專利名稱：包含免疫細(xì)胞因子的凍干制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含免疫細(xì)胞因子的、穩(wěn)定的凍干藥物制劑，還涉及所述凍干藥物制劑的制備。
免疫細(xì)胞因子是由抗體和細(xì)胞因子組成的共軛物，其中抗體的兩條免疫球蛋白重鏈的羧基末端分別與細(xì)胞因子的氨基末端連接。
抗體是某些具有保護(hù)功能的糖蛋白，作為抗原免疫作用的結(jié)果它們出現(xiàn)在血液、淋巴和身體分泌物中并隨后與抗原發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)?？贵w屬于免疫球蛋白(Ig)，可以分為5類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的一些還可以進(jìn)一步劃分出亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。免疫細(xì)胞因子包括了所有的IgG抗體。它們包含了單克隆抗體、多克隆抗體和多特異性抗體，例如雙特異性抗體。
細(xì)胞因子是一類多肽，它們由細(xì)胞內(nèi)分泌或者外分泌出來，即進(jìn)入血液或者周圍組織，在與特異的受體結(jié)合以后影響其它細(xì)胞的功能，通常是其分裂和生長(zhǎng)功能，也可以是運(yùn)動(dòng)功能。某些情況下，產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞自身就是這種調(diào)控的對(duì)象，這時(shí)被稱為自分泌。細(xì)胞因子還特別調(diào)控免疫系統(tǒng)細(xì)胞的復(fù)雜相互作用。
細(xì)胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和通常的多肽激素。細(xì)胞因子包括生長(zhǎng)激素(例如人生長(zhǎng)激素、人N-甲硫氨酰基生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素)、甲狀旁腺激素、甲狀腺激素、胰島素、前胰島素、松弛素、前松弛素、糖蛋白激素〔例如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體素(LH)〕、肝生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、催乳激素、胎盤催乳素、小鼠促性腺激素相關(guān)的多肽、抑制素、活化素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、整合素、血小板生成素(TPO)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(例如NGFβ)、血小板生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF，例如TGFα和TGFβ)、紅細(xì)胞生成素(EPO)、干擾素(例如IFNα、IFNβ和IFN γ)、造血生長(zhǎng)因子(例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF)、白細(xì)胞介素(IL，例如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12)和腫瘤壞死因子(TNF，例如TNFα和TNFβ)。
同上述的抗體和細(xì)胞因子相似，免疫細(xì)胞因子是肽活性成分，因此不能夠從腸道吸收。因此對(duì)于治療的應(yīng)用，它們一般需要以溶液形式腸胃外給藥。
包含多肽活性成分的溶液制劑的一個(gè)問題是，這些成分有聚集和形成蛋白質(zhì)多聚體的傾向。但是這個(gè)問題的嚴(yán)重性依相關(guān)特定活性成分的物理化學(xué)性質(zhì)而不同。具有親水性質(zhì)的蛋白質(zhì)在水溶液中具有相對(duì)較低的形成聚集物的傾向，而具有疏水性質(zhì)的蛋白質(zhì)聚集的傾向增強(qiáng)。
抗體由兩個(gè)反向平行折疊片組成，這兩個(gè)折疊片互相以三明治形式的方式排列(保守結(jié)構(gòu)域)。疏水和親水的氨基酸在折疊片中交替出現(xiàn)，兩個(gè)折疊片中的每一個(gè)疏水側(cè)鏈互相指向?qū)Ψ?，這樣就指向了三明治結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，而兩個(gè)折疊片中的每一個(gè)親水氨基酸伸向外部(J.Klein，Immunologie[Immunology]，Verlag Chemie，Weinheim，1991)。伸向外部的親水氨基酸使得抗體在水溶液中溶解，且這樣阻止了不同抗體之間的相互作用。因此抗體只具有低的表面疏水性和聚集傾向。
由于以上的性質(zhì)，可以相對(duì)簡(jiǎn)單地配制穩(wěn)定形式的抗體溶液。一個(gè)商品化產(chǎn)品的例子是Rituxan，是一種包含單克隆抗體rituximab、無機(jī)緩沖液和聚山梨酸酯的含水制劑。用冷凍干燥除去水使得含水抗體溶液(它自身已經(jīng)較為穩(wěn)定)的穩(wěn)定性更為增強(qiáng)。在給藥前，向其中加入水，使得到的凍干物重溶為含水溶液。這種類型產(chǎn)品的一個(gè)例子是Remicade，其中除了含有單克隆抗體infliximab、無機(jī)緩沖液和聚山梨酸酯以外，還包含作為抗凍劑或者結(jié)構(gòu)形成者的糖。
WO 98/22136 A2公開了一種含有抗體、糖或者氨基糖、氨基酸和表面活性劑的凍干制劑。盡管所要求保護(hù)的制劑一般用于抗體，但是只有包含針對(duì)乙型肝炎病毒的單克隆抗體(AK HBV)的制劑并且其中各自包含抗L-選擇蛋白抗體和抗L神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(anti-L-NGFR)抗體的制劑公開于工作實(shí)施例中。
細(xì)胞因子不含有如抗體中導(dǎo)致良好水溶性的保守結(jié)構(gòu)域。因此它們?cè)诤芤褐芯哂懈鼮樵鰪?qiáng)的聚集傾向。這尤其是對(duì)于那些含有一束四個(gè)α螺旋作為共同結(jié)構(gòu)特征(所謂的4α螺旋束細(xì)胞因子)并且由于所述結(jié)構(gòu)特征而具有顯著疏水性的細(xì)胞因子。與疏水性相伴的疏水相互作用反過來又經(jīng)常是聚集的原因或機(jī)制(Hora-MS和Chen-B，(1999)，Bio-pharm.Ind.Perspect.，217-248)。含有一束四個(gè)α螺旋作為共同結(jié)構(gòu)特征的細(xì)胞因子有，許多白細(xì)胞介素，特別是IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11和IL-12，干擾素，特別是IFNβ和IFNγ，造血生長(zhǎng)因子(例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF)、紅細(xì)胞生成素(EPO)和干細(xì)胞因子(SCF)。在文獻(xiàn)中明確描述為疏水性的細(xì)胞因子有，如IL-2(Robb-RJ et al.(1983)PNAS 805990-4；US 5,580,856)，IL-4(Sharma-S et al.(1987)2351489-92)，IL-5(Takatsu-K et al.(1985)JI134382-9)，G-CSF(US 5,104,65)。
細(xì)胞因子的強(qiáng)烈(聚集)傾向，特別是4α螺旋束細(xì)胞因子，需要特殊措施以使它們穩(wěn)定。例如產(chǎn)品Proleukin，是一種含有活性成分白細(xì)胞介素-2的凍干物，其中包含作為助劑的糖、無機(jī)緩沖液和陰離子去污劑(十二烷基硫酸鈉)。但是從毒理學(xué)角度看陰離子去污劑是非常值得懷疑的，特別是當(dāng)藥物要腸胃外給藥時(shí)。
另一個(gè)顯示了在使含細(xì)胞因子的制劑穩(wěn)定時(shí)的特殊困難的例子是市場(chǎng)上含有干擾素β的產(chǎn)品(Avonex、Betaferon、Rebif)。所有這些產(chǎn)品都是用白蛋白穩(wěn)定的，而從毒理學(xué)角度看白蛋白應(yīng)同樣被劃歸為非常危險(xiǎn)的物質(zhì)，特別是在考慮到不利免疫反應(yīng)時(shí)。
由于上述細(xì)胞因子和抗體之間的不同，各由一個(gè)抗體和兩個(gè)細(xì)胞因子組成的免疫細(xì)胞因子在其物理化學(xué)性質(zhì)上也與抗體明顯不同。特別是含有4α螺旋束細(xì)胞因子的免疫細(xì)胞因子，由于具有顯著疏水性，在水溶液中具有強(qiáng)烈的形成聚集物的傾向，并且所以很難使其穩(wěn)定。
本發(fā)明的目的是提供一種免疫細(xì)胞因子的穩(wěn)定制劑。所述制劑不應(yīng)包含任何毒理上不可接受的助劑；應(yīng)在增強(qiáng)的脅迫條件下(例如升高的溫度和大氣濕度)，穩(wěn)定時(shí)間延長(zhǎng)；且應(yīng)可用水性溶劑重新溶解，得到具有高活性成分含量的、可以即刻給藥的溶液。
令人驚奇的是，已經(jīng)有可能通過冷凍干燥含水緩沖溶液(其中除了免疫細(xì)胞因子以外，還包含糖或者氨基糖、氨基酸和表面活性劑)而提供一種達(dá)到上述要求的制劑。因此本發(fā)明涉及穩(wěn)定的、包含免疫細(xì)胞因子、糖或氨基糖、氨基酸和表面活性劑的凍干制劑。
所述制劑優(yōu)選包含免疫細(xì)胞因子，其中細(xì)胞因子組分選自具有4α螺旋束作為共同結(jié)構(gòu)特征的一組細(xì)胞因子，特別是白細(xì)胞介素，優(yōu)選IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11和/或IL-12，干擾素，優(yōu)選IFNβ和/或IFNγ，和/或造血生長(zhǎng)因子，優(yōu)選M-CSF、GM-CSF、G-CSF、EPO或SCF。所述組合物特別優(yōu)選包含含有白細(xì)胞介素-2(IL-2)的免疫細(xì)胞因子。
根據(jù)本發(fā)明的制劑具有良好的生理耐受性，可以容易地制備、可以精確配藥，并且根據(jù)儲(chǔ)存期間甚至是在重復(fù)凍溶過程后的測(cè)定、分解產(chǎn)物和聚集物情況來看是穩(wěn)定的。所述制劑在冷藏溫度下(2-8℃)和在室溫(23-27℃)及相對(duì)大氣濕度60％(r.h.)下儲(chǔ)存至少三個(gè)月，且長(zhǎng)達(dá)兩年內(nèi)都是穩(wěn)定的。令人驚奇的是，根據(jù)本發(fā)明的所述制劑在升高的溫度和更高的大氣濕度水平下，例如在溫度40℃和75％相對(duì)濕度下，在所述的儲(chǔ)存時(shí)間內(nèi)，仍然是穩(wěn)定的。
本凍干制劑可以簡(jiǎn)單方式，通過加入含水溶劑例如注射用水或者是等滲的含水溶液而重溶得到可以即刻給藥的、無微粒的溶液。重溶的溶液其穩(wěn)定期大約為5天，但是最好在24小時(shí)內(nèi)給藥。
使用含水溶劑重溶根據(jù)本發(fā)明的制劑，可以方便地制備pH從5到8、優(yōu)選5.6到7.4，特別優(yōu)選6到7，且滲透壓是250到350mOsmol/kg的含有免疫細(xì)胞因子的溶液。重溶的制劑因此可以直接通過靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)以及皮下給藥，而基本上沒有疼痛。除此以外，本制劑還可以被加于輸注溶液，例如葡萄糖溶液、等滲鹽溶液或林格溶液，這些溶液中也可含有其它活性成分，這樣就又能夠施用相對(duì)大量的活性成分。
根據(jù)本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案，凍干的藥物制劑基本上由免疫細(xì)胞因子、糖或者氨基糖、氨基酸、緩沖液和表面活性劑組成。
根據(jù)本發(fā)明的制劑可以制備濃度符合臨床需要的免疫細(xì)胞因子溶液。優(yōu)選的免疫細(xì)胞因子溶液，其濃度為大約0.1到25mg/ml，特別優(yōu)選1到10mg/ml，非常特別優(yōu)選1到5mg/ml。
根據(jù)本發(fā)明的制劑中使用的糖可以是單糖、二糖或者三糖。這些糖可以單獨(dú)或者與糖醇(例如甘露醇)混合使用。可提及的單糖的例子有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖和山梨糖；可提及的二糖的例子有蔗糖、乳糖、麥芽糖或海藻糖；且可提及的三糖的例子是棉子糖。優(yōu)選的糖是蔗糖、乳糖、麥芽糖或海藻糖，特別優(yōu)選蔗糖和麥芽糖。
也可以存在氨基糖，即含有伯、仲或叔氨基基團(tuán)或者?；被鶊F(tuán)(-NH-CO-R)而非羥基基團(tuán)的單糖。對(duì)于本發(fā)明的目的，優(yōu)選葡萄糖胺、N-甲基葡萄糖胺、半乳糖胺和神經(jīng)氨酸。
存在于根據(jù)本發(fā)明的制劑中的糖/氨基糖，其含量是這樣的在使用預(yù)定體積的溶劑重溶產(chǎn)生的溶液中，糖的濃度為大約1到200mg/ml。在重溶的溶液中，糖的優(yōu)選濃度為15到30mg/ml。
依照本發(fā)明使用的適宜的氨基酸是堿性、酸性或者中性氨基酸，例如精氨酸、組氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、甘氨酸等。氨基酸優(yōu)選以其無機(jī)鹽的形式使用(有利的是以鹽酸鹽，即氨基酸的氫氯化物形式)。在使用游離氨基酸時(shí)，所需的pH通過加入一種適宜的生理耐受的緩沖物質(zhì)，例如有機(jī)或無機(jī)酸(如檸檬酸和磷酸、硫酸、乙酸、甲酸或其鹽)來設(shè)定。優(yōu)選檸檬酸鹽和磷酸鹽，使用它們可以得到非常穩(wěn)定的凍干物。
優(yōu)選的氨基酸是精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸。除此以外，也可以使用酸性氨基酸，例如谷氨酸和天冬氨酸，或中性氨基酸例如異亮氨酸、亮氨酸和丙氨酸，或芳香族氨基酸，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。在根據(jù)本發(fā)明的制劑中氨基酸的含量是從1到200mmol/l，優(yōu)選是從40到100mmol/l，特別優(yōu)選是40-80mmol/l(每一個(gè)濃度都以重溶后的溶液為基礎(chǔ))。
可以使用的表面活性劑是通常在藥物制劑中使用的所有表面活性劑，優(yōu)選非離子表面活性劑，特別是聚山梨酸酯和聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物。特別優(yōu)選聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，特別是聚氧乙烯(20)山梨聚糖單十二酸酯和聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯。按照本發(fā)明，制劑包含0.001％到1％重量的(表面活性劑)，優(yōu)選0.005％到0.5％，且特別優(yōu)選0.01％到0.15％(每一個(gè)百分比濃度都以重溶后的溶液為基礎(chǔ))。
如果根據(jù)本發(fā)明的制劑包含緩沖液，則它們?cè)瓌t上可以是任何生理可耐受的、適宜于設(shè)定所需pH的物質(zhì)。緩沖物質(zhì)的量如此選擇，在凍干制劑重溶后(例如用注射用水重溶)得到的含水溶液其緩沖物質(zhì)的濃度是5mmol/l到50mmol/l，優(yōu)選10到20mmol/l。優(yōu)選的緩沖物質(zhì)是檸檬酸緩沖液或磷酸緩沖液。適宜的磷酸緩沖液是磷酸的單和/或二鈉鹽和鉀鹽的溶液，例如磷酸氫二鈉或磷酸二氫鉀，以及鈉鹽和鉀鹽的混合物，例如磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀的混合物。
如果重溶后的溶液不能通過免疫細(xì)胞因子的滲透性質(zhì)和為穩(wěn)定制劑而使用的助劑來達(dá)到等滲，則還可能進(jìn)一步需要等滲劑以能夠建立等滲性的量在制劑中存在。所述等滲劑優(yōu)選為生理可耐受的鹽，例如氯化鈉或氯化鉀，或者生理可耐受的多元醇或者糖，例如葡萄糖、甘油或甘露醇。
除此以外，根據(jù)本發(fā)明的凍干物還可包含其它生理可耐受的助劑，例如抗氧化劑(例如抗壞血酸或谷胱甘肽)，防腐劑(例如苯酚、間甲酚、甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、硫柳汞、苯扎氯銨或其它穩(wěn)定劑)、結(jié)構(gòu)形成者或增溶劑，例如聚乙二醇(PEG)，如PEG3000、3350、4000或6000，或環(huán)糊精，如羥丙基-β-環(huán)糊精、硫丁乙基-β-環(huán)糊精或γ環(huán)糊精，或葡聚糖。
根據(jù)本發(fā)明的制劑可以通過制備包含免疫細(xì)胞因子作為活性成分、及糖或氨基糖、氨基酸以及表面活性劑以及(如果需要的話)其它藥物助劑的含水制劑，然后凍干所述溶液而獲得。
所述含水制劑可以通過向包含免疫細(xì)胞因子的溶液中加入所述的助劑來制備。為達(dá)到此目的，將確定體積的含有確定濃度的所述助劑的儲(chǔ)液加入到含有確定濃度的得自其制劑的免疫細(xì)胞因子的溶液中，且如果需要的話，將混合物用水稀釋到事先計(jì)算好的濃度?；蛘?，助劑可以固體形式加入到包含免疫細(xì)胞因子的起始溶液中。如果免疫細(xì)胞因子是固體形式，如凍干物形式，則根據(jù)本發(fā)明的制劑可以如下制備首先將各自的免疫細(xì)胞因子溶于水或含有一種或多種其它助劑的含水溶液中，然后加入所需量的包含其它助劑的儲(chǔ)液、固體形式的其它助劑和/或水。免疫細(xì)胞因子可以有利地直接溶解于包含所有其它助劑的溶液中。在某一種免疫細(xì)胞因子制備的過程中或過程末尾，可以方便地加入根據(jù)本發(fā)明的制劑中的一種或者多種助劑。這優(yōu)選在免疫細(xì)胞因子制劑的制備之后，即將免疫細(xì)胞因子直接溶解于包含一種、一種以上或所有其他助劑的含水溶液中，或者是用適宜的方法(如切向流過濾)重新緩沖制劑之后，在純化的最后一步時(shí)進(jìn)行。為制備本制劑，各其它成分只需以較小量加入和/或根本不加入。最優(yōu)選在制備之后進(jìn)行的最后一步純化時(shí)，將各成分直接溶解于一種包含所有其他助劑的水溶液中，直接得到將要被凍干的溶液。
包含各免疫細(xì)胞因子和助劑的溶液pH設(shè)定為5到8，過濾除菌并且凍干。
得到的凍干制劑可以通過加入一種含水溶劑重溶而得到可以直接給藥的含水制劑，特別是可以通過腸胃外途徑直接給藥的。因此本發(fā)明還涉及一種免疫細(xì)胞因子的含水藥物制劑，所述制劑可以通過用一種含水溶劑重溶根據(jù)本發(fā)明的凍干物而得到。
重溶的含水藥物制劑的適宜pH為5-8，優(yōu)選pH在5.6-7，4，特別優(yōu)選pH在6.0-7.0。
實(shí)施例解釋了本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1(8020批)
來自包含以下成分的含水溶液的凍干物0.7mg/ml EMD 273066(huKS-IL2)5mmol/l檸檬酸100mmol/l精氨酸鹽酸鹽1.5％重量的蔗糖0.01％重量的聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯(Tween80)將確定體積的包含各確定濃度助劑的含水溶液混合，進(jìn)行制備。使用了以下溶液溶液A(活性成分溶液)包含5mg/ml EMD 2730665mmol/l檸檬酸100mmol/l精氨酸鹽酸鹽0.01％重量的聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯(Tween80)NaOH調(diào)pH至7.0溶液B(助劑溶液)包含1.744％重量的蔗糖5mmol/l檸檬酸100mmol/l精氨酸鹽酸鹽0.01％重量的聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯(Tween80)NaOH調(diào)pH至7.0為了制備根據(jù)本發(fā)明的制劑，將100ml溶液A與614ml溶液B混合。
制備的溶液在包裝前過濾除菌。每一個(gè)6ml的小瓶中注入4ml溶液。然后用塞子預(yù)封小瓶并凍干。凍干后，將小瓶密封并卷曲。
實(shí)施例2(8021批)
來自包含以下成分的含水溶液的凍干物0.7mg/ml EMD 27 3066(huKS-IL2)5mmol/l檸檬酸100mmol/l精氨酸鹽酸鹽1.5％重量的麥芽糖0.01％重量的聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯(Tween80)將確定體積的包含各確定濃度助劑的含水溶液混合，進(jìn)行制備。使用了以下溶液溶液A(活性成分溶液)包含5mg/ml EMD 2730665mmol/l檸檬酸100mmol/l精氨酸鹽酸鹽0.01％重量的聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯(Tween80)NaOH調(diào)pH至7.0溶液B(助劑溶液)包含1.744％重量的麥芽糖5mmol/l檸檬酸100mmol/l精氨酸鹽酸鹽0.01％重量的聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯(Tween80)NaOH調(diào)pH至7.0為了制備根據(jù)本發(fā)明的制劑，將100ml溶液A與614ml溶液B混合。
制備的溶液在包裝前過濾除菌。每一個(gè)6ml的小瓶中注入4ml溶液。然后用塞子預(yù)封小瓶并凍干。凍干后，將小瓶密封并卷曲。
實(shí)施例3(8431批)
來自包含以下成分的含水溶液的凍干物1mg/ml EMD 273066(huKS-IL2)5mmol/l檸檬酸100mmol/l精氨酸鹽酸鹽1.5％重量的蔗糖0.01％重量的聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯(Tween80)將確定體積的包含各確定濃度助劑的含水溶液混合，進(jìn)行制備。使用了以下溶液溶液A(活性成分溶液)包含1.45mg/ml EMD 2730661.5％重量的蔗糖5mmol/l檸檬酸NaOH調(diào)pH至7.0溶液B(助劑溶液)包含1.5％重量的蔗糖5mmol/l檸檬酸287mmol/l精氨酸鹽酸鹽0.0283％重量的聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯(Tween80)NaOH調(diào)pH至7.0為了制備根據(jù)本發(fā)明的制劑，將46.9ml溶液A與25.1ml溶液B混合。
制備的溶液在包裝前過濾除菌。每一個(gè)6ml的小瓶中注入2ml溶液。然后用塞子預(yù)封小瓶并凍干。凍干后，將小瓶密封并卷曲。
實(shí)施例4(8591批)
來自包含以下成分的含水溶液的凍干物4mg/ml EMD 273066(huKS-IL2)12.5mmol/l檸檬酸80mmol/l精氨酸鹽酸鹽1.8％重量的蔗糖0.008％重量的聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯(Tween80)將確定體積的包含各確定濃度助劑的含水溶液混合，進(jìn)行制備。使用了以下溶液溶液A(活性成分溶液)包含5mg/ml EMD 2730665mmol/l檸檬酸100mmol/l精氨酸鹽酸鹽0.01％重量的聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯(Tween80)NaOH調(diào)pH至6.0溶液B(助劑溶液)包含8.7％重量的蔗糖41mmol/l檸檬酸NaOH調(diào)pH至6.0為了制備根據(jù)本發(fā)明的制劑，將4ml溶液A與15.5ml溶液B混合。
制備的溶液在包裝前過濾除菌。每一個(gè)2ml的小瓶中注入1ml溶液。然后用塞子預(yù)封小瓶并凍干。凍干后，將小瓶密封并卷曲。
實(shí)施例5(比較制劑1使用甘露醇而不是蔗糖，8008批)來自包含以下成分的含水溶液的凍干物0.7mg/ml EMD 273066(huKS-IL2)
5mmol/l檸檬酸100mmol/l精氨酸鹽酸鹽4％重量的甘露醇0.01％重量的聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯(Tween80)NaOH調(diào)pH至7.0通過直接凍干具有上述組成的活性成分溶液進(jìn)行制備。
制備的溶液在包裝前過濾除菌。每一個(gè)6ml的小瓶中注入4ml溶液。然后用塞子預(yù)封小瓶并凍干。凍干后，將小瓶密封并卷曲。
實(shí)施例6(比較制劑2，8434批，在組成上與8431批對(duì)應(yīng)，沒有加入精氨酸)來自包含以下成分的含水溶液的凍干物1mg/ml EMD 273066(huKS-IL2)5mmol/l檸檬酸1.5％重量的蔗糖0.01％重量的聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯(Tween80)將確定體積的包含各確定濃度助劑的含水溶液混合，進(jìn)行制備。使用了以下溶液溶液A(活性成分溶液)包含1.45mg/ml EMD 2730661.5％重量的蔗糖5mmol/l檸檬酸NaOH調(diào)pH至7.0溶液B(助劑溶液)包含1.5％重量的蔗糖
5mmol/l檸檬酸0.0283％重量的聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯(Tween80)NaOH調(diào)pH至7.0為了制備根據(jù)本發(fā)明的制劑，將46.9ml溶液A與25.1ml溶液B混合。
制備的溶液在包裝前過濾除菌。每一個(gè)6ml的小瓶中注入2ml溶液。然后用塞子預(yù)封小瓶并凍干。凍干后，將小瓶密封并卷曲。
實(shí)施例7(比較制劑3，8430批，在組成上與8431批對(duì)應(yīng)，沒有加入Tween80)來自包含以下成分的含水溶液的凍干物1mg/ml EMD 273066(huKS-IL2)5mmol/l檸檬酸100mmol/l精氨酸鹽酸鹽1.5％重量的蔗糖將確定體積的包含各確定濃度助劑的含水溶液混合，進(jìn)行制備。使用了以下溶液溶液A(活性成分溶液)包含1.45mg/ml EMD 2730661.5％重量的蔗糖5mmol/l檸檬酸NaOH調(diào)pH至7.0溶液B(助劑溶液)包含1.5％重量的蔗糖5mmol/l檸檬酸
287mmol/l精氨酸鹽酸鹽NaOH調(diào)pH至7.0為了制備根據(jù)本發(fā)明的制劑，將46.9ml溶液A與25.1ml溶液B混合。
制備的溶液在包裝前過濾除菌。每一個(gè)6ml的小瓶中注入2ml溶液。然后用塞子預(yù)封小瓶并凍干。凍干后，將小瓶密封并卷曲。
實(shí)施例8(比較制劑4，8429批，在組成上與8431批對(duì)應(yīng)，沒有加入Tween80和精氨酸)來自包含以下成分的含水溶液的凍干物1mg/ml EMD 273066(huKS-IL2)5mmol/l檸檬酸1.5％重量的蔗糖將確定體積的包含各確定濃度助劑的含水溶液混合，進(jìn)行制備。使用了以下溶液溶液A(活性成分溶液)包含1.45mg/ml EMD 2730661.5％重量的蔗糖5mmol/l檸檬酸NaOH調(diào)pH至7.0溶液B(助劑溶液)包含1.5％重量的蔗糖5mmol/l檸檬酸NaOH調(diào)pH至7.0
為了制備根據(jù)本發(fā)明的制劑，將46.9ml溶液A與25.1ml溶液B混合。
制備的溶液在包裝前過濾除菌。每一個(gè)6ml的小瓶中注入2ml溶液。然后用塞子預(yù)封小瓶并凍干。凍干后，將小瓶密封并卷曲。
對(duì)制劑穩(wěn)定性的研究使用穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的制劑的穩(wěn)定性。為達(dá)到這一目的，將制備的凍干物在不同的溫度下儲(chǔ)存特定時(shí)間長(zhǎng)度，使用適宜的分析方法進(jìn)行研究。40℃，相對(duì)大氣濕度為75％的氣候條件被選作脅迫條件，以快速地獲得不同制劑穩(wěn)定性的差異。免疫細(xì)胞因子中可能的不穩(wěn)定性主要顯示于聚集物的形成和降解產(chǎn)物的形成。降解產(chǎn)物和可溶性聚集物優(yōu)選通過大小排阻層析(SEC-HPLC)測(cè)定，而目測(cè)和濁度測(cè)量檢測(cè)可見的聚集物。同樣ELISA檢驗(yàn)用于評(píng)價(jià)制劑的完整性和與受體結(jié)合的能力。ELISA與280nm波長(zhǎng)的紫外分光光度測(cè)定一起，還可用于確定含量。
分析檢驗(yàn)方法外觀在冷光源的幫助下用眼睛檢查制備的制劑中是否存在微?；蛴锌赡艿幕鞚岢霈F(xiàn)。
蛋白質(zhì)濃度A280nm得到的蛋白質(zhì)溶液在280nm波長(zhǎng)的吸收用于確定制備的制劑的濃度?；钚猿煞謍uKS-IL2(EMD273066)的消光系數(shù)1.41由定量氨基酸分析確定。對(duì)于實(shí)際的測(cè)量，將蛋白質(zhì)溶液三等份稀釋，直至待測(cè)溶液的吸收在0.1和1.0(對(duì)應(yīng)0.5mg/ml的蛋白濃度)吸收單位之間。相對(duì)于不含有活性成分的對(duì)應(yīng)參比溶液，測(cè)量含有活性成分的待測(cè)溶液的吸收度。
純度大小排阻層析，SEC-HPLC大小排阻層析(SEC-HPLC)是一種分析方法，用它可以確定制備制劑的純度以及單體/聚集體的比例。待測(cè)溶液的組分根據(jù)它們的分子大小，通過一種特殊的多孔HPLC柱子而分開。相對(duì)大的分子被洗脫，而相對(duì)小的分子不同程度地?cái)U(kuò)散滲入到固定相的孔中，從而或強(qiáng)或弱地被保留。因此，相對(duì)小的分子例如huKS-IL2的降解產(chǎn)物比huKS-IL2單體，且特別是比首先從柱子中被洗脫的huKS-IL2聚集物，出現(xiàn)在較晚的保留時(shí)間。
活性成分分子的濃度和完整性KSA-ELISA在此分析方法(ELISA，酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè))中，用對(duì)于huKS-IL2的特異抗原(EPCAM或KSA抗原)包被微量反應(yīng)板，待測(cè)溶液中將要被確定的huKS-IL2分子通過它們的抗體組分與抗原結(jié)合，并由此結(jié)合到微量反應(yīng)板上。加入生物素化的抗IL-2抗血清后，抗IL-2抗體與結(jié)合在反應(yīng)板上的huKS-IL2分子的IL2部分發(fā)生反應(yīng)。洗滌微量反應(yīng)板，除去過量的抗IL-2抗體。加入的鏈親和素過氧化物酶的共軛物通過生物素與反應(yīng)板結(jié)合，并使隨后步驟中加入的染料四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯(TMB)的無色形式氧化，產(chǎn)生藍(lán)色。在一段確定的時(shí)間后加入磷酸終止氧化反應(yīng)。溶液呈現(xiàn)黃色，可以在450nm波長(zhǎng)處定量測(cè)定。蛋白質(zhì)待測(cè)溶液的濃度在這里與該波長(zhǎng)測(cè)定的吸收成正比。
結(jié)果表1和2(8020批和8021批)的結(jié)果明確地確證了制備的制劑的質(zhì)量和穩(wěn)定性。40℃，75％相對(duì)大氣濕度的氣候條件被選作脅迫條件，以快速地獲得不同制劑穩(wěn)定性的差異。令人驚奇的是，上述的制劑即使在提高的溫度和相對(duì)大氣濕度下(40℃，75％相對(duì)大氣濕度)下放置大于6個(gè)月的時(shí)間仍然是穩(wěn)定的。對(duì)應(yīng)的比較制劑1(表3，8008批實(shí)施例5)，其中使用糖醇甘露醇，而非二糖(蔗糖或麥芽糖)作結(jié)構(gòu)形成者，已經(jīng)在相應(yīng)的脅迫條件下放置4周后聚集。在室溫(25℃，60％相對(duì)濕度)下放置26周后，明顯可見的聚集物同樣在相應(yīng)的恒溫恒濕條件下廣布。這樣比較制劑1只能在冷卻條件下儲(chǔ)存，這與根據(jù)本發(fā)明的制劑形成對(duì)比。
實(shí)施例制劑4(8591批)是另一個(gè)證明根據(jù)本發(fā)明的制劑穩(wěn)定性的例子，同時(shí)也顯示可以將所述制劑應(yīng)用于增加的蛋白質(zhì)濃度(參見表4)。所述制劑在40℃(75％相對(duì)濕度)下儲(chǔ)存了14周。
在另一系列實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)了根據(jù)本發(fā)明的制劑中的所有助劑是否對(duì)于穩(wěn)定作用都是必需的。實(shí)驗(yàn)批8431包含根據(jù)本發(fā)明的制劑中的所有組分，而比較制劑缺少了個(gè)別組分-與實(shí)施例3(8431批)一致的制劑所有的組分都存在-比較制劑2(實(shí)施例6，8434批)沒有加入精氨酸-比較制劑3(實(shí)施例7，8430批)沒有加入Tween80-比較制劑4(實(shí)施例8，8429批)沒有加入Tween80和精氨酸示于

圖1中的結(jié)果明確地確證了加入氨基酸對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的制劑的穩(wěn)定性是絕對(duì)必要的。根據(jù)所述圖，盡管加入Tween80看起來不必要，但這與事實(shí)并不完全符合。早在活性成分溶液制備的蛋白質(zhì)純化步驟中，就加入了Tween80，其特別目的是防止可見聚集物的形成。這里使用的Tween80的濃度高于臨界微團(tuán)濃度(CMC，Tween80的CMC為0.001％)。在所述系列實(shí)驗(yàn)中，試圖通過所謂的切向流過濾方法除去精氨酸和Tween80。在此，由滲濾的方式通過一個(gè)50kD的膜進(jìn)行緩沖液的交換。但是有些情況下Tween80微團(tuán)大于膜的排阻限，因此不能被完全除去。
向根據(jù)本發(fā)明的制劑中加入Tween80對(duì)于凍干物的重新溶解以及對(duì)于重溶后獲得的溶液的穩(wěn)定性是絕對(duì)必要的，這由另一項(xiàng)研究證實(shí)。從包含Tween80的EMD 273066(huKS-IL2)活性成分溶液開始，通過蛋白質(zhì)A柱子進(jìn)行親和層析分離并除去助劑Tween80。向得到的無Tween80溶液中逐漸增量加入Tween8 0。得到的制劑在2ml的小瓶?jī)?nèi)，放置于實(shí)驗(yàn)室搖床上，在25℃下脅迫21天。每日目測(cè)受脅迫的制劑，在特定時(shí)刻用分光光度法分析它們的蛋白質(zhì)含量。所述研究的結(jié)果示于圖2。對(duì)于沒有加入Tween80的制劑，只經(jīng)過一天就觀察到了輕微的混濁，混濁隨著時(shí)間的延伸變得日益可見。經(jīng)過21天后，還發(fā)現(xiàn)了含量的顯著下降，如圖所示。
表1根據(jù)實(shí)施例1的制劑8020的穩(wěn)定性
表2根據(jù)實(shí)施例2的制劑8021的穩(wěn)定性
表3比較制劑1(根據(jù)實(shí)施例5的8008批)的穩(wěn)定性
表4根據(jù)實(shí)施例4的制劑(8591批)的穩(wěn)定性
權(quán)利要求
1.免疫細(xì)胞因子的凍干藥物制劑，其包含免疫細(xì)胞因子、糖或氨基糖、氨基酸和表面活性劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的凍干藥物制劑，其特征在于其中存在的免疫細(xì)胞因子是含有選自具有一束四個(gè)α螺旋作為共同結(jié)構(gòu)特征的細(xì)胞因子作為其細(xì)胞因子成分的免疫細(xì)胞因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的凍干藥物制劑，其特征在于所述免疫細(xì)胞因子含有白細(xì)胞介素、干擾素和/或造血生長(zhǎng)因子作為其細(xì)胞因子組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的凍干藥物制劑，其特征在于所述免疫細(xì)胞因子含有白細(xì)胞介素2作為其細(xì)胞因子組分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干藥物制劑，其特征在于所述制劑基本由免疫細(xì)胞因子、糖或氨基糖、氨基酸、緩沖劑和表面活性劑組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干藥物制劑，其特征在于所述糖是單糖、二糖或三糖，優(yōu)選為蔗糖、乳糖、麥芽糖或者海藻糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干藥物制劑，其特征在于所述氨基糖是葡萄糖胺、N-甲基葡萄糖胺、半乳糖胺或者神經(jīng)氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干藥物制劑，其特征在于所述氨基酸是堿性、酸性或中性氨基酸，優(yōu)選為精氨酸、賴氨酸或鳥氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干藥物制劑，其特征在于所述表面活性劑是非離子表面活性劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的凍干藥物制劑，其特征在于所述表面活性劑是聚山梨酸酯或聚氧乙烯-聚氧丙烯聚集物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的凍干藥物制劑，其特征在于所述表面活性劑是聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯——聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯或聚氧乙烯(20)山梨聚糖單十二酸酯。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干藥物制劑，其特征在于進(jìn)一步存在建立等滲性所必需量的等滲劑。
13.免疫細(xì)胞因子的含水藥物制劑，其可以通過用含水溶劑重溶根據(jù)權(quán)利要求1至12中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干藥物制劑而獲得。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的免疫細(xì)胞因子的含水藥物制劑，其特征在于所述溶液pH為5-8，優(yōu)選為5.6-7.4。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的免疫細(xì)胞因子的含水藥物制劑，其特征在于所述溶液的pH為6-7。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至12中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干藥物制劑的制備方法，其特征在于制備包含免疫細(xì)胞因子、糖或氨基糖、氨基酸、表面活性劑及，如果需要，還包含其它藥物助劑的含水制劑，以及然后將所述溶液凍干。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的包含免疫細(xì)胞因子的凍干藥物制劑。所述制劑具有延長(zhǎng)的保存期限，甚至是在升高的溫度下，并且所述制劑在重溶后可以作為藥物經(jīng)腸胃外途徑給藥。
文檔編號(hào)A61K38/21GK1627958SQ03803355
公開日2005年6月15日 申請(qǐng)日期2003年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月6日
發(fā)明者H-P·措貝爾, S·O·阿恩特 申請(qǐng)人:默克專利股份有限公司