4)洗脫：移去酶標(biāo)抗體，用稀釋緩沖液對(duì)洗脫液進(jìn)行稀釋?zhuān)瓜疵撘褐心竟系鞍?酶的濃度：酶標(biāo)抗體中抗體的濃度=1:80、1:40、1:20、1:10、1:5，分別放置于37°C溫度下 作用lh、2h、3h ;移去洗脫液，洗滌，待洗滌完成后，加入底物，37°C避光作用30分鐘；
[0229] 所述洗脫液的配制方法示例：將木瓜蛋白酶用pH為8. 0、摩爾濃度0. lmol/L的 Tris-HCI緩沖液配制成2mg/mL，再加入二硫蘇糖醇（DTT)，配制成二硫蘇糖醇的濃度為 lmmol/L，37°C孵育 30min ;
[0230] (5)滴加終止液至每一微孔；
[0231] (6)于405nm的檢測(cè)波長(zhǎng)下在酶標(biāo)儀上分別讀取每組OD值，具體結(jié)果參見(jiàn)表3，
[0232] 表3 :ELISA洗脫液最佳工作濃度計(jì)洗脫時(shí)間
[0233]
[0234] 通過(guò)比較OD值，以判斷ELISA孔壁上結(jié)合的汞抗-酶標(biāo)復(fù)合物洗脫程度，當(dāng)OD值 最低時(shí)，抗汞抗體-酶標(biāo)復(fù)合物洗脫程度達(dá)到最大。
[0235] 從表3可知，當(dāng)洗脫液中木瓜蛋白酶的濃度：酶標(biāo)抗體中抗體的濃度=1:20時(shí)， 各組OD值均低于其他組，說(shuō)明在該濃度洗脫液洗脫效果達(dá)到最優(yōu)；而作用時(shí)間不管是lh、 2h、3h，各組OD值變化均不大，可見(jiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸減弱，在酶濃度不變的情 況下，延長(zhǎng)消化時(shí)間并不能提高消化率，所以本實(shí)驗(yàn)中洗脫液的作用時(shí)間為l_3h皆可。
[0236] 應(yīng)用實(shí)施例
[0237] I. ELISA法檢測(cè)血漿中汞螯合型免疫復(fù)合物
[0238] 采用方法一提供的ELISA法，對(duì)100個(gè)血漿樣品進(jìn)行檢測(cè)，具體操作條件如下：
[0239] 1)固載：將補(bǔ)體Clq包被于聚丙烯固相載體上，用稀釋緩沖液按I :2500的倍比稀 釋?zhuān)又罞LISA板微孔中，4°C下存放16小時(shí)；
[0240] 2)封閉：移去稀釋緩沖液，洗滌，加封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，洗滌；
[0241] 3)加樣：分別加待測(cè)血漿樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，將樣品用稀釋緩沖液按I :20的倍比稀 釋?zhuān)又罞LISA板微孔中，37°C溫育1. 5小時(shí)；
[0242] 4)捕獲：移去待測(cè)血漿，洗滌，加入用稀釋緩沖液按1:2500的倍比稀釋的抗汞抗 體，37°C溫育1. 5小時(shí)；
[0243] 5)酶結(jié)合物溫育：移去抗汞抗體，洗滌，加入抗體濃度為2 μ g/mL的酶標(biāo)抗體， 37°C溫育1. 5小時(shí)；
[0244] 6)底物溫育：移去酶標(biāo)抗體，洗滌，待洗滌完成后，加入底物，37°C避光作用30分 鐘，向ELISA板微孔加入終止液；
[0245] 7)檢測(cè)：于405nm波長(zhǎng)下在酶標(biāo)儀上分別讀取待測(cè)血漿樣品和上述汞螯合型免疫 復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，結(jié)果如表4所示。
[0246] 表4采用方法一對(duì)100份標(biāo)本血漿的實(shí)測(cè)結(jié)果
[0247]
[0248] CN 105137059 A m ~P 17/19 頁(yè)
[0249] 2、ELISA+AAS法檢測(cè)血漿中鉻螯合型免疫復(fù)合物
[0250] 采用本發(fā)明方法二提供的Elisa方法與AAS方法結(jié)合的方法，對(duì)100個(gè)血漿樣品 進(jìn)行檢測(cè)，具體操作條件如下：
[0251] 1)固載：將補(bǔ)體CIF蛋白包被于聚苯乙烯固相載體上，用稀釋緩沖液按1:2500的 倍比稀釋?zhuān)又罞LISA板微孔中，4°C下存放16小時(shí)；
[0252] 2)封閉：移去稀釋緩沖液，洗滌，加封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，洗滌；
[0253] 3)溫育：分別加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)血漿樣品，將樣品用稀釋緩沖液按1:20的倍比稀 釋?zhuān)又罞LISA板微孔中，37°C溫育2小時(shí)；
[0254] 4)洗脫：移去待測(cè)樣品，洗滌，加入木瓜蛋白酶濃度為100 μ g/mL的洗脫液，37°C 下作用1小時(shí)；
[0255] 5)檢測(cè)：采用原子吸收光譜儀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)血漿樣品中螯合于循環(huán)免疫復(fù) 合物上的鉛，檢測(cè)結(jié)果如表5所示。
[0256] 表5采用方法二對(duì)100份標(biāo)本血漿的實(shí)測(cè)結(jié)果
[0257]
[0258] UiN 丄 丄 CUUijy Λ J 丄 O/ 丄；7
[0259] 應(yīng)用實(shí)施例3 ：
[0260] 采用本發(fā)明方法三提供的Elisa與ICP-MS結(jié)合的方法，以實(shí)施例1提供的汞螯合 型免疫復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)100個(gè)血漿樣品進(jìn)行檢測(cè)，具體操作條件如下：
[0261] 1)固載：將抗C3抗體包被于聚苯乙烯固相載體上，用稀釋緩沖液按1:2500的倍 比稀釋?zhuān)又罞LISA板微孔中，37°C水浴1小時(shí)后貯存于冰箱；
[0262] 2)封閉：移去稀釋緩沖液，洗滌，加封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，洗滌；
[0263] 3)溫育：分別加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)血漿樣品，將樣品用稀釋緩沖液按1:20的倍比稀 釋?zhuān)又罞LISA板微孔中，37°C溫育2小時(shí)；
[0264] 4)洗脫：移去待測(cè)樣品，洗滌，加入木瓜蛋白酶濃度為100 μ g/mL的洗脫液，37°C 下作用1小時(shí)；
[0265] 5)酸化：加入硝酸對(duì)溶液進(jìn)行酸化，封口過(guò)夜，徹底酸化，加入雙氧水，并且加熱 趕酸；
[0266] 6)檢測(cè)：取樣于電感耦合等離子體質(zhì)譜儀下檢測(cè)螯合于循環(huán)免疫復(fù)合物上的汞， 讀出相應(yīng)數(shù)值并計(jì)算含量，結(jié)果如表6所示。
[0267] 表6采用方法三對(duì)100份標(biāo)本血漿的實(shí)測(cè)結(jié)果
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[0270] 上述實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不能以此來(lái)限定本發(fā)明保護(hù)的范圍， 本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所 要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種汞螯合型免疫復(fù)合物，其特征在于，該汞螯合型免疫復(fù)合物為以下復(fù)合物中的 一種： 汞離子結(jié)合于免疫復(fù)合物形成的復(fù)合物，或 汞離子結(jié)合于載體蛋白及能和該載體蛋白特異性結(jié)合的抗體所形成的復(fù)合物；或 汞離子結(jié)合于免疫球蛋白后與載體蛋白結(jié)合形成的復(fù)合物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的汞螯合型免疫復(fù)合物，其特征在于，所述載體蛋白或免疫復(fù) 合物至少含有鋅指結(jié)構(gòu)、巰基、半胱氨酸殘基中一種結(jié)構(gòu)，汞離子通過(guò)鋅指結(jié)構(gòu)、巰基、半胱 氨酸殘基中至少一種與載體蛋白或免疫復(fù)合物結(jié)合。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的汞螯合型免疫復(fù)合物，其特征在于，所述載體蛋白為抗體蛋 白、脂蛋白、血紅蛋白、核抗原、異種血清抗原、病毒、細(xì)菌、原蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)中的一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的汞螯合型免疫復(fù)合物，其特征在于，其中，汞離子通過(guò)螯合劑 與載體蛋白結(jié)合后再與能和載體蛋白特異性結(jié)合的抗體結(jié)合。5. -種如權(quán)利要求1所述的汞螯合型免疫復(fù)合物的制備方法，其特征在于，該制備方 法包括： A) 合成汞螯合型免疫復(fù)合物的步驟； B) 提純汞螯合型免疫復(fù)合物的步驟：采用免疫親和層析法去除步驟A)合成的汞螯合 型免疫復(fù)合物中未參與反應(yīng)的載體蛋白、特異性抗體及汞離子。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于， 所述步驟A)具體步驟為： (I )配制螯合劑溶液：將螯合劑溶解，配制成螯合劑溶液； (II )配制載體蛋白溶液：將載體蛋白加入到硼酸鹽緩沖溶液中，制得載體蛋白溶液； (III)攪拌過(guò)夜：將步驟⑴螯合劑溶液加入到步驟（II)的載體蛋白溶液中，攪拌后 于搖床作用2-30h，得到混合液； (IV )透析袋預(yù)處理：在透析袋中加入EDTA-NaHOV^液煮沸，棄廢液后用CldH2O沖洗， 重復(fù)該步驟1_3次； (V) 透析：將步驟（III)的混合液裝入經(jīng)步驟（IV)處理后的透析袋中，用CldH2O透析， 換水2-3次，4°C透析過(guò)夜之后，收集液體； (VI) 汞離子螯合：在上述步驟（V)中的液體中加入HCl溶液調(diào)整pH至7. 0,緩慢加入 汞離子溶液，邊滴加邊震蕩，之后于搖床作用2-30h，然后重復(fù)步驟（V) -次，收集液體，得 到汞螯合型抗原； (VII) 結(jié)合：在上述汞螯合型抗原中加入能與載體蛋白特異性結(jié)合的抗體，反應(yīng)后得 到汞螯合型免疫復(fù)合物； 所述步驟B)具體步驟如下： (i) 將上述A)步驟合成的汞螯合型免疫復(fù)合物復(fù)溶于生理鹽水中； (ii) 層析柱預(yù)處理：使用稀釋緩沖液沖洗管路，在層析柱中裝入能與免疫復(fù)合物特異 性結(jié)合的填料，裝柱后繼續(xù)用稀釋緩沖液平衡柱子； (ii)上樣：待柱子平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（i)所得溶液，然后上柱，汞螯合型 免疫復(fù)合物吸附在填料上，未反應(yīng)的載體蛋白、抗體、汞離子隨稀釋緩沖液流出； (iv)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗柱子，至基線平衡，然后使用〇. 05-0. lOMol/L的 Na2HP0j§液進(jìn)行洗脫； (v) 收集：收集步驟（iv)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性； (vi) 收集到的洗脫液裝入透析袋用CldH2O透析除鹽，換水2-4次后，4°C透析過(guò)夜，收集 樣本； (vii) 層析柱預(yù)處理：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與汞特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡柱子； (viii) 上樣：待步驟（vii)的柱子平衡后，用稀釋緩沖液稀釋上述步驟（vi)的樣本， 然后將稀釋后的樣本上柱，汞螯合型免疫復(fù)合物吸附在填料上，未反應(yīng)的抗原抗體復(fù)合物 會(huì)隨稀釋緩沖液流出； (ix) 洗脫：步驟（viii)之后用稀釋緩沖液沖洗柱子，至基線平衡，然后使用 0. 5-1. OMol/L的似2即04溶液進(jìn)行洗脫； (X)收集：收集步驟（ix)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性； (xi)對(duì)步驟（X)的洗脫液裝入透析袋用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C透析過(guò)夜，收 集樣本，即得到純化的汞螯合型免疫復(fù)合物。7. 如權(quán)利要求1所述的汞螯合型免疫復(fù)合物在制備檢測(cè)汞螯合型免疫復(fù)合物的酶聯(lián) 免疫試劑盒中的應(yīng)用。8. -種檢測(cè)汞螯合型免疫復(fù)合物的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括如權(quán) 利要求1所述的汞螯合型免疫復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)品。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括至少一種以 下試劑：含有捕獲抗原抗體復(fù)合物的蛋白的包被液、含有捕獲金屬Hg的抗體的包被液、酶 標(biāo)抗體。10. -種定量檢測(cè)汞螯合型免疫復(fù)合物的方法，其特征在于，以已知含量的權(quán)利要求1 所述的汞螯合型免疫復(fù)合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)：酶聯(lián)免疫法、 酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純免疫復(fù) 合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純免疫復(fù)合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶 聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種汞螯合型免疫復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用，該汞螯合型免疫復(fù)合物為以下復(fù)合物中的一種：汞離子結(jié)合于免疫復(fù)合物形成的復(fù)合物，或汞離子結(jié)合于載體蛋白及能和該載體蛋白特異性結(jié)合的抗體所形成的復(fù)合物；或汞離子結(jié)合于免疫球蛋白后與載體蛋白結(jié)合形成的復(fù)合物。本發(fā)明所述汞螯合型免疫復(fù)合物的是一種相對(duì)特異性的免疫復(fù)合物，用于檢測(cè)地區(qū)人群血清中是否汞螯合型免疫復(fù)合物及含量，間接反映這個(gè)地區(qū)汞污染程度。
【IPC分類(lèi)】G01N33/53, G01N33/531
【公開(kāi)號(hào)】CN105137059
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510411290
【發(fā)明人】張積仁, 陽(yáng)帆, 董欣敏, 吳婧, 蔡睿, 孫遙, 趙乙木
【申請(qǐng)人】上海拜豪生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年7月14日