專利名稱：亞氨基糖衍生物在抑制離子通道活性中的應(yīng)用的制作方法
相關(guān)申請的交叉引用本申請要求于2002年9月23日申請的美國臨時申請順序號60/412,560的優(yōu)先權(quán)，所述臨時申請通過引用全部結(jié)合到本文中。
背景丙型肝炎病毒(HCV)是具有晚期肝硬化和肝細(xì)胞癌的顯著危險的慢性肝炎的主要原因(參見Di Bisceglie，A.M.，(1997)Hepatology 26(3增刊1)345-385)。HCV屬于黃病毒科(Flaviviridae)，該科由三個屬組成黃病毒(flavivirus)、瘟病毒(pestivirus)和嗜肝病毒(hepacivirus)。當(dāng)缺乏合適的小動物模型和可靠的體外感染性測定用于HCV時，先用一種相關(guān)的瘟病毒即牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)，初步測試潛在的抗病毒藥物。已經(jīng)采用BVDV體外感染性測定證明，含有葡萄糖類似物1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡萄糖醇(也稱為脫氧野尻霉素(deoxynojirimycin)或“DNJ”)或者半乳糖類似物1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-半乳糖醇(也稱為脫氧半乳糖野尻霉素(deoxygalactonojirimycin)或“DGJ”)的烷基化亞氨基糖衍生物是有效的抗病毒抑制劑(參見Durantel，D.等，(2001)J. Virol.75(19)8987-98)。
DNJ衍生物至少是部分抗病毒抑制劑，因為它們抑制ERα-葡糖苷酶I和II。這些酶去除形成N聚糖前體部分的三個葡萄糖殘基，所述前體被整個地轉(zhuǎn)移給ER中的新生糖蛋白。ERα-葡糖苷酶的抑制阻止含N聯(lián)寡糖的單葡萄糖基化糖蛋白的形成，并且阻止含N聯(lián)寡糖的單葡萄糖基化糖蛋白隨后與駐留在ER中的陪伴分子鈣聯(lián)接蛋白和鈣網(wǎng)蛋白的相互作用(參見Bergeron，J.J.等，(1994)TrendsBiochem.Sci.19(3)第124-8頁；Peterson，JR.等，(1995)Mol.Biol.Cell6(9)1173-84)。對于包括BVDV包膜糖蛋白和HCV包膜糖蛋白在內(nèi)的許多宿主編碼的和病毒編碼的糖蛋白的適當(dāng)折疊來說，鈣聯(lián)接蛋白相互作用是至關(guān)重要的(參見Branza-Nichita，N.等，(2001)J Virol.75(8)3527-36；Choukhi，A.等，(1998)J. Virol.，1998 72(5)3851-8)。BVDV包膜糖蛋白的錯折疊會降低病毒粒子從感染細(xì)胞中的分泌。
先前實驗已經(jīng)顯示，長鏈烷基衍生物N-壬基-DNJ(NN-DNJ)的抗病毒效果比短鏈烷基衍生物N-丁基-DNJ(NB-DNJ)更顯著，盡管后者在細(xì)胞中達(dá)到更有效的ERα-葡糖苷酶抑制(參見Durantel，D.等，(2001)J. Virol.75(19)8987-98)。另外，不被識別ERα-葡糖苷酶的長鏈烷基DGJ-衍生物和不抑制ERα-葡糖苷酶的長鏈烷基DGJ-衍生物也顯示出有效的抗病毒活性。因此，ER α-葡糖苷酶抑制與觀察到的抗病毒效果沒有直接關(guān)系，排除了它作為單獨的抗病毒機(jī)制。
其它的作用機(jī)制顯然與烷基側(cè)鏈長度有關(guān)，因為短鏈N-丁基-DGJ(NB-DGJ)沒有顯示出抗病毒活性，而長鏈烷基衍生物NN-DGJ卻是有效的抑制劑。然而，這與烷基化亞氨基糖衍生物的兩親性去垢劑樣效應(yīng)并無關(guān)系，因為在體外BVDV感染性測定中，結(jié)構(gòu)類似的去垢劑n-辛基葡萄糖苷(n-OG)和n-壬基葡萄糖苷都不是抗病毒劑(參見Durantel，D.等，(2001)J.Virol.75(19)8987-98)。藥物處理影響病毒膜糖蛋白的二聚作用并且改變了BVDV病毒粒子分泌的膜糖蛋白組成，但并不影響病毒RNA復(fù)制，也不影響病毒蛋白質(zhì)合成。
因其ERα-葡糖苷酶抑制活性，無論是長鏈還是短鏈烷基DNJ-衍生物都對登革病毒(DENV)和日本腦炎病毒(JEV)等黃病毒具有抗病毒性(參見Courageot，M.P.等，(2000)J Virol.74(1)564-72；Wu，S.F.等，(2002)J.Virol.，76(8)3596-604)。相比之下，DGJ-衍生物沒有顯示出針對黃病毒的抗病毒活性，但長鏈烷基DGJ-衍生物卻是有效的瘟病毒抑制劑。與更密切相關(guān)的瘟病毒和嗜肝病毒不同，黃病毒不含p7或類似的小跨膜蛋白。同樣，DNJ-衍生物和DGJ-衍生物可通過抑制p7或類似蛋白，抑制病毒復(fù)制。
HCV正鏈RNA基因組編碼一種約3000個氨基酸殘基的多蛋白前體。該多蛋白通過病毒蛋白酶和細(xì)胞蛋白酶進(jìn)行共翻譯和翻譯后加工，以產(chǎn)生成熟的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B(有關(guān)綜述參見Reed，K.E.和C.M.Rice，(2000)Curr.Top.Microbiol Immunol 242第55-84頁)，以及來自多蛋白N-端區(qū)的核糖體移碼的潛在的F蛋白(參見Xu，Z.等，(2001)EMBO J.20(14)第3840-8頁)。盡管在翻譯過程中或緊接著在翻譯后，有效完成了多蛋白前體的大多數(shù)切割，但是在E2/p7和p7/NS2位點的切割卻是延遲的，導(dǎo)致產(chǎn)生E2-p7-NS2前體。此外，在E2和p7間的加工是不完全的，導(dǎo)致E2-p7以及E2和p7的產(chǎn)生(參見Lin，C.等，(1994)J. Virol.68(8)第5063-73頁；Mizushima，H.等，(1994)J.Virol.68(10)第6215-22頁)。
因為沒有可用的HCV復(fù)制的細(xì)胞培養(yǎng)模型，所以，有關(guān)HCV復(fù)制的信息都是通過使用BVDV細(xì)胞培養(yǎng)模型而來。同樣，有關(guān)p7的大多數(shù)功能性數(shù)據(jù)是從BVDV p7(一種與HCV p7非常類似的70個氨基酸的蛋白)的研究中獲得。通過將突變引入到感染性BVDV的cDNA克隆，已經(jīng)得到有關(guān)BVDV p7的功能性數(shù)據(jù)。完整p7基因的一個符合讀框的缺失并不影響B(tài)VDV RNA復(fù)制，但卻導(dǎo)致產(chǎn)生非感染性病毒粒子。然而，可通過補(bǔ)充p7，產(chǎn)生感染性病毒粒子(參見Harada，T.，N.Tautz和H.J.Thiel，(2000)J.Virol.74(20)9498-506)，這表明瘟病毒p7對感染性子代病毒的產(chǎn)生是必要的。
HCV p7蛋白是63個氨基酸的肽，其已顯示出是兩次跨膜的多境起源的膜蛋白，并且其N-端和C-端朝向胞外環(huán)境(參見Carrere-Kremer，S.等，(2002)J.Virol.76(8)3720-30)。同樣，p7蛋白已顯示出包括兩個跨膜結(jié)構(gòu)域。其N-端跨膜結(jié)構(gòu)域包括從大約位置10到大約位置32的氨基酸，而其C-端跨膜結(jié)構(gòu)域包括從大約位置36到大約位置58的氨基酸。盡管在所有HCV病毒株中這兩個跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸有所不同，但對于已報道的病毒株來說，跨膜結(jié)構(gòu)域的大部分氨基酸(通常約大于70％)是疏水性氨基酸，其特征為F、I、W、Y、L、V、M、P、C和A。這兩個跨膜結(jié)構(gòu)域通過三個非疏水性氨基酸(K或R、G、R或K)連接，p7的共有序列是ALENLVVLNAASAAGTHGILWFLVFFCAAWYVKGRLVPGATYSLLGLWPLLLLLLALPQRAYA(SEQ ID NO.1)(參見Carrere-Kremer，S.等，(2002)J.Virol.76(8)3720-30)。
亞基因組復(fù)制子的研究已經(jīng)顯示，HCV p7對基因組復(fù)制并不是必須的(參見Lohmann，V.等，(1999)Science 285(5424)第110-3頁；Pietschmann，T.等，(2001)J.Virol.75(3)第1252-64頁)，但是其在產(chǎn)生感染性病毒中的作用尚不清楚。已表明HCV p7是一組稱為病毒通道蛋白(viroporin)的小蛋白的推定成員，這類蛋白介導(dǎo)陽離子穿透膜并且對于病毒粒子的釋放或成熟來說是重要的。對于某些病毒通道蛋白，已經(jīng)顯示跨膜結(jié)構(gòu)域足以形成膜通道(參見Duff，K.C.和R.H.Ashley，(1992)Virology 190(1)第485-9頁；Fischer，W.B.等，(2001)Eur.Biophys.J.30(6)第416-20頁)。
概述一個實施方案涉及用于治療HCV感染的方法，即給予有需要的患者(特別是人)有效抑制HCV p7蛋白活性的亞氨基糖衍生化合物。用于所述方法的化合物能有效抑制HCV p7蛋白透化膜的能力。在最廣泛的方面，所述化合物由下式I或II表示 I II其中每個R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15、R15′、R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自獨立選自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺?；?；(C1-6烷基)磺?；环蓟酋；?；氨磺?；?C1-6烷基)氨磺?；?C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和雜芳基，其中每個取代基可以相同或不同。
R2和R4為各自獨立選自以下的取代基直鏈C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基。每個直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任選被取代，且取代的C1-18烷基被一個或多個獨立選自以下的取代基取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺?；?；芳基磺酰基；氨磺?；?，(C1-6烷基)氨磺?；?；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH，其中所選的取代基可以相同或不同。特別合適的取代基包括壬基、7-氧雜壬基和10-氧雜十一烷基，而特別需要的化合物包括N-壬基脫氧野尻霉素(NN-DNJ)、N-壬基脫氧半乳糖野尻霉素(NN-DGJ)、N-7-氧雜壬基-6-甲基脫氧半乳糖野尻霉素(即N-7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ、N-7-氧雜壬基-1，6-二脫氧半乳糖野尻霉素或N-7-氧雜壬基-甲基-DGJ)和N-10-氧雜十一烷基-1，6-二脫氧半乳糖野尻霉素(即N-10-氧雜十一烷基-6-甲基脫氧半乳糖野尻霉素、N-10-氧雜十一烷基-甲基-DGJ、N-10-氧雜十一烷基-6-脫氧-DGJ、(2R，3S，4R，5S)-1-(9-甲氧基壬基)-2-甲基-3，4，5-哌啶三醇、(2R，3R)-2，3-二羥基丁二酸酯(1∶1)或SP240)。
可將一種或多種所述化合物包裝成用于治療HCV感染的試劑盒。該試劑盒可包括治療HCV感染的說明書以及給予所述化合物的用具。
另一個實施方案涉及用于篩選能抑制HCV p7活性的化合物的方法。具體地講，可根據(jù)化合物是否抑制p7或p7變體透化膜的能力進(jìn)行篩選。在這樣的方法中，需要使用人工膜系統(tǒng)或細(xì)菌系統(tǒng)。
附圖簡述

圖1A顯示大腸桿菌(E.coli)Rosetta gami(DE3)pLacl細(xì)胞的生長曲線。在指定時間內(nèi)(誘導(dǎo)后的小時)監(jiān)測非轉(zhuǎn)化細(xì)胞(A)、pTriEx1.1轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(B)和pTiEx1.1 p7轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(C)的光密度(OD600nm)。顯示了未誘導(dǎo)細(xì)胞(○)和加入1mM IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞(□)的生長曲線。圖1B顯示，在指定時間內(nèi)由非轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta gami(DE3)pLacl細(xì)胞(A)、pTriEx1.1轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(B)和pTiEx1.1 p7轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(C)釋放的[3H]-尿苷。顯示了未誘導(dǎo)細(xì)胞(○)和加入1mM IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞(□)的生長曲線。
圖2顯示合成HCV p7的Tris-tricine凝膠電泳分析。凝膠經(jīng)銀染色(左圖)或轉(zhuǎn)移到膜上，隨后用鏈霉抗生物素探測(右圖)。
圖3A顯示將合成HCV p7重組到BLM中的通道記錄。直線表示閉合狀態(tài)。圖3B顯示，數(shù)據(jù)收集約30分鐘后記錄的電流曲線。圖3C顯示，如圖3A所示，在+100mV膜電位記錄到的電流曲線柱狀圖。
圖4顯示短鏈(NB-DNJ，NB-DGJ)和長鏈(NN-DNJ，NN-DGJ)烷基亞氨基糖衍生物對BLM中p7通道信號的影響。鉗制電位穩(wěn)定維持在+100mV，加入亞氨基糖衍生物直至指定的終濃度。
圖5顯示N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ(或者稱為N7-氧雜壬基-甲基-DGJ)對BLM中p7通道信號的影響。鉗制電位穩(wěn)定維持在+100mV，加入N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ直至指定的終濃度。
圖6顯示歸一化總電流曲線和標(biāo)準(zhǔn)偏差對藥物濃度繪制的曲線示意圖。對于NN-DNJ(方形)和NN-DGJ(菱形)，數(shù)據(jù)代表4秒鐘的3個代表性的曲線片段的平均值，而對于N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ(三角)，數(shù)據(jù)代表30秒鐘的3個代表性的曲線片段的平均值。按照公式“總電流”＝1/(1+([藥物]/Kapp)，由數(shù)據(jù)S擬合推導(dǎo)出近似結(jié)合常數(shù)(Kapp)為對于NN-DNJ，Kapp＝45.2(±10.7)μM；對于NN-DGJ，Kapp＝110.4(±19.9)μM；對于N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ，Kapp＝114.2(±18.3)μM。
圖7顯示SP240(即N-10-氧雜十一烷基-1，6-二脫氧半乳糖野尻霉素)對BLM中p7通道信號的影響。
定義除非另有說明，本文所用的術(shù)語“烷基”是指含有一個或多個碳原子的直鏈和支鏈烷基，包括例如甲基、乙基、丁基和壬基。
本文所用的術(shù)語“芳基”是指苯環(huán)等單環(huán)芳基，或者茚滿基、萘基或芴基等苯并稠合芳基。
本文所用的術(shù)語“雜芳基”是指含有一個或多個雜原子的芳族化合物。實例包括吡啶基、呋喃基和噻吩基或含有一個或多個雜原子的苯并稠合芳族化合物，例如吲哚基或喹啉基。
本文所用的術(shù)語“雜原子”是指N、O、S等非碳原子。
本文所用的術(shù)語“環(huán)烷基”是指含有3、4、5、6、7或8個碳的碳環(huán)，包括例如環(huán)丙基和環(huán)己基。
除非另有說明，本文所用的術(shù)語“烷氧基”是指含有一個或多個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，包括例如甲氧基和乙氧基。
本文所用的術(shù)語“烯基”是指含有一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈烷基，例如乙烯基和丙烯基。
本文所用的術(shù)語“芳烷基”是指被芐基和苯乙基等芳基取代的烷基。
本文所用的術(shù)語“炔基”是指含有一個或多個三鍵的直鏈或支鏈烷基，例如乙炔基和丙炔基。
本文所用的術(shù)語“芳氧基”是指-OH基團(tuán)中的氫原子被芳基取代而產(chǎn)生的取代基，包括例如苯氧基。
本文所用的術(shù)語“芳烷氧基”是指被芳基取代的烷氧基，例如2-苯基乙氧基。
本文所用的術(shù)語“烷基氨基”是指被一個烷基取代的氨基，例如甲氨基(-NHCH3)和乙氨基(-NHCH2CH3)。
本文所用的術(shù)語“二烷基氨基”是指被兩個烷基取代的氨基，例如二甲氨基(-N(CH3)2)和二乙氨基(-N(CH2CH3)2)。
本文所用的術(shù)語“DNG”是指1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡萄糖醇或“脫氧野尻霉素”。
本文所用的術(shù)語“DGJ”是指1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-半乳糖醇或“脫氧半乳糖野尻霉素”。
本文所用的術(shù)語“BLM”是指“黑脂膜”。
優(yōu)選實施方案的詳述在所公開的方法中使用的化合物，作為HCV p7的抑制劑是有效的。在最廣泛的方面，所述化合物由下式I或II表示 I II在一方面，所述方法設(shè)計給予式I化合物。每個R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′各自獨立選自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺?；?；(C1-6烷基)磺?；?；芳基磺?；话被酋；?C1-6烷基)氨磺?；?；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和雜芳基。每個取代基可以相同或不同。
在一個優(yōu)選的實施方案中，R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少一個為羥甲基(-CH2OH)?；蛘?，R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少一個為羥基(-OH)。最優(yōu)選的實施方案設(shè)計R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少兩個選自-CH3、-CH2OH和-OH。
R2為選自以下的取代基直鏈C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基。每個直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任選被取代，且所述取代的C1-18烷基被一個或多個獨立選自以下的基團(tuán)取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基、C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺?；?C1-6烷基)磺?；?；芳基磺?；话被酋；?C1-6烷基)氨磺?；?；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH。
優(yōu)選R2為直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基或取代的C1-18烷基。更優(yōu)選R2為直鏈C7-11烷基、支鏈C7-11烷基、取代的C7-11烷基或被C1-6烷氧基取代的直鏈或支鏈C1-18烷基。R2的直鏈C7-11烷基取代基的實例包括庚基、辛基和壬基。R2的取代烷基的實例為7-氧雜壬基(-CH2(CH2)5-O-CH2CH3)。最優(yōu)選R2為正壬基、7-氧雜壬基或10-氧雜十一烷基。
在式I的某些實施方案中，所述化合物可以由下式之一來表示
上式中每個環(huán)碳原子的立體化學(xué)可以與其它環(huán)碳原子的立體化學(xué)各不相同。更優(yōu)選所述化合物具有一個下表1給出的結(jié)構(gòu)式
表1
更優(yōu)選所述化合物具有一個以下結(jié)構(gòu)式 再更優(yōu)選R2為壬基、7-氧雜壬基或10-氧雜十一烷基，最優(yōu)選的化合物包括N-壬基脫氧野尻霉素(NN-DNJ)、N-壬基脫氧半乳糖野尻霉素(NN-DGJ)、N-7-氧雜壬基-6-甲基脫氧半乳糖野尻霉素(即N-7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ、N-7-氧雜壬基-1，6，-二脫氧半乳糖野尻霉素或N-7-氧雜壬基-甲基-DGJ)和N-10-氧雜十一烷基-1，6-二脫氧半乳糖野尻霉素(即N-10-氧雜十一烷基-6-甲基脫氧半乳糖野尻霉素、N-10-氧雜十一烷基-甲基-DGJ、N-10-氧雜十一烷基-6-脫氧-DGJ、(2R，3S，4R，5S)-1-(9-甲氧基壬基)-2-甲基-3，4，5-哌啶三醇、(2R，3R)-2，3-二羥基丁二酸酯(1∶1)或SP240)和它們的異構(gòu)體，例如 所公開方法的另一方面設(shè)計給予式II化合物。每個R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自獨立選自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺?；?；(C1-6烷基)磺?；?；芳基磺?；?；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺?；?C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和雜芳基。每個取代基可以相同或不同。
在一個優(yōu)選的實施方案中，R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′中的至少一個為羥甲基(-CH2OH)?；蛘?，R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少一個為羥基(-OH)。最優(yōu)選的實施方案設(shè)計R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少兩個選自-CH3、-CH2OH和-OH。
在式II中，R4為選自以下的取代基直鏈C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基。每個直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任選被取代，且每個取代的C1-18烷基被一個或多個獨立選自以下的基團(tuán)取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺?；?；(C1-6烷基)磺?；?；芳基磺?；?；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺?；?C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH。
優(yōu)選R4為直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基或取代的C1-18烷基。更優(yōu)選R4為直鏈C7-11烷基、支鏈C7-11烷基、取代的C7-11烷基或被C1-6烷氧基取代的直鏈或支鏈C1-18烷基。R4的直鏈C7-11烷基取代基的實例包括庚基、辛基和壬基。R4的取代烷基的實例為7-氧雜壬基(-CH2(CH2)5-O-CH2CH3)。最優(yōu)選R4為n-壬基、7-氧雜壬基或10-十一烷基。
在一個實施方案中，公開了用于治療HCV感染的方法，所述方法包括使HCV p7蛋白或者包含p7蛋白的膜組分與一種或多種抑制p7蛋白活性的化合物接觸。本發(fā)明人已表明p7蛋白增加膜的通透性，類似于膜通道蛋白的功能。另外，本發(fā)明人已表明特定化合物能抑制p7透化膜的能力。然而，所公開的方法設(shè)計本文公開的化合物也可抑制p7蛋白的其它活性。
所選化合物可通過與p7蛋白的相互作用，抑制該蛋白的一種或多種活性。在這種情況下，如具體結(jié)合測定所示，需要選擇與p7蛋白結(jié)合且其表觀結(jié)合常數(shù)不大于約Kapp＝130μM(即Kapp＝114.2(±18.3)μM)的化合物?；蛘?，如具體通透性測定所示，可能需要選擇能阻斷p7蛋白透化膜的能力的化合物，當(dāng)所述化合物濃度不大于約180μM時。
當(dāng)所選化合物抑制p7透化膜的能力時，所述化合物可阻止p7形成通道，或者在通道形成后所述化合物可阻斷該通道(即作為通道阻斷劑)?；蛘撸龌衔锟赏ㄟ^與一種或多種膜組分(例如磷脂)相互作用而改變膜流動性或局部特性，抑制p7蛋白。因此，所述化合物可抑制p7形成功能性膜通道的能力。
在又一個實施方案中，提供用于篩選有效抑制HCV p7活性的潛在抗病毒藥的方法。通常，所述方法包括將p7或p7變體摻入到膜系統(tǒng)中并觀察通透性增加，例如通過采用標(biāo)準(zhǔn)方法記錄跨膜電流。然后將試驗化合物加入到膜系統(tǒng)中，以測定所述化合物是否抑制p7透化膜的能力。理想的化合物在不超過約180μM的濃度下可完全阻斷p7透化膜的能力。
黑脂膜(“BLM”)可用于所述方法，但也可采用其它膜系統(tǒng)。黑脂膜是本領(lǐng)域眾所周知的，BLM通常用于研究膜通透性，例如在由通道形成蛋白介導(dǎo)時(參見Duff，K.C.和R.H.Ashley，(1992)Virology 190(1)第485-9頁)。
當(dāng)選定用于觀察p7活性的合適膜系統(tǒng)后，可以將p7摻入到所述膜中，以形成含p7的膜?？蓮钠渲衟7蛋白顯示出增加選定膜通透性的任何HCV病毒株中選取p7蛋白。例如，可選定來自HCV-H病毒株的p7蛋白(即ALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLKGRWVPGAVYALYGMWPLLLLLLALPQRAYA(SEQ ID NO.1))，或者可選定來自另一病毒株的p7蛋白。可能需要使用p7共有序列，所述共有序列是通過比較已報道的p7蛋白的氨基酸序列而獲得，或者可能需要選擇來自特定HCV分化體(例如分化體1)的p7蛋白。
在篩選方法的另一個實施方案中，可能需要使用所選p7蛋白的變體，如果所述變體是功能性的話(例如當(dāng)采用本領(lǐng)域已知方法測定時，所述變體顯示出透化所選的膜)。可能的變體包括融合、缺失和/或突變或取代。例如，可能需要產(chǎn)生生物素?；痯7蛋白，用于所述方法。在另一個實例中，可能需要至少使用顯示出透化所選膜的p7或p7衍生物的部分(例如選定的p7蛋白或變體可證明在BLM中電導(dǎo)水平不小于約60pS(即86±22pS))。也可能需要在選定的p7氨基酸序列中產(chǎn)生突變。當(dāng)產(chǎn)生突變時，可能需要根據(jù)HCV病毒株之間的比較，保持給定位置上氨基酸的一定特性。例如，對來自不同HCV株p7序列的比較已顯示出某些氨基酸位置的特性可以是“疏水性”、“中性”或“親水性”(參見Carrere-Kremer，S.等，(2002)J.Virol.76(8)3720-30)?！笆杷园被帷笨蓪儆贔、I、W、Y、L、V、M、P、C和A。
選定的p7蛋白或變體可以人工合成，或者在細(xì)菌細(xì)胞或真核細(xì)胞等合適的生物系統(tǒng)中表達(dá)。當(dāng)所述蛋白摻入到選定的膜系統(tǒng)中后，可以通過測定所述蛋白是否證明活性(例如引起通透性增加或細(xì)胞活力下降)，來測定膜通透性?？梢允乖囼灮衔锱c所述蛋白和/或含p7的膜組分接觸，以測定所述化合物是否抑制所述蛋白的活性。在所述方法中，可以在p7摻入到膜之前和/或之后，使試驗化合物與p7和/或含p7的膜組分接觸。
在一個實施方案中，可能需要使用亞氨基糖衍生物作為篩選方法中的試驗化合物。具體地講，可能需要使用本文所述的DGJ烷基化衍生物或DNJ烷基化衍生物作為試驗化合物。特別需要烷基化亞氨基糖N-壬基脫氧野尻霉素(NN-DNJ)、N-壬基脫氧半乳糖野尻霉素(NN-DGJ)、N-7-氧雜壬基-6-甲基脫氧半乳糖野尻霉素(即N-7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ、N-7-氧雜壬基-1，6-二脫氧半乳糖野尻霉素或N-7-氧雜壬基-甲基-DGJ)和N-10-氧雜十一烷基-1，6-二脫氧半乳糖野尻霉素(即N-10-氧雜十一烷基-6-甲基脫氧半乳糖野尻霉素、N-10-氧雜十一烷基-甲基-DGJ、N-10-氧雜十一烷基-6-脫氧-DGJ、(2R，3S，4R，5S)-1-(9-甲氧基壬基)-2-甲基-3，4，5-哌啶三醇、(2R，3R)-2，3-二羥基丁二酸酯(1∶1)或SP240)的衍生物和/或它們的異構(gòu)體。
在另一個實施方案中，可能需要使用已顯示出與p7或其它膜組分相互作用的、作為所述方法中的試驗化合物的化合物或其衍生物(例如已顯示出在體外與p7相互作用的化合物)。在又一個實施方案中，可能需要使用已顯示出破壞由p7或其它蛋白形成的通道的化合物，和/或已知是由p7或其它蛋白形成的通道的阻斷劑的化合物，或其衍生物，作為所述方法中的試驗化合物。例如，已知金剛烷胺是甲型流感病毒M2通道的通道阻斷劑(參見Hay，A.J.等，(1985)EMBO J.4(11)第3021-4頁；Duff，K.C.和R.H.Ashley，(1992)Virology 190(1)第485-9頁；Sunstrom，N.A.等，(1996)J. Membr.Biol.150(2)第127-32頁；Fischer，W.B.等，(2001)Eur.Biophys.J.30(6)第416-20頁)。近來，其他人已表明，p7形成離子通道，該通道被金剛烷胺阻斷(參見Griffin等，F(xiàn)EBS Letters，2003，Jan.20；535(1-3)34-8)。因此，可能需要使用金剛烷胺或其衍生物作為所述方法中的試驗化合物。
在一個實施方案中，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性增加可導(dǎo)致細(xì)胞生長被抑制時，誘導(dǎo)型細(xì)菌系統(tǒng)可用于觀察通透性。例如，在合適的細(xì)菌系統(tǒng)中，可以從誘導(dǎo)型啟動子表達(dá)p7或其變體，以確定所述細(xì)胞是否表現(xiàn)出細(xì)胞生長的抑制?；蛘撸谡T導(dǎo)p7表達(dá)之前，可以通過用[3H]-尿苷等放射性分子標(biāo)記細(xì)胞，來證實通透性的增加。在誘導(dǎo)p7表達(dá)之后，可以通過測定釋放到培養(yǎng)基中的[3H]-尿苷，來評價通透性?？梢詫⒃囼灮衔锝o予所述細(xì)菌，以測定所述化合物是否抑制細(xì)胞生長和/或所述化合物是否抑制[3H]-尿苷釋放到培養(yǎng)基中。
化合物的制備可以用市售的亞氨基化合物作為原料，制備用于本文所述方法的化合物。市售來源包括Sigma，St.Louis，MO；Cambridge ResearchBiochemicals，Norwich，Cheshire，United Kingdom；和Toronto ResearchChemicals，Ontario，Canada。
或者，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合成方法合成本發(fā)明的化合物。例如，各種脫氧野尻霉素(DNJ)衍生物的合成描述于美國專利第5,622,972；5,200,523；5,043,273；4,944,572；4,246,345；4,266,025；4,405,714；和4,806,650號，以及美國申請順序號10/031,145。本文所述其它亞氨基糖化合物是已知的，并且可以通過以下美國專利給出的方法來制備第4,861,892；4,894,388；4,910,310；4,996,329；5,011,929；5,013,842；5,017,704；5,580,884；5,286,877；5,100,797；和6,291,657號。
藥用組合物當(dāng)需要以藥用組合物或藥物形式給予所述化合物時，本文公開的化合物可以配制成供各種給藥方式用。技術(shù)和制劑通?？稍谝韵挛墨I(xiàn)中找到REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(第18版)，MackPublishing Co.(1990)。
所述藥物可以適合于通過任何合適途徑給藥，例如通過口服(包括口腔含化或舌下)、直腸、鼻腔、局部(包括口腔含化、舌下或經(jīng)皮)或胃腸外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮內(nèi))途徑，雖然優(yōu)選口服給藥。所述組合物可以通過藥學(xué)領(lǐng)域已知的任何方法來制備，例如通過在無菌條件下將活性成分與載體混合在一起。
對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，藥學(xué)上可接受的鹽通常是眾所周知的，可以包括但不限于以下實例乙酸鹽、苯磺酸鹽(benzenesulfonate)、苯磺酸鹽(besylate)、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、依地酸鈣、樟磺酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、依地酸鹽、乙二磺酸鹽、依托酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、谷氨酸鹽、乙醇酰氨苯胂酸鹽、己基間苯二酚酸鹽、海巴明、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥萘酸鹽、碘化物、依西酸鹽、乳酸鹽、乳二糖酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、粘酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽、雙羥萘酸鹽(恩波酸鹽)、泛酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、堿式乙酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、單寧酸鹽、酒石酸鹽或茶氯酸鹽。其它藥學(xué)上可接受的鹽可以在例如以下文獻(xiàn)中找到REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES(第18版)，參見上文。
優(yōu)選的藥學(xué)上可接受的鹽包括例如乙酸鹽、苯甲酸鹽、溴化物、碳酸鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、萘磺酸鹽、雙羥萘酸鹽(恩波酸鹽)、磷酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽或酒石酸鹽。
對于注射來說，所述化合物和藥物可以配制在水溶液中，最好是在Hank氏溶液、Ringer氏溶液等生理上相容的緩沖液中，或者在生理鹽水緩沖液中。對于所述經(jīng)粘膜給藥，在制劑中使用適合于待穿透屏障的滲透劑。所述滲透劑是本領(lǐng)域眾所周知的。
采用藥學(xué)上可接受的載體，將本文公開的化合物配制成用于所述方法實踐的適合于系統(tǒng)給藥的制劑，這包括在所述方法的范圍之內(nèi)。適當(dāng)選用載體和合適的生產(chǎn)管理，本方法的組合物、特別是配制成溶液劑的本方法組合物可以通過胃腸外給藥，例如通過靜脈內(nèi)注射。采用本領(lǐng)域眾所周知的藥學(xué)上可接受的載體，可以容易地將所述化合物配制成適合于口服給藥的制劑。所述載體使所述方法的化合物能夠配制成片劑、丸劑、膠囊劑、液體制劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑、混懸劑等，用于口服給予待治療的患者。
適用于本方法的藥用組合物包括如下組合物其中含有達(dá)到其預(yù)定目的有效量的活性成分。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)卮_定有效量，尤其是根據(jù)本文所提供的詳細(xì)的公開內(nèi)容。
除了活性成分之外，這些藥用組合物可含有合適的藥學(xué)上可接受的載體，所述載體包括便于將所述活性化合物加工成藥學(xué)上可使用的制劑的賦形劑和輔料。配制成用于口服給藥的制劑可以呈片劑、錠劑、膠囊劑或溶液劑的形式。
本文所述的藥物以及用于本文所提供的方法中的藥物可包括一種或多種以下成分防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、香味劑、鹽、緩沖劑、包衣劑或抗氧化劑。它們也可含有除所述化合物和/或本文所述藥物之外的治療活性藥物。通過將活性化合物與固體賦形劑混合，任選研磨所得混合物，并且如果需要在加入合適的輔料后，加工顆粒狀混合物，以得到片心或錠心，可以獲得供口服用的藥物制劑。具體地講，合適的賦形劑是填充劑，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制劑，例如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基-纖維素、羧甲基-纖維素鈉(CMC)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP聚維酮碘)。如果需要，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，例如海藻酸鈉。
可用于口服的藥物制劑包括由明膠制成的鎖口型(push-fit)膠囊以及由明膠和增塑劑(例如甘油或山梨醇)制成的密封軟膠囊。鎖口型膠囊可含有活性成分以及乳糖等填充劑、淀粉等粘合劑和/或滑石粉或硬脂酸鎂等潤滑劑，任選穩(wěn)定劑。在軟膠囊劑中，活性化合物可以溶于或懸浮于合適的液體例如脂肪油、液狀石蠟或液體聚乙二醇(PEG)中。另外，可以加入穩(wěn)定劑。
給藥途徑下面將會更詳細(xì)考慮不同的給藥途徑a.口服給藥適合于口服給藥的藥物可以是膠囊劑或片劑；散劑或顆粒劑；溶液劑、糖漿劑或混懸劑(在水或非水液體中)；食用泡沫劑(foams)或泡沫劑(whips)；或乳劑。
片劑或硬明膠膠囊劑可以包含乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其鹽。
軟明膠膠囊劑可以包含植物油、蠟、油脂、半固體或液體多元醇等。
溶液劑和糖漿劑可包含水、多元醇和糖。對于制備混懸劑來說，可以使用油(例如植物油)，以提供水包油或油包水混懸劑。
b.經(jīng)皮給藥適于經(jīng)皮給藥的藥物可以是設(shè)計在一段較長時間內(nèi)與受體皮膚保持密切接觸的透氣型貼劑(discrete patch)。例如，可通過離子導(dǎo)入法，給予貼劑中的活性成分(離子導(dǎo)入法描述于PharmaceuticalResearch，3(6)318(1986))。
c.局部給藥適于局部給藥的藥物可以是軟膏劑、乳膏劑、混懸洗劑、散劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑。
對于眼部感染或口腔和皮膚等其它外部組織感染來說，最好使用局部軟膏劑或乳膏劑。當(dāng)配制軟膏劑時，可以將活性成分與石蠟或水混溶性軟膏基質(zhì)混合?；蛘?，可以將活性成分與水包油基質(zhì)或油包水基質(zhì)一起配制成乳膏劑。
適于眼部局部給藥的藥物包括滴眼劑。此時，活性成分可溶解或懸浮在合適載體例如水性溶劑中。
適于口腔局部給藥的藥物包括糖錠劑、軟錠劑和漱口劑。
d.直腸給藥適于直腸給藥的藥物可以是栓劑或灌腸劑。
e.鼻腔給藥使用固體載體的適于鼻腔給藥的藥物包括粗粉(例如粒徑范圍在20-500微米)。這可以以吸入的方式給藥，即從靠近鼻子的盛有粉劑的容器中通過鼻腔快速吸入。
使用液體載體的適于鼻腔給藥的組合物包括鼻腔噴霧劑或滴鼻劑。這些可包含活性成分的水性或油性溶液劑。
適于通過吸入給藥的藥物包括微粒粉劑或霧劑，它們可由不同種類的儀器產(chǎn)生，例如加壓的氣溶膠、噴霧器或吹藥器?？梢灾圃爝@些儀器，以便提供預(yù)先確定的活性成分的劑量。
f.胃腸外給藥適于胃腸外給藥的藥物包括水性和非水性無菌注射溶液劑或混懸劑。它們可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和賦予組合物與預(yù)定受體的血液基本等滲的溶質(zhì)。所述組合物中可以存在的其它成分包括例如水、乙醇、多元醇、甘油和植物油。適于胃腸外給藥的組合物可以呈單劑量或多劑量容器形式，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冷凍-干燥(凍干)條件下貯存，只需在臨用前加入無菌液體載體例如無菌注射用水即可?？蓮臒o菌粉針劑、顆粒劑和片劑制備臨用注射溶液劑。
g.劑量可通過常規(guī)試驗，容易地確定劑量，并且在主治醫(yī)生或臨床醫(yī)生的監(jiān)控下進(jìn)行。確定合適劑量的指導(dǎo)原則是給予合適而有效且無毒或可接受毒性的材料劑量(參見例如Fingl等，(1975)ThePharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1頁)。對于NN-DNJ或類似化合物，預(yù)計成人日劑量可以在0.1mg-5g活性藥物的范圍內(nèi)，可以在3mg-2400mg范圍內(nèi)，最好在5mg-800mg范圍內(nèi)，更優(yōu)選在15mg-400mg，最優(yōu)選15mg-100mg。每天可以給予單次日劑量，或者每天給予2次、3次或更多次劑量。
以下實施例僅僅用來說明上述方法；它們并不是用來以任何方式限制本發(fā)明范圍的。
實施例1.誘導(dǎo)p7在細(xì)菌中表達(dá)下面一組實驗證明，可誘導(dǎo)p7在細(xì)菌中表達(dá)。本實驗可用于確定p7或p7變體是否能透化膜。實驗也顯示出p7的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞生長的停止，此外，p7的表達(dá)導(dǎo)致放射性標(biāo)記尿苷的釋放。
實施例1.1.材料與方法p7表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。采用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法，通過DNA操作構(gòu)建重組質(zhì)粒。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，使用作為模板的編碼質(zhì)粒pTM1/CE1E2p7的HCV 1a株的cDNA(AF009606)(由J.Dubuisson友好提供)，擴(kuò)增HCV p7的編碼區(qū)。使用以下2個寡核苷酸引物進(jìn)行PCR反應(yīng)引物1，AAGCGCCCATGGCTTTGGAGAACCTCGTAATAC(SEQ ID NO.2)和引物2，ATTGAATTCTTAGTGATGGTGATGGTGATGGTGGTGGTATGCCCGCTGAGGCAAC(SEQ ID NO.3)。引物1和引物2分別編碼p7的5′端區(qū)和3′端區(qū)。為了在5′端產(chǎn)生NcoI限制位點，在3′端產(chǎn)生EcoRI限制位點，將下劃線序列引入引物中。純化所得PCR產(chǎn)物，用NcoI和EcoRI限制酶(Roche)消化，并與事先已用NcoI和EcoRI消化的pTriEx1.1表達(dá)載體(Novagen)連接。連接混合物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌R.gami(DE3)pLacl細(xì)胞(CN Biosciences)。含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌克隆在含有50μg/ml羧芐西林(Sigma)的培養(yǎng)基中擴(kuò)增。分離質(zhì)粒DNA，進(jìn)行限制性分析，并且使用用于T7啟動子的引物和引物2進(jìn)行測序，以便排除在PCR反應(yīng)中引入突變的可能性。所分離的含p7質(zhì)粒命名為pTriEx1.1p7。
誘導(dǎo)p7在細(xì)菌中表達(dá)。在37℃，在50μg/ml羧芐西林存在下，將含有pTriEx1.1或pTriEx1.1 p7質(zhì)粒的大腸桿菌R.gami(DE3)pLacl細(xì)胞的單菌落在LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，直到它們的OD600nm達(dá)到0.5為止。將3ml這樣的起始培養(yǎng)物加入到含有50μg/ml羧芐西林和0.4％葡萄糖的100ml LB培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞在同樣條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞的OD600nm達(dá)到0.5-0.7時，通過加入1mM異丙基硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Roche)誘導(dǎo)p7表達(dá)，并通過監(jiān)測OD600n跟蹤它們的進(jìn)一步生長。未轉(zhuǎn)化細(xì)菌(沒有pTriEx1.1質(zhì)粒)在沒有羧芐西林時生長。
細(xì)菌細(xì)胞釋放[3H]-尿苷。如上所述培養(yǎng)細(xì)菌，但是這次是在2μCi/ml[3H]-尿苷(Amersham，UK)存在下培養(yǎng)，直到它們的OD600nm達(dá)到0.5為止。然后沉淀細(xì)胞，用PBS洗滌3次并重懸浮在25ml生長培養(yǎng)基中。15分鐘后，通過加入1mM IPTG誘導(dǎo)p7表達(dá)。誘導(dǎo)后，在不同時間取出0.5ml試樣，將細(xì)胞通過離心沉淀，上清液與3.5mlUltima Gold閃爍混合劑(Packard，UK)混合，使用Beckman LS 3801閃爍計數(shù)器，通過閃爍計數(shù)測定釋放到培養(yǎng)基中的放射性。
實施例1.1.結(jié)果誘導(dǎo)p7在細(xì)菌中表達(dá)。為了評價HCV p7對膜通透性的影響，使用受嚴(yán)格控制的T7 lac啟動子調(diào)節(jié)的IPTG誘導(dǎo)型系統(tǒng)，讓p7在大腸桿菌Rosetta gami(DE3)pLacl細(xì)胞中表達(dá)(參見Dubendorff，J.W.和F.W.Studier，(1991)J. Mol.Biol.219(1)第45-59頁)。Rosetta gami(DE3)pLacl細(xì)胞攜帶處于lacUV5啟動子控制之下的染色體拷貝T7RNA聚合酶，并且從pLacl質(zhì)粒提供足夠的lac阻抑物，以保證在未誘導(dǎo)狀態(tài)下的嚴(yán)格性表達(dá)(參見Studier，F(xiàn).W.和B.A.Moffatt，(1986)J.Mol.Biol.189(1)第113-30頁)。用IPTG誘導(dǎo)后，通過監(jiān)測不同時間的細(xì)胞密度，跟蹤p7表達(dá)對宿主細(xì)胞的影響。IPTG的加入對非轉(zhuǎn)化細(xì)胞(圖A，上圖)和pTriEx1.1轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(圖B，上圖)沒有影響，然而p7的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞群體生長的停止(圖1C，上圖)，很可能是因為在大腸桿菌細(xì)胞膜上形成孔。
為了分析化合物從表達(dá)HCV p7的細(xì)菌內(nèi)流出，給重組克隆加載放射性標(biāo)記的尿苷，并在誘導(dǎo)后測定不同時間點的放射性的釋放(圖1，下圖)。在非轉(zhuǎn)化細(xì)胞或攜帶親代質(zhì)粒的克隆中沒有觀察到顯著流出[3H]-尿苷(圖1A和圖B，下圖)。在誘導(dǎo)p7合成2小時后，表達(dá)p7的細(xì)胞開始向培養(yǎng)基中釋放[3H]-尿苷。在4小時的監(jiān)測周期中，[3H]-尿苷的釋放增加(圖1C)，表明p7誘導(dǎo)外細(xì)胞膜的通透性。
實施例2.合成的p7摻入到BLM中下面一組實驗證明，根據(jù)通道記錄測定，合成的p7可增加BLM的通透性。實驗也顯示出長鏈烷基亞氨基糖衍生物抑制p7活性。
實施例2.1.材料與方法.
肽的合成和產(chǎn)物質(zhì)量控制。由英國的Albachem合成N-端加有生物素-標(biāo)記的50mg相當(dāng)于p7(HCV H株)的肽(生物素-ALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLKGRWVPGAVYALYGMWPLLLLLLALPQRAYA(SEQ ID NO.4))。使用基體輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)分析p7肽將p7蛋白溶于40％乙腈中，得到含有1mg/ml肽的溶液。將1μl該溶液試樣與1μl含有16mM辛基-葡糖苷溶液的飽和α-氰基-4-羥基肉桂酸的95∶5乙腈/水(v/v)溶液混合。將該混合物試樣(1μl)置于質(zhì)譜儀靶中并讓其風(fēng)干。用胰蛋白酶自溶物對測得的質(zhì)量進(jìn)行外標(biāo)。用TofSpec 2E質(zhì)譜儀(Micromass，Wythenshawe，Manchester，UK)，在反射模式下操作，記錄質(zhì)譜。源電壓、提取電壓和聚焦電壓分別為20000V、19950V和16000V。所有數(shù)據(jù)都運用Mass Lynx版本3.2軟件進(jìn)行分析。按照MALDI質(zhì)譜分析，觀察到對應(yīng)于全長p7肽的峰，即在m/z 7247.8。
為了測定全長肽的純度，使用以下方法的修改版本，將所述肽再進(jìn)行Tris-Tricine凝膠電泳Schgger和yon Jagow，(1987)Anal.Biochem.，166(2)第368-79頁。簡而言之，將溶于40％乙腈/水(500μg/ml)的p7(5μg)在Tricine樣品緩沖液中加樣到凝膠(8×10cm2)上，所述凝膠由分離膠(20.18％T，0.83％C)、間隔膠(11.44％T，0.34％C)和濃縮膠(10.9％T，0.32％C)組成，其中T是單體(丙烯酰胺和雙丙烯酰胺)濃度的總百分?jǐn)?shù)，而C是相對于T來說的交聯(lián)劑濃度的百分?jǐn)?shù)。在30V恒壓下進(jìn)行凝膠電泳，直到樣品完全進(jìn)入濃縮膠后，將電壓升至110V。
通過銀染色和蛋白質(zhì)印跡分析凝膠。對于銀染色，將凝膠在50％甲醇中洗滌10分鐘，然后在5％甲醇中洗滌10分鐘。然后將凝膠在40μM DTT溶液中孵育10分鐘，然后用水沖洗并在0.1％AgNO3水溶液中孵育10分鐘。隨后用水洗滌3次，共10秒鐘，然后加入顯影液(7.5g NaCO3，125μl甲醛的250ml水)。通過加入固體一水檸檬酸，終止顯影過程。將凝膠用水沖洗并浸泡在35％乙醇/2％甘油中，然后干燥。
對于蛋白質(zhì)印跡分析，用半干電印跡儀(2小時，40mA)(Merek)，將凝膠上的蛋白在轉(zhuǎn)移緩沖液(24mM Tris堿，192mM甘氨酸，20％甲醇)中轉(zhuǎn)移到Immobilon P膜(Amersham，UK)上。將該膜在含有3％牛奶的PBS-0.1％Tween中封閉過夜，然后在室溫下與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素(1μg/ml的PBS-0.1％Tween，1％牛奶)一起孵育3小時。然后在PBS-0.1％Tween、1％牛奶中洗滌2次，然后按照制造商的說明書，用ECL檢測系統(tǒng)(Amersham，UK)進(jìn)行顯影。
銀染色凝膠和蛋白質(zhì)印跡兩者都顯示出預(yù)期分子量的一種主要種類(圖2)，表明至少部分加樣的蛋白含有全長生物素?；痯7蛋白。然而，因為以前曾觀察到有和沒有尿素的凝膠之間分辨率的差異，所以在沒有尿素情況下重新分析化學(xué)合成的p7。雖然鏈霉抗生物素探測的蛋白質(zhì)印跡顯示全長生物素酰化p7的存在，但是在銀染色凝膠上觀察到約為一半表觀分子量的額外的寬條帶，所述條帶占總p7的50％-60％。該寬條帶相當(dāng)于通過質(zhì)譜觀察到的來自較小的非生物素?；痯7的種類，其質(zhì)量理論上相當(dāng)于含有N-端跨膜結(jié)構(gòu)域的p7片段。因為已證明難以從p7的截短形式分離出全長p7，所以隨后將其混合物用于在黑脂膜中進(jìn)行通道記錄。
黑脂膜(BLM)中的通道記錄。制備BLM以研究膜動力學(xué)，是本領(lǐng)域眾所周知的。在聚四氟乙烯薄膜(厚度約25μm，Yellow SpringsInstruments，Ohio，USA)中，形成的BLM跨越橢圓形小孔，其長軸直徑約為100μm(參見Montal，M.和P.Mueller，(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69(12)第3561-6頁)。將40μl脂質(zhì)混合物(1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)∶1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(POPC)(4∶1(w/w))溶于戊烷(5mg/ml)中，并鋪在水性面下相的上面(0.5M KCl，5mM HEPES，1mM CaCl2，pH 7.4)。這使得約0.2mg脂質(zhì)沉積在聚四氟乙烯薄膜的每一面上。讓溶劑蒸發(fā)10分鐘后，通過提高聚四氟乙烯膜孔上方小室的緩沖液水平，形成BLM。形成穩(wěn)定的BLM后，從200倍過量貯液，將HCV p7蛋白(溶于乙醇)加入到接地的水性面下相(雙層每邊小室中的體積2ml)，反面小室達(dá)到終濃度約為50μM。時間延遲約10分鐘后，出現(xiàn)記錄。用Axopatch 1 D放大器，在5kHz頻率下記錄電流。數(shù)據(jù)用50Hz的截止頻率進(jìn)行過濾，然后用軟件Origin 5.0進(jìn)行分析。或在正面或在反面加入藥物(來自NN-DNJ(Synergy Pharmaceuticals)、NN-DGJ(Toronto Research Chemicals)和N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ(United Therapeutics Inc.)的10mM貯液，以及來自NB-DNJ(Sigma)和NB-DGJ的100mM貯液)。通過向測試室中序貫加入等體積，來增加藥物濃度。加入藥物約1分鐘后，在+100mV記錄數(shù)據(jù)達(dá)約3分鐘。
實施例2.2.結(jié)果將p7摻入到BLM中。根據(jù)記錄跨BLM通道信號的測定，將p7加入到緩沖液小室增加BLM通透性。在-100mV，通道電導(dǎo)水平上升至2nS(圖3A)。在+50mV所測最小平均電導(dǎo)水平約為86±22pS(表1)。
表1
表1p7的電導(dǎo)水平。數(shù)據(jù)來自圖3A的記錄，表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤，如括號內(nèi)所示。根據(jù)1秒時間段的記錄來計算平均值。
*來自1秒時間段的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差**從目測曲線確定數(shù)值特定電導(dǎo)水平的壽命范圍從幾百毫秒到幾分鐘。穩(wěn)定的長期持續(xù)的電導(dǎo)狀態(tài)以約100pS(和100pS的倍數(shù))的間隔變化，表明形成相對穩(wěn)定的通道，其電導(dǎo)約為100pS。記錄的波動可顯示亞電導(dǎo)狀態(tài)的存在。圖3B中顯示了在+100mV進(jìn)行記錄的柱狀圖的實例。延長對同一樣品的測量，導(dǎo)致增加的噪聲水平，這最終排除了對特定電導(dǎo)水平的設(shè)定(圖3C)。在一些實驗中，將p7插入到BLM中，產(chǎn)生脈沖樣活性(例如圖4，左上圖)。
對含有生物素-p7蛋白的膜進(jìn)行鏈霉抗生物素金染色，隨后通過透射電鏡術(shù)檢測該復(fù)合物，表明生物素-p7蛋白象通道(數(shù)據(jù)未顯示)，正如對生物合成-合成HCV p7所報道的一樣(參見Griffin等，F(xiàn)EBSLetters，2003年1月20日；535(1-3)34-8)。(另見Pavlovic等，PNAS 2003年5月13日；100(10)6104-8)。
無論是包括跨膜結(jié)構(gòu)域I(″TMD I″)(例如ALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLK(SEQ ID NO.5))的肽還是包括跨膜結(jié)構(gòu)域II(″TMD II″)(例如GRWVPGAVYALYGMWPLLLLLLALPQRAYA(SEQ ID NO.6))的肽加入到BLM中，都不能獨自形成通道，對其測定表明，缺乏通道信號(數(shù)據(jù)未顯示)。甚至將這兩個結(jié)構(gòu)域加入到BLM中，也不形成通道(數(shù)據(jù)未顯示)。
將藥物濃度逐漸增加的亞氨基糖衍生物加入到膜一側(cè)的緩沖液中，測定它們對p7誘導(dǎo)的通道活性的效應(yīng)。對于短鏈烷基衍生物NB-DGJ和NB-DNJ，p7通道活性保持不變(圖4，上圖)。同樣，高達(dá)3.0mM的N-辛基葡糖苷對通道活性也沒有影響(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，加入更多的長鏈烷基衍生物NN-DGJ、NN-DNJ和N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ，導(dǎo)致對p7通道信號的劑量依賴性抑制(圖4，下圖和圖5)。從所得歸一化總電流曲線的曲線示意圖和它們各自的S擬合(圖6)，推導(dǎo)出近似結(jié)合常數(shù)為對于NN-DGJ，Kapp＝110.4(±19.9)μM，對于NN-DNJ，Kapp＝45.2(±10.7)μM，對于N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ，Kapp＝114.2(±18.3)μM。對于NN-DGJ，在約140μM觀察到通道活性被完全阻斷，而對于NN-DNJ在105μM、對于N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ在180μM觀察到通道活性被完全阻斷。在增加任何藥物濃度時，沒有觀察到漏電流。
同樣，加入更多的長鏈烷基衍生物SP240(即N-10-氧雜十一烷基-1，6-二脫氧半乳糖野尻霉素)，導(dǎo)致對p7通道信號的劑量依賴性抑制(圖7)。對于SP240，在約100μM觀察到通道活性被完全阻斷。
本說明書引用的所有專利和其它參考文獻(xiàn)都預(yù)示著本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平，并且通過引用包括任何表格和附圖在內(nèi)的全部內(nèi)容結(jié)合到本文中，其程度與每篇參考文獻(xiàn)各自通過引用全部結(jié)合到本文中一樣。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，可以適當(dāng)?shù)匦薷谋景l(fā)明以獲得結(jié)果和所提到的優(yōu)勢以及固有的優(yōu)勢。作為代表性的優(yōu)選實施方案的本文所述方法、變化和化合物/組合物都是示例性的，并不是為了限制本發(fā)明的范圍。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，那些改變和其它用途全都包括在本發(fā)明中。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，對在此公開的本發(fā)明進(jìn)行不同的取代和修改。例如，可以利用各種不同的結(jié)合對，以及各種不同的治療藥和診斷藥。因此，所述額外的實施方案都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在缺乏本文未具體公開的任何要素和限制的情況下，可以適宜地實施本文說明性地描述的本發(fā)明。因此，例如，在各種情況下，術(shù)語“包括”、“基本由...組成”和“由...組成”中的任一個都可以用其它兩個術(shù)語來替換。所用的術(shù)語和短語可用作描述性而不是限制性的術(shù)語和短語，而且不會在使用所述術(shù)語和短語時排除任何等同的所示、所述的特征或其部分，但是人們知道，在本發(fā)明范圍內(nèi)可以進(jìn)行不同的修改。因此，人們應(yīng)理解，盡管已經(jīng)通過優(yōu)選實施方案具體公開了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員也可采用本文公開構(gòu)思的任選特征、修改和變化，并且所述修改和變化被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
另外，當(dāng)按照馬庫什化合物或其它分類的替代化合物描述本發(fā)明的特征或方面時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會知道，也因此按照馬庫什化合物或其它化合物的任何各個成員或成員亞類來描述本發(fā)明。
另外，除非有相反的說明，當(dāng)實施方案中提供各種數(shù)值時，采用任何2個不同數(shù)值作為范圍的端點來描述額外的實施方案。其范圍也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，所述方法包括給予有需要的患者選自式I化合物或式II化合物、其相關(guān)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽和溶劑合物的化合物 其中每個取代基R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15、R15′、R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自獨立選自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺?；?；(C1-6烷基)磺?；?；芳基磺酰基；氨磺?；?，(C1-6烷基)氨磺?；?；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和雜芳基，其中每個取代基可以相同或不同；其中每個烷基、烯基、炔基、芳基和雜芳基部分可任選被一個或多個獨立選自以下的基團(tuán)取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺?；?；(C1-6烷基)磺?；?；芳基磺?；?；氨磺?；?，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH；且R2和R4為各自獨立選自以下的取代基直鏈C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基；其中每個直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任選被取代，且每個取代的C1-18烷基被一個或多個獨立選自以下的基團(tuán)取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1- 6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺?；?C1-6烷基)磺?；?；芳基磺酰基；氨磺?；?，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH。
2.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括使HCV p7蛋白和含有p7蛋白的膜組分中的一個或它們兩個與所述化合物接觸。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是式I化合物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少一個為-CH2OH。
5.權(quán)利要求3的方法，其中R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少一個為-OH。
6.權(quán)利要求3的方法，其中R2為直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基或取代的C1-18烷基。
7.權(quán)利要求6的方法，其中R2為直鏈C7-11烷基、支鏈C7-11烷基或取代的C7-11烷基。
8.權(quán)利要求3的方法，其中R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少兩個選自-CH3、-CH2OH和-OH。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述化合物是選自以下的化合物 相關(guān)異構(gòu)體及其混合物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述化合物是選自下表給出的化合物
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是選自以下的化合物及其混合物
12.權(quán)利要求11的方法，其中R2為直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基或取代的C1-18烷基。
13.權(quán)利要求11的方法，其中R2為直鏈C7-11烷基、支鏈C7-11烷基或取代的C7-11烷基。
14.權(quán)利要求11的方法，其中R2為直鏈C7-18烷基。
15.權(quán)利要求14的方法，其中R2為直鏈C7-11烷基。
16.權(quán)利要求15的方法，其中R2為正壬基。
17.權(quán)利要求11的方法，其中R2為被C1-6烷氧基取代的直鏈或支鏈C1-18烷基。
18.權(quán)利要求17的方法，其中R2為7-氧雜壬基。
19.權(quán)利要求17的方法，其中R2為10-十一烷基。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是N-壬基-DNJ。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是N-壬基-DGJ。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是N-7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是N-10-氧雜十一烷基-甲基-DGJ。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是式II化合物。
25.權(quán)利要求24的方法，其中R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′中的至少一個為-CH2OH。
26.權(quán)利要求24的方法，其中R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′中的至少一個為-OH。
27.權(quán)利要求24的方法，其中R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′中的至少兩個選自-CH3、-CH2OH和-OH。
28.權(quán)利要求27的方法，其中R4為直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基或取代的C1-18烷基。
29.權(quán)利要求27的方法，其中R4為直鏈C7-11烷基、支鏈C7-11烷基或取代的C7-11烷基。
30.權(quán)利要求27的方法，其中R4為被C1-6烷氧基取代的直鏈或支鏈C1-18烷基。
31.權(quán)利要求27的方法，其中R4為正壬基。
32.權(quán)利要求27的方法，其中R4為7-氧雜壬基。
33.權(quán)利要求27的方法，其中R4為10-氧雜十一烷基。
34.權(quán)利要求2的方法，其中含有p7蛋白的膜相對于不含p7蛋白的膜來說具有增加的通透性，并且所述化合物降低增加的通透性。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述化合物抑制通道的形成。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述化合物是通道阻斷劑。
37.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者是人。
38.一種用于篩選潛在HCV抗病毒藥的方法，所述方法包括將p7蛋白和變體中的至少一個摻入到膜中，以產(chǎn)生含有p7的膜，其中所述含有p7的膜相對于不含p7的膜來說具有增加的通透性；使含有p7的膜的一種或多種組分與試驗化合物接觸；將其中一種或多種組分已經(jīng)接觸試驗化合物的含有p7的膜的通透性與其中沒有組分接觸試驗化合物的含有p7的膜的通透性進(jìn)行比較。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述p7蛋白選自HCV分化體1的成員。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述p7蛋白包含氨基酸序列ALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLKGRWVPGAVYALYGMWPLLLLLLALPQRAYA(SEQ ID NO.1)
41.權(quán)利要求38的方法，其中所述p7變體包含至少一個跨膜結(jié)構(gòu)域。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述p7變體包含至少一個從所選p7蛋白的大約位置10到大約位置32的氨基酸序列，以及從大約位置36到大約位置58的氨基酸序列。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域中大于約70％的氨基酸是以下成員F、I、W、Y、L、V、M、P、C和A。
44.權(quán)利要求38的方法，其中所述p7變體包含生物素?；痯7蛋白。
45.權(quán)利要求38的方法，其中使所述p7蛋白與試驗化合物接觸。
46.權(quán)利要求38的方法，其中通過記錄跨膜電流來比較通透性。
47.權(quán)利要求38的方法，其中所述膜包括黑脂膜。
48.權(quán)利要求38的方法，其中所述試驗化合物抑制通道的形成。
49.權(quán)利要求38的方法，其中所述試驗化合物是通道阻斷劑。
50.權(quán)利要求38的方法，其中所述試驗化合物選自式I化合物或式II化合物、其相關(guān)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽和溶劑合物 其中每個取代基R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15、R15′、R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自獨立選自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺?；?；(C1-6烷基)磺?；?；芳基磺酰基；氨磺?；?，(C1-6烷基)氨磺?；?；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和雜芳基；其中每個取代基可以相同或不同；其中每個烷基、烯基、炔基、芳基和雜芳基部分可任選被一個或多個獨立選自以下的基團(tuán)取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺?；?；芳基磺?；?；氨磺?；?C1-6烷基)氨磺?；?C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH；且R2和R4為各自獨立選自以下的取代基直鏈C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基；其中每個直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任選被取代，且每個取代的C1-18烷基被一個或多個獨立選自以下的基團(tuán)取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1- 6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺?；?；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺?；?C1-6烷基)氨磺?；?；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH。
51.權(quán)利要求38的方法，其中所述試驗化合物是金剛烷胺或其衍生物。
52.一種用于治療丙型肝炎病毒(HCV)感染的試劑盒，所述試劑盒包括(A)式I化合物或式II化合物、其相關(guān)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物 其中每個取代基R11、R11′、R12、R12＇、R13、R13′、R14、R14′、R15、R15′、R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自獨立選自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺?；?C1-6烷基)磺?；?；芳基磺?；?；氨磺?；?，(C1-6烷基)氨磺?；?C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和雜芳基，其中每個取代基可以相同或不同；其中每個烷基、烯基、炔基、芳基和雜芳基部分可任選被一個或多個獨立選自以下的基團(tuán)取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺?；?C1-6烷基)磺?；?；芳基磺?；?；氨磺?；?，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH；且R2和R4為各自獨立選自以下的取代基直鏈C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基；其中每個直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任選被取代，且每個取代的C1-18烷基被一個或多個獨立選自以下的基團(tuán)取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺?；?C1-6烷基)磺?；环蓟酋；话被酋；?C1-6烷基)氨磺?；?C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH；和(B)用于治療HCV感染的說明書。
53.一種式I化合物或式II化合物、其相關(guān)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物的組合物 其中每個取代基R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15、R15′、R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自獨立選自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺?；?；(C1-6烷基)磺?；环蓟酋；?；氨磺?；?C1-6烷基)氨磺?；?；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和雜芳基，其中每個取代基可以相同或不同；其中每個烷基、烯基、炔基、芳基和雜芳基部分可任選被一個或多個獨立選自以下的基團(tuán)取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺?；?C1-6烷基)磺?；?；芳基磺?；?；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH；且R2和R4為10-氧雜十一烷基。
全文摘要
公開了通過給予有效抑制丙型肝炎病毒(HCV)p7蛋白活性的亞氨基糖衍生化合物而治療HCV感染的方法和試劑盒，以及用于篩選抑制p7蛋白或其變體活性的化合物的方法。所公開的N－取代亞氨基化合物及其藥用組合物抑制HCV p7透化膜的能力。特別有效的化合物是衍生自N－烷基化哌啶的亞氨基糖。也公開了用于篩選潛在HCV抗病毒藥的方法。
文檔編號A61K31/40GK1694696SQ03825200
公開日2005年11月9日 申請日期2003年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月23日
發(fā)明者尼科爾·齊特茲曼, 雷蒙德·德韋克 申請人:牛津大學(xué)校委會