專利名稱:利用不溶性免疫復(fù)合物提高抗體的生產(chǎn)的制作方法
本申請是1986年6月20日遞交的876，828號美國專利申請的部分后繼申請。
本發(fā)明涉及一種利用不溶性免疫復(fù)合物提高抗各種抗原的抗體產(chǎn)量的方法。純化的抗原、含其它污染抗原的富集抗原以及不均一抗原混合物均可作為抗原的來源。多克隆單特異性抗體、多克隆多特異性抗體以及單克隆抗體均可與抗原及蛋白A-Sepharose結(jié)合，以形成不能溶解的免疫復(fù)合物。以這類復(fù)合物之抗原成分誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體不僅效率高，而且在某些情況下，還具有超過原始抗血清或單克隆抗體的改善了的特異性。
現(xiàn)有技術(shù)中已使用了各種各樣的方案來生產(chǎn)抗糖蛋白、抗糖脂及抗腫瘤相關(guān)抗原的單克隆和多克隆抗體。例如可利用完整細胞這一高免疫原性載體生產(chǎn)單克隆抗體。然而，這種方法在生產(chǎn)有用抗體中卻存在著效率低的問題。此外，純化的可溶性抗原在小鼠體內(nèi)正如同一免疫原在兔和羊等其它種動物體內(nèi)相反，其免疫原性是很差的。
某種抗原以不溶形式存在即可能改善可溶性抗原制劑在小鼠體內(nèi)的免疫原性。例如，某些情況下對癌胚抗原作明礬淀淀即可能提高免疫原性。但為了達到預(yù)期的抗體生產(chǎn)水平，常常要使用佐劑。按傳統(tǒng)方法，業(yè)已使用佐劑如弗氏佐劑與可溶性抗原制劑混合用于免疫兔或羊。然而佐劑往往在小鼠內(nèi)無效;盡管可以產(chǎn)生可測滴度的抗體，但抗原特異性雜交瘤的產(chǎn)率卻很低。本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)抗原特異性雜交瘤有效的不能溶解的免疫原。
使用現(xiàn)有技術(shù)中所描述的可溶性免疫原制劑，通常還須為分離足夠量的純化抗原付出大量的勞動。大多數(shù)用可溶性抗原進行免疫的方法中，所用純化抗原量為50-100μg。鑒于大多數(shù)細胞表面或胞漿抗原都只是以很小的量產(chǎn)生的，所以為制得這一劑量的抗原便須作大量的生物化學(xué)純化工作。本發(fā)明的一個方面即在于提供一種由不均一抗原混合物中富集某給定抗原的方法，從而減少了純化工作。本文中所用的“富集”一詞是指提高有用抗原或抗體的濃度。
本發(fā)明的另一個方面是涉及生產(chǎn)抗同一抗原上抗原決定基的單克隆抗體，但所說的抗原決定基並不同于由用于制備免疫原的抗體鑒定的抗原決定基。前已證明了對這些抗多抗原決定基之抗體的需要。例如，業(yè)已發(fā)現(xiàn)在一種糖蛋白分子內(nèi)可存在有一個以上的抗原決定基，而且在糖蛋白分子的不同亞群上可具有抗原決定基的不同形式的結(jié)合。因此，並不是所有抗原決定基都一定在所有糖蛋白分子上和/或在一給定的組織內(nèi)有著同樣的分布。特別是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，人黑素瘤相關(guān)抗原系統(tǒng)中抗原異質(zhì)性的程度取決于被單克隆抗體識別的抗原決定基(Morgan等，Mol.Immunology，待出版)。一種識別分散于多數(shù)黑素瘤糖蛋白分子上之抗原決定基的單克隆抗體(MAb)，比識別僅存在于糖蛋白分子亞群上之抗原決定基的MAb具有較小的抗原異質(zhì)性。使用抗癌胚抗原(CEA)的單克隆抗體，可將CEA制劑再分為攜帶獨特抗原決定基之分子的若干組群。這一點也已用抗Ⅱ類組織相容性抗原(HLA-DR抗原)的單克隆抗體證實。因此，生產(chǎn)抗已知抗原上特異抗原決定基的獨特抗體，可使單克隆抗體的治療應(yīng)用-包括向靶細胞釋放放射性同位素、藥物或毒素得以最佳化。
如抗原純化一樣，生產(chǎn)抗已知抗原之特異性抗原決定基的單克隆抗體的現(xiàn)有工藝方法也是很復(fù)雜的?，F(xiàn)有工藝方法學(xué)是使用經(jīng)一系列步驟分離的可溶性純化抗原進行免疫，其包括生產(chǎn)大量的已知單克隆抗體、純化該抗體、將該抗體接到某種不溶性基質(zhì)(如Sepharose)上使之成為不溶的，而且典型地還要以至少一種其它親合分離方法(如凝集素親合層析法、離子交換層析法)與單克隆抗體親合層析法結(jié)合使用，以自不均一抗原混合物中提純抗原等步驟。這種方法不僅費用高、花費的時間長，而且需要用大量細胞作為不純抗原的來源。此外，在分離出來后，這種可溶性抗原制劑在小鼠體內(nèi)的免疫原性亦很差。為此，本領(lǐng)域內(nèi)需要找到一種能更為有效地並花費較少時間的生產(chǎn)這類單克隆抗體的方法，所說的這些抗體是針對抗原上由已有單克隆抗體所識別之抗原決定基以外的抗原決定基的。依據(jù)本發(fā)明的方法，所用抗原來源無須純化，而且尚可提高免疫原性。
本領(lǐng)域中還要求有一種能生產(chǎn)抗那些存在其多克隆抗血清之抗原的單克隆抗體的方法。如果存在有這些多克隆抗血清，既使量很小、滴度很低或者是以多特異性形式(即含有不同特異性的許多抗體)存在，亦可以將其用于本發(fā)明生產(chǎn)單克隆抗體。但在許多情況下，這些抗血清的量是有限的，不足以用來作抗體親合層析，因此在使用可溶性純化抗原的免疫方法中是沒有用的。本發(fā)明之免疫方法的另一個好處是可制得不同于用在免疫中之多克隆抗血清的、有著不同特異性的單克隆抗體。
本領(lǐng)域中還需要有一種能有效地生產(chǎn)單克隆抗個體基因型抗體的方法，該抗體可識別鼠源單克隆抗體(MAb)的抗原結(jié)合部位。已提出假設(shè)並在某些動物模型身上得以證實的是，抗個體基因型抗體起到以正或負兩種方式調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用。在某些情況下，可用抗個體基因型抗體替代純化的抗原用于生產(chǎn)疫苗，從而不再必須對給定的抗原進行生物化學(xué)純化。
如在某些動物模型中所顯示的，用作疫苗的抗個體基因型抗體有可能用于對腫瘤的輔助治療。由于難于生產(chǎn)抗其它鼠單克隆抗體的鼠源單克隆抗體而使得這個領(lǐng)域的應(yīng)用研究進展不利。雖已成功地生產(chǎn)了抗人及兔抗體的鼠MAb，但大多數(shù)抗腫瘤相關(guān)抗原的MAb都是小鼠來源的。這些腫瘤特異性鼠MAb的結(jié)合位點有很差的免疫原性，而這大概是因為由Fc區(qū)域內(nèi)共同序列誘導(dǎo)的自身耐受性所致。似乎Fc區(qū)內(nèi)的種間差異可能導(dǎo)致抗原結(jié)合位點(個體基因型)之免疫原性的提高。本發(fā)明是使用不能溶解的免疫復(fù)合物以提高抗單克隆抗體之個體基因型抗體的產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一優(yōu)點在于，它提供了一種有效地產(chǎn)生一組針對給定抗原之多重抗原決定基的單克隆抗體的技術(shù)。該方法學(xué)有利于生產(chǎn)能識別抗原之免疫劣勢抗原決定基(Immunorecessive epitopes)的單克隆抗體。結(jié)果各種單克隆抗體均可結(jié)合于一種靶細胞或抗原上，從而可以以較高劑量結(jié)合毒素或放射性同位素並向靶位點的釋放之。因為靶細胞的多個不同抗原決定基均可被結(jié)合，所以有較高濃度的免疫結(jié)合物釋放即可改善細胞毒性或映象性質(zhì)(Imaging Property)。此外，單克隆抗體之多重性的可利用性將使各種抗原決定基(某中有的可能是某特殊靶細胞所特有的)均能中靶。這種獨特的結(jié)合能力即可允許選擇那些與正常細胞的抗原決定基很少有或沒有交叉反應(yīng)性的單克隆抗體，而這反過來又可允許使用較高劑量的免疫結(jié)合物。
本發(fā)明公開了一種提高抗體生產(chǎn)的方法，其包括將抗體吸附于不能溶解的蛋白A上，從而形成一種免疫吸附劑;使抗原與該免疫吸附劑結(jié)合，形成一種不能溶解的免疫復(fù)合物;用該不溶性免疫復(fù)合物免疫動物並由被免疫的動物體內(nèi)收集抗血清。
本發(fā)明的一個相關(guān)方面公開了一種改善可溶性抗原之免疫原性，因而提高特異性單克隆抗體生產(chǎn)的方法，其包括使抗體吸附于不能溶解的蛋白A上，以形成一種免疫吸附劑;使可溶性抗原與該免疫吸附劑結(jié)合，以形成一種不能溶解的免疫復(fù)合物;使得自被免疫動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成能夠產(chǎn)生抗該可溶性抗原之單克隆抗體的雜交瘤;培養(yǎng)雜交瘤以產(chǎn)生單克隆抗體並收集作為雜交瘤之產(chǎn)物的單克隆抗體。
本發(fā)明的再一個方面公開了一種生產(chǎn)對抗原決定基-其不同于被已有單克隆抗體識別者-特異之單克隆抗體的方法，其包括將抗多價抗原之第一抗原決定基的已有單克隆抗體吸附在不溶性蛋白A上，以形成一種免疫吸附劑;使該免疫吸附劑與抗原結(jié)合，形成一種其中第一抗原決定基是被已有單克隆抗體掩敝了的不溶性免疫復(fù)合物;用該不溶性免疫復(fù)合物免疫動物;使得自被免疫動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合以形成能夠產(chǎn)生抗特殊抗原決定基之第二單克隆抗體的雜交瘤;培養(yǎng)該雜交瘤以產(chǎn)生對特殊抗原決定基特異的第二單克隆抗體並收集作為雜交瘤之產(chǎn)物的第二單克隆抗體。
本發(fā)明的再一個方面公開了一種生產(chǎn)單克隆抗個體基因型抗體的方法，其包括使第一抗體吸附在不能溶解的蛋白A上以形成一種免疫吸附劑;用該免疫吸附劑免疫動物;使得自被免疫動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成能夠產(chǎn)生對第一抗體之抗原決定基特異的單克隆抗體的雜交瘤;培養(yǎng)該雜交瘤以產(chǎn)生這種單克隆抗體並收集作為雜交瘤之產(chǎn)物的單克隆抗體。
本發(fā)明也公開了用作免疫原的不溶性免疫復(fù)合物以及用于生產(chǎn)單克隆抗個體基因型抗體的免疫吸附劑。此外還公開了多種可結(jié)合于腫瘤相關(guān)抗原之多抗原決定基的單克隆抗體。
本發(fā)明的再一個方面是涉及能夠結(jié)合不被抗體9.2.27識別的、人黑素瘤相關(guān)糖蛋白之抗原決定基的單克隆抗體，並包括能夠生產(chǎn)這些抗體的連續(xù)的雜交細胞系。
參閱以下的描述及附圖將會進一步明瞭本發(fā)明的這些及其它一些方面。
圖1顯示在ELISA法檢測中，單克隆抗體與α-2巨球蛋白之三種不同來源的結(jié)合。這三種來源是(1)得自培養(yǎng)的黑素瘤的α-2巨球蛋白;(2)自正常人血清純化的α-2巨球蛋白;(C)自牛血清分離的牛α-2巨球蛋白。
圖2顯示抗α-2巨球蛋白之單克隆抗體的流動細胞計數(shù)結(jié)果。上面各組顯示與單克隆抗體保溫的CEM(人T細胞)或FMX(人黑素瘤)細胞，這些單克隆抗體分別是可與α-2巨球蛋白(α-2M)或中間纖絲抗原(抗IFA)反應(yīng)的，並且上述細胞是染有FITC羊抗小鼠免疫球蛋白的。下面各組顯示在與α-2M或抗IFA混育前用溶血卵磷脂預(yù)通透處理的FMX和CEM細胞?？笽FA是細胞內(nèi)、非細胞表面抗原的陽性對照物。
圖3顯示被試抗(A)蛋白多糖陽性和(B)蛋白多糖陰性A375黑素瘤細胞之黑素瘤反應(yīng)性單克隆抗體的流動細胞計數(shù)結(jié)果。
本發(fā)明的提高抗體生產(chǎn)的方法包括了現(xiàn)有技術(shù)中的抗原純化步驟，同時能增加抗原反應(yīng)性雜交瘤的數(shù)目(超過了用現(xiàn)有方法學(xué)獲得的抗原反應(yīng)性雜交瘤數(shù)目)，從而提高了產(chǎn)生抗某預(yù)期抗原之單克隆和多克隆抗體的總效率。
為了完成本發(fā)明，必須確定抗原混合物內(nèi)預(yù)期抗原的相對量。為此，須用二碘水楊酸鋰、丁醇、等滲尿素、非離子去污劑或離子去污劑等試劑進行細胞表面提取，以制得可溶性提取物。例如，常常使用非去污劑提取法制備外周膜蛋白。以可溶性提取物為抗原的富集源，提取物制劑的1%(W/W)或1%以上為靶抗原。但亦可使用富集了較少靶抗原的提取物制劑。
之后分析提取物制劑的蛋白含量。將溶于磷酸鹽緩沖鹽的水100ng至10μg蛋白以100μl體積加至聚乙烯微滴定板內(nèi)。干燥過夜后，使用ELISA方法，根據(jù)多克隆抗血清或單克隆抗體對固相靶抗原的結(jié)合來檢測預(yù)期抗原的存在。為了進行比較，可使用得自非抗原攜帶細胞的相似提取物?？乖牧靠梢砸韵♂尭骺變?nèi)靶蛋白的滴度來表示。在確認提取物制劑中存在有預(yù)期抗原之后，即可對固相抗原滴定抗體或抗體源。應(yīng)基于有最高滴度、可在適當種動物體內(nèi)生產(chǎn)和/或能夠結(jié)合于蛋白A-Sepharose的鼠免疫球蛋白亞類等要求來選擇用于制備免疫原的抗血清或單克隆抗體。
用于形成不溶性免疫復(fù)合物的典型蛋白濃度是每20μl蛋白A-Sepharose(裝填體積)加20μl多克隆抗血清?；蛘呤牵?-50μg MAb免疫球蛋白便可與同樣體積的蛋白A-Sepharose形成不溶性復(fù)合物。通過吸附形成免疫吸附劑，即在室溫下一端上一端下地來回轉(zhuǎn)動2小時，之后用磷酸鹽緩沖鹽水洗?；蛘咭嗫墒诡A(yù)期的抗體直接連接到CNBr-Sepharose上制成免疫吸附劑。
之后用該免疫吸附劑吸附抗原提取物。為了盡可能地減少提取物蛋白對免疫吸附劑的非特異性粘附，可用正常免疫球蛋白-蛋白A-Sepharose預(yù)吸附提取物。正常免疫球蛋白可由兔或羊血清中制得，或者得自與用以吸收特異抗原者為同一亞類的非特異性小鼠單克隆抗體。預(yù)吸附是經(jīng)下列三個步驟完成的(1)將非特異性免疫吸附劑與提取物制劑在室溫下保溫2小時;(2)將提取物制劑移到一等分部份的新鮮非特異性免疫吸附劑內(nèi)再保溫2小時;(3)將上清液移入第三個等分部份的非特異性免疫吸附劑內(nèi)，于4℃保溫過夜。使非特異性結(jié)合成分如此反復(fù)消耗之后，再用抗特異性抗原的抗血清或MAb滴定該抗原制劑，並分成若干等份冷凍，以備進一步制劑不溶性免疫復(fù)合物。
用4-疊氮基水楊酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS-ASA)處理，使抗體與蛋白A交聯(lián)，從而提高不溶性免疫復(fù)合物的體內(nèi)穩(wěn)定性(Tae等，Anal.Biochem.121286，1982)。另外，用NHS-ASA處理亦可使抗體與抗原交聯(lián)。交聯(lián)可防止在血清中解離，從而提高免疫復(fù)合物的體內(nèi)保留時間。
通過ELISA法分析給定抗原的相對富集量，並在此基礎(chǔ)上估計加入不能溶解之抗體中的總蛋白量。據(jù)此，如果抗原制劑是一種純化的抗原，則每份免疫吸附劑和每次免疫可使用250ng或更少些的純抗原。如果合適抗原只占制劑的1%，則一般使用5-10μg抗原制劑。如果用作抗原來源的可溶性提取物是含有濃度不到1%之給定抗原的異質(zhì)性抗原混合物，則用于吸附到不能溶解之抗體上的提取物應(yīng)為10μg或更多些。于4℃保溫2-14小時后，用PBS洗此不能溶解的免疫復(fù)合物並注射到BALB/C小鼠的腹腔內(nèi)。
如果要作脾臟內(nèi)免疫，應(yīng)在用27號針頭進行脾內(nèi)注射之前，在-Dounce裝置內(nèi)將免疫吸附劑勻漿，使之成為較小的Sepharose顆粒。雖然腹腔內(nèi)免疫法是每周一次連續(xù)3-6周，但脾臟內(nèi)免疫一般只作一次，且所用抗原制劑的量一般是5-10μg。對于腹腔內(nèi)和脾臟內(nèi)免疫，均在未次免疫后3-7天收獲脾細胞，並用標準技術(shù)制備雜交瘤細胞。用ELISA法，針對用于免疫的原始靶抗原混合物，以及已知不含有用抗原的靶抗原混合物來篩選雜交瘤細胞。
不能溶解的免疫復(fù)合物亦可改善可溶性抗原的免疫原性，從而可生產(chǎn)出原先不能得到的高灣度抗血清或特異性單克隆抗體。另外，當通過使抗原結(jié)合于某種已知的單克隆抗體以將抗原摻入到不能溶解的免疫復(fù)合物中時，即可使被該單克隆抗體識別的抗原決定基得以有效地掩蓋起來。
用存在于不能溶解的免疫復(fù)合物中帶有一被掩敝的抗原決定基的抗原免疫，可更為有效地生產(chǎn)出針對抗原上未被掩敝之抗原決定基的第二代單克隆抗體。該項技術(shù)可用于產(chǎn)生針對非腫瘤相關(guān)抗原之腫瘤相關(guān)抗原決定基的單克隆抗體。也可用識別給定抗原之不同抗原決定基的單克隆抗體來鑒別致癌基因和原致癌基因產(chǎn)物(Proto-Oncogene products)。
為生產(chǎn)單克隆抗個體基因型抗體，須將人或小鼠單克隆抗體吸附于蛋白A-Sephrose上。洗掉所得免疫吸附劑上未結(jié)合的抗體，之后用以免疫嚙齒動物。可借助以下兩種方法之一來篩選由被免疫的脾細胞與骨髓瘤細胞融合所產(chǎn)生的雜交瘤細胞。如果是用吸附于蛋白A-Sepharose上的不能溶解的鼠抗體免疫大鼠，便使用抗大鼠過氧化物酶連接試劑，通過間接ELISA法篩選雜交瘤細胞。如果是免疫小鼠，則通過用假定抗個體基因型抗體抑制酶標記的特異性抗體(個體基因型)對靶細胞(抗原)的結(jié)合來篩選雜交瘤細胞。
使用不能溶解的免疫復(fù)合物免疫原能獲得成功將歸因于多種因素。第一是將給定的抗原吸附于特異性抗體所獲得的相對富集量。但這一點並不提示使用多克隆抗血清作為免疫抗體之來源對于實驗成功是合情合理的。使用多克隆抗血清時，不可能期望以這種方法制得大量富集的給定抗原。這一成功的第二個因素可能是在Sepharose上不能溶解的蛋白A的輔助作用，它在提高B細胞分化和增殖能力上可能起作用。可溶性蛋白A是一種已知的小鼠B細胞的有絲分裂原和細胞分化劑。蛋白A可起到次級增殖信號的作用並引起靶抗原預(yù)致敏之B細胞的克隆擴增。使用這些免疫原獲得成功的第三個因素在于，免疫復(fù)合物可能是調(diào)解免疫應(yīng)答的天然方式。許多研究表明，抗原-抗體復(fù)合物趨向于淋巴結(jié)的濾泡區(qū)域並優(yōu)先結(jié)合于Fc受體。被巨噬細胞濃集並進而呈獻出來可導(dǎo)致B淋巴樣細胞致敏，從而提高了免疫應(yīng)答能力?？梢云谕捎谂c宿主的免疫球蛋白競爭結(jié)合蛋白A，而使不能溶解的免疫復(fù)合物得以在體內(nèi)逐步地釋放。
實施例1使用單特異性多克隆抗血清產(chǎn)生單克隆抗體業(yè)已證明α-2巨球蛋白(α2m)是由人黑素瘤細胞合成的並分泌到廢培養(yǎng)基內(nèi)的(Morgan，JNCI21557，1984)?？墒褂谜Ｑ濡?m免疫產(chǎn)生的單一特異性多克隆抗血清鑒定這種分子。結(jié)果證明黑素瘤細胞α2m與血清α2m有大致相同的分子量，並有相同的亞單位組成。在未報導(dǎo)的研究中發(fā)現(xiàn)，使用針對血清α2m的多克隆抗血清與含有黑素瘤細胞α2m之廢培養(yǎng)基制成的不溶性復(fù)合物，制得了抗黑素瘤細胞α-2巨球蛋白的單克隆抗體。圖1中顯示了這些抗α2m MAb的特異性。所示數(shù)據(jù)得自于三組抗體。第一組與得自正常血清、黑素瘤細胞廢培養(yǎng)基以及牛血清的α-2巨球蛋白反應(yīng)。第二組MAb只識別黑素瘤廢培養(yǎng)基和正常血清中的人α-2巨球蛋白。第三組抗體只與黑素瘤細胞α2m反應(yīng)，而不識別正常人或牛血清α2m。這些結(jié)果證明能夠利用單一特異性多克隆免疫復(fù)合物提高單克隆抗體生產(chǎn)，而且表明所產(chǎn)生的單克隆抗體可能是對抗原的腫瘤細胞形式而不是對其正常血清相對物有選擇性，盡管該腫瘤細胞形式與正常血清抗原在分子量及亞單位組成上十分相似。
進一步通過流動細胞計數(shù)法來定性抗α2m單克隆抗體的特異性。將合成α2m的人黑素瘤細胞系與抗α2m MAb一同保溫。為了檢定α2m是被合成的，而不是在細胞表面上表達的，須在與MAb保溫前用溶血卵磷脂預(yù)通透FMX細胞。用缺乏α2m的完整的並經(jīng)預(yù)通透的人T細胞(CEM)作為陰性對照。以抗中間纖絲MAb作為通透后接近細胞內(nèi)抗原的陽性對照。圖2證明了抗α2m MAb只同細胞內(nèi)α2m結(jié)合，此表明α2m不是在FMX細胞的表面上表達的。CEM細胞一直是非反應(yīng)性的，證明對培養(yǎng)基中牛α2m的內(nèi)吞作用並沒有干擾檢測結(jié)果。
實施例2使用異質(zhì)性抗原制劑中的多特異性多克隆抗體產(chǎn)生抗轉(zhuǎn)化生長因子的單克隆抗體
α轉(zhuǎn)化生長因子(αTGF)在控制腫瘤生長，特別是在內(nèi)分泌生長調(diào)節(jié)中可能起重要作用，而抗αTGF單克隆抗體是很難產(chǎn)生的(盡管可以制得合成肽-其代表了這種肽生長因子之所有或部分氨基酸序列)。用反相HPLC法自黑素瘤病人的尿中分離αTGF，並用αTGF制劑滴定用完整黑素瘤細胞免疫所產(chǎn)生的多特異性免抗血清。該抗血清對αTGF制劑(經(jīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測證明其含有大約20%αTGF和80%其它污染的尿蛋白)展示一低滴定度(1∶4)。使這一抗血清-抗原制劑結(jié)合于蛋白A-Sepharose上，並經(jīng)六周免疫制得單克隆抗體。表1中顯示了得自這些融合過程的雜交瘤克隆的實例。
表1與α-轉(zhuǎn)化生長因子起反應(yīng)的單克隆抗體反應(yīng)性樣式＊克隆的百分數(shù)TGF+、EGF+23TGF-、EGF+69TGF+、EGF-8＊用固相ELISA法檢測單克隆抗體與黑素瘤病人之尿αTGF和純化之人EGF的結(jié)合能力。
在對尿αTGF反應(yīng)中產(chǎn)生的大多數(shù)單克隆抗體均與人表皮生長因子(EGF)制劑以及αTGF反應(yīng)。某些用尿αTGF免疫產(chǎn)生的單克隆抗體優(yōu)先與EGF反應(yīng)，但不與來自αTGF之C末端的17氨基酸肽反應(yīng)。有一種單克隆抗體表現(xiàn)了對αTGF的特異性但不與人EGF反應(yīng)。這些結(jié)果表明，非免疫原性肽生長因子如αTGF，可通過形成免疫復(fù)合物使之不能溶解而成為有免疫原性的。
實施例3產(chǎn)生抗人IgM的單克隆抗個體基因型抗體可將抗存在于B細胞表面上之人IgM的單克隆抗個體基因型抗體作為治療劑用于治療某些形式的B細胞淋巴瘤。為了加速這些抗體的產(chǎn)生，並為了只使用小量的、有時是有限的IgM免疫原，而試驗了脾臟內(nèi)免疫的方法。用可溶性人IgM作脾臟內(nèi)注射，其並不是一種產(chǎn)生雜交瘤的有效免疫原。然而，如表2中所示，當通過鼠抗人IgM單克隆抗體形成人IgM與蛋白A-Sepharose的復(fù)合物時，IgM即成為有免疫原性的，致使有大約1%的克隆是針對人IgM骨髓瘤蛋白之抗原結(jié)合部位的。
所有融合均是用小鼠骨髓瘤細胞系8.653，並以脾細胞∶骨髓瘤細胞＝4∶1的融合比率完成的。融合后將細胞分配到96孔平板內(nèi)，以使每個孔接種的細胞數(shù)為大約2×106個細胞。
a，只加人IgM(個體基因型)免疫球蛋白。
b，與蛋白A-Sepharose復(fù)合的人IgM(個體基因型)免疫球蛋白。
c，通過小鼠單克隆抗人IgM橋與蛋白A-Sepharose復(fù)合的人IgM(個體基因型)免疫球蛋白。
d，用固相ELISA法檢測含抗個體基因型雜交瘤之各孔與5份IgM病變蛋白的儲集物或與用于免疫之IgM的結(jié)合情況。
之后檢測這些抗IgM個體基因型單克隆抗體的特異性。檢測了鼠單克隆抗體與人IgM病變蛋白及個體IgM制劑的結(jié)合。表3表明這些單克隆抗體只結(jié)合自體IgM，而沒有結(jié)合其它的IgM制劑，從而顯示了相似的抗個體基因型特異性。
＊用固相ELISA法檢測由指出的病人IgM免疫所產(chǎn)生的抗個體基因型抗體與一系列IgM病變蛋白的結(jié)合。結(jié)果以O(shè)D405值表示。
a，抗個體基因型單克隆抗體名稱。
b，同型免疫球蛋白和抗個體基因型單克隆抗體亞類。
c，數(shù)據(jù)下劃橫線者為陽性ELISA結(jié)果。
d，人IgM骨髓瘤蛋白的儲集物;Meloy-5供體，Cappel-12供體。
e.正常人血清。
實施例4產(chǎn)生抗可識別人黑素瘤細胞腫瘤相關(guān)抗原之單克隆抗體的鼠單克隆抗個體基因型抗體識別人黑素瘤相關(guān)抗原(為250Kd糖蛋白/蛋白聚糖復(fù)合物，也稱為“蛋白聚糖抗原”)的抗體9.2。27可用于擊中病人體內(nèi)的人黑素瘤靶細胞(Schroff等，JNCI74299，1985;Oldham等，J.Clin.Oncol.21235，1984)。由9.2.27識別的抗原代表了一項困難的生物化學(xué)純化工作，這是因為它需要使用以CsCI梯度離心與抗體親合層析相結(jié)合的選擇性提取技術(shù)。目前只能以小量地分離得到這種抗原，其不足以用于免疫程序。由于抗原量不足，也限制了250Kd組分作為疫苗的潛在應(yīng)用。然而，如能產(chǎn)生出可識別MAb9.2.27的單克隆抗個體基因型抗體，便可為臨床提供一種代用疫苗。已在大鼠和小鼠身上試驗了許多免疫方法學(xué)，以確定可誘導(dǎo)抗鼠單克隆抗體之鼠單抗隆抗個體基因型抗體的最佳方法。這些方法包括了使用可溶性MAb與弗氏佐劑的傳統(tǒng)免疫程序。也有人通過以MAb與白蛋白載體相聯(lián)接制得免疫原，使之越過種屬屏障(進入大鼠和倉鼠)以提高免疫原性。但這些方法學(xué)在產(chǎn)生抗個體基因型抗體方面均未獲得成功。
依據(jù)本發(fā)明的方法，使用聯(lián)在蛋白A-Sepharose上不能溶解的MAb9.2.27，可成功地在大鼠體內(nèi)產(chǎn)生出抗個體基因型抗體。結(jié)果示于表4。
ND未作。
結(jié)果表明大鼠單克隆抗體同免疫原性MAb9.2.27結(jié)合，而不與小鼠單克隆抗體的同一亞類或其它亞類結(jié)合。因而通過制成免疫復(fù)合物使小鼠單克隆抗體成為不溶性的，可有助于降低小鼠或大鼠對小鼠單克隆抗體的自身耐受性。
實施例5產(chǎn)生抗人黑素瘤相關(guān)蛋白聚糖抗原之各個抗原決定基的多單克隆抗體在所設(shè)計的免疫方法中，使用了不能溶解的免疫復(fù)合物，以產(chǎn)生大量抗人黑素瘤相關(guān)蛋白聚糖抗原的單克隆抗體。
為產(chǎn)生抗蛋白聚糖抗原的抗體而使用了三種類型的免疫原。第一種是完整細胞。所用的細胞系包括生長于含10%胎牛血清之DMEM(J.R.Scientific，Woodland，CA)中的A375M/M、SK MEL-28和SK MEL-31，以及生長于無血清培養(yǎng)基(含5mg/升胰島素和鐵傳遞蛋白及5μg/升硒的Ischove氏培養(yǎng)基)中的A375M/M。使用10×106個細胞皮下注射，每周注射一次連續(xù)三周。第二種免疫原是由黑素瘤細胞(如吸附于小扁豆凝集素或麥胚凝集素-Sepharose 4B上之FMX或SK MEL-28(Morgan等，Hybridoma3233，1984))的提取物制得的。使用的第三種類型免疫原是不能溶解的免疫復(fù)合物(如與蛋白-Sepharose結(jié)合的9.2.27和黑素瘤NP-40提取物的復(fù)合物(Giardina等，J.Immunol.待出版))。第二和第三種類型的免疫原每周注射一次，融合前連續(xù)注射六周。第四種免疫方法包括以完整細胞負荷劑量與免疫復(fù)合物結(jié)合使用，其中給小鼠先注射一次完整細胞，之后用不溶性免疫復(fù)合物連續(xù)注射五周。
以免疫的脾細胞與Ag8.653。NS-1骨髓瘤細胞(脾細胞∶骨髓細胞＝10∶1)融合而產(chǎn)生雜交瘤細胞。首先使用兩步驟間接過氧化物酶法(Woodhouse等，J.Natl.Canc.Inst.74383，1985)檢測骨髓瘤與黑素瘤細胞、B細胞和T細胞的結(jié)合能力。骨髓瘤對黑素瘤細胞的結(jié)合為陽性的，但對B和T細胞的結(jié)合為陰性的，之后用流動血細胞計數(shù)法篩分之。
簡單地說，即將B和T細胞的單細胞懸液，以及A375M/M蛋白聚糖陽性和A3751°蛋白聚糖陰性黑素瘤細胞的單細胞懸液與單克隆抗體(濃度為每1×106細胞1μg抗體)一同溫育。之后用異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的羊抗小鼠抗體(Iago Inc.，Burlingame，CA)檢測結(jié)合的單克隆抗體。使用標準化的熒光素顆粒(Becton Dickinson，Mountain View，CA)，在EpicsC細胞熒光照相圖(Coulter Diagnostics，Hialeah，F(xiàn)L)上計算游離的熒光素當量(Fluorescein Equivalents)，以分析靶細胞結(jié)合。圖3顯示了用MAb9.2.27和四種與蛋白聚糖陽性細胞(圖3A)反應(yīng)但不與蛋白聚糖陰性細胞(圖3B)結(jié)合的黑素瘤陽性單克隆抗體進行實驗所得到的結(jié)果。
之后用間接ELISA分析法(Morgan和Mclntyre，Canc.Res.433155，1983)檢測與蛋白聚糖陽性黑素瘤細胞系反應(yīng)，但不與正?；蚩乖幮约毎捣磻?yīng)的單克隆抗體。該分析法是使用骨髓瘤細胞的NP40提取物完成的。有許多假定的抗蛋白聚糖單抗隆抗體可以以相似于MAb9.2.27的方式與骨髓瘤細胞提取物反應(yīng)，而有些則並不與之發(fā)生作用。
之后使用人黑素瘤、皮膚和腎組織樣品，以免疫過氧化物酶染色法進一步檢定產(chǎn)生相似于MAb9.2.27之ELISA圖型的單克隆抗體。后兩種正常組織代表了所有已知與9.2.27有交叉反應(yīng)性的正常組織。強烈著染黑素瘤樣品、皮膚表層內(nèi)基底細胞和腎組織內(nèi)收集管的單克隆被認為是假定的抗蛋白聚糖抗體(“9.2.27樣抗體”)，並對其作進一步的試驗研究。
進行雙決定因素ELISA試驗判定對蛋白聚糖的反應(yīng)活性。以兩種方式作雙決定因素ELISA(double determinant ELISA)試驗。第一種方式是使用MAb9.2.27F(ab)′2作俘獲抗體，同時加入抗原的標準源SK MEL-28NP40提取物，之后再加假定之抗蛋白聚糖抗體的上清液。溫育后用生物素抗小鼠Fc特異性試劑檢測結(jié)合的單克隆抗體。在第二種方式的試驗中，提取物中的抗原被固相抗體-包括MAbs9.2.27、NR-Ml-02、NR-Ml-03、NR-Ml-04和NR-Ml-05所俘獲。以不同的聯(lián)合形式將已經(jīng)生物素基化的同樣抗體用于檢測結(jié)合的抗原。在這些條件下，識別同一抗原決定基的抗體沒有發(fā)生顯色反應(yīng)，而識別特定抗原決定基的抗體則出現(xiàn)了很強的顯色反應(yīng)。由這一試驗可以推定，每種抗體只有一個單一的抗原決定基存在于抗原上，該抗原則已通過被同一抗體俘獲和檢測而得以確定。
可用免疫沉淀法和SDS-PAGE法來進一步估計有這一水平之反應(yīng)活性的抗體，以進一步證實其對蛋白聚糖的反應(yīng)活性。為進行更詳細地評價，試驗選用了五種抗蛋白聚糖抗體。
表5中總結(jié)了融合數(shù)及假定之抗蛋白聚糖抗體的數(shù)目。
表5對融合及檢測結(jié)果的總結(jié)假定之抗蛋白免疫原類型 融合數(shù)目 篩選之雜交瘤的數(shù)目 聚糖MAb的數(shù)目凝集素/提取物 7 1.619 1完整細胞 7 1.767 4免疫復(fù)合物 5 1.261 0完整細胞加 2 1.302 67免疫復(fù)合物完整細胞免疫法產(chǎn)生出相對很少的假定的抗蛋白聚糖抗體。然而，將使用完整細胞致敏加上繼后用不能溶解的MAb9.2.27和蛋白聚糖抗原的免疫復(fù)合物作加強免疫，則可大量產(chǎn)生假定的抗蛋白聚糖抗體。選用了五種假定的抗蛋白聚糖單克隆抗體作進一步分析。表6中列出了這些抗體及產(chǎn)生這些抗體的細胞系。
各命名的細胞系已寄存在A.T.C.C.(Rockville，Maryland)，並在表中指出了各自的登記號。
表6單克隆抗體及雜交瘤細胞系命名單克隆抗體 雜交瘤細胞系 ATCC登記號NR-Ml-02 NR-Ml-02A1923 HB-9352NR-Ml-03 NR-Ml-03A221S HB-9349NR-Ml-04 NR-Ml-04A1993 HB-9351NR-Ml-05 NR-Ml-05A2106 HB-9350NR-Ml-06 NR-Ml-06A3-27 HB-9348表7中給出了檢測這些抗體之反應(yīng)活性的結(jié)果。
就抗蛋白聚糖單克隆抗體進行了更詳細的免疫過氧化物酶法分析。其反應(yīng)活性的模式類同于MAb9.2.27，其包括對有代表性的黑素瘤部分的高密度而且均勻的著染，同時所有經(jīng)抗體染色的細胞均為腫瘤細胞而證實的低度抗原異質(zhì)性。實驗中還發(fā)現(xiàn)平滑肌和內(nèi)皮細胞與所有抗體都有反應(yīng)活性。
還在ELISA和流動細胞計數(shù)法中分別使用雙決定因素及附加分析法，進行了抗蛋白聚糖單克隆抗體的抗原決定基比較。表8所示的結(jié)果表明，MAbs9.2.27、NR-Ml-03和NR-Ml-05在用于俘獲和檢測時，並沒有給出陽性信號，此提示它們各識別一種特定的抗原決定基。反之，MAbs NR-Ml-02和NR-Ml-04當以任何方式結(jié)合使用時均沒有給出陽性信號，因而它們可能是識別同一抗原決定基的。
這一假設(shè)已用流動細胞計數(shù)法測定附加的細胞表面結(jié)合得以進一步證實。通過測定各種抗體的熒光強度，在表9中顯示出各識別不同抗原決定基之抗體的結(jié)合，其熒光強度為單用兩種抗體減去對照抗體之熒光強度理論總合的100%或更多。NR-Ml-04和NR-Ml-02只給出預(yù)期值的一半，此表明這些抗體可識別同一抗原決定基。篩選了61種其它抗蛋白聚糖單克隆抗體，以試驗它們對四個被9.2.27、NR-Ml-03、NR-Ml-05和MR-Ml-02/NR-Ml-04識別的決定基的“疊加性”。被試的61種抗體中沒有一種能識別出如MAb9.2.27(即用于免疫復(fù)合物免疫法的抗體)所識別的同一抗原決定基。61種抗體中有10種顯示可識別由NR-Ml-02和NR-Ml-04識別的同一決定基，而只有3種抗體可識別由NR-Ml-03或NR-Ml-05識別的同一決定基。有48種抗體未能識別由五種已定性的抗體所鑒別出的抗原決定基。
之后使用THP-1(一種表達鼠和人IgG之Fc受體的連續(xù)的單核細胞系)估計有代表性的抗蛋白聚糖單克隆抗體之Fc介導(dǎo)的結(jié)合，結(jié)果如表10所示。因為THP-1細胞系不能表達IgG1的受體，所以IgG-1抗蛋白聚糖單克隆抗體(NR-Ml-02和NR-Ml-04)的結(jié)合是在本底水平。值得注意的是，IgG-2b NR-Ml-05抗體也沒有結(jié)合，而IgG-2a抗體，即NR-Ml-03和9.2.27則結(jié)合得極好。
表10以流動細胞計數(shù)法檢測Fc受體結(jié)合抗體 同型抗體 熒光素當量 試驗對照比例Secondary Alone … 37，000 1.0NR-Ml-02 IgG1 43，000 1.2NR-Ml-04 IgG1 61，000 1.6NR-Ml-05 IgG2b 55，000 1.5NR-Ml-03 IgG2a 186，000 5.09.2.27 IgG2a 196，000 5.3由上述內(nèi)容可以看出，雖然為闡述清楚起見文中描述了本發(fā)明的特定實施方案及實施例，但在不違背本發(fā)明之實質(zhì)和范圍的前提下，是可以作各種改動的。因此除本發(fā)明待批權(quán)利要求
的內(nèi)容外，本發(fā)明將不受限制。
權(quán)利要求
1.一種提高抗體生產(chǎn)的方法，其包括如下步驟使抗體吸附于不能溶解的蛋白A上，以形成一種免疫吸附劑；使抗原與所說的免疫吸附劑結(jié)合，形成一種不能溶解的免疫復(fù)合物；用所說的不能溶解的免疫復(fù)合物免疫動物；並且由所說的被免疫動物體內(nèi)收集抗血清。
2.一種改善可溶性抗原的免疫原性，從而提高特異性單克隆抗體之生產(chǎn)的方法，其包括如下步驟使抗體吸附于不能溶解的蛋白A上，以形成一種免疫吸附劑;使所說的可溶性抗原與所說的免疫吸附劑結(jié)合，以形成一種不能溶解的免疫復(fù)合物;用所說的不能溶解的免疫復(fù)合物免疫動物;使得自被免疫之動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成能產(chǎn)生抗所說可溶性抗原之單克隆抗體的雜交瘤;培養(yǎng)所說的雜交瘤以產(chǎn)生所說的單克隆抗體;並且收集作為所說雜交瘤之產(chǎn)物的所說的單克隆抗體。
3.一種生產(chǎn)對不同于由已有單克隆抗體識別之抗原決定基特異的單克隆抗體的方法，其包括如下步驟使抗多價抗原之第一抗原決定基的第一單克隆抗體吸附在不能溶解的蛋白A上，以形成一種免疫吸附劑;使所說的免疫吸附劑與所說的抗原結(jié)合，形成一種不能溶解的免疫復(fù)合物，其中所說的第一抗原決定基是被所說的第一單克隆抗體掩敝的;用所說的不能溶解的免疫復(fù)合物免疫動物;使得自所說之被免疫動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成能夠產(chǎn)生抗所說第二抗原決定基之第二單克隆抗體的雜交瘤;培養(yǎng)所說的雜交瘤以產(chǎn)生所說的第二單克隆抗體;並且收集作為所說的雜交瘤的產(chǎn)物的所說的第二單克隆抗體。
4.細胞系NR-Ml-02A1923。
5.細胞系NR-Ml-03A2215。
6.細胞系NR-Ml-04A1993。
7.細胞系NR-Ml-05A2106。
8.細胞系NR-Ml-06A3026。
9.一種生產(chǎn)單克隆抗個體基因型抗體的方法，其包括如下步驟使第一抗體吸附在不能溶解的蛋白A上，以形成一種免疫吸附劑;用所說的免疫吸附劑免疫動物;使得自所說被免疫動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成能產(chǎn)生抗所說第一抗體之某抗原決定基的單克隆抗體的雜交瘤;培養(yǎng)所說的雜交瘤以產(chǎn)生所說的單克隆抗體;並且收集作為所說雜交瘤之產(chǎn)物的所說單克隆抗體。
10.一種用作免疫原的不能溶解的免疫復(fù)合物，其包含吸附于不能溶解之蛋白A上的抗體，以及被所說抗體識別並與之結(jié)合的抗原。
11.一種用于生產(chǎn)單克隆抗個體基因型抗體的免疫吸附劑，其包含吸附于不能溶解之蛋白A上的抗體。
12.一種用作免疫原的不能溶解的免疫復(fù)合物，其包含直接同Sepharose相聯(lián)接的抗體，以及可被所說的抗體識別並與之結(jié)合的抗原。
13.由權(quán)利要求
4、5、6、7和8的細胞系生產(chǎn)的單克隆抗體。
專利摘要
公開了一種通過用不能溶解的免疫復(fù)合物免疫以提高抗體生產(chǎn)的方法。可使純化之抗原或不均一性抗原混合物與多克隆或單克隆抗原結(jié)合，并使所得復(fù)合物連接于不能解的蛋白A上以形成不能溶解的免疫復(fù)合物。也公開了改善可溶性抗原之免疫原性及生產(chǎn)單克隆抗個體基團型抗體的方法。還公開了包含抗原及直接于Sepharose上或吸附于不能溶解之蛋白A上的抗體的不能溶解的免疫復(fù)合物，以及包含吸附于不能溶解之蛋白A上的抗體的免疫吸附劑。
文檔編號C07K19/00GK87105716SQ87105716
公開日1988年6月8日 申請日期1987年6月19日
發(fā)明者阿爾頓·C·摩根, 克利夫·S·伍德豪斯, 羅伯特·F·麥克英特爾 申請人:尼奧爾克斯公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan