專利名稱：Bapta衍生物在制備臨床藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種已知化合物的衍生物新的用途，確切地說是BAPTA其衍生物在制備臨床藥物中的應(yīng)用。用于急性細(xì)胞大面積死亡患者的搶救和治療。
背景技術(shù)：
缺血、缺氧是人體急性細(xì)胞大面積死亡的主要原因，如缺血性中風(fēng)、心肌梗塞導(dǎo)致腦細(xì)胞、心肌細(xì)胞死亡等。近年來與缺血、缺氧相關(guān)的細(xì)胞死亡機(jī)制的研究有較大進(jìn)展，這為研究開發(fā)保護(hù)細(xì)胞免遭死亡的強(qiáng)效藥物指出了方向，也提供了理論根據(jù)。
著名藥理學(xué)家張均田先生在《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法》一書中對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣超載的論述指出內(nèi)源性或外源性因子包括藥物引起的胞內(nèi)鈣超負(fù)荷可導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。反之，有些疾病會(huì)造成胞內(nèi)鈣超載。且不論這兩者的因果關(guān)系如何，胞內(nèi)鈣超負(fù)荷是各種原因引起細(xì)胞死亡的最終必經(jīng)之路(p.473，20～22行)。由于嚴(yán)重炎癥、血管栓塞、血管痙攣、微循環(huán)障礙等導(dǎo)致組織細(xì)胞缺血缺氧，能量代謝障礙，細(xì)胞內(nèi)外離子失衡，鈉-鈣交換增強(qiáng)致細(xì)胞內(nèi)鈣增加；離子失衡使細(xì)胞膜去極化，神經(jīng)元興奮性增加使興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸大量釋放，NMDA受體激活，大量鈣內(nèi)流；細(xì)胞內(nèi)高鈣又觸發(fā)胞內(nèi)鈣庫(kù)內(nèi)鈣釋放，致細(xì)胞內(nèi)游離鈣進(jìn)一步升高；細(xì)胞去極化引起電壓依賴性鈣通道開放，導(dǎo)致鈣內(nèi)流，加上ATP依賴性鈣泵失能，胞內(nèi)鈣不能泵出。以上諸多原因綜合結(jié)果，形成細(xì)胞內(nèi)鈣超載。
細(xì)胞內(nèi)鈣超載通過以下途徑致細(xì)胞中毒乃至死亡①激活鈣致活蛋白酶類(Ca2+activated proteases)，尤其是Calpain，使細(xì)胞蛋白特別是骨架蛋白(cytoskeletal proteins)和微管相關(guān)蛋白-2(microtubule-associated protein-2，MPA2)水解，引起細(xì)胞崩塌；②激活脂酶(包括磷脂酶)，使膜磷脂水解，花生四烯酸代謝產(chǎn)物增多，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)完整性受損和炎癥反應(yīng)，加重細(xì)胞損傷；③促進(jìn)氧自由基和一氧化氮生成，加重細(xì)胞損傷。(唐康，張均田.腦缺血損傷機(jī)制和治療策略研究進(jìn)展.《中國(guó)新藥雜志》2000；9(12)809-13，孫異臨，曲寶清，胡予，等。缺血性腦內(nèi)鈣分布變化及鈣阻斷劑的腦保護(hù)作用《中華神經(jīng)外科雜志》1995；11(3)148-50；劉穎菊，薛春生，周歧新。缺血再灌流后Fas及FasL在腦內(nèi)表達(dá)的變化和氟桂嗪的抑制作用《藥學(xué)學(xué)報(bào)》2000；35(11)810-3。)
鑒于細(xì)胞內(nèi)鈣超載在細(xì)胞死亡過程中的中心作用，迅速降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度，減輕或消除鈣超載，理論上是搶救瀕危細(xì)胞，減輕細(xì)胞損傷，從而減少梗塞壞死范圍，減少死亡率和致殘程度的有效和重要途徑。
降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣，目前臨床所能應(yīng)用的是鈣通道阻滯劑。由于藥動(dòng)學(xué)和組織選擇性的原因，目前臨床上主要應(yīng)用的是尼莫地平。該鈣通道阻滯劑通過阻斷細(xì)胞膜上L-型鈣通道，減少鈣內(nèi)流而發(fā)揮作用。鈣通道阻滯劑作用機(jī)理決定了該類藥主要用于預(yù)防而治療應(yīng)用較差，因?yàn)棰俨荒苤苯咏档图?xì)胞內(nèi)鈣，對(duì)已形成的細(xì)胞內(nèi)高鈣無效；②其只能阻斷L-型通道，其它類型(如N型)通道無效，鈣可循其它通道進(jìn)入細(xì)胞；③其對(duì)細(xì)胞內(nèi)高鈣所致的細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)的鈣釋放(“鈣致鈣釋放”)無作用。因此，發(fā)現(xiàn)和開發(fā)能迅速分布進(jìn)入細(xì)胞直接發(fā)揮作用的細(xì)胞內(nèi)降鈣劑應(yīng)是重要的新藥研發(fā)方向。
BAPTA[1，2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N，N-N`，N`-tetraace-ticacid，1，2，雙-鄰氨苯氧乙烷基-N，N，-N`，N`-四乙酸]是Roger Y.Tsien于1980年合成的高選擇性、高效鈣絡(luò)合劑，其與鈣絡(luò)合作用機(jī)制與經(jīng)典的鈣絡(luò)合劑EGTA、EDTA相同。主要用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離[Ca+]，是國(guó)際上常用的一種鈣螯合劑。BAPTA作用特點(diǎn)為①對(duì)鈣離子的高選擇性，而對(duì)鎂的選擇性很低(Ca++∶Mg++＝105)這一點(diǎn)對(duì)降低鈣超載而保護(hù)細(xì)胞是有利的，因?yàn)镸g++是Ca++的生理性拮抗劑；②對(duì)受pH變化影響很??；③和鈣產(chǎn)生作用快(比EGTA快50-400倍)；④與鈣絡(luò)合不發(fā)生熒光，不會(huì)產(chǎn)生可能的光毒作用。
BAPTA的結(jié)構(gòu)如下 BAPTA雖然是一種性能優(yōu)異的鈣絡(luò)合劑，但其高離解性使之不能透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。最早使用微注射法引入細(xì)胞，用于基礎(chǔ)理論研究，但實(shí)驗(yàn)方法困難，使用極為不便。
Tsien于1981年將BAPTA和乙酰氧甲基(acetoxymethyl)反應(yīng)生成乙酰氧甲基四酯(BAPTA-AM)。(Nature，1981，290527-8)BAPTA-AM的結(jié)構(gòu)如下 BAPTA-AM是BAPTA的衍生物具有很高的脂溶性，易透過細(xì)胞膜在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，故又稱為“細(xì)胞可通透性”(cell permeant)BAPTA-AM，而BAPTA則“細(xì)胞不通透性”，以示區(qū)別。BAPTA-AM在進(jìn)入細(xì)胞前不能發(fā)揮鈣絡(luò)合作用，進(jìn)入細(xì)胞后則在脂酶作用下水解，釋出BAPTA發(fā)揮作用。
作為國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目，我國(guó)學(xué)者楊利蘋等也合成了BAPTA及其細(xì)胞可滲透的AM酯，同時(shí)合成了七種具有對(duì)稱或不對(duì)稱結(jié)構(gòu)的BAPTA的衍生物，所謂對(duì)稱、不對(duì)稱是指苯環(huán)上同一位置(第4、4`位置)的取代基相同或不相同，取代基有溴基、硝基、甲基、甲?；?、對(duì)二羧基苯乙烯基等，并探討了不同取代基時(shí)對(duì)[Ca++]的親和力以及對(duì)Ex、Em和Kd值影響的規(guī)律性(《華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》1996年第1期p45～51控制細(xì)胞內(nèi)游離[Ca+]的螯合劑BAPTA衍生物的合成及結(jié)構(gòu)與性能關(guān)系)。
申請(qǐng)人檢索了自1970年以來國(guó)內(nèi)外數(shù)十種醫(yī)學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等方面的專業(yè)期刊、雜志后發(fā)現(xiàn)，BAPTA-AM被廣泛地研究和報(bào)導(dǎo)，多數(shù)認(rèn)為對(duì)機(jī)體組織細(xì)胞有保護(hù)作用。但遺憾的是所有的研究都是將BAPTA-AM溶于有機(jī)溶劑如二甲基亞砜等進(jìn)行體外試驗(yàn)。這些有毒的溶劑不能用于人體，由于未解決藥劑學(xué)上的關(guān)鍵問題，至今沒有BAPTA衍生物作為藥用研究的報(bào)導(dǎo)。它們僅充當(dāng)研究用試劑的角色——即測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離[Ca+]的螯合劑。
本發(fā)明所稱的BAPTA衍生物系指其酯化產(chǎn)物以及苯環(huán)有取代基的酯化產(chǎn)物，即由下列通式表示的化合物
式中X1～X4可以是相同的基團(tuán)，也可以是不相同的基團(tuán)，當(dāng)X1～X4均為乙酰氧甲基時(shí)即是BAPTA-AM。X1、X2、X3、X4可以為乙酸甲酯等其它的酯，可以為-CH2Y，Y為鹵素，NO2、CF3，CN等；A和B表示苯環(huán)上的取代基，可以是-H、-CHO、-COOH、R(烴基)、X(鹵素)、-NO2、-NHR、-CF3、-RO(烷氧基)等，A、B可以在苯環(huán)的3、4、5、6位，可以是對(duì)稱的，也可以是不對(duì)稱的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用BAPTA衍生物的高脂溶性，易于透過血腦屏障及實(shí)質(zhì)性臟器細(xì)胞膜的特點(diǎn)，將其開發(fā)成能通過靜脈注射的治療搶救藥物，比如微粒給藥制劑等，主要用于臨床上大面積細(xì)胞死亡性疾病(如腦梗塞、心肌梗塞、肝壞死、腎缺血性壞死、壞死性胰腺炎等)的搶救和治療。
本發(fā)明的技術(shù)方案是應(yīng)用先進(jìn)的微粒給藥新技術(shù)將BAPTA衍生物與適宜輔料一起加工成微乳、微囊、、微球或脂質(zhì)體。微型包囊與微型成球技術(shù)是應(yīng)用于藥物的新工藝、新技術(shù)。成囊或成球的制備過程通稱微型包囊術(shù)，簡(jiǎn)稱微囊化，系利用天然或合成的高分子材料作為囊膜，活性成分作為囊芯被包裹形成的微小膠囊稱微囊，或者活性成分溶解和/或分散在高分子材料基質(zhì)中形成骨架型微小球稱微球，有時(shí)兩者無嚴(yán)格的區(qū)分，通稱微粒，粒子直徑以微米汁。脂質(zhì)體是以磷脂和附加劑在溶液中分散形成的囊泡這一特性、將活性成分包覆起來形成的一種微粒。磷脂有天然磷脂如卵磷脂、豆磷脂等，合成磷脂如二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿等；附加劑有膽固醇、十八胺、磷脂酸等。經(jīng)三十多年的發(fā)展，這些制劑及其制備方法屬公知技術(shù)的一部分?！端幬镄聞┬团c新技術(shù)》陸彬主編，人民衛(wèi)生出版社，2002年2月出版，第四章脂質(zhì)體的制備技術(shù)、第五章微型包囊與微型成球技術(shù)?！端巹W(xué)》屠錫德等主編，人民衛(wèi)生出版社、2002年10月出版，第二十七章、第一節(jié)、第二節(jié)、第三十章、第一節(jié)、第二節(jié)。
申請(qǐng)人委托安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了藥效學(xué)研究試驗(yàn)，供試的BAPTA衍生物微粒給藥制劑(商品名為“細(xì)胞活素”)結(jié)果如下1、對(duì)腦梗塞保護(hù)作用動(dòng)物試驗(yàn)在小鼠斷頭后張口喘氣及氮?dú)馊毖跄Ｐ蜕?，?xì)胞活素6、3、1.5mg.kg-1靜脈注射可明顯延長(zhǎng)小鼠斷頭后張口喘氣時(shí)間，并呈一定的量效關(guān)系；6、3、1.5mg.kg-1細(xì)胞活素可延長(zhǎng)小鼠氮?dú)馊毖跛劳鰰r(shí)間，并可提高小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎6h內(nèi)存活率。在大鼠大腦動(dòng)脈結(jié)扎模型(MCAO)上，細(xì)胞活素(iv)6、3、1.5mg.kg-1治療給藥能顯著減輕腦組織梗塞重量百分比，且呈一定的量效關(guān)系，并能明顯抑制MCAO大鼠異常神經(jīng)癥狀的產(chǎn)生；6、3、1.5mg.kg-1細(xì)胞活素能顯著抑制MCAO大鼠腦組織中的LDH活性的降低，明顯降低缺血腦組織中MDA的含量，細(xì)胞活素6、3、mg.kg-1還能明顯抑制MCAO大鼠腦組織中NO含量的降低。預(yù)防給藥也具有明顯的作用。在不完全性腦缺血模型上，細(xì)胞活素6、3、1.5mg.kg-1靜脈注射可抑制雙側(cè)CCA結(jié)扎所致腦水腫的發(fā)生，并降低腦指數(shù)，6、3、mg.kg-1細(xì)胞活素還能明顯降低腦組織血管通透性。細(xì)胞活素0.050、0.025、0.0125mg.ml-1可明顯抑制加入膠原(100mg.ml-1)后2min和5min時(shí)血小板的聚集反應(yīng)。此外細(xì)胞活素可明顯降低大鼠頸總動(dòng)脈-靜脈旁路模型中血栓的濕重。以上研究結(jié)果表明細(xì)胞活素對(duì)不同模型缺血缺氧性腦損傷有保護(hù)作用。
2、對(duì)心肌缺血損傷保護(hù)作用動(dòng)物試驗(yàn)采用異丙腎上腺素所致大鼠急性心肌缺血損傷模型，研究細(xì)胞活素對(duì)心肌缺血損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，細(xì)胞活素能明顯抑制異丙腎上腺引起的血清肌酸激酶活性的升高。結(jié)論細(xì)胞活素對(duì)大鼠急性心肌缺血損傷具有一定的保護(hù)作用。
3、對(duì)腎功能衰竭保護(hù)作用動(dòng)物試驗(yàn)采用甘油導(dǎo)致的大鼠急性腎功能衰竭模型對(duì)的藥理作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明，細(xì)胞活素能明顯抑制甘油引起的尿素氮水平的升高。結(jié)論細(xì)胞活素對(duì)大鼠急性腎功能衰竭具有一定的保護(hù)作用。
4、對(duì)肝損傷的保護(hù)作用也進(jìn)行了動(dòng)物試驗(yàn)。采用四氯化碳導(dǎo)致的大鼠肝損傷模型對(duì)細(xì)胞活素的藥理作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明，細(xì)胞活素能明顯抑制四氯化氮導(dǎo)致的大鼠肝損傷，減輕肝細(xì)胞壞死程度和血清學(xué)指標(biāo)(降低血清膽紅素和谷丙轉(zhuǎn)氨酶等)。
5、對(duì)胰腺炎的保護(hù)作用也進(jìn)行了動(dòng)物試驗(yàn)。采用大鼠急性壞死性胰腺炎(ANP)模型，對(duì)細(xì)胞活素的藥理作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明，細(xì)胞活素能明顯降低大鼠血清淀粉酶水平，并可使胰腺組織病理學(xué)改變明顯減輕。
具體實(shí)施例方式
非限定實(shí)施例敘述如下1、脂質(zhì)體的制備取0.1mmol磷脂和0.1mmol膽固醇以及0.08mmol BAPTA-AM(以下簡(jiǎn)稱TM)溶于氯仿中，使用薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空下脫云氯仿，器壁上便附著有均勻的干膜，再加入磷酸微沖液或Tris緩沖液，用超聲波處理至溶液清徹透明即可。
2、微囊的制備將TM與明膠水溶液混合攪拌得到o/w型乳狀液，升溫至50℃加稀醋酸調(diào)pH至3.5左右，加Na2SO4溶液使凝聚成微囊分散在乳狀液中，繼續(xù)加入Na2SO4溶液使微囊沉降，冷卻至15℃以下加甲醛溶液并用NaOH調(diào)pH8～9使微囊固化，水洗至無甲醛即得微TM微囊。
3、微乳的制備將適量的TM采用月桂酸異丙酯為油相，磷脂為乳化劑，分別以正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇為助乳化劑，先求得乳化劑和助乳化劑的最佳比值(用KM值表示)，再分別按KM為1∶1、1.5∶1、1.77∶1、1.94∶1制備微乳。
4、W/O/W復(fù)乳的制備囊材的有機(jī)溶劑溶液(含親油性乳化劑)與藥物TM水溶液(含增稠劑)制成W/O型乳濁液冷卻(15℃)以增大水相粘度加含親水性乳化劑的水作連續(xù)相W/O/W復(fù)乳。
5、/O/W復(fù)乳的制備將適量的TM與司盤80搖勻，加入0.5％的明膠溶液和0.1％的氯化鈉，攪拌形成W/O初乳后，加入吐溫80及蒸餾水?dāng)嚢杓吹谩?br> 6、用溶劑揮發(fā)法制備微球。將適量的聚乳酸和TM溶于二氯甲烷中，在攪拌下將溶液緩緩滴入1％的明膠溶液中，攪拌形成O/W初乳后，40℃減壓蒸去二氯甲烷，過濾收集微球，蒸餾水洗滌后，干燥即得。
7、脂納米粒的制備通過高壓乳勻法生產(chǎn)。這種技術(shù)是將TM溶解或溶化在熔融的脂類中(該脂類在熔點(diǎn)5-10℃以上熔化)。包含藥物的熔融物在攪拌條件下被分散到具有相同溫度的熱表面活性劑水溶液中，接著，所得到的前體乳劑利用有活塞蓋的均化機(jī)均化，得到的熱納米乳劑被冷卻至室溫，脂類重結(jié)晶得到固體脂肪納米粒。熱乳化技術(shù)也適用于對(duì)熱敏感的藥物，因?yàn)楸┞对诟邷貤l件的時(shí)間很短。
權(quán)利要求
1.一種BAPTA衍生物在制備臨床藥物中的應(yīng)用，其特征在于BAPTA衍生物在制備治療急性細(xì)胞大面積死亡藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種BAPTA衍生物在制備臨床藥物中的應(yīng)用，其特征是制備治療急性細(xì)胞大面積死亡藥物中的應(yīng)用，可以加工成微粒給藥制劑，用于臨床上大面積細(xì)胞死亡性疾病如腦梗塞、心肌梗塞、肝壞死、腎缺血性壞死、壞死性胰腺炎等的搶救和治療。
文檔編號(hào)A61K31/185GK1605333SQ20031010605
公開日2005年4月13日 申請(qǐng)日期2003年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月10日
發(fā)明者劉經(jīng)星 申請(qǐng)人:合肥恒星藥物研究所