專利名稱：一種單克隆抗體、其編碼基因、用途以及分泌它的雜交瘤細胞系的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系，一種單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體，編碼它們的基因和它們的用途。這類抗體通過與CD146分子相互作用能夠抑制腫瘤生長和轉移，終止早期妊娠。因此，它們可以用于與血管生成有關疾病的診斷和治療，是一類新型的避孕和流產藥物。
背景技術：
腫瘤是一種與血管生成有關的疾病，是當前危害人類生命健康的頭號殺手。我國每年惡性腫瘤的發(fā)病人數(shù)約160萬。死于癌癥者占死亡總人數(shù)的20％以上，居城市居民死亡原因的第一位(根據(jù)1996年統(tǒng)計資料)。目前缺乏對腫瘤進行早期特異性診斷的方法。在腫瘤治療中，三大常規(guī)<放療，化療和手術>是首選，藥物治療是一個重要方面。由于大多數(shù)腫瘤化療藥物不是針對腫瘤細胞的特異性作用，因此副作用大而且容易產生耐藥性。此外影響腫瘤藥物治療效果的因素還包括藥物的運輸方式和滲透性等，這是目前腫瘤治療學急需解決的關鍵問題。本研究首次發(fā)現(xiàn)CD146分子特異分布于新生血管內皮細胞，在新生血管生成過程中起著非常重要的作用。血管生成在生理和病理條件下均可發(fā)生。病理條件下的血管生成包括腫瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變、類風濕性關節(jié)炎等，生理條件下的血管生成包括胚胎發(fā)育和傷口愈合等。
本發(fā)明的特色之一在于發(fā)現(xiàn)CD146分子選擇性地表達在腫瘤新生血管，因此它可以作為一個腫瘤血管特征性標志物用于腫瘤的診斷。在治療方面，本發(fā)明所采取的策略是通過干擾CD146在血管生成方面的作用，從而阻斷腫瘤區(qū)的營養(yǎng)和氧供應，使腫瘤細胞缺血壞死[1]。本發(fā)明與傳統(tǒng)的抗腫瘤抗體相比，其特點在于抗CD146抗體是一類高效、廣譜、無毒或低毒、無耐藥性的新型抗癌藥物。作用機理如下，(1)腫瘤血管內皮細胞相對比較穩(wěn)定，突變少，因此抗腫瘤血管藥物不會象抗腫瘤細胞藥物那樣易產生耐藥性；(2)不同類型實體瘤的特異靶分子不同，而它們賴以生存的新生血管結構大致相同，因此抗腫瘤新生血管抗體具有廣譜性，即一種抗腫瘤血管藥物可以應用于多種腫瘤的治療；(3)成千上萬個腫瘤細胞依賴于一條毛細血管獲取氧和營養(yǎng)物質，即使少量藥物對于血管的不完全破壞，亦會造成血栓形成，導致大量腫瘤細胞缺血死亡。因此本發(fā)明用藥量少，效率高；(4)腫瘤血管藥物直接作用于血管內皮，無需穿透到腫瘤深部，避免了腫瘤組織局部高壓所引起的藥物滲透和分布問題；(5)抗體選擇性地破壞腫瘤血管而非正常血管，這種高度藥物靶向特異性將大大減少藥物的毒付作用。
本發(fā)明的特色之二在于發(fā)現(xiàn)CD146分子特異分布于滋養(yǎng)層細胞，在胚胎植入和胎盤建立過程中起著非常重要的作用。目前避孕藥物的作用機理主要是通過干預胚泡植入過程。胚泡侵入到母體子宮內的過程(簡稱植入)，是一個受到母體孕酮和雌激素的共同控制過程。胚胎植入的順利進行，一方面要求胚泡從透明帶孵育出來，處于活化狀態(tài)，另一方面還要求母體的子宮處于接受狀態(tài)，能夠接受胚泡的植入。這兩方面在時間和空間需要高度的協(xié)調一致，否則將導致胚泡植入失敗，造成流產[2，3]。研制新型避孕藥物的關鍵是尋找在胚胎植入過程中起關鍵作用的新型藥物靶分子。作為一個有應用前景的避孕藥物靶點要具備以下2個基本條件(1)特異性避孕候選藥物靶點必需只在胚泡植入過程中起關鍵作用，而對其他器官沒有重要作用，否則會增加藥物的副作用；(2)通用性由于不同的種屬的胚泡植入和早期胎盤形成的方式差異很大，因此最好選用一個避孕靶點能夠應用于多個種屬植入過程。
我們首次發(fā)現(xiàn)CD146是一個非常理想的避孕藥物靶分子，具備上述兩個條件(1)CD146是一個非常保守的通用靶分子，人和小鼠的CD146mRNA序列同源性達到82％以上，它在人和小鼠的胚泡植入中都起重要作用；(2)CD146分子在血管內皮和胚胎滋養(yǎng)層細胞[4]上高表達，這保證了CD146作為避孕靶分子的特異性。我們發(fā)現(xiàn)抗CD146抗體能夠有效阻斷小鼠胚泡植入，造成小鼠流產率達80％以上，這一發(fā)現(xiàn)為避孕藥物的開發(fā)提供了新的途徑和新型候選藥物。進一步分析抗CD146抗體的作用機制，我們發(fā)現(xiàn)(1)抗CD146抗體抑制小鼠滋養(yǎng)層細胞黏附和遷移；(2)抑制小鼠滋養(yǎng)層細胞分泌金屬蛋白酶，從而抑制胚泡外圍的滋養(yǎng)層細胞侵入到母體子宮內；(3)抑制母體蛻膜的血管生成，導致胚胎發(fā)育滯后。在動物實驗中，對妊娠期小鼠注射抗CD146抗體后，不僅造成流產現(xiàn)象，而且母體子宮蛻膜中的血管密度與對照組相比明顯減少。這些試驗結果為避孕藥物的開發(fā)提供了新思路和新靶點，抗CD146抗體為一類新型避孕藥物。
本發(fā)明采用兩種技術路線制備抗CD146分子的抗體(1)采用腫瘤細胞培養(yǎng)上清誘導人臍靜脈內皮細胞，使其成為增殖的血管內皮細胞。后者用于免疫小鼠獲得單克隆抗體。這種新方法不僅提高了增生血管內皮細胞標志的豐度，維持了細胞膜抗原的天然構象，而且還可以發(fā)現(xiàn)增生期血管新的靶分子。(2)利用現(xiàn)代分子生物學和抗體工程技術，研制出各種不同結構形式的基因工程抗體。這些抗體比原代鼠單克隆抗體具有更大的應用價值，主要表現(xiàn)在免疫源性較低、毒副作用小；易于與其它功能分子結合形成高效的免疫復合物；抗體基因易于保存并有利于進行抗體結構與功能的改造，以更好地適應于臨床應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種分泌特異結合CD146分子的單克隆抗體的雜交瘤細胞系。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種特異結合CD146分子的單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種編碼這種單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體的核苷酸序列。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體的用途。
本發(fā)明提供了一種分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系，所分泌的單克隆抗體特異結合CD146分子。該細胞系已于2000年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址是，中國，北京，中關村，其保藏編號為CGMCC0491。
本發(fā)明還提供了由所述的雜交瘤細胞系分泌的單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體。所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)可以具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述抗體的輕鏈可變區(qū)可以具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了所述的單克隆抗體的Fab片段，其中，該Fab片段的Fab輕鏈可具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，該Fab片段的Fab重鏈可具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了所述的單克隆抗體的單鏈抗體，其中，該單鏈抗體可具有SEQ ID NO5所示的氨基酸序列。
本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明的單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體在制備用于腫瘤診斷和導向治療的藥物中的應用。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體在藥物篩選和腫瘤疫苗中的應用。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體在制備阻止早期妊娠和避孕方面的藥物中的應用。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體在制備治療與新生血管有關的疾病的藥物中的應用。
綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)抗CD146抗體不僅能夠抑制胚胎植入導致流產，而且能夠抑制腫瘤生長和轉移。因此，這類抗體可用于腫瘤及其它與血管生成有關疾病的診斷和治療，是一類新型的避孕和流產藥物。
附圖簡要說明

圖1流式細胞術分析CD146抗體與各種細胞的結合.抗CD146抗體結合人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和人微血管內皮細胞(HMVEC)，而不結合表皮細胞(A431)和乳腺上皮細胞(HBL100)。
圖2免疫組化表示抗CD146抗體結合胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、平滑肌肉瘤等組織中的新生血管。
圖3SDS-PAGE分析CD146抗體親和層析柱分離和純化靶分子。1-蛋白標準分子量；2-人臍靜脈內皮蛋白質粗提液，3-層析柱流出液；4-層析柱洗脫液，5-洗脫液與Protein A反應去除免疫球蛋白之后蛋白組分。
圖4抗體靶分子與CD146分子的氨基酸序列比較。
圖5凝膠分析抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)經(jīng)過PCR擴增后的基因產物。1-1Kb DNA標準分子量；2-載體；4-VL基因；5-VH基因。
圖6抗體Fab基因和重組質粒的構建。1-100bp DNA標準分子量；2-抗體輕鏈基因；3-載體pComb3-k SacI/XbaI；4-抗體輕鏈可變區(qū)；5-抗體輕鏈基因；6-抗體重鏈Fd；7-重鏈可變區(qū)。
圖7SDS-PAGE和免疫印跡檢測抗體Fab和單鏈抗體scFv。
圖8ELISA檢測單克隆抗體(IgG)，抗體Fab和單鏈抗體scFv對CD146分子的結合活性。
圖9凝膠電泳分析含有單鏈抗體基因的重組質粒。1，2，4-分別代表不同的克??；3-DNA標準分子量。
圖10雞胚尿囊膜血管生成試驗A同型鼠IgG對尿囊膜血管生長無影響。B抗CD146抗體對雞胚血管生成具有明顯的抑制作用。
圖11抗CD146抗體抑制腫瘤生長，抑制率分別為平滑肌肉瘤(SK-LMS-1)50％，肝癌(7721)71.9％，胰腺癌(SW1990)48.7％。用131I-抗CD146抗體偶聯(lián)物治療胰腺癌時，腫瘤抑制率達到82％。
圖12動物試驗表示荷人胰腺癌裸鼠在經(jīng)過抗CD146抗體和同型鼠抗體(對照組)治療后的情況。與對照組相比，抗CD146抗體對于腫瘤的生長具有明顯的抑制作用。
圖13治療后腫瘤的病理檢查。A-比較對照組同型鼠抗體(上)和抗CD146抗體治療后的腫瘤大??；B-抗CD146抗體治療后的腫瘤病理分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中血管密度降低，部分血管可見栓塞，血管周圍腫瘤細胞可見空泡壞死。
圖14抗CD146抗體對小鼠外胎盤錐黏附的影響。
圖15抗CD146抗體對小鼠外胎盤錐擴展的影響。
圖16小鼠外胎盤錐在抗CD146抗體或同型鼠IgG存在下的體外生長情況。A-在抗CD146抗體的存在下小鼠外胎盤錐不向外擴展，B-在同型鼠IgG的存在下小鼠外胎盤錐的擴展不受影響。
圖17抗CD146抗體對經(jīng)FGF刺激的小鼠外胎盤錐黏附的影響。
圖18抗CD146抗體對經(jīng)FGF刺激的小鼠外胎盤錐擴展的影響。
圖19抗CD146抗體對經(jīng)VEGF刺激的小鼠外胎盤錐黏附的影響。
圖20抗CD146抗體對經(jīng)VEGF刺激的小鼠外胎盤錐擴展的影響。
圖21抗CD146抗體對小鼠外胎盤錐金屬蛋白酶分泌的影響。(a)和(d)為培養(yǎng)24小時培養(yǎng)液的酶譜結果，(b)和(e)為培養(yǎng)48小時培養(yǎng)液的酶譜結果，(c)和(f)EDTA處理組。
圖22抗CD146抗體對小鼠胚泡植入的影響?？笴D146抗體導致80％以上的胚胎流產。圖22-A是以PBS為對照，圖22-B是以同型鼠IgG為對照。
圖23動物試驗觀察CD146抗體導致妊娠小鼠流產。小鼠子宮分左右兩側，左側經(jīng)過抗CD146抗體處理后，個別殘余的胚胎發(fā)育不良或畸形。右側為對照經(jīng)過無關小鼠IgG處理，胚胎發(fā)育正常。
實施例實施例一抗CD146單克隆抗體的制備和鑒定應用雜交瘤技術生產單克隆抗CD146抗體[5]，具體操作如下采用肝癌細胞的培養(yǎng)上清誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增生，以增生的HUVEC作為免疫原對BALB/C小鼠進行五次免疫接種。每次接種部位為腹膜內注射和皮下注射，注射的細胞總數(shù)大約為107。在最后一次免疫接種三天后，取脾臟，并將脾細胞懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基中。在聚乙二醇(PEG)存在下，將脾細胞和P3-X63-Ag8.635鼠骨髓瘤細胞進行融合，并用HAT選擇性培養(yǎng)基對雜交瘤進行篩選。
運用Douillard等人介紹的方法[6]，將增生HUVEC細胞接種到96孔培養(yǎng)板內培養(yǎng)過夜。用新鮮配置的0.5％的戊二醛固定細胞15分鐘，用PBS洗三遍。加入牛血清白蛋白封閉1小時。然后加入分泌抗體的雜交瘤培養(yǎng)上清、酶標抗體和底物，進行ELISA篩選。挑選只與免疫原結合而不與原代HUVEC結合的單克隆抗體。篩選出的陽性克隆在通過免疫組化方法進一步篩選。用每個克隆的培養(yǎng)上清對正常肝及肝癌組織冰凍切片染色，挑選只與肝癌血管反應而不與正常肝反應的雜交瘤細胞株。經(jīng)過以上兩種方法的篩選，最后獲得的特異抗體僅與增生HUVEC及與肝癌血管內皮反應，不與正常肝血管反應。
用限制性稀釋法多次克隆分泌特異抗體的雜交瘤細胞，最后獲得分泌新生血管特異抗體的雜交瘤細胞HE2A5(保藏號CGMCC0491)。HE2A5雜交瘤所分泌的抗體識別靶抗原為CD146分子。
腹水的制備方法簡述如下六周齡BALB/C小鼠腹腔注射降植烷(Pristane)0.5ml/只。10天后，將雜交瘤細胞懸液接種于BALB/C小鼠腹腔，1×107/ml/只，約十天后，收集腹水，離心取上清。通過蛋白A親和層析，從培養(yǎng)上清或腹水中純化單克隆抗體。將純化單克隆抗體無菌過濾，并冷藏或冷凍保存。應用Zymed公司抗體亞型鑒定試劑盒，ELISA方法鑒定出抗CD146抗體屬于IgG型抗體。
采用FACS細胞分類器分析抗CD146抗體對各種細胞系的結合活性。將1×106細胞與抗CD146抗體培養(yǎng)上清共孵育1小時。用PBS洗三遍，加入FITC-羊抗鼠IgG抗體，浮育45分鐘。洗三遍后，將細胞重新懸浮在500μlPBS中。在FACS上進行免疫熒光分析并測定平均熒光密度。實驗結果歸納于表1和圖1。
表1 FACS分析CD146抗體與人正常和腫瘤細胞系的結合

利用冷凍組織切片和免疫組化方法[7]鑒定抗CD146抗體與人體正常組織和腫瘤組織的反應，結果表明抗CD146抗體與許多腫瘤組織的微血管高特異反應，而與正常組織的反應十分有限(表2，圖2)。
表2 免疫組織化學分析CD146抗體與人正常和腫瘤組織血管的結合

為了進一步研究抗體靶分子的理化性質，我們用生物素標記HUVEC細胞膜蛋白，免疫沉淀，SDS-PAGE和免疫印跡等方法分析，確定抗體靶分子是一個分子量為97kD左右(圖3)，表達于細胞表面的膜蛋白，抗原決定簇為構象結構。利用親和層析分離純化抗體靶分子，通過氨基酸序列分析結果表明靶分子的N端20個氨基酸與人細胞黏附分子CD146完全相同，確認CD146分子(圖4)。
CD146分子，又名MUC18、A32抗原、MCAM、Mel-CAM和S-Endo-1[8-10]，新近被鑒定為Ig基因超家族的成員。它是一種跨膜的糖蛋白，其胞外區(qū)有一個典型的V-V-C-C-C的類Ig結構域，僅有一個跨膜區(qū)，胞質部分較短，有一些潛在的蛋白激酶的識別位點。CD146是一個高度糖基化的蛋白質，大約35％的分子量是由碳水化合物組成，包括唾液酸和其它的碳水化合物。目前，對CD146功能理解甚少。有試驗表明它參與細胞黏附、遷移和細胞信號傳導[11-13]。本發(fā)明解釋了CD146分子的部分生物學功能，發(fā)現(xiàn)了CD146分子及其抗體在腫瘤診斷和治療以及避孕藥物方面的應用價值。
實施例二抗CD146人-鼠嵌合抗體的制備由于鼠單克隆抗體在人體免疫系統(tǒng)中被識別為外來物質，誘發(fā)機體的免疫排斥反應，因而不適用于人體治療。為了克服這一缺點。本發(fā)明采用現(xiàn)代分子生物學技術，研制出了人/鼠嵌合抗體chiAA98。該抗體的可變區(qū)(抗原結合區(qū))來自鼠源蛋白(占抗體分子的1/3)，其他不變區(qū)來自人IgG(占抗體分子的2/3)。這種抗體不僅保持了鼠單抗結合抗原的特異性，能夠競爭抑制單克隆抗CD146抗體與其靶抗原的結合；而且降低了抗體分子中的鼠源成分，減低了人的免疫排斥反應，增加了抗體的生物學效應功能，便于臨床應用。研制嵌合抗體的操作步驟如下從雜交瘤細胞HE2A5中分離純化mRNA，合成第一鏈cDNA。設計引物輕鏈可變區(qū)引物為5′gg tct aga gag ctc gtg atg aca 3′(23mer)(SEQID NO6)和5′at gga tcc agc ccg ttt tat ttc c 3′(24mer)(SEQID NO7)；重鏈可變區(qū)引物為5′ccg ctc gag gag gtg cag ctg ctg gaatct 3′(30mer)(SEQ ID NO8)和5′ccc aag ctt tga gga gac ggtga 3′(23mer)(SEQ ID NO9)。用PCR方法克隆和擴增抗體輕和重鏈可變區(qū)基因(圖5)，并分別克隆到T載體上進行基因序列分析。根據(jù)所獲得的基因序列推導出該基因所編碼的重鏈可變區(qū)是由118個氨基酸組成，序列如SEQ ID NO1所示。抗CD146抗體輕鏈可變區(qū)是由112個氨基酸組成，序列如SEQ ID NO2所示。
然后把抗CD146抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因分別與人的輕鏈和重鏈恒定區(qū)基因連接，構建可編碼完整嵌合抗體的融合基因；將這種融合基因插入到有選擇性標記和基因控制區(qū)(如啟動子，增強子，終止子)的表達載pDHL[14]中；在細菌中擴增這種表達載體，分離純化含有嵌合抗體基因的表達載體。用lipofectin將含有嵌合抗體基因的表達載體導入哺乳動物細胞CHO中。用MTX篩選轉化細胞，獲得轉基因細胞株CHO-chiAA98。用ELISA篩選分泌抗體并鑒定細胞株CHO-chiAA98的穩(wěn)定性。檢測嵌合抗體的抗原結合特異性和效應功能，結果顯示抗CD146嵌合抗體保留親代抗CD146抗體的特異性。
實施例三 抗CD146抗體一Fab的制備利用抗體識別腫瘤血管的特異性，將抗體識別功能片段與具有免疫活性或抗腫瘤活性物質連接，研制出具有識別和殺傷作用的雙能夠融合蛋白。其中抗體成分主要是Fab。生產抗體Fab功能片段的操作步驟如下首先設計一套引物抗體Fd引物為5’agg tcc agc tgc tcg agt ctg g3’(mH1)(SEQ ID NO10)和5’gat atc act agt ggg ccc gct ggg ctc3’(forIgG2a/2b)(SEQ ID NO11)；抗體輕鏈引物為5’primer gat att gag ctc gtgatg ac(c/a) ca(g/a)(t/a)ct cc(SEQ ID NO12)和3’primer 5’gc tct aga aag ctta tta aca ctc att cct gtt gaa(SEQ ID NO13)。用快速制備、純化mRNA試劑盒(Promega)從大約2×107個雜交瘤細胞HE2A5中提取并純化mRNA。以純化的mRNA為模板，反轉錄合成cDNA。用PCR方法，以cDNA為模板，在PCR反應體系中分別加入引物，進行30個循環(huán)的PCR擴增。每個循環(huán)的條件是94℃變性30s，55℃退火90s，72℃延伸90s，反應進行到最后一個循環(huán)后在72℃中保溫10min。反應結束后，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物(圖6)。把擴增抗CD146抗體的Fd(抗體可變區(qū)和恒定區(qū)CH1)基因和輕鏈基因克隆到pComb3H[15]表達載體上。把Fab-pCom3H重組質粒轉入大腸桿菌XL-Blue(DE3)，用含氨芐青霉素選擇性培養(yǎng)基篩選重組菌。用IPTG誘導重組菌表達可溶性抗CD146抗體-Fab。從胞周質中分離純化抗CD146抗體-Fab(圖7)。ELISA和免疫印記鑒定可溶性抗CD146抗體-Fab的特異性(圖8)。
分析抗CD146抗體-Fab的基因序列并推導出抗CD146抗體輕鏈是由217個氨基酸組成，序列如SEQ ID NO3所示?？笴D146抗體重鏈Fd是由222個氨基酸組成，序列如SEQ ID NO4所示。
實施例四抗CD146小分子單鏈抗體的制備抗CD146小分子單鏈抗體是保留抗體的特異性和生物活性的最小分子。由于它分子量小和免疫源性低，因此有利于作為載體攜帶藥物和毒素進行免疫治療。制備方法如下設計引物輕鏈可變區(qū)引物為5′primer for VL(25mer)ccg gag ctcgtg atg aca caa tct c(SEQ ID NO14)和3′primer for VL(26mer)gc tct aga ccg ttt tat ttc cag ctt(SEQ ID NO15)；重鏈鏈可變區(qū)引物為5′primer for VH(27mer)ccg ctc gag tct gga gct gag ctg gtg(SEQ ID NO16)和3′primer for VH(26mer)gg act agt tga gga gacggt gac cgt(SEQ ID NO17)。以抗CD146抗體-Fab基因為模板，用PCR方法分別擴增抗體的輕重鏈可變區(qū)基因。PCR反應進行30個循環(huán)。每個循環(huán)的條件是94℃變性30s，55℃退火90s，72℃延伸90s，反應進行到最后一個循環(huán)后在72℃中保溫10min。反應結束后，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物。把擴增的抗體可變區(qū)基因克隆到pComb3H表達載體上，構建VH-linker-VL融合基因(圖9)。構建可溶性單鏈抗體高效表達載體。氨芐青霉素篩選分泌抗體的重組菌，IPTG誘導培養(yǎng)，離心收集含有可溶性抗體功能片段的上清。層析分離純化單鏈抗體(圖7)。ELISA鑒定可溶性抗CD146單鏈抗體的特異性和生物活性(圖8)。單鏈抗CD146抗體核苷酸序列分析以及推導出的氨基酸序列如SEQ ID NO5所示。
實施例五、抗CD146抗體抑制血管生成我們采用雞胚尿囊膜血管生成(CAM)模型檢測CD146抗體對血管生成的影響。方法如下[16]受精萊杭雞蛋37℃培養(yǎng)三天后剝除蛋殼，在半圓形容器中繼續(xù)無菌培養(yǎng)三天，將抗CD146抗體和對照抗體溶液吸附到2×2mm濾紙上，然后將濾紙平放于尿囊膜血管網(wǎng)上孵育24至48小時，解剖顯微鏡下觀察血管生成并照相。
結果發(fā)現(xiàn)在雞胚發(fā)育的第6天，將PBS，抗CD146抗體，同型鼠抗體加樣于尿囊膜血管，培養(yǎng)24小時后連續(xù)觀察。在每組20個加樣雞蛋中，CD146抗體抑制血管生成為16/20。同型鼠IgG對尿囊膜血管生長無任何反應。在CD146抗體加樣區(qū)可見約6×6mm的無血管區(qū)，其中沒有觀察到出血與炎癥反應。與對照組PBS或同型鼠抗體相比，抗CD146抗體對雞胚血管生成都具有明顯的抑制作用。(圖10)。
實施例六、抗CD146抗體抑制腫瘤的生長和轉移荷人瘤裸鼠動物試驗將人腫瘤模型分為肝癌，胰腺癌及平滑肌肉瘤3組。腫瘤細胞接種量分別為肝癌細胞77211×107個，胰腺癌細胞SW19902×106個，和平滑肌肉瘤細胞SK-LMS-1 0.5×106個，在腫瘤生長到直徑約1cm時開始腹腔給藥10mg/kg/只，每周2次。肝癌治療組為腫瘤細胞與抗體同時給藥。對照組分別以PBS或同型鼠IgG取代抗CD146抗體。每周測量瘤長徑，短徑，并計算瘤體積。當對照組出現(xiàn)小鼠死亡時終止觀察。按公式計算抑瘤率，抑瘤率(％)＝1-(實驗組瘤體積/對照組瘤體積)。
在腫瘤生長到直徑約1cm時，開始腹腔注射抗體10mg/kg/只，每周2次，觀察3-4周。我們發(fā)現(xiàn)抗CD146抗體單獨使用對三種腫瘤均有不同程度的治療作用，腫瘤抑制率分別為平滑肌肉瘤50％，肝癌71.9％，胰腺癌48.7％。當我們把抗CD146抗體與131I偶聯(lián)，用131I-抗CD146抗體偶聯(lián)物治療胰腺癌時，僅一次給藥后觀察10-18天腫瘤抑制率達到82％-86％。這一結果表明抗CD146抗體及其抗體-131I偶聯(lián)物均能有效抑制多種腫瘤生長，而且后者的抑瘤作用更強(圖11)。
在治療過程中，我們對小鼠的全身情況進行了觀察。發(fā)現(xiàn)CD146抗體治療組小鼠精神良好，食欲正常，體重無減，沒有腫瘤轉移和死亡。而對照組由于腫瘤體積大且出現(xiàn)潰瘍和壞死，造成小鼠精神不佳，食欲不振，出現(xiàn)明顯消瘦和惡病質現(xiàn)象(圖12)。在60-80％對照組小鼠的肺和淋巴結發(fā)現(xiàn)腫瘤轉移灶，20％的小鼠在治療第14-16天死亡。
對腫瘤組織進一步病理分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)CD146抗體治療的腫瘤組織中血管密度降低至對照組的1/3，部分血管可見栓塞，血管周圍腫瘤細胞可見空泡壞死(圖13)。由于抗CD146抗體選擇性結合血管內皮細胞而非用于接種的腫瘤細胞，因此我們認為CD146抗體的抑瘤作用可能是通過抑制腫瘤血管生成而實現(xiàn)的。
實施例七 抗CD146抗體對小鼠外胎盤錐黏附和擴展的影響為了研究CD146在妊娠期小鼠子宮和胚胎中的表達，我們用原位雜交的方法分析了整個妊娠期小鼠子宮中CD146的表達。實驗結果顯示CD146主要表達在植入位點、胚胎滋養(yǎng)層細胞、子宮蛻膜血管等與胚泡植入密切相關的部位。特別引起我們注意的是CD146分子在滋養(yǎng)層細胞上的高表達。為了進一步證實，我們采用免疫熒光的方法分析了CD146分子在小鼠外胎盤錐中滋養(yǎng)層細胞的分布。結果顯示，抗CD146抗體特異結合遷移性強的滋養(yǎng)層細胞，提示CD146可能參與滋養(yǎng)層細胞的遷移過程。
因此，我們分離了小鼠外胎盤錐，在體外水平研究抗CD146抗體對小鼠滋養(yǎng)層細胞黏附和擴展的影響，具體方法如下，小鼠交配后檢出陰栓的第一天作為妊娠第一天，從妊娠第8.5天的雌鼠子宮蛻膜中取出胚胎，在胚胎外胚層處將外胎盤錐分離，經(jīng)清洗后隨機移入培養(yǎng)碟中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液為Ham’s F-12培養(yǎng)基，并補充3％胎牛血清，1.6mg/ml碳酸氫鈉，0.3mg/ml谷氨酰胺，0.24mg/ml乳酸鈣和400U/ml慶大霉素。24孔培養(yǎng)板預先用0.1mg/ml層粘連蛋白按10μl/孔鋪蓋，在超凈臺內室溫風干3小時以上。外胎盤錐培養(yǎng)液中加入抗CD146抗體(20μg/ml)作為實驗組，對照組用相同濃度的正常小鼠IgG。培養(yǎng)48小時，每隔12小時在倒置顯微鏡下觀察一次，輕輕晃動培養(yǎng)板，不動者為黏附的外胎盤錐，在已黏附的外胎盤錐周圍遷移出滋養(yǎng)層細胞的被認為是擴展的外胎盤錐，實驗結果表明，抗CD146抗體能抑制外胎盤錐在層粘連蛋白的黏附和擴展率(圖14，15)，其中對外胎盤錐擴展的抑制更為顯著。在對照組中，滋養(yǎng)層細胞正常遷移和擴展，而實驗組中，滋養(yǎng)層細胞的遷移和擴展能力受到抑制，細胞成圓形不像對照組的伸展狀(圖16)實驗重復3次。另外，我們還檢測了抗CD146抗體對經(jīng)過bFGF和VEGF刺激的小鼠外胎盤錐的黏附和擴展的作用，發(fā)現(xiàn)抗CD146抗體對其也有抑制效果(圖17～20)，具體方法是在外胎盤錐培養(yǎng)液中不加胎牛血清，而加入10ng/ml的bFGF或VEGF，其他步驟同上。
實施例八 CD146抗體抑制小鼠外胎盤錐分泌金屬蛋白酶分離妊娠第8.5天的小鼠外胎盤錐，在培養(yǎng)24和48小時后收集培養(yǎng)液，用Bradford法測定培養(yǎng)液的蛋白濃度。然后進行丙烯酰胺凝膠電泳，以含1mg/ml明膠的10％丙烯酰胺凝膠作為分離膠，4％丙烯酰胺凝膠作為濃縮膠，每泳道10-20μl培養(yǎng)液，相當于6μg總蛋白質，與非還原的樣品緩沖液37度孵育半個小時，再上樣電泳，電泳在冰浴中進行，濃縮膠內的電壓為80伏，分離膠中的電壓為120伏。電泳后凝膠在2.5％TritonX-100中洗滌數(shù)次，在孵育液(150mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl2，和50mmol/L Tris-HCl，pH7.6)中37度孵育16-18小時，常規(guī)考馬斯亮藍G-250染色，脫色后在Bio-rad Chemdoc 2000凝膠成像儀進行定量分析。孵育液中加入EDTA(20mmol/L)螯合鈣離子，以鑒定是否為金屬蛋白酶起的作用。結果顯示抗CD146抗體對小鼠外胎盤錐中滋養(yǎng)層細胞分泌金屬蛋白酶9和金屬蛋白酶2有明顯的抑制(圖21)，定量分析差異顯著，p＜0.01。
實施例九 抗CD146抗體導致妊娠小鼠的流產在動物實驗中，我們觀察抗CD146抗體是否能夠終止妊娠。實驗分為3組，每組9只小鼠。一組注射抗CD146抗體，一組以PBS為對照，另一組以同型鼠IgG為對照。注射同型鼠IgG的目的是為了排除小鼠IgG本身對胚泡植入的影響。在妊娠第三天，對其左側子宮角(即子宮和卵巢的連接處)用微量注射器注入抗CD146抗體(2μg抗體溶在10μlpH7.4磷酸緩沖液)，對其右側子宮角注入相同體積的PBS或相同濃度的正常小鼠IgG。五天后處死小鼠，在解剖鏡下統(tǒng)計小鼠胚胎的成功植入率。結果顯示經(jīng)注入抗CD146抗體的右側子宮，小鼠胚泡的植入被阻斷，抑制率高達80％以上(圖22)剩余的胚胎有發(fā)育不良和畸形的現(xiàn)像，而對照側子宮胚泡植入未受影響(圖23)。這種現(xiàn)象說明CD146分子在胚胎植入和維持妊娠方面起著非常重要的作用，抗CD146抗體能夠影響胚胎植入和胚胎的發(fā)育。
參考文獻1.Folkman J.Tumor angiogenesistherapeutic implication.N Engl J Med，1971，285(21)1182～11862.Paria，B.C.et al.Deciphering the cross-talk of implantationAdvance and challenges.Science，2002，296(21)2185-21883.Cross，J.C.et al.Implantation and the placentaKey pieces of the development puzzle.Science，1994，266(2)1508-15184.Shih，I.M.，Wang，T.L.，Wu，T.C.et al.Expression of Mel-CAM in implantation siteintermediate trophoblastic cell line，IST-1，limits its migration on uterine smoothmuscle cells.J.Cell sci.111，2655-2664(1998).
5.Kohler and Milstein.Nature，1975，256495.
6.Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Screening monoclonal antibody productionusing enzyme-labeled second antibody.Meth.Enzymol，1983，92168-74.
7.Ivan Lefkovits.Immunology Methods Manual.19978.Shih，I.M.，Elder，D.E.，Speicher，D.et al.Isolation and functional characterization ofthe A32 melanoma-associated antigens.Cancer Res54，2514-2520(1994)9.Bardin，N.，F(xiàn)rances，V.，Lesaule，G.et al.Identification of the S-Endo endothelial-associated antigen.Biochem.Biophys.Res.Commun.218，210-216(1996).
10.Shih，I.E.，Nesbit，M.，Herlyn，M.et al.A new Mel-Cam(CD146)-specific monoclonalantibody，MN-4，on paraffin-embedded tissue.Mod.Pathol.11，1098-1106(1998).
11.Shih，I.M.，Speicher，D.，Hsu，M.Y.et al.Melanoma cell-cell interactions are mediatedthrough heterophilic Mel-CAM/ligand adhesion.Cancer Res.57，3835-3840(1997).
12.Anfosso，F(xiàn).，Bardin，N.，F(xiàn)rances，V.et al.Activation of human endothelial cells via S-Endo-1 antigen(CD146)stimulates the tyrosine phosphorylation of focal adhesionkinase p125 FAK.J.Biol.Chem.273，26852-26856(1998).
13.Anfosso，F(xiàn).，Bardin，N.，Vivier，E.et al.Outside-in signalling pathway linked to CD146engagement in human endothelial cells.J Biol Chem(2000).
14.朱迎春等，細胞與分子免疫學雜志16355-358，2000
15.Kang AS，et al.Linkage of recognition and replication functions by assemblycombinatorial antibody Fab libraries along phage surfaces.Proc Natl Acad Sci USA，88363-366，1991.
16.Auerbach R，Kubai L，Knighton D.A simple procedure for the long-term cultivation forchicken embryo.Dev Biol，41391-394，1974.
序列表<110>中國科學院生物物理研究所<120>一種單克隆抗體、其編碼基因、用途以及分泌它的雜交瘤細胞系<130>I030173<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>118<212>PRT<213>小鼠<400>1Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr20 25 30Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Asp Ile Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr65 70 75 80Met Leu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr100 105 110Thr Val Thr Val Ser Ser115
<210>2<211>112<212>PRT<213>小鼠<400>2Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser20 25 30Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg85 90 95Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala100 105 110<210>3<211>217<212>PRT<213>小鼠<400>3Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 5Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg85 90 95Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala100 105 110Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu115 120 125Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro130 135 140Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn145 150 155 160Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr165 170 175Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His180 185 190Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile195 200 205Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Trp210 215
<210>4<211>222<212>PRT<213>小鼠<400>4Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr20 25 30Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Asp Ile Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr65 70 75 80Met Leu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr100 105 110Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro115 120 125Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly130 135 140Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn145 150 155 160
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Arg Arg Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser115 120 125Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Cly Ala130 135 140Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr145 150 155 160Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile165 170 175Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Asp Ile Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe180 185 190Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr195 200 205Met Leu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Phe Cys210 215 220Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr225 230 235 240Thr Val Thr Val Ser Ser245<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>6ggtctagaga gctcgtgatg aca23<210>7<211>24
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1.一種分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系，其保藏編號為CGMCC0491。
2.一種由權利要求1所述的雜交瘤細胞系分泌的單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體。
3.按照權利要求2所述的單克隆抗體，其中，所述抗體的重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述抗體的輕鏈可變區(qū)具有SEQID NO2所示的氨基酸序列。
4.按照權利要求2所述的單克隆抗體的Fab片段，其中，該Fab片段的Fab輕鏈具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，該Fab片段的Fab重鏈具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
5.按照權利要求2所述的單克隆抗體的單鏈抗體，其中，該單鏈抗體具有SEQ ID NO5所示的氨基酸序列。
6.一種編碼權利要求2至5中任何一項所述的單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體的核苷酸序列。
7.權利要求1至5中任何一項所述的單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體在制備用于腫瘤診斷和導向治療的藥物中的應用。
8.權利要求1至5中任何一項所述的單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體在藥物篩選和腫瘤疫苗中的應用。
9.權利要求1至5中任何一項所述的單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體在制備阻止早期妊娠和避孕方面的藥物中的應用。
10.權利要求1至5中任何一項所述的單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人-鼠嵌合抗體在制備治療與新生血管有關的疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系，其保藏編號為CGMCC0491。本發(fā)明還提供了所述的雜交瘤細胞系分泌的單克隆抗體，或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，或者人－鼠嵌合抗體，編碼它們的基因和它們的用途。
文檔編號A61P15/00GK1530440SQ03120599
公開日2004年9月22日 申請日期2003年3月14日 優(yōu)先權日2003年3月14日
發(fā)明者閻錫蘊, 劉琴, 林蕓 申請人:中國科學院生物物理研究所