帶位置，縱坐標(biāo)為該蛋白條帶中汞金屬能量。
【具體實(shí)施方式】
[0053] -種汞螯合型免疫復(fù)合物，該汞螯合型免疫復(fù)合物為以下復(fù)合物中的一種：
[0054] 汞離子結(jié)合于免疫復(fù)合物形成的復(fù)合物，或
[0055] 汞離子結(jié)合于載體蛋白及能和該載體蛋白特異性結(jié)合的抗體所形成的復(fù)合物；或
[0056] 汞離子結(jié)合于免疫球蛋白后與載體蛋白結(jié)合形成的復(fù)合物。
[0057] 具體的，所述載體蛋白或免疫復(fù)合物至少含有鋅指結(jié)構(gòu)、巰基、半胱氨酸殘基中一 種結(jié)構(gòu)，汞離子通過鋅指結(jié)構(gòu)、巰基、半胱氨酸殘基中至少一種與載體蛋白或免疫復(fù)合物結(jié) 合。
[0058] 具體的，所述載體蛋白為抗體蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、核抗原、異種血清抗原、病 毒、細(xì)菌、原蟲、蠕蟲中的一種。
[0059] 進(jìn)一步的，汞離子通過螯合劑與載體蛋白結(jié)合后再與能和載體蛋白特異性結(jié)合的 抗體結(jié)合。
[0060] 進(jìn)一步的，所述螯合劑為ITCBE、EDTA、谷胱甘肽（GSH)、多磷酸鹽、氨基羧酸、 1，3-二酮、羥基羧酸中的一種。
[0061] 本發(fā)明還提供了兩種制備汞螯合型免疫復(fù)合物的方法，通過這兩種方法獲得汞螯 合型免疫復(fù)合物。
[0062] 其中，第一種制備方法包括
[0063] A)合成汞螯合型免疫復(fù)合物的步驟；
[0064] B)提純汞螯合型免疫復(fù)合物的步驟：采用免疫親和層析法去除步驟A)合成的汞 螯合型免疫復(fù)合物中未參與反應(yīng)的載體蛋白、特異性抗體及汞離子。
[0065] 具體地，所述汞螯合型免疫復(fù)合物的制備方法中，
[0066] ( I )配制螯合劑溶液：將螯合劑溶解，配制成螯合劑溶液；
[0067] ( II )配制載體蛋白溶液：將載體蛋白加入到硼酸鹽緩沖溶液中，制得載體蛋白溶 液；
[0068] (III)攪拌過夜：將步驟⑴螯合劑溶液加入到步驟（II)的載體蛋白溶液中，攪 拌后于搖床作用2-30h，得到混合液；
[0069] ( IV )透析袋預(yù)處理：在透析袋中加入EDTA-NaHCO3溶液煮沸，棄廢液后用ddH 20 沖洗，重復(fù)該步驟1-3次；
[0070] (V)透析：將步驟（III)的混合液裝入經(jīng)步驟（IV )處理后的透析袋中，用CldH2O 透析，換水2-3次，4°C透析過夜之后，收集液體；
[0071] (VI)汞離子螯合：在上述步驟（V)中的液體中加入HCl溶液調(diào)整pH至7. 0,緩慢加 入汞離子溶液，邊滴加邊震蕩，之后于搖床作用2-30h，然后重復(fù)步驟（V) -次，收集液體， 得到汞螯合型抗原；
[0072] (VII)結(jié)合：在上述萊螯合型抗原中加入能與載體蛋白特異性結(jié)合的抗體，反應(yīng) 后得到汞螯合型免疫復(fù)合物；
[0073] 所述步驟B)具體步驟如下：
[0074] (i)將上述A)步驟合成的汞螯合型免疫復(fù)合物復(fù)溶于生理鹽水中；
[0075] (ii)層析柱預(yù)處理：使用稀釋緩沖液沖洗管路，在層析柱中裝入能與免疫復(fù)合物 特異性結(jié)合的填料，裝柱后繼續(xù)用稀釋緩沖液平衡柱子；
[0076] (ii)上樣：待柱子平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（i)所得溶液，然后上柱，汞螯 合型免疫復(fù)合物吸附在填料上，未反應(yīng)的載體蛋白、抗體、汞離子隨稀釋緩沖液流出；
[0077] (iv)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗柱子，至基線平衡，然后使用0. 05-0. lOMol/L的 Na2HP04溶液進(jìn)行洗脫；
[0078] (V)收集：收集步驟（iv)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0079] (vi)收集到的洗脫液裝入透析袋用CldH2O透析除鹽，換水2-4次后，4°C透析過夜， 收集樣本；
[0080] (Vii)層析柱預(yù)處理：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝 入能與汞特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡柱子；
[0081] (Viii)上樣：待步驟（Vii)的柱子平衡后，用稀釋緩沖液稀釋上述步驟（vi)的樣 本，然后將稀釋后的樣本上柱，汞螯合型免疫復(fù)合物吸附在填料上，未反應(yīng)的抗原抗體復(fù)合 物會(huì)隨稀釋緩沖液流出；
[0082] (ix)洗脫：步驟（Viii)之后用稀釋緩沖液沖洗柱子，至基線平衡，然后使用 0. 5-1. OMol/L的似2即04溶液進(jìn)行洗脫；
[0083] (X)收集：收集步驟（ix)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0084] (xi)對步驟（X)的洗脫液裝入透析袋用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C透析過 夜，收集樣本，即得到純化的汞螯合型免疫復(fù)合物。
[0085] 本發(fā)明還提供了上述汞螯合型免疫復(fù)合物在制備檢測汞螯合型免疫復(fù)合物的酶 聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。
[0086] 本發(fā)明還提供了一種檢測汞螯合型免疫復(fù)合物的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒包括 如權(quán)利要求1所述的汞螯合型免疫復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0087] 進(jìn)一步的，上述試劑盒還包括至少一種以下試劑：含有捕獲抗原抗體復(fù)合物的蛋 白的包被液、含有捕獲金屬Hg的抗體的包被液、酶標(biāo)抗體。
[0088] 在本發(fā)明中，能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的試劑盒可以列出以下幾種，但并不限于此。
[0089] 一種用于檢測汞螯合循環(huán)免疫復(fù)合物的試劑盒，包括：含有可捕獲抗原抗體復(fù)合 物的蛋白的包被液、封閉液、洗滌緩沖液、抗汞抗體、酶標(biāo)抗體、底物、終止液、稀釋緩沖液、 陽性對照、陰性對照。
[0090] 一種用于檢測汞螯合循環(huán)免疫復(fù)合物的試劑盒，包括：含有可捕獲抗原抗體復(fù)合 物的蛋白的包被液、封閉液、洗滌緩沖液、洗脫液、陽性對照、陰性對照。
[0091] -種用于檢測汞螯合循環(huán)免疫復(fù)合物的試劑盒，包括：含有可捕獲抗原抗體復(fù)合 物的蛋白的包被液、封閉液、洗滌緩沖液、洗脫液、硝酸、過氧化氫、陽性對照、陰性對照。 [0092] 一種用于檢測汞螯合循環(huán)免疫復(fù)合物的試劑盒，包括用于提純血清免疫復(fù)合物所 需溶液、復(fù)溶液、含有可捕獲金屬汞的抗體的包被液、封閉液、洗滌緩沖液、酶標(biāo)抗體、底物、 終止液、稀釋緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照。
[0093] 一種用于檢測汞螯合循環(huán)免疫復(fù)合物的試劑盒：包括用于提純血清免疫復(fù)合物所 需溶液、復(fù)溶液、陽性對照、陰性對照。
[0094] -種用于檢測汞螯合循環(huán)免疫復(fù)合物的試劑盒，包括用于提純血清免疫復(fù)合物所 需溶液、復(fù)溶液、硝酸、過氧化氫、陽性對照、陰性對照等。
[0095] 一種用于檢測汞螯合循環(huán)免疫復(fù)合物的試劑盒，包括用于提純血清免疫復(fù)合物所 需溶液、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、上樣緩沖液、溶解膠床上含抗原抗體復(fù)合物的蛋白條帶所需液 體、含有可捕獲金屬汞的抗體的包被液、封閉液、洗滌緩沖液、酶標(biāo)抗體、底物、終止液、稀釋 緩沖液、陽性對照、陰性對照等。
[0096] -種用于檢測汞螯合循環(huán)免疫復(fù)合物的試劑盒，包括用于提純血清免疫復(fù)合物所 需溶液、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、上樣緩沖液、溶解膠床上含抗原抗體復(fù)合物的蛋白條帶所需液 體、陽性對照、陰性對照等。
[0097] -種用于檢測汞螯合循環(huán)免疫復(fù)合物的試劑盒，包括用于提純血清免疫復(fù)合物所 需溶液、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、上樣緩沖液、溶解膠床上含抗原抗體復(fù)合物的蛋白條帶所需液 體、硝酸、過氧化氫、陽性對照、陰性對照等。
[0098] 上述幾種試劑盒中，所述捕獲循環(huán)免疫復(fù)合物的蛋白，包括但不限于補(bǔ)體ClqXIF 蛋白、抗 C3 抗體，如貨號為"NOVUS H00000712-p01" 的 Clq Recombinant Protein;所述捕 獲金屬汞的抗體包括但不限于購買自巴傲得生物科技有限公司貨號為"巴傲得AP7014"的 鼠抗Hg mAb ;封閉液為質(zhì)量濃度為1% -5%的牛血清蛋白或脫脂奶粉；洗脫液包括但不限 于木瓜蛋白酶的Tris-HCl緩沖溶液；所述膠床介質(zhì)包括但不限于瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺 凝膠；用于提純血清免疫復(fù)合物所需溶液包括但不限于PEG溶液、硼酸鹽緩沖液；底物包括 但不限于TMB溶液、ABTS溶液；所述上樣緩沖液包括但不限于含有溴酚藍(lán)的Tris-HCl緩沖 溶液；酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體，如HRP酶標(biāo)抗體；標(biāo) 準(zhǔn)品包括但不限于本發(fā)明的汞螯合型循環(huán)免疫復(fù)合物、其他螯合有汞金屬的免疫復(fù)合物； 陽性對照包括但不限于本發(fā)明汞螯合型循環(huán)免疫復(fù)合物、其他螯合有汞金屬的免疫復(fù)合 物，陰性對照為稀釋緩沖液。
[0099] 本發(fā)明還提供了一種定量檢測汞螯合型免疫復(fù)合物的方法，以已知含量的汞螯合 型免疫復(fù)合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對樣品進(jìn)行檢測：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與原 子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純免疫復(fù)合物與原子吸 收光譜結(jié)合法、提純免疫復(fù)合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子 吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0100] 在本發(fā)明中，用檢測汞螯合型免疫復(fù)合物的方法可以列出的有以下幾種，但并不 限于以下幾種。
[0101] 本發(fā)明除特別說明外，涉及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，試劑、材料如 下述所列舉，在本發(fā)明中沒有列舉出來的均為本領(lǐng)域常用的或者可以通過市購方式獲得， 以下是本發(fā)明使用到的試驗(yàn)用試劑如下：
[0102] 稀釋緩沖液為pH 9. 6的0. 05M碳酸鹽緩沖液，配制方法示例：取I. 5g的Na2COjP 2. 93g 的 NaHCO3溶解加 CldH2O 定容至 1000 mL ;
[0103] 洗滌緩沖液為ρΗ7· 4的0· 15M PBS緩沖液，配制方法示例：取0· 2g的ΚΗ2Ρ04、2· 90g 的 Na2HPO4 ·12Η20、8· Og 的 NaCl、0· 2g 的 KCl、0· 5mL Tween-20,溶解加 ddH20 定容至 1000 mL ;
[0104] 封閉液為牛血清蛋白溶液，配制方法示例：取0.1 g牛血清蛋白，加入洗滌緩沖液 稀釋定容至IOOmL ;
[0105] 終止液為2M H2SO4,配制方法示例：取178. 3mL的CldH2O，向CldH2O中逐滴沿壁加入 濃H2SO 4，邊加邊攪拌，定容至200mL ;
[0106] 底物緩沖液的pH為5. 0, Na2HPO4的摩爾濃度為0. 2M、檸檬酸的摩爾濃度為0. 1M， 每50mL的底物緩沖液的制備方法如下：取I. 42gNa2HP04、0. 96g檸檬酸，然后加入CldH2O至 50mL，即得；
[0107] 底物為甲基聯(lián)苯胺（簡稱TMB)溶液，該甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液由按照如下比例的 組分配制而成：TMB :底物緩沖液：0. 75% H2O2= 0. 5mL :10mL :32 μ L，其中TMB為2g/L的甲 基聯(lián)苯胺乙醇溶液；
[0108] 可以捕獲免疫復(fù)合物的蛋白為可與免疫復(fù)合物特異性結(jié)合的蛋白，包括但不限于 如補(bǔ)體ClqXIF蛋白、抗C3抗體；以下實(shí)施例中，可以捕獲免疫復(fù)合物的蛋白具體使用的是 貨號為 "NOVUS H00000712-p01" 的 Clq Recombinant Protein;
[0109] 捕獲汞的物質(zhì)為購買自巴傲得生物科技有限公司貨號為"巴傲得AP7014"的鼠抗 HgmAb ;其中，本發(fā)明所述與汞特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗Hg抗體、抗汞抗體均為捕獲汞的物質(zhì)； [0110] 所述能與人血清白蛋白特異性結(jié)合的抗體為兔抗人血清白蛋白抗體，為市售；
[0111] 以下所述稀釋倍比為重量體積比。
[0112] 方法一 =ELISA法檢測汞螯合型免疫復(fù)合物，