基酸樹脂的方法，該方法克服了本領(lǐng)域中存在的問(wèn)題和滿足有效生產(chǎn)大規(guī)模數(shù)量的堅(jiān)強(qiáng)工藝的要求。此外，與使用CTC負(fù)載的樹脂的方法相比，本發(fā)明的方法導(dǎo)致基本降低的循環(huán)時(shí)間，降低的原材料使用和降低的處理問(wèn)題。本發(fā)明的許多優(yōu)點(diǎn)和獲得的測(cè)試結(jié)果是不可預(yù)料的。
在一個(gè)變化方案中，本發(fā)明提供沒(méi)有氯三苯甲基氯接頭-樹脂或其它含鹵素接頭-樹脂的生物活性物質(zhì)或治療劑的方法。該方法包括反應(yīng)活化的N-保護(hù)氨基酸或活化的氨基酸衍生物與取代或未取代的三苯甲醇樹脂，以獲得樹脂-CT-AA-PG(“保護(hù)基團(tuán)”)產(chǎn)物。將樹脂-CT-AA-PG產(chǎn)物解保護(hù)和與生物活性物質(zhì)或治療劑的其它所需構(gòu)件反應(yīng)，以獲得生物活性物質(zhì)或治療劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，N-保護(hù)的活化氨基酸選自氨基酸酰氯、氨基酸酰氟、氨基酸酰溴、氨基酸混合酸酐、氨基酸活化酯、包含鹵素的氨基酸，和優(yōu)選FMOC-氨基酸酰氯。用于本發(fā)明的取代或未取代三苯甲醇樹脂包括氯三苯甲醇樹脂、甲氧基三苯甲醇樹脂、二甲氧基三苯甲醇樹脂、乙氧基三苯甲醇樹脂、和/或二甲氧基三苯甲醇樹脂。作為例子，氯三苯甲醇樹脂是2’氯三苯甲醇樹脂。
在進(jìn)一步的方面，理解在此所述的方法可包括進(jìn)行工藝步驟以使得該方法具有FDA順應(yīng)性。各種FDA順應(yīng)性獲得步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在另一個(gè)變化方案中，本發(fā)明提供由在此所述的方法產(chǎn)生的產(chǎn)物。理解由于在此所述方法的優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)產(chǎn)生在此所述的治療劑或生物活性物質(zhì)時(shí)，有氨基酸或氨基酸衍生物使用量的顯著和不可預(yù)料的降低。此外，由于使用在此所述的方法降低了循環(huán)時(shí)間，可以在更短的時(shí)間期間內(nèi)產(chǎn)生更多的藥劑或物質(zhì)。
在仍然另一方面，本發(fā)明包括一種制備底物的方法，在該底物上可以產(chǎn)生治療劑或其它生物活性物質(zhì)。該方法包括反應(yīng)活化氨基酸或其衍生物與取代或未取代的三苯甲醇樹脂以獲得樹脂-CT-AA產(chǎn)物。樹脂-CT-AA產(chǎn)物然后用作其它所需組分加成的底物，該其它所需組分包括其它氨基酸、或在此所述的其它組分。
在仍然另一方面，本發(fā)明提供一種形成樹脂-CT-AA產(chǎn)物的方法。此樹脂是水分穩(wěn)定的和由于它要求較少的生產(chǎn)步驟，其較不昂貴。與CTC樹脂方法相比，該方法也產(chǎn)生較少的廢物。描述了從中間體2’氯三苯甲醇樹脂直接生產(chǎn)負(fù)載樹脂的方法。典型地，為將結(jié)合醇到氨基酸上，人們會(huì)使用偶合劑如DIC、DCC、HBTU、TATU、PyBOP或其它偶合劑。這些活化劑昂貴，可能是危險(xiǎn)和大體積的，減緩或停止與受阻三苯甲醇基團(tuán)的反應(yīng)。在非親核堿存在下通過(guò)使用FMOC-氨基酸酰氯，可以將氨基酸直接結(jié)合到醇樹脂上。氨基酸酰氯可購(gòu)自Advanced Chem Tech(Louisville，KY)或可以容易地由常規(guī)技術(shù)制備。
固體負(fù)載的2’三苯甲醇可以從Aldrich Chemical購(gòu)得，或它可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法合成。參見(jiàn)例如Orsoz等人，TetrahedronLetters(39)1998的3241-3241頁(yè)，其中可以采用苯甲酰氯和路易斯酸催化劑，將交聯(lián)的聚苯乙烯珠粒轉(zhuǎn)化成聚合物負(fù)載的二苯酮。然后采用苯基鋰將獲得的二苯酮官能度轉(zhuǎn)變成三苯甲醇官能度。然后通過(guò)本發(fā)明的方法準(zhǔn)備將固體負(fù)載的三苯甲醇轉(zhuǎn)化成氨基酸負(fù)載的樹脂。
固體負(fù)載的三苯甲醇可以是取代或未取代的。取代基包括，但不限于鹵素，鹵素包括但不限于氯、溴和氟；取代或未取代的烷氧基，該烷氧基包括但不限于乙氧基、甲氧基、丙氧基、亞甲氧基、亞乙氧基、乙二醇、和丙二醇；取代或未取代的烷基聚醚基團(tuán)，該聚醚基團(tuán)包括但不限于二甘醇、二丙二醇、三甘醇、和三丙二醇；取代或未取代的含有1-6個(gè)碳原子的低級(jí)烷基，該低級(jí)烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、和三氟甲基；取代或未取代的芳基，該芳基包括但不限于苯基、芐基、甲苯基、甲氧基苯基、和氯苯基、取代或未取代的雜芳基、和取代或未取代的環(huán)烷烴。
用于本發(fā)明實(shí)施的非親核堿化合物包括，但不限于二異丙基乙胺(DIEA)、三乙胺、吡啶、2，4，6-可力丁、DMAP、苯基二甲胺、其它取代胺及其混合物。更優(yōu)選的非親核堿化合物是二異丙基乙胺(DIEA)、三乙胺、和吡啶及其混合物。最優(yōu)選的非親核堿化合物是三乙胺。
含酰胺的催化劑化合物的優(yōu)選范圍是0.5-10.00eq，更優(yōu)選的范圍是0.7-5eq，和最優(yōu)選的范圍是1-3eq。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，消除昂貴的樹脂官能化步驟和相關(guān)的洗滌步驟。此方法也采用具有更長(zhǎng)存放期的水分穩(wěn)定和較不昂貴樹脂，替換具有有限存放期的水分敏感樹脂的使用。因此，在此所述的方法提供相對(duì)于常規(guī)樹脂顯示更長(zhǎng)，優(yōu)異存放期的負(fù)載樹脂。理解本發(fā)明的這些優(yōu)點(diǎn)是不可預(yù)料的。
典型地在負(fù)載之后封端肽樹脂。這可以采用甲醇進(jìn)行，得到取代或未取代的三苯甲基甲基酯。其進(jìn)行以防止新肽鏈的基團(tuán)(該基團(tuán)不被第一氨基酸酯化)和破壞產(chǎn)物純度。采用本發(fā)明的較不反應(yīng)性CTOH樹脂允許構(gòu)造肽而不采用甲醇封端。在本發(fā)明的一個(gè)變化方案中，由于CTOH是頗為受阻，不活化，和不與典型的大體積活化(DCC、HBTU、PyBOP等)氨基酸反應(yīng)，人們不需要進(jìn)行端封。這也使樹脂更為親水且增加在聚合物凝膠中肽/氨基酸的溶解度。在本發(fā)明的另一個(gè)變化方案中，其中發(fā)現(xiàn)殘余CTOH是反應(yīng)性的，非必要地采用乙酰氯、乙酸酐或其它所需的封端化合物將它封端。
理解本發(fā)明極大地影響樹脂的循環(huán)，和提供具有增加循環(huán)性的樹脂。如果與如下文獻(xiàn)中的新低空隙空間共聚物結(jié)合甚至更極大地提供此優(yōu)點(diǎn)Bohling等人，2002年8月16日提交的，題目為“低空隙空間樹脂”(摘要號(hào)DN#A01406)的U.S.臨時(shí)專利申請(qǐng)系列No.60/404,045，該文獻(xiàn)如在此完全說(shuō)明的那樣引入作為參考。
典型地為循環(huán)此樹脂，人們采用在有機(jī)溶劑中的稀酸從樹脂斷裂肽。然后將獲得的三苯甲基碳正離子采用堿驟冷以得到CTOH樹脂，然后將該CTOH樹脂洗滌和采用SOCl2或AcCl處理以再生水分敏感的CTC。此方法概略于如完全說(shuō)明的那樣在此引入的US6239220B1，和討論于Harre等人(反應(yīng)性和官能聚合物41(1999)111-114)。此外，跳過(guò)氯化反應(yīng)和產(chǎn)生水分不敏感產(chǎn)物的益處，該方法也避免了斷裂封端甲氧基的要求，允許更溫和的斷裂條件和更高的循環(huán)產(chǎn)量。
可用于本發(fā)明，和負(fù)載在此處所述樹脂上的例示“氨基酸”是由NH2--CHR--COOH表示的化合物，其中R是H、脂族基團(tuán)、取代的脂族基團(tuán)、芳族基團(tuán)或取代的芳族基團(tuán)。在自然界中發(fā)現(xiàn)“天然氨基酸”。例子包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和組氨酸。R是氨基酸的側(cè)鏈。天然氨基酸側(cè)鏈的例子包括甲基(丙氨酸)、異丙基(纈氨酸)、仲丁基(異亮氨酸)、--CH2CH(--CH)2(亮氨酸)、芐基(苯基丙氨酸)、對(duì)羥基芐基(酪氨酸)、--CH2OH(絲氨酸)、CHOHCH3(蘇氨酸)、--CH2-3-吲哚基(色氨酸)、--CH2COOH(天冬氨酸)、CH2CH2COOH(谷氨酸)、--CH2C(O)NH2(天冬酰胺)、--CH2CH2C(O)NH2(谷氨酰胺)、--CHSSH(半胱氨酸)、CH2CH2SCH3(蛋氨酸)、--(CH2)4NH2(賴氨酸)、--(CH2)3NH2(鳥氨酸)、-[(CH)2]4NHC(.-dbd.NH)NH2(精氨酸)和--CH2-3-咪唑基(組氨酸)。丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的側(cè)鏈?zhǔn)侵宓?，即僅包含碳和氫，和每個(gè)在此稱為“天然氨基酸的脂族側(cè)鏈”。
可用于本發(fā)明的其它天然氨基酸的側(cè)鏈包括含雜原子的官能團(tuán)，如醇(絲氨酸、酪氨酸、羥脯氨酸和蘇氨酸)、胺(賴氨酸、鳥氨酸、組氨酸和精氨酸)、硫醇(半胱氨酸)或羧酸(天冬氨酸和谷氨酸)。當(dāng)改性含雜原子的官能團(tuán)以包括保護(hù)基團(tuán)時(shí)，該側(cè)鏈稱為氨基酸的“保護(hù)的側(cè)鏈”。
合適保護(hù)基團(tuán)的選擇依賴于被保護(hù)的官能團(tuán)，保護(hù)基團(tuán)曝露的條件和分子中可存在的其它官能團(tuán)。用于以上討論的官能團(tuán)的合適保護(hù)基團(tuán)描述于Greene和Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis(有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán))”，John Wiley & Sons(1991)，該文獻(xiàn)的整個(gè)教導(dǎo)內(nèi)容如在此完全說(shuō)明的那樣引入此說(shuō)明書作為參考。只使用常規(guī)試驗(yàn)，熟練技術(shù)人員可選擇用于公開的合成中的合適保護(hù)基團(tuán)，該保護(hù)基團(tuán)包括除如下描述的那些以外的保護(hù)基團(tuán)，以及用于施加和除去保護(hù)基團(tuán)的條件。
合適醇保護(hù)基團(tuán)的例子包括芐基、烯丙基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、乙酸酯等。合適氨基保護(hù)基團(tuán)的例子包括芐氧基羰基、叔丁氧基羰基、叔丁基、芐基和芴基甲氧基羰基(Fmoc)。叔丁氧基羰基是優(yōu)選的胺保護(hù)基團(tuán)。合適羧酸保護(hù)基團(tuán)的例子包括叔丁基、Fomc、甲基、甲氧基甲基、三甲基甲硅烷基、芐氧基甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基等。叔丁基是優(yōu)選的羧酸保護(hù)基團(tuán)。合適硫醇保護(hù)基團(tuán)的例子是S-芐基、S-叔丁基、S-乙?；?、S-甲氧基甲基、S-三苯甲基等。
賴氨酸、天冬氨酸和蘇氨酸是優(yōu)選在本發(fā)明一個(gè)變化方案中保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的例子。脂族基團(tuán)包括直鏈、支化C1-C8或環(huán)狀C3-C8烴，該烴是完全飽和的或包含一個(gè)或多個(gè)不飽和單元。在一個(gè)例子中，脂族基團(tuán)是C1-C4烷基。芳族基團(tuán)包括碳環(huán)芳族基團(tuán)如苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基和2-蒽基，雜環(huán)芳族基團(tuán)如N-咪唑基、2-咪唑、1-噻吩基、3-噻吩基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、2-吡喃基、3-吡喃基、3-吡唑基、4-吡唑基、5-吡唑基、2-吡嗪基、2-噻唑、4-噻唑、5-噻唑、2-噁唑基、4-噁唑基和5-噁唑基。
芳族基團(tuán)也包括稠合多環(huán)芳族環(huán)體系，其中碳環(huán)芳族環(huán)或雜芳基環(huán)稠合到一個(gè)或多個(gè)其它雜芳基環(huán)上。例子包括2-苯并噻吩基、3-苯并噻吩基、2-苯并呋喃基、3-苯并呋喃基、2-吲哚基、3-吲哚基、2-喹啉基、3-喹啉基、2-苯并噻唑、2-苯并噁唑、2-苯并咪唑、2-喹啉基、3-喹啉基、1-異喹啉基、3-喹啉基、1-異吲哚基、3-異吲哚基、和吖啶基。
芳族基團(tuán)和脂族基團(tuán)的合適取代基是與公開的反應(yīng)相容的那些，即不顯著降低反應(yīng)收率和不引起顯著量的副反應(yīng)。合適的取代基一般包括脂族基團(tuán)、取代的脂族基團(tuán)、芳基、鹵素、鹵代烷基(如三鹵代甲基)、硝基、腈、--CONHR、--CON(R)2、--OR、--SR、--S(O)R、--S(O)2R，其中每個(gè)R獨(dú)立地是脂族基團(tuán)、或芳基。盡管某些官能團(tuán)可能不與一個(gè)或多個(gè)公開的反應(yīng)相容，這些官能團(tuán)可以保護(hù)的形式存在。然后可除去保護(hù)基團(tuán)以再生原始官能團(tuán)。只使用常規(guī)試驗(yàn)，熟練技術(shù)人員能夠選擇與公開的反應(yīng)相容的保護(hù)基團(tuán)。
肽模擬物，或其組分也可用于本發(fā)明、如在此所述負(fù)載到樹脂上、或由在此所述的方法產(chǎn)生。肽模擬物是具有對(duì)肽足夠結(jié)構(gòu)相似性的化合物，使得由模擬物保持肽的所需性能。例如，用作治療HIV感染的蛋白酶抑制劑的肽模擬物，公開于Tung等人，WO94/05639、Vazquez等人，WO94/04491、Vazquez等人，WO94/10134和Vazquez等人，WO94/04493。這些公開文獻(xiàn)的完全相關(guān)教導(dǎo)在此引入作為參考。為用作藥物，肽模擬物應(yīng)當(dāng)保持肽的生物活性，但也具有一種或多種與被模擬的肽相比改進(jìn)的性能。例如，一些肽模擬物在體內(nèi)耐水解或降解。制備肽模擬物的一種策略是采用基團(tuán)替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，該基團(tuán)與被替換的氨基酸殘基結(jié)構(gòu)相關(guān)和可形成肽鍵?？捎糜谔鎿Q肽中氨基酸殘基的新氨基酸衍生物的開發(fā)會(huì)促進(jìn)新肽模擬物藥物的開發(fā)。
例示肽模擬物描述于Gabriel，Richard L.等人，2002年12月12日提交的，題目為“氨基酸衍生物及其制備方法”的美國(guó)專利申請(qǐng)系列No.20020188135。此專利申請(qǐng)如完全說(shuō)明的那樣在此引入作為參考。同樣用于本發(fā)明的是這些化合物的生理可接受鹽。例如，可以通過(guò)與合適的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸，如氯化氫、溴化氫、乙酸、高氯酸等反應(yīng)，獲得包含胺或其它堿性基團(tuán)的化合物鹽。含有季銨基團(tuán)的化合物也包含反荷陰離子(counteranion)如氯根、溴根、碘根、乙酸根、高氯酸根等。可以通過(guò)與合適的堿，例如氫氧化物堿反應(yīng)制備包含羧酸或其它酸性官能團(tuán)的化合物鹽。酸性官能團(tuán)的鹽包含反荷陽(yáng)離子(countercation)如鈉、鉀等。
本發(fā)明也用于治療劑和生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生和制造，該治療劑和生物活性物質(zhì)含有一個(gè)或多個(gè)肽、肽衍生物、或肽模擬物作為其構(gòu)件或組分。也可以由本發(fā)明產(chǎn)生由酯官能度終止的化合物或化合物片段。使用本發(fā)明制造或產(chǎn)生的治療劑可隨組合物的目的而廣泛地變化。藥劑可描述為單一實(shí)體或?qū)嶓w的結(jié)合。設(shè)計(jì)輸送系統(tǒng)以與具有高水溶性的治療劑或與具有低水溶性的那些一起使用，以生產(chǎn)具有受控釋放速率的輸送系統(tǒng)。術(shù)語(yǔ)“治療劑”和“生物活性物質(zhì)”非限制性地包括藥劑；維生素；礦物質(zhì)補(bǔ)充物；用于疾病或病情治療、預(yù)防、診斷、治愈或減輕的物質(zhì)；或影響身體結(jié)構(gòu)和功能的物質(zhì)；或藥物前體，在將其放置在預(yù)定的生理環(huán)境中之后它們變成生物活性的或更為活性的。
有用治療劑和生物活性物質(zhì)的例子包括如下擴(kuò)展的治療類別同化激素類藥、抗酸劑、抗哮喘劑、抗膽固醇劑和抗脂質(zhì)劑、抗凝血?jiǎng)?、抗驚厥劑、止瀉劑、止吐藥、抗感染劑、抗炎劑、抗躁狂劑、止惡心劑、抗腫瘤劑、抗肥胖劑、解熱劑和止痛劑、鎮(zhèn)痙劑、抗血栓劑、抗尿血?jiǎng)⒖剐慕g痛藥、抗組胺劑、鎮(zhèn)咳藥、食欲抑制劑、生物制劑、腦擴(kuò)張劑、冠狀擴(kuò)張劑、減充血?jiǎng)⒗騽?、診斷劑、紅細(xì)胞生成劑、祛痰劑、胃腸鎮(zhèn)靜劑、促血糖增高劑、催眠劑、降血糖劑、離子交換樹脂、緩瀉劑、礦物質(zhì)補(bǔ)充物、粘液溶解劑、神經(jīng)肌肉藥物、末梢血管擴(kuò)張藥、精神藥物、鎮(zhèn)靜劑、刺激劑、甲狀腺粉和抗甲狀腺劑、子宮松弛劑、維生素、抗原材料、和藥物前體。
有用治療劑和生物活性物質(zhì)的其它例子也包括(a)抗腫瘤劑、抗代謝物、細(xì)胞毒素劑、免疫調(diào)節(jié)劑；(b)鎮(zhèn)咳藥；(c)抗組胺劑；(d)減充血?jiǎng)?e)各種生物堿；(f)抗心律不齊藥；(g)解熱藥；(h)食欲抑制劑；(i)祛痰劑；(j)抗酸劑；(k)生物制劑如肽、多肽、蛋白質(zhì)和氨基酸、激素、干擾素或細(xì)胞因子和其它生物活性肽化合物，如HGH、tPA、降鈣素、ANF、EPO和胰島素；(l)抗感染劑如抗真菌劑、抗病毒劑、抗菌劑和抗生素；和(m)抗原材料，特別是在疫苗應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)的那些。
治療劑或生物活性物質(zhì)可非必要地包括含DNA或RNA的生物活性物質(zhì)、含多糖的生物活性物質(zhì)、生長(zhǎng)因子、激素、血管生成抑制劑、干擾素或細(xì)胞因子、和藥物前體。以治療有效的數(shù)量使用在此所述方法產(chǎn)生的治療劑。盡管治療劑的有效量依賴于使用的特定材料，約1％-約65％的治療劑數(shù)量是有用的?？梢允褂酶』蚋蟮臄?shù)量以達(dá)到某些治療劑治療的有效水平。
實(shí)施例1表面官能化交聯(lián)珠粒由Fmoc-L-亮氨酸酰氯的負(fù)載將根據(jù)Bohling等人，2002年8月16日提交的，題目為“用于固相合成的樹脂(DN# A010407)”的U.S.臨時(shí)專利申請(qǐng)系列No.60/404,044生產(chǎn)的2-氯三苯甲醇樹脂，該文獻(xiàn)如完全說(shuō)明的那樣在此引入作為參考，采用Fmoc-L-亮氨酸負(fù)載，采用甲醇處理以除去殘余的溶劑并干燥。重量增量用于定量化負(fù)載。假定樹脂的能力是1.3mmol/g。將一部分樹脂采用1％TFA/DCM斷裂，并由HPLC分析溶液以確定氨基酸的斷裂收率(回收率)。
將每個(gè)樹脂樣品(1.0000+/-0.05g)稱重加入含有側(cè)口和可除去盤的60mL玻璃合成器容器。采用二氯甲烷(DCM)預(yù)溶脹合成器中的樹脂。排出DCM和向每個(gè)合成器中加入Fmoc-L-Leu-Cl和二異丙基乙胺(DIEA)在10ml DCM中的溶液。開始緩慢的氮?dú)鈹嚢琛Ｃ總€(gè)樣品，分別地以克計(jì)的Fmoc-L-Leu-OH數(shù)量是0.358，和以mL計(jì)的DIEA數(shù)量是0.177。使每個(gè)混合物在環(huán)境溫度下反應(yīng)兩小時(shí)，然后將溶液排出。如需要，采用在DCM(10mL)中的DIEA(1mL)和乙酰氯(2mL)處理至少30分鐘，而將任何剩余的三苯甲醇端基封閉。將每個(gè)樹脂樣品采用5×10mL部分的DCM洗滌和轉(zhuǎn)移到配衡的30mL多孔玻璃漏斗中，然后采用另外2×10mL部分的DCM洗滌。然后將每個(gè)負(fù)載的樹脂采用4×10mL部分的異丙醇(IPA)解溶脹和由如下方式部分干燥采用真空通過(guò)濾餅拉動(dòng)空氣，然后在真空烘箱中在30℃下干燥過(guò)濾器和樹脂過(guò)夜。然后將過(guò)濾器和樹脂再稱重和計(jì)算質(zhì)量的差異。Leu的質(zhì)量＝最終重量-(過(guò)濾器皮重+1.000g樹脂)。
T-20實(shí)施例此實(shí)施例描述已知為T-20的肽的十個(gè)肽片段制備，該肽于U.S.Pat.No.6,015,881，表1，描述為包含氨基酸17-26的肽No.11。U.S.Pat.No.6,015,881在此如完全說(shuō)明的那樣引入作為參考。通過(guò)在偶合期間周期性取樹脂樣和運(yùn)行Kaiser測(cè)試以確定任何未反應(yīng)伯胺的存在，而研究反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。將樹脂與兩種對(duì)比樹脂比較，一種對(duì)比樹脂來(lái)自Novabiochem，和另一種對(duì)比樹脂來(lái)自Polymer Labs。
如在實(shí)施例1中那樣，將2-氯三苯甲醇樹脂采用Fmoc-L-亮氨酸Cl負(fù)載。將樹脂樣品(1.0g)稱重加入含有側(cè)口和可除去盤的60mL玻璃合成器容器。將DCM(10mL)加入到容器中和采用氮?dú)鈹嚢?0分鐘，然后排出。然后通過(guò)如下方式解保護(hù)亮氨酸衍生的樹脂加入10mL哌啶在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的25％溶液，攪拌10分鐘，排液和重復(fù)一次。通過(guò)采用7×10mL體積NMP洗滌而除去解保護(hù)殘余物。通過(guò)在室溫下將1.5eq氨基酸(以此順序首先加入Fmoc-glu(t-Bu)-OH，關(guān)于加入量和化學(xué)式量參見(jiàn)表)，1.5eq的1-羥基苯并三唑(HOBT)(0.149g)和1.5eq的DIEA(0.126g)溶于7.5mL NMP，制備序列中下一氨基酸的活化酯。然后驟冷溶液和加入1.5eq的六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’，-四甲基脲鎓(HBTU)(0.370g)并攪拌30分鐘。然后將DCM(2.5mL)加入到溶液中且使其靜置30分鐘。然后將活化的氨基酸溶液加入到排出的樹脂中和采用氮?dú)鈹嚢?。?5分鐘獲得和分析樣品(Kaiser測(cè)試)并記錄結(jié)果。在反應(yīng)完成時(shí)，將樹脂排出和采用NMP(3×10mL)洗滌。然后對(duì)于序列中的剩余氨基酸，從采用哌啶的解保護(hù)重復(fù)此過(guò)程。(Glu(tBu)，Lys(Boc)，Asn(trt)，Glu(tBu)，Gln(trt)，Glu(tBu)，leu，leu)。理解與其它已知技術(shù)相比，使用在本發(fā)明中所述方法和組分的肽合成循環(huán)時(shí)間極大地降低。
表1肽合成效率比較
以到陰性(negative)Kaiser測(cè)試的時(shí)間給出結(jié)果。
附錄1 AA使用單體 fwt 要求的克數(shù)FMOC Glu(t-Bu) 425.48 0.415FMOC Lys(Boc) 468.55 0.457FMOC Asn(trt) 596.68 0.582FMOC Glu(t-Bu) 425.48 0.415FMOC Gln(trt) 610.71 0.595FMOC Glu(t-Bu) 425.48 0.415FMOC Leu 353.42 0.345FMOC Leu 353.42 0.345FMOC Glu(t-Bu) 425.48 0.415HOBT 153.15 0.149DIEA 129.25 0.126HBTU 379.25 0.370LeuCT-樹脂(g)＝ 1.00總NMP 1035.5mL負(fù)載水平(mmol/g)＝ 0.65總DCM 72.5mL樣品數(shù)目＝ 1.00總哌啶 32mL總樹脂(g)＝ 1.00總HOBT 1.344g總mmol＝0.65總DIEA 1.134G單體加料的eq.＝ 1.50總HBTU 3.328G每個(gè)步驟的偶合循環(huán)＝1.00單體使用/循環(huán)(mmol)＝ 0.975加入的AA9理解在此所述的方法可用于肽，特別是T-20，和T-20類肽的非常低成本和有效的合成。這樣的方法采用固相和液相合成過(guò)程以合成和結(jié)合具體肽片段的組，以得到感興趣的肽。在其它的變化方案中，也產(chǎn)生單個(gè)肽片段，該片段用作感興趣肽(如T-20)合成中的中間體。在仍然另一個(gè)方面，本發(fā)明提供這樣肽中間體片段的組，該組可以一起被采用以生產(chǎn)全長(zhǎng)型T-20和T-20類肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解基本降低了用于生產(chǎn)肽的循環(huán)時(shí)間，該肽包括但不限于包括許多更小片段的組合體的T-20，其處于聚集體中。不僅僅降低循環(huán)時(shí)間，而且極大地降低了廢物，和極大地增加了效率。
在另一方面，精制由在此所述方法產(chǎn)生的肽或肽片段，和/或也精制用作目標(biāo)肽合成中的中間體的單個(gè)肽片段。
進(jìn)一步理解本發(fā)明也可用于產(chǎn)生肽和肽片段，該肽和肽片段顯示抑制融合相關(guān)活動(dòng)的能力，和也顯示有效的抗病毒活性。這些肽和肽片段描述于U.S.Pat.Nos.5,464,933、5,656,480和PCT公開No.WO96/19495，該文獻(xiàn)在此如明確說(shuō)明的那樣引入作為參考。本發(fā)明提供在大規(guī)模數(shù)量下產(chǎn)生這些治療劑的方法。
使用固相和液相合成過(guò)程制備T-20和T-20片段，以合成和結(jié)合具體肽片段的組以得到感興趣的肽。一般情況下，本發(fā)明的方法包括在由在此所述本發(fā)明產(chǎn)生的固體載體上，合成T-20或T-20類肽具體側(cè)鏈保護(hù)的肽片段中間體，在溶液中偶合保護(hù)的片段以形成保護(hù)的T-20或T-20類肽，隨后進(jìn)行側(cè)鏈的解保護(hù)以得到最終的T-20或T-20類肽。本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案包括具有氨基酸序列如U.S.專利No.6,015,881(“881專利”)中所示的T-20肽合成。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及單個(gè)肽片段，該片段用作感興趣肽(如T-20)的合成中的中間體。本發(fā)明的肽片段包括，但不限于氨基酸序列如’881專利中所示的那些。
理解本發(fā)明也可使用常規(guī)技術(shù)，使用CTC-樹脂，產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)肽片段，和使用在此所述的技術(shù)，使用醇類樹脂，產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)肽片段。其后可結(jié)合獲得的肽以獲得T-20肽或T-20類肽。
理解除T-20以外，本發(fā)明的方法，片段和片段組和用于選擇片段和片段組的技術(shù)可用于合成T-20類片段。術(shù)語(yǔ)“T-20類”在此用于表示列于U.S.Pat.Nos.5,464,933、5,656,480或PCT公開No.WO96/19495的任何HIV或非HIV肽，每個(gè)文獻(xiàn)在此全文引入作為參考。
除以上所述的T-20和T-20類肽以外，本發(fā)明的方法，片段和片段組可用于合成含有改性氨基和/或羧基端基的肽。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于合成具有通式的肽，其中X是乙酰基和Z是酰胺基團(tuán)。在優(yōu)選的方法中，可以使用任何非二氧化硅類塔填料(為了負(fù)載能力的最大化)精制T-20和T-20類肽和中間體，該填料包括但不限于鋯類填料、聚苯乙烯、聚丙烯酸類物或在高(大于＞7)pH范圍下穩(wěn)定的其它聚合物類填料。例如，在顯示寬pH范圍的非二氧化硅負(fù)載塔填料中，該pH包括大于由Tosohaus(Montgomeryville，Pa.)銷售的產(chǎn)品的pH值。由這樣材料填充的塔可以在低、中或高壓色譜中運(yùn)行。
本發(fā)明也提供如在’881專利的表1中所列的具有特定氨基酸序列的T-20和T-20類肽的肽片段中間體，和’881專利的表2中所列的肽片段中間體組的大規(guī)模有效生產(chǎn)。這樣的肽中間體，特別是’881專利的表2中所列的組中的肽中間體用于生產(chǎn)T-20和T-20類肽。
可以采用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)如叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(trt)和叔丁氧基羰基(Boc)保護(hù)肽片段氨基酸殘基的任意一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈。t-Bu基團(tuán)是氨基酸殘基Tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)和Asp(D)的優(yōu)選側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)；trt基團(tuán)是氨基酸殘基His(H)、Gln(Q)和Asn(N)的優(yōu)選側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)；和Boc基團(tuán)是氨基酸殘基Lys(K)和Trp(W)的優(yōu)選側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。
在片段的合成期間，要保護(hù)組氨酸殘基的側(cè)鏈，優(yōu)選采用三苯甲基(trt)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)組氨酸殘基的側(cè)鏈。如果不保護(hù)，用于從樹脂斷裂肽片段的酸可有害地與組氨酸殘基反應(yīng)，引起肽片段的降解。
采用三苯甲基(trt)基團(tuán)保護(hù)本發(fā)明肽片段的谷氨酰胺殘基。然而，可以在某些片段的羧基末端不保護(hù)谷氨酰胺殘基?？梢员Ｗo(hù)本發(fā)明每個(gè)肽片段的所有天冬酰胺殘基。此外，采用Boc基團(tuán)保護(hù)色氨酸殘基。
使用在此所述的固相合成技術(shù)制備一些單個(gè)肽片段，而使用固相和溶液相合成技術(shù)的結(jié)合非必要地制備本發(fā)明的其它肽?；蛘呖珊铣杀景l(fā)明的肽使得連接肽的氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)鍵是非肽鍵。這些另外的非肽鍵可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的反應(yīng)形成，和可包括但不限于亞氨基、酯、酰肼、氨基脲、和偶氮鍵，其是列舉但只是少數(shù)。
在本發(fā)明的仍然另一個(gè)實(shí)施方案中，可以采用在它們的氨基和/或羧基末端存在的另外化學(xué)基團(tuán)合成包括上述序列的T-20和T-20類肽，使得例如，增強(qiáng)肽的穩(wěn)定性，反應(yīng)性和/或溶解性。例如，可以將疏水性基團(tuán)如芐氧羰基、丹磺酰基、乙酰基或叔丁氧基羰基加到肽的氨基末端。同樣，可以在肽的氨基末端布置乙?；?-芴基甲氧基-羰基。另外，可以將疏水性基團(tuán)，叔丁氧基羰基、或酰氨基加到肽的羧基末端。相似地，可以在肽的羰基末端布置對(duì)硝基芐基酯基團(tuán)。
此外，可以合成T-20和T-20類肽使得改變它們的空間構(gòu)型。例如，可以使用肽的一種或多種氨基酸殘基的D-異構(gòu)體，而不是通常的L-異構(gòu)體。
仍然進(jìn)一步，本發(fā)明肽的至少一個(gè)氨基酸殘基可以由一種公知的非天然氨基酸殘基取代。如這些的改變可用于增加本發(fā)明肽的穩(wěn)定性，反應(yīng)性和/或溶解性。
優(yōu)選，使用標(biāo)準(zhǔn)FMOC方案由在此所述的固相肽合成(SPPS)技術(shù)合成本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)肽片段，參見(jiàn)如Carpino等人，1970，J.Am.Chem.Soc.92(19)5748-5749；Carpino等人，1972，J.Org.Chem.37(22)3404-3409。在本發(fā)明的另一個(gè)變化方案中，在超酸敏感性固體載體上，使用本發(fā)明的肽片段的固相合成制備一個(gè)或多個(gè)片段，該固體載體包括，但不限于2-氯三苯甲基氯樹脂(參見(jiàn)，如Barlos等人，1989，Tetrahedron Letters 30(30)3943-3946)和4-羥甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸樹脂(參見(jiàn)如Seiber，1987，Tetrahedron Letters28(49)6147-6150，和Richter等人，1994，Tetrahedron Letters 35(27)4705-4706)。2-氯三苯甲基氯樹脂和4-羥甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸樹脂兩者可以購(gòu)自Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，Calif。
除在此所述的新穎技術(shù)以外，或與在此所述的新穎技術(shù)結(jié)合，可以使用常規(guī)技術(shù)的樹脂生產(chǎn)和負(fù)載的一般過(guò)程?？梢允褂美?，通過(guò)如下技術(shù)進(jìn)行的樹脂負(fù)載制備一些片段將樹脂，優(yōu)選超酸敏感性樹脂如2-氯三苯甲基樹脂加入到反應(yīng)腔中。將樹脂采用氯化溶劑如二氯甲烷(DCM)洗滌。將床排液和加入1.5當(dāng)量氨基酸和2.7當(dāng)量二異丙基乙胺(DIEA)在約8-10個(gè)體積的二氯乙烷(DCE)中的溶液。應(yīng)當(dāng)保護(hù)氨基酸的N-末端，優(yōu)選采用Fmoc保護(hù)氨基酸的N-末端，和其中必須或適當(dāng)?shù)貞?yīng)當(dāng)保護(hù)氨基酸的側(cè)鏈。將混合物采用氮?dú)夤呐荻鴶嚢?小時(shí)。在攪拌之后，將床排液和采用DCM洗滌。將樹脂上的活性位置采用9∶1的MeOH∶DIEA溶液封端約20-30分鐘。將床排液，采用DCM洗滌4次和采用氮?dú)鈨艋稍镆缘玫截?fù)載的樹脂。然后按照標(biāo)準(zhǔn)洗滌，解保護(hù)，偶合和斷裂方案構(gòu)造片段。使用在此所述的新穎技術(shù)制備其它片段。然后如所述結(jié)合由各種技術(shù)制備的片段。
Fmoc是氨基酸N-末端的優(yōu)選保護(hù)基團(tuán)。依賴于要負(fù)載的氨基酸，可以保護(hù)或可以不保護(hù)它的側(cè)鏈。例如，當(dāng)負(fù)載Trp時(shí)，應(yīng)當(dāng)采用Boc保護(hù)它的側(cè)鏈。相似地，可以采用trt保護(hù)Gln的側(cè)鏈。然而，當(dāng)在1-16個(gè)肽片段合成的制備中負(fù)載Gln時(shí)，應(yīng)當(dāng)不保護(hù)它的側(cè)鏈。不需要保護(hù)Leu的側(cè)鏈。
用于負(fù)載樹脂和用于肽合成的Fmoc保護(hù)的氨基酸可購(gòu)自Sean或Genzyme，含有或不含有如要求的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)?？梢允褂迷诖怂龅男路f技術(shù)，單獨(dú)或與其它常規(guī)技術(shù)結(jié)合，制備描述于U.S.專利No.6,281,331(如完全說(shuō)明的那樣在此引入作為參考)的其它例示肽和片段。
實(shí)施例2人降鈣素的側(cè)鏈保護(hù)片段24-33(Boc-Cys(Trt)-Gly-Asn(Trt)-Leu-Ser-(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-OH)的合成將根據(jù)Bohling等人，2002年8月16日提交的，題目為“用于固相合成的樹脂”的DN# A010407，U.S.臨時(shí)專利申請(qǐng)系列No.60/404,044(如完全說(shuō)明的那樣在此引入作為參考)生產(chǎn)的2-氯三苯甲醇樹脂，采用Fmoc-L-甘氨酸負(fù)載，采用甲醇處理以除去殘余的溶劑并干燥。重量增量用于定量化負(fù)載。假定樹脂的能力是1.3mmol/g。將一部分樹脂采用1％TFA/DCM斷裂，和由HPLC分析溶液以確定氨基酸的斷裂收率(回收率)。
初始負(fù)載將每個(gè)樹脂樣品(1.0000+/-0.05g)稱重加入含有側(cè)口和可除去盤的60mL玻璃合成器容器。采用二氯甲烷(DCM)預(yù)溶脹合成器中的樹脂。排出DCM和向每個(gè)合成器中加入Fmoc-L-Gly-Cl和二異丙基乙胺(DIEA)在10ml DCM中的溶液。開始緩慢的氮?dú)鈹嚢?。每個(gè)樣品，分別地以克計(jì)的Fmoc-L-Leu-OH數(shù)量是0.358，和以mL計(jì)的DIEA數(shù)量是0.177。使每個(gè)混合物在環(huán)境溫度下反應(yīng)兩小時(shí)，然后將溶液排出。如需要，采用在DCM(10mL)中的DIEA(1mL)和乙酰氯(2mL)處理至少30分鐘，而將任何剩余的三苯甲醇端基封閉。將每個(gè)樹脂樣品采用5×10mL部分的DCM洗滌和轉(zhuǎn)移到配衡的30mL多孔玻璃過(guò)濾漏斗中，然后采用另外2×10mL部分的DCM洗滌。然后將每個(gè)負(fù)載的樹脂采用4×10mL部分的異丙醇(IPA)解溶脹和由如下方式部分干燥采用真空通過(guò)濾餅拉動(dòng)空氣，然后在真空烘箱中于30℃下干燥過(guò)濾器和樹脂過(guò)夜。然后將過(guò)濾器和樹脂再稱重和計(jì)算質(zhì)量的差異。Gly的質(zhì)量＝最終重量-(過(guò)濾器皮重+1.000g樹脂)。
肽構(gòu)造如在實(shí)施例1中那樣，將2-氯三苯甲醇樹脂采用Fmoc-L-Gly-Cl負(fù)載。將樹脂樣品(1.0g)稱重加入含有側(cè)口和可除去盤的60mL玻璃合成器容器。將DCM(10mL)加入到容器中和采用氮?dú)鈹嚢?0分鐘，然后排出。然后通過(guò)如下方式解保護(hù)甘氨酸衍生的樹脂加入10mL哌啶在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的25％溶液，攪拌10分鐘，排液和重復(fù)一次。通過(guò)采用7×10mL體積NMP洗滌而除去解保護(hù)殘余物。通過(guò)在室溫下將1.5eq氨基酸(以此順序首先加入Fmoc-Leu-OH，關(guān)于加入量和化學(xué)式量參見(jiàn)表)，1.5eq的1-羥基苯并三唑(HOBT)(0.149g)和1.5eq的DIEA(0.126g)溶于7.5mL NMP，制備序列中下一氨基酸的活化酯。然后驟冷溶液和加入1.5eq的六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’，-四甲基脲鎓(HBTU)(0.370g)并攪拌30分鐘。然后將DCM(2.5mL)加入到溶液中并使其靜置30分鐘。然后將活化的氨基酸溶液加入到排出的樹脂中和采用氮?dú)鈹嚢?。?5分鐘獲得和分析樣品(Kaiser測(cè)試)并記錄結(jié)果。在反應(yīng)完成時(shí)，將樹脂排出和采用NMP(3×10mL)洗滌。然后對(duì)于序列中的剩余氨基酸，從采用哌啶的解保護(hù)重復(fù)此過(guò)程。(Met，Cys(Trt)，Thr(tBu)，Ser(tBu)Leu，Asn(Trt)，Gly，Cys(Trt))。
然后通過(guò)加入14mL在DCM中的1％TFA和混合5分鐘，斷裂肽。然后將斷裂溶液收集入包含相對(duì)TFA等同量吡啶的燒瓶中。重復(fù)斷裂和結(jié)合2個(gè)斷裂溶液。將溶劑交換成乙醇和通過(guò)加入水而沉淀產(chǎn)物。收集固體和采用水洗滌，然后在室溫下干燥。
使用在此所述的方法，已經(jīng)產(chǎn)生了人降鈣素的三(3)個(gè)片段。已經(jīng)產(chǎn)生了具有如下序列的三個(gè)例示片段片段1HGln(Trt)-Thr(tBu)-Ala-IIe-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-Gly-CTC片段2Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln(tBu)-Asp(OtBu)-Phe-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Phe-His(Trt)-Thr(tBu)-Phe-Pro-OH片段3Boc-Cys(Trt)-Gly-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr-(tBu)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-OH
附錄2 AA使用附錄1 AA使用單體 fwt要求的克數(shù)FMOC Gly 297.32 0.357FMOC Leu 353.42 0.424FMOC Met 371.46 0.446FMOC Cys(Trt) 585.72 0.703FMOC Thr(t-Bu) 397.46 0.477FMOC Ser(t-Bu) 383.44 0.460FMOC Leu 353.42 0.424FMOC Asn(trt) 596.68 0.716596.680.582FMOC Gly 297.32 0.357FMOC Cys(Trt) 585.72 0.703HOBT 153.15 0.149DIEA 129.25 0.126HBTU 379.25 0.370LeuCT-樹脂(g)＝ 1.00 總NMP 1035.5mL負(fù)載水平(mmol/g)＝ 0.65 總DCM 72.5mL樣品數(shù)目＝ 1.00 總哌啶 32mL總樹脂(g)＝ 1.00 總HOBT 1.344g總mmol＝ 0.65 總DIEA 1.134g單體加料的eq.＝ 1.50 總HBTU 3.328g每個(gè)步驟的偶合循環(huán)＝ 1.00單體使用/循環(huán)(mmol)＝0.975加入的AA 9實(shí)施例3
T-1249的合成在此所述的方法和底物也可用于構(gòu)造描述于U.S.專利No.6,469,136(′136專利)的多肽，該專利如完全說(shuō)明的那樣在此引入作為參考。特別地，可以使用在此所述的新穎技術(shù)，單獨(dú)或與在此所述的常規(guī)方法結(jié)合，構(gòu)造在此稱為T-1249和T-1249類肽的肽。這些方法采用固相和液相合成過(guò)程，以合成和結(jié)合特定肽片段的組，以得到感興趣的肽。
在此描述肽，特別是在此稱為T-1249和T-1249類肽的肽合成的新穎方法。這些方法采用固相和液相合成過(guò)程，以合成和結(jié)合特定肽片段的組，以得到感興趣的肽。一般情況下，該方法包括在固體載體上合成T-1249或T-1249類肽的特定側(cè)鏈保護(hù)的肽片段中間體，在溶液中偶合保護(hù)的片段以形成保護(hù)的T-1249或T-1249類肽，隨后進(jìn)行側(cè)鏈的解保護(hù)以得到最終的T-1249或T-1249類肽。本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案包括具有氨基酸序列如’136專利中所示的T-1249肽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供構(gòu)造單個(gè)肽片段的低成本，高度有效的方法，該肽片段用作感興趣的肽(如T-1249)合成中的中間體。本發(fā)明的肽片段包括，但不限于，氨基酸序列如’136專利的表1中所示的那些。
在此所述的固相液相合成反應(yīng)的結(jié)合允許以大規(guī)模制造高純度T-1249和T-1249類肽，其具有比現(xiàn)有技術(shù)中所述那些更高的產(chǎn)量和更高的收率?？梢砸磺Э嘶蚋嗲Э说囊?guī)模合成T-1249和T-1249類肽。
全長(zhǎng)型肽的產(chǎn)生本發(fā)明用于合成已知為T-1249的肽。T-1249是39個(gè)氨基酸殘基多肽，它的序列衍生自HIV-1，HIV-2和SIV gp41病毒多肽序列。理解除T-1249以外，本發(fā)明的方法，片段和片段組和用于選擇片段和片段組的技術(shù)可用于合成T-1249類片段。在此使用的術(shù)語(yǔ)“T-1249類”表示以下文獻(xiàn)中所列的任何HIV或非HIV肽1999年5月20日提交的國(guó)際申請(qǐng)No.PCT/US99/11219，1999年11月25日公開的國(guó)際公開No.WO99/59615，該文獻(xiàn)在此全文引入作為參考。
除上述T-1249和T-1249類肽以外，本發(fā)明的方法，片段和片段組可用于合成含有改性氨基和/或羧基端基的肽，或其它聚合物類填料，它們?cè)诟吆偷蚿H范圍下穩(wěn)定。
肽中間體也使用在此所述的新穎方法，單獨(dú)或與其它本領(lǐng)域方法結(jié)合，構(gòu)造特定氨基酸序列如’136專利的表1中所列的T-1249和T-1249類肽的一個(gè)或多個(gè)肽片段中間體，和如’136的專利表2中所列的一個(gè)或多個(gè)肽片段中間體組。
肽合成優(yōu)選使用固相合成技術(shù)制備單個(gè)肽片段，而非必要地使用固相和溶液相合成技術(shù)的結(jié)合制備本發(fā)明的其它肽。合成在T-1249或T-1249類肽的生產(chǎn)中達(dá)到極點(diǎn)。
可另外合成本發(fā)明的肽使得一個(gè)或多個(gè)鍵是非肽鍵，該鍵連接肽的氨基酸殘基。這些另外的非肽鍵可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的反應(yīng)形成，且可包括但不限于亞氨基、酯、酰肼、氨基脲、和偶氮鍵，這些鍵是列舉但只是少數(shù)。此外，可以合成T-1249和T-1249類肽使得改變它們的空間構(gòu)型。例如，可以使用肽的一種或多種氨基酸殘基的D-異構(gòu)體，而不是通常的L-異構(gòu)體。
仍然進(jìn)一步，本發(fā)明肽的至少一個(gè)氨基酸殘基可以由一種公知的非天然氨基酸殘基取代。如這些的改變可用于增加本發(fā)明肽的穩(wěn)定性，反應(yīng)性和/或溶解性。可以合成任何T-1249或T-1249類肽以另外具有共價(jià)連接到它的氨基和/或羧基末端的大分子載體基團(tuán)。這樣的大分子載體基團(tuán)可包括，例如，脂質(zhì)-脂肪酸共軛物、聚乙二醇、碳水化合物或另外的肽。
使用在此所述的新穎技術(shù)制備氨基酸負(fù)載的樹脂。在攪拌之后，將床排液和采用DCM洗滌。將床排液，采用DCM洗滌4次并采用氮?dú)鈨艋稍镆缘玫截?fù)載的樹脂。
Fmoc是氨基酸N-末端的優(yōu)選保護(hù)基團(tuán)。依賴于要負(fù)載的氨基酸，可以保護(hù)或可以不保護(hù)它的側(cè)鏈。例如當(dāng)負(fù)載色氨酸(Trp)時(shí)，應(yīng)當(dāng)采用Boc保護(hù)它的側(cè)鏈。然而，不需要保護(hù)亮氨酸(Leu)的側(cè)鏈。優(yōu)選，將谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)和絲氨酸(Ser)保護(hù)為叔丁基醚或叔丁基酯。和將色氨酸(Trp)和賴氨酸(Lys)保護(hù)為叔丁氧基羰基氨基甲酸酯(Boc)?？梢圆捎没蚩梢圆徊捎萌郊谆Ｗo(hù)天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)的酰胺側(cè)鏈。
同時(shí)，將要加入到樹脂的序列中的隨后氨基酸在它的羧基末端活化用于反應(yīng)。應(yīng)當(dāng)采用Fmoc保護(hù)每種氨基酸的胺末端。依賴于加入的氨基酸，可以保護(hù)或可以不保護(hù)它的側(cè)鏈。優(yōu)選，采用t-Bu保護(hù)tyr(Y)，Thr(T)，Ser(S)，Glu(E)和Asp(P)的側(cè)鏈；采用trt保護(hù)Gln(Q)和Asn(N)的側(cè)鏈，和采用Boc保護(hù)Lys(K)和Trp(w)的側(cè)鏈。不需要保護(hù)Leu或Ile的側(cè)鏈。
氨基酸可以按如下方式活化。在室溫下，將Fmoc保護(hù)的氨基酸(1.5eq)，1-羥基苯并三唑水合物(HOBT)(1.5eq)，和二異丙基乙胺(DIEA)(1.5eq)溶于極性，非質(zhì)子溶劑如N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基乙酰胺(DMAC)(約7.5vol)。將溶液急冷到0-5℃和然后加入六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’，-四甲基脲鎓(HBTU)或O-苯并三唑-1-基-四甲基四氟硼酸酯(HBTU)(1.5eq)，隨后攪拌5-15分鐘以溶解。重要的是在0-5℃下進(jìn)行活化以最小化氨基酸的外消旋化。HBTU是最后加入到冷溶液中的試劑，因?yàn)樗淮嬖跁r(shí)不能進(jìn)行活化和外消旋化。
將活化的氨基酸的溶液加入到排液的樹脂中，采用DCM(大約2.5vol)洗滌。注意由于HBTU在DCM中的不溶性，在NMP中進(jìn)行氨基酸的活化。然而，在此點(diǎn)之前將DCM加入到反應(yīng)中以保持樹脂珠粒的適當(dāng)溶脹。在20-30℃下采用N2鼓泡約1小時(shí)而攪拌反應(yīng)。
如果在偶合循環(huán)之間要將樹脂貯存過(guò)夜，可以將樹脂床排液和在氮?dú)獗Ｗo(hù)下采用NMP覆蓋。或者，可以將床排液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下貯存，然后在進(jìn)行下一個(gè)偶合循環(huán)之前采用DCM洗滌調(diào)節(jié)。如果在斷裂之前要將完成的片段貯存過(guò)夜，由于可以在NMP中發(fā)生顯著的Fmoc解保護(hù)，應(yīng)當(dāng)將樹脂床采用IPA洗滌到?jīng)]有NMP。
在判斷偶合完成之后，將樹脂排液和采用3個(gè)NMP的等分試樣(大約10vol)洗滌。對(duì)于肽片段的隨后鏈節(jié)(即氨基酸)重復(fù)循環(huán)。在最終的偶合反應(yīng)之后，將樹脂采用4個(gè)NMP的等分試樣(大約10vol)洗滌，然后采用2個(gè)等分試樣(大約10vol)的DMC和2 IPA洗滌?？梢圆捎玫?dú)鈨艋蛟诤嫦渲懈稍飿渲Y(jié)合的肽。
例如，根據(jù)如下的非限制性技術(shù)，可以將通過(guò)固相合成技術(shù)合成的肽斷裂和分離可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)從樹脂斷裂肽。例如，1％或2％三氟乙酸(TFA)在DCM中的溶液或TFA在DCM中的1％和2％溶液結(jié)合物可用于斷裂肽。乙酸(HOAC)、鹽酸(HCl)或甲酸也可用于斷裂肽。斷裂要求的具體斷裂劑，溶劑和時(shí)間依賴于被斷裂的特定肽。在斷裂之后，將斷裂級(jí)分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加工過(guò)程以分離肽。典型地，將結(jié)合的斷裂級(jí)分在真空下濃縮，隨后采用極性非質(zhì)子或極性非質(zhì)子溶劑如乙醇(EtOH)、甲醇(MeOH)、異丙醇(IPA)、丙酮、乙腈(ACN)、二甲基甲酰胺(DMF)、NMD、DMAC、DCM等重組，隨后采用抗溶劑如水或己烷沉淀或結(jié)晶，和由真空過(guò)濾收集。或者，可以在肽分離之后將產(chǎn)物采用有機(jī)溶劑或水研磨。
對(duì)于全長(zhǎng)型T-1249肽的合成，可以將肽中間體偶合在一起以得到T-1249肽。例如，可以使用在此所述的一種或多種方法，將以上的肽中間體的組偶合在一起以生產(chǎn)T-1249全長(zhǎng)型肽。
在某些實(shí)施方案中，對(duì)于T-1249的合成，可以遵循三片段的途徑?！叭瓮緩健焙铣杀硎具@樣的T-1249合成方案，該方案采用三個(gè)T-1249中間體肽片段開始，使用固相和液相合成技術(shù)將該片段合成和偶合成全長(zhǎng)型T-1249肽。
固相肽合成(SPPS)的方法；一般過(guò)程向SPPS腔中加入FmocLeu-樹脂(1eq)。將樹脂在5％哌啶DCM(7.5vol)中采用氮?dú)鈨艋?5-30分鐘而調(diào)節(jié)。將溶劑排出和將樹脂采用在NMP中的20％哌啶(5體積)處理30分鐘2次，以除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)。在第二個(gè)20％哌啶/NMP處理之后，將樹脂采用NMP(5vol)洗滌5-7次達(dá)到陰性(negative)choranil測(cè)試。
同時(shí)，將隨后的氨基酸(1.5eq)，HOBT(1.5eq)和DIEA(1.5eq)在3∶1NMP/DCM(10vol)中結(jié)合，使其在室溫下完全溶解和冷卻到0℃。加入HBTU，將溶液攪拌10-15分鐘以溶解固體，然后加入到樹脂中。將懸浮液采用攪拌在氮?dú)鈿夥障聰嚢?-3小時(shí)。采用定性茚三酮測(cè)試監(jiān)測(cè)偶合完成。如果反應(yīng)在3h之后未完成(陽(yáng)性(positive)茚三酮測(cè)試持續(xù))，應(yīng)當(dāng)將反應(yīng)器排液和應(yīng)當(dāng)采用活化氨基酸的新鮮溶液(0.5eq)進(jìn)行再偶合。正常地在再偶合30min-1h之后，獲得陰性(negative)茚三酮測(cè)試。對(duì)于片段中的剩余氨基酸重復(fù)此循環(huán)。當(dāng)構(gòu)造片段時(shí)，可需要從5體積增加用于洗滌的溶劑體積。在最終偶合之后，將樹脂采用5-8體積的NMP洗滌3次，然后采用10體積的DCM洗滌2次和在真空烘箱中在40℃下干燥到恒重。
肽從樹脂斷裂的優(yōu)選方法以下的方法描述了肽AcAA1-12OH從樹脂的斷裂。然而，相同的方法可用于本發(fā)明其它肽片段的斷裂。
方法AHOAc的使用將樹脂(1g，0.370mmol)采用AcOH/MeOH/DCM(5∶1∶4，20vol，20mL)的混合物采用氮?dú)鈹嚢杼幚?.5h和將溶液轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶，攪拌，和采用水(20vol)處理。將獲得的白色淤漿濃縮(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，40℃浴)以除去DCM和由過(guò)濾收集產(chǎn)物。干燥到恒重以87A％的純度提供0.69g(74％)AcAA1-12OH。如以上的樹脂的第二處理提供較不純材料(83Area％)的另外0.08g(8.5％)AcAA1-12OH，建議稍＞1.5hr的所需反應(yīng)時(shí)間。
方法BTFA的使用將樹脂(1wt，20g)采用1.7體積的在DCM中1％TFA洗滌5-6次，每次洗滌3-5分鐘。將1％TFA/DCM洗液在包含吡啶的燒瓶中收集(與洗液中TFA的1∶1體積比)。結(jié)合包含洗液的產(chǎn)物(600mL，30vol)和由蒸餾除去DCM到最小罐體積(約1/3原始體積)。調(diào)節(jié)真空以保持15-25℃的罐溫度。加入乙醇(6.5vol)和繼續(xù)蒸餾直到除去DCM(由餾出物的溫度增加確定)。再次調(diào)節(jié)真空以保持15-20℃的罐溫度。最終罐體積應(yīng)當(dāng)為約8-9體積。將溶液冷卻到5-10℃和在30分鐘內(nèi)加入水(6.5vol)以沉淀AcAA1-12OH。將固體由真空過(guò)濾收集和采用水(2-3vol)洗滌。將淤漿在0-5℃下攪拌30分鐘，將固體由真空過(guò)濾收集和干燥到恒重，以90％收率和84Area(A％)純度得到16.80g的AcAA1-12OH。
FmocAA27-38OH的SPPS和從樹脂的斷裂如上所述采用10g以0.75mmol/g負(fù)載的FmocTrp(Boc)OR開始，進(jìn)行FmocAA27-38OH的SPPS。使用斷裂方法B(169/120/1，78％收率，87.9A％)。
HPLC條件Vydac C8，cat.No.208TP54，5u，300A，0.9mL/min.，280nm，A0.1％TFA/水，B80％I-PrOH/20％乙腈的混合物和0.1％TFA.60-80％B/30min。典型的樣品制備在0.10mL NMP中溶解1mg，采用1mL乙腈稀釋。向20.mul.L回路中注入20.mu.L。
CTOH樹脂的循環(huán)本發(fā)明特別用于取代三苯甲基樹脂的循環(huán)。典型地為循環(huán)這些樹脂，人們首先采用弱酸從樹脂斷裂產(chǎn)物，形成未結(jié)合的肽和氯三苯甲基陽(yáng)離子。然后將陽(yáng)離子采用堿性溶液如甲醇中的氫氧化鈉處理(參見(jiàn)，如完全說(shuō)明的那樣在此引入作為參考的US專利No.6,239,220)，洗滌和干燥以再生取代的三苯甲醇。傳統(tǒng)的方法是然后通過(guò)將它轉(zhuǎn)化成取代的三苯甲基氯樹脂而活化取代的三苯甲醇樹脂。此步驟是有問(wèn)題的且提出許多挑戰(zhàn)，如果人們反而活化保護(hù)的氨基酸可避免這些挑戰(zhàn)。由于樹脂典型地溶脹5-8cc/g，樹脂的活化要求每樹脂體積的大設(shè)備體積。當(dāng)洗滌樹脂時(shí)通常存在材料構(gòu)造問(wèn)題，如通常用于轉(zhuǎn)化的亞硫酰氯可損害標(biāo)準(zhǔn)不銹鋼過(guò)濾器，要求使用更特殊的材料以防止腐蝕。玻璃襯里的反應(yīng)釜是通常的。耐氯化物的過(guò)濾器是非通常和昂貴的。在OH向Cl轉(zhuǎn)化之后的樹脂洗滌也要求許多溶劑，然后必須對(duì)其進(jìn)行循環(huán)或處理。最后，取代的三苯甲基氯樹脂產(chǎn)物則是水分敏感性的，導(dǎo)致處理和干燥問(wèn)題。由于使用液體產(chǎn)物而不是固體，采用氨基酸活化的本發(fā)明具有較為更少的挑戰(zhàn)。消除過(guò)濾器的使用和消除或降低大量洗滌溶劑。由于氨基酸并不如樹脂那樣溶脹，這也更是體積有效的。此外，本發(fā)明并不要求甲氧基封端，故循環(huán)斷裂條件更為溫和。同樣，羥基使樹脂更為親水性和改進(jìn)了試劑和產(chǎn)物通過(guò)凝膠相的輸送。
盡管以上僅描述了本發(fā)明的少數(shù)，優(yōu)選的實(shí)施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到可以改進(jìn)和改變實(shí)施方案而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，以上所述的優(yōu)選實(shí)施方案在所有方面解釋為說(shuō)明性的和不是限制性的，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求限定，而不是由上述的說(shuō)明書限定，且希望在此包括權(quán)利要求同等意義和范圍內(nèi)的所有變化。
權(quán)利要求
1.一種制備沒(méi)有氯三苯甲基氯接頭-樹脂的生物活性物質(zhì)，生物活性物質(zhì)的片段，治療劑，或治療劑的片段的方法，包括活化氨基酸或活化氨基酸衍生物與取代或未取代的三苯甲醇樹脂反應(yīng)，以獲得樹脂-CT-AA產(chǎn)物；和反應(yīng)該樹脂-CT-AA產(chǎn)物與該生物活性物質(zhì)，該治療劑，或該片段的其它構(gòu)件，以獲得該生物活性物質(zhì)，該治療劑，該生物質(zhì)活性物質(zhì)的片段，或該治療劑的片段。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該活化氨基酸選自保護(hù)的氨基酸酰氯、保護(hù)的氨基酸酰氟、保護(hù)的氨基酸酰溴、和保護(hù)的氨基酸混合酸酐、保護(hù)的氨基酸活化酯、和FMOC-氨基酸酰氯。
3.權(quán)利要求1的方法，其中該取代或未取代的三苯甲醇樹脂選自氯三苯甲醇樹脂、用烷氧基取代的三苯甲醇樹脂、用鹵素取代的三苯甲醇樹脂、用取代烷基取代的三苯甲醇、和用結(jié)合到三苯甲基芳族環(huán)上的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代的三苯甲醇。
4.權(quán)利要求3的方法，其中該氯三苯甲醇樹脂是2’氯三苯甲醇樹脂。
5.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括斷裂一個(gè)或多個(gè)該片段，該生物活性物質(zhì)，或該治療劑。
6.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括循環(huán)該樹脂。
7.由權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的產(chǎn)物。
8.權(quán)利要求7的產(chǎn)物，其中該生物活性物質(zhì)或其片段選自T-20的片段、T-20、T-20類肽的片段、和T-20類肽、T-1249的片段、T-1249、T-1249類肽的片段、和T-1249類肽。
9.一種制備用于產(chǎn)生生物活性物質(zhì)或治療劑的底物的方法，包括活化氨基酸或其衍生物與取代或未取代的三苯甲醇樹脂反應(yīng)，以獲得樹脂-CT-AA產(chǎn)物。
10.權(quán)利要求9的方法，進(jìn)一步包括使用該樹脂-CT-AA產(chǎn)物以產(chǎn)生生物活性物質(zhì)前體、治療劑前體、該生物活性物質(zhì)、或該治療劑。
11.權(quán)利要求9的方法，進(jìn)一步包括循環(huán)該樹脂用于隨后的產(chǎn)生步驟。
12.權(quán)利要求1的方法，其中該取代或未取代的三苯甲醇樹脂包括低空隙空間樹脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備沒(méi)有氯三苯甲基氯接頭－樹脂的生物活性物質(zhì)或治療劑的方法。該方法包括反應(yīng)活化氨基酸或活化氨基酸衍生物與取代或未取代的三苯甲醇樹脂，以獲得樹脂－CT－AA產(chǎn)物；和反應(yīng)樹脂－CT－AA產(chǎn)物與生物活性物質(zhì)或治療劑的其它構(gòu)件，以獲得該生物活性物質(zhì)或治療劑。也在此提供由該方法產(chǎn)生的產(chǎn)物。本發(fā)明特別用于產(chǎn)生T－20和T－1249治療劑。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1520827SQ20041000486
公開日2004年8月18日 申請(qǐng)日期2004年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月12日
發(fā)明者J·C·博林, J·J·邁克納, M·K·金斯, W·A·齊亞諾, J C 博林, 邁克納, 金斯, 齊亞諾 申請(qǐng)人:羅姆和哈斯公司