一種汞螯合型免疫復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及汞螯合型免疫復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫復(fù)合物（Immune complexes，IC)是抗原抗體結(jié)合的產(chǎn)物，根據(jù)全國(guó)科學(xué)技術(shù) 名詞審定委員會(huì)的定義，是指抗體與可溶性抗原結(jié)合而形成的復(fù)合物。它分為兩類，一種是 組織中固定的免疫復(fù)合物，而另一種則是游離于血液中的免疫復(fù)合物，成為循環(huán)免疫復(fù)合 物（circulating immune complexes，CIC)。免疫復(fù)合物在清除和破壞各種抗原中起著不 可缺少的作用，機(jī)體免疫反應(yīng)的結(jié)果就是不斷產(chǎn)生免疫復(fù)合物。當(dāng)機(jī)體內(nèi)抗原（或抗體） 數(shù)量略多于抗體（或抗原）時(shí)，就會(huì)形成中等分子大小的免疫復(fù)合物，它既不易被吞噬細(xì)胞 吞噬，又不能通過腎小球?yàn)V孔排出，可較長(zhǎng)時(shí)間游離于血液和其他體液中。當(dāng)血管壁通透性 增加時(shí)，此類IC可隨血液沉積在某些部位的毛細(xì)血管壁或嵌合在腎小球基底膜上，激活補(bǔ) 體導(dǎo)致免疫復(fù)合物沉積。這些沉積或鑲嵌于血管壁或組織的免疫復(fù)合物，乃造成血管基膜 炎癥和組織損傷的始動(dòng)因素。免疫復(fù)合物可通過以下幾方面造成組織損傷：1)激活補(bǔ)體： 沉積的IC通過激活補(bǔ)體，產(chǎn)生過敏毒素和具有趨化效應(yīng)的活性片段，趨化至局部的肥大細(xì) 胞、嗜堿性粒細(xì)胞釋放活性介質(zhì)致局部血管通透性增高，引起滲出和局部水腫；2)吸引白 細(xì)胞浸潤(rùn)和集聚：中性粒細(xì)胞在吞噬IC時(shí)釋放毒性氧化物和溶酶體酶，損傷鄰近組織；3) 活化血小板：IC可通過活化血小板釋放血管活性胺類物質(zhì)，導(dǎo)致血管擴(kuò)張、通透性增加，加 劇局部滲出和水腫，并激活凝血機(jī)制，形成微血栓，引起局部缺血、出血和組織壞死。
[0003] 多種疾病的發(fā)生都與免疫復(fù)合物的沉積息息相關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征、冷球蛋白血癥、脈管炎、細(xì)菌、病毒和寄生蟲感染、過敏反應(yīng)、自身免疫 疾病、皮膚病等。早在上世紀(jì)90年代，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在正常機(jī)體中，免疫復(fù)合物被不斷降 解，因而一般檢測(cè)不到免疫復(fù)合物或只呈現(xiàn)低濃度，而在上述一系列疾病中，血清中的免疫 復(fù)合物即CIC含量顯著升高。雖然CIC檢測(cè)不具有疾病特異性，但其檢測(cè)能提供關(guān)于免疫 病理、疾病的發(fā)展及預(yù)后方面的信息。在某些微生物感染、自身免疫中，檢測(cè)循環(huán)免疫復(fù)合 物可用作疾病活動(dòng)性、評(píng)價(jià)機(jī)體的機(jī)能和檢測(cè)療效的指標(biāo)。而近些年來，學(xué)者們致力于研究 特異性的免疫復(fù)合物，研究各種特異性免疫復(fù)合物與疾病致病、疾病發(fā)展、疾病診斷等各方 面的關(guān)系，而這些研究將促使我們對(duì)疾病有更深一步了解。
[0004] 萊（Mercury，Hg)是一種無處不在的重金屬，廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)，是 一種非常重要的環(huán)境污染物。2011年，美國(guó)毒物和疾病登記署（United States Agency for Toxic Substances and Disease Registry，ATSDR)已將其列入物質(zhì)優(yōu)先列表內(nèi) (Substance Priority List)，而世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO)也早 已將其列為10大最易引起健康問題的化學(xué)品之一。在美國(guó)，Hg被認(rèn)為是四大環(huán)境污染物 之一，嚴(yán)重影響著人們的身體健康。常見的汞職業(yè)暴露人群包括從事金屬冶煉、開采金礦、 燒煤、電產(chǎn)業(yè)和木材生產(chǎn)的人群，而對(duì)于普通人群主要通過食入汞污染的海鮮、飲入汞污染 水源、吸入燃料燃燒或蒸發(fā)的汞蒸汽。此外，含汞化妝品的接觸、填充汞合金牙科填充物、 接觸疫苗防腐劑中的乙基汞、含汞殺蟲劑的接觸都是常見的汞暴露方式，汞與人們的生活 密切相關(guān)。2009年，國(guó)家健康與營(yíng)養(yǎng)測(cè)試調(diào)查中發(fā)現(xiàn)（National Health and Nutrition Examination Study, NHANES)，2 %的美國(guó)育齡期婦女體內(nèi)的汞都超標(biāo)，可見汞污染是一個(gè) 亟待解決的問題。
[0005] 2004年美國(guó)學(xué)者A. Ramanaviciene等發(fā)現(xiàn)血清中循環(huán)免疫復(fù)合物含量與地方環(huán) 境污染有關(guān)，發(fā)現(xiàn)隨著地區(qū)污染嚴(yán)重程度的增加，當(dāng)?shù)嘏Ｑ逯械腃IC含量顯著增加，差異 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因而可以作為評(píng)價(jià)地區(qū)污染的指標(biāo)。但環(huán)境污染究竟是如何刺激機(jī)體內(nèi) CIC含量顯著升高，是一種還是多種污染物共同作用導(dǎo)致其升高，CIC的升高是否因此會(huì)導(dǎo) 致機(jī)體損傷，增加機(jī)體對(duì)于疾病的易感性，這些都有待研究。眾所周知，循環(huán)免疫復(fù)合物是 一種特殊意義的蛋白質(zhì)，而汞可作用于全身多個(gè)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，汞是否可以作用于循環(huán)免 疫復(fù)合物，而使循環(huán)免疫復(fù)合物含量改變、活性改變、功能改變，這些尚缺乏相關(guān)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種汞螯合型免疫復(fù)合物，該 汞螯合型免疫復(fù)合物是一種相對(duì)特異性的免疫復(fù)合物，用于檢測(cè)地區(qū)人群血清中是否存在 汞螯合型免疫復(fù)合物及其含量，間接反映這個(gè)地區(qū)汞污染程度。
[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0008] -種汞螯合型免疫復(fù)合物，該汞螯合型免疫復(fù)合物為以下復(fù)合物中的一種：
[0009] 汞離子結(jié)合于免疫復(fù)合物形成的復(fù)合物，或
[0010] 汞離子結(jié)合于載體蛋白及能和該載體蛋白特異性結(jié)合的抗體所形成的復(fù)合物；或
[0011] 汞離子結(jié)合于免疫球蛋白后與載體蛋白結(jié)合形成的復(fù)合物。
[0012] 進(jìn)一步地，所述載體蛋白或免疫復(fù)合物至少含有鋅指結(jié)構(gòu)、巰基、半胱氨酸殘基中 一種結(jié)構(gòu)，汞離子通過鋅指結(jié)構(gòu)、巰基、半胱氨酸殘基中至少一種與載體蛋白或免疫復(fù)合物 結(jié)合。
[0013] 具體的，所述載體蛋白為抗體蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、核抗原、異種血清抗原、病 毒、細(xì)菌、原蟲、蠕蟲中的一種。
[0014] 進(jìn)一步的，汞離子通過螯合劑與載體蛋白結(jié)合后再與能和載體蛋白特異性結(jié)合的 抗體結(jié)合。
[0015] 進(jìn)一步的，所述螯合劑為ITCBE、EDTA、多磷酸鹽、氨基羧酸、1，3-二酮、羥基羧酸 中的一種。
[0016] 本發(fā)明還提供了兩種制備汞螯合型免疫復(fù)合物的方法，通過這兩種方法獲得汞螯 合型免疫復(fù)合物。
[0017] 其中，第一種制備方法包括
[0018] A)合成汞螯合型免疫復(fù)合物的步驟：先將螯合劑與載體蛋白結(jié)合，再與汞離子絡(luò) 合；
[0019] B)提純汞螯合型免疫復(fù)合物的步驟：采用免疫親和層析法去除步驟A)合成的汞 螯合型免疫復(fù)合物中未參與反應(yīng)的載體蛋白、特異性抗體及汞離子。
[0020] 具體地，所述汞螯合型免疫復(fù)合物的制備方法中，
[0021] ( I )配制螯合劑溶液：將螯合劑溶解，配制成螯合劑溶液；
[0022] ( II )配制載體蛋白溶液：將載體蛋白加入到硼酸鹽緩沖溶液中，制得載體蛋白溶 液；
[0023] (III)攪拌過夜：將步驟⑴螯合劑溶液加入到步驟（II)的載體蛋白溶液中，攪 拌后于搖床作用2-30h，得到混合液；
[0024] ( IV )透析袋預(yù)處理：在透析袋中加入EDTA-NaHCO3溶液煮沸，棄廢液后用ddH 20 沖洗，重復(fù)該步驟1-3次；
[0025] (V)透析：將步驟（III)的混合液裝入經(jīng)步驟（IV )處理后的透析袋中，用CldH2O 透析，換水2-3次，4°C透析過夜之后，收集液體；
[0026] (VI)汞離子螯合：在上述步驟（V)中的液體中加入HCl溶液調(diào)整pH至7. 0,緩慢加 入汞離子溶液，邊滴加邊震蕩，之后于搖床作用2_30h，然后重復(fù)步驟（V) -次，收集液體， 得到汞螯合型抗原；
[0027] (VII)結(jié)合：在上述萊螯合型抗原中加入能與載體蛋白特異性結(jié)合的抗體，反應(yīng) 后得到汞螯合型免疫復(fù)合物；
[0028] 所述步驟B)具體步驟如下：
[0029] (i)將上述A)步驟合成的汞螯合型免疫復(fù)合物復(fù)溶于生理鹽水中；
[0030] (ii)層析柱預(yù)處理：使用稀釋緩沖液沖洗管路，在層析柱中裝入能與免疫復(fù)合物 特異性結(jié)合的填料，裝柱后繼續(xù)用稀釋緩沖液平衡柱子；
[0031] 所述能與免疫復(fù)合物特異性結(jié)合的填料為吸附有可與免疫復(fù)合物特異性結(jié)合物 質(zhì)的硅膠或樹脂；
[0032] (ii)上樣：待柱子平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（i)所得溶液，然后上柱，汞螯 合型免疫復(fù)合物吸附在填料上，未反應(yīng)的載體蛋白、抗體、汞離子隨稀釋緩沖液流出；
[0033] (iv)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗柱子，至基線平衡，然后使用0. 05-0. lOMol/L的 Na2HP04溶液進(jìn)行洗脫；
[0034] (V)收集：收集步驟（iv)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0035] (vi)收集到的洗脫液裝入透析袋用CldH2O透析除鹽，換水2-4次后，4°C透析過夜， 收集樣本；
[0036] (Vii)層析柱預(yù)處理：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝 入能與汞特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡柱子；
[0037] 所述能與汞特異性結(jié)合的填料為吸附有可與汞特異性結(jié)合物質(zhì)的硅膠或樹脂；
[0038] (Viii)上樣：待步驟（Vii)的柱子平衡后，用稀釋緩沖液稀釋上述步驟（Vi)的樣 本，然后將稀釋后的樣本上柱，汞螯合型免疫復(fù)合物吸附在填料上，未反應(yīng)的抗原抗體復(fù)合 物會(huì)隨稀釋緩沖液流出；
[0039] (ix)洗脫：步驟（Viii)之后用稀釋緩沖液沖洗柱子，至基線平衡，然后使用 0. 5-1. OMol/L的似2即04溶液進(jìn)行洗脫；
[0040] (X)收集：收集步驟（ix)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0041] (xi)對(duì)步驟（X)的洗脫液裝入透析袋用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C透析過 夜，收集樣本，即得到純化的汞螯合型免疫復(fù)合物。
[0042] 本發(fā)明還提供了上述汞螯合型免疫復(fù)合物在制備檢測(cè)汞螯合型免疫復(fù)合物的酶 聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。
[0043] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)汞螯合型免疫復(fù)合物的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒包括 如權(quán)利要求1所述的汞螯合型免疫復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0044] 進(jìn)一步的，上述試劑盒還包括至少一種以下試劑：含有捕獲抗原抗體復(fù)合物的蛋 白的包被液、含有捕獲金屬Hg的抗體的包被液、酶標(biāo)抗體。
[0045] 一種定量檢測(cè)汞螯合型免疫復(fù)合物的方法，其特征在于，以已知含量的汞螯合型 免疫復(fù)合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與原子 吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純免疫復(fù)合物與原子吸收 光譜結(jié)合法、提純免疫復(fù)合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸 收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0046] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0047] 1.首次合成了汞螯合型免疫復(fù)合物，并證實(shí)了在機(jī)體內(nèi)汞可存在于免疫系統(tǒng)，并 證明了汞螯合型免疫復(fù)合物的存在；
[0048] 2.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了免疫復(fù)合物的特異性識(shí)別，并實(shí)現(xiàn)了汞螯合型免疫復(fù)合物的定量 檢測(cè)，提供從免疫角度檢測(cè)機(jī)體內(nèi)的汞含量水平的方法，并為工業(yè)地區(qū)的汞污染水平提供 間接指標(biāo)。
[0049] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0050] 圖1為免疫復(fù)合物非變性電泳條帶圖；
[0051] 圖2為免疫復(fù)合物的電泳條帶的同步輻射線X線熒光分析圖；
[0052] 其中，圖1中的M為Marker，IC為汞螯合型免疫復(fù)合物；圖2中的橫坐標(biāo)為蛋白條