專利名稱：抑制hsv－1和hsv－2復(fù)制的抗－h(huán)sv劑和生產(chǎn)具有抗－h(huán)sv活性的物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗-HSV藥物，它來(lái)源于植物，且能抑制HSV-1和HSV-2復(fù)制，本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)植物來(lái)源的、具有抗-HSV活性的物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒包括I型單純皰疹病毒和II型單純皰疹病毒(HSV)感染困擾著大約五千萬(wàn)美國(guó)人，且每年還出現(xiàn)大約500,000的新病例。大約有三千萬(wàn)美國(guó)人感染有生殖器皰疹病毒(美國(guó)公共健康聯(lián)合會(huì))。HSV病毒顆粒是一種較大的(100至150mμg)，有二十面體衣殼的包膜病毒。其含有雙鏈DNA，其基因組編碼至少70種多肽。這種大量的調(diào)控信息使得病毒顆粒在被感染的細(xì)胞中能控制自己的基因表達(dá)并適應(yīng)多種復(fù)雜的情況。單純皰疹病毒通過(guò)直接接觸進(jìn)入宿主，且僅傳播至靶組織，病毒通過(guò)神經(jīng)元軸索流(neuronal axonal flow)在宿主中傳播，當(dāng)宿主從急性感染中恢復(fù)后，病毒靶向至背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia)，并在靶向組織中保持潛伏。HSV病毒之所以難以治療，是由于其具有一種機(jī)制，通過(guò)該機(jī)制，經(jīng)數(shù)代復(fù)制后，病毒將適應(yīng)不利的環(huán)境并存活。
一旦病毒被傳染給易感個(gè)體，HSV將在粘膜表面的上皮細(xì)胞中復(fù)制。HSV病毒的復(fù)制通常是無(wú)癥狀的，這可由如下事實(shí)證明許多個(gè)體對(duì)HSV抗體呈血清反應(yīng)陽(yáng)性，卻無(wú)感染癥狀史。對(duì)于一些個(gè)體來(lái)說(shuō)，這種感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的潰瘍損傷。
在上皮細(xì)胞中復(fù)制后，病毒感染支配感染部位的感覺(jué)神經(jīng)元的外周末梢，然后通過(guò)神經(jīng)元的軸突轉(zhuǎn)移至神經(jīng)核。病毒的DNA進(jìn)入神經(jīng)元的核部位，從而建立了潛伏感染。由于潛伏感染在宿主的整個(gè)一生中都存在于機(jī)體的那些神經(jīng)細(xì)胞中，因此HSV感染將有可能導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移多次發(fā)生。
在現(xiàn)有技術(shù)中，已知可以采用藥物和草藥來(lái)治療HSV-1和HSV-2病毒感染。更確切的，治療集中于作為單純性皰疹主要病因的HSV-1病毒，或作為生殖器皰疹主要病因的HSV-2病毒。流行病學(xué)研究表明，HSV-2病毒感染與其他導(dǎo)致生殖器潰瘍的性傳播疾病一起，增加了得HIV的風(fēng)險(xiǎn)。目前對(duì)這種風(fēng)險(xiǎn)增加的機(jī)理還未知，但這可能是由于在STDs產(chǎn)生的炎癥免疫反應(yīng)期間，由于存在于生殖上皮中的HIV-敏感細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)數(shù)量增加而引起的(Latif et al.1989)。
目前可以采用的治療手段幫助宿主免疫系統(tǒng)自身抵抗皰疹病毒。目前，絕大多數(shù)的治療手段集中于通過(guò)消極影響宿主細(xì)胞膜受體，或通過(guò)干擾融合所需的病毒蛋白的糖基化作用，和通過(guò)減少在宿主細(xì)胞核中的病毒復(fù)制來(lái)防止病毒顆粒囊膜與宿主細(xì)胞質(zhì)膜的融合?？梢垣@得許多抑制HSV復(fù)制的抗病毒藥物，其包括阿昔洛韋(acyclovir)，更昔洛韋(gancyclovir)和膦甲酸鈉(foscarnet)。治療生殖器皰疹的三種最常見(jiàn)的處方藥物是阿昔洛韋(acyclovir)，泛昔洛韋(Famciclovir)，和萬(wàn)乃洛韋(Valacyclovir)。
阿昔洛韋(ACV)，即9-[(2-羥乙氧基)甲基]鳥(niǎo)嘌呤，是一種已經(jīng)被用于治療多種皰疹病毒感染的主要抗病毒藥物。它可以通過(guò)局部的，口服的或靜脈內(nèi)的制劑方式給藥，其中局部制劑的效果較差。阿昔洛韋治療極少見(jiàn)副作用。萬(wàn)乃洛韋或阿昔洛韋的L-纈氨酸酯是一種阿昔洛韋的前體藥物?？拱捳畈《舅幬飮娢袈屙f(penciclovir)，即9-(4-羥基-3-羥甲基丁-1-基)-鳥(niǎo)嘌呤，具有與阿昔洛韋類似的抗人皰疹病毒的活性譜。泛昔洛韋，即噴昔洛韋的6-脫氧衍生物，在體內(nèi)通過(guò)氧化代謝途徑轉(zhuǎn)化為噴昔洛韋。
核苷類似物，例如鳥(niǎo)嘌呤核苷類似物阿昔洛韋，萬(wàn)乃洛韋，噴昔洛韋和泛昔洛韋具有比膦甲酸鈉更窄的抗病毒譜，且主要表現(xiàn)為抗HSV-1和HSV-2和VZV病毒的效果。這些化合物并不像膦甲酸鈉一樣直接作用于病毒DNA聚合酶，但必須被病毒酶和細(xì)胞酶磷酸化三次才能抑制病毒聚合酶。其主要通過(guò)口服組合物的方式給藥，雖然其他的給藥方式，例如非腸道的給藥也是可行的。在非腸道給藥治療皰疹病毒感染中存在的一些問(wèn)題是需高劑量和大體積給藥以及抗病毒化合物在循環(huán)中的半衰期短。此外，還要求長(zhǎng)期的每日用藥。核苷類似物阿昔洛韋，萬(wàn)乃洛韋，噴昔洛韋和泛昔洛韋在治療復(fù)發(fā)性皮膚病毒病的臨床有效性與膦甲酸鈉一樣，十分有限。在局部治療時(shí)，其治愈時(shí)間僅縮短了大約2到3天。
應(yīng)當(dāng)注意到，所有的上述藥物均靶向敏感細(xì)胞感染后的病毒DNA復(fù)制。這些藥物在感染發(fā)展至引起損害的程度后局部施用時(shí)，在減少生殖器上皮中的病毒復(fù)制方面顯示出無(wú)效。
在動(dòng)物模型中證明，減少感染初期上皮的復(fù)制，會(huì)減少存在于神經(jīng)節(jié)中的潛伏病毒的數(shù)量，降低疾病復(fù)發(fā)的頻率和嚴(yán)重程度。但是，其他研究證實(shí)，在動(dòng)物模型中，上皮復(fù)制不是建立潛伏感染的先決條件。此外，高百分比的攜帶潛伏病毒顆粒但并無(wú)感染癥狀病史的婦女表明，在人群中，高水平的復(fù)制不是建立潛伏感染所必須的。
除了上述藥物以外，許多草藥療法目前也正在使用，且其有效性一直被持續(xù)地研究。絕大多數(shù)草藥中的活性成分為生物堿，一種一旦過(guò)度攝入將呈強(qiáng)毒性的分子。有許多草藥對(duì)多數(shù)病毒很有效，例如，熏衣草，沒(méi)藥和洋蘇草。還有其他的例子表明，天然精油在抗接觸的HSV病毒方面具有強(qiáng)烈的效果。其活性成分可以是從萜烯，倍半萜，到酮，醛，酯，到乙醇和酚。一般的，精油為從植物的花、葉和根中提取的活性成分。最通常采用的為熏衣草，羅勒，金盞花，檸檬，茶樹(shù)，肉桂，香茅，丁香，桉樹(shù)，天竺葵，niqouli，牛至，薄荷，百里香，姜，綠葉刺蕊草，香柏木，蜜蜂花，玉樹(shù)，迷迭香和許多其他的植物。
這種草藥和天然產(chǎn)物應(yīng)用的再度興起的結(jié)果促進(jìn)了大量的調(diào)查草藥相關(guān)的藥學(xué)特性的生物學(xué)基礎(chǔ)研究。一種這種具有潛在藥學(xué)特性的植物產(chǎn)物為松果提取物。曾有報(bào)道，松果提取物對(duì)多種傳染性疾病和許多腫瘤有改善作用。
美國(guó)專利4,985,249教導(dǎo)了松果的堿性提取物。在該專利中，堿提取后在pH 5條件下沉淀產(chǎn)生一種已知被稱為PC6的成分；然后通過(guò)乙醇的進(jìn)一步沉淀產(chǎn)生另一種被稱為PC7的成分。兩種成分的活性組分，PC6和PC7，均顯示含有木質(zhì)素或與多糖共價(jià)結(jié)合的類聚苯丙烯(polyphenylpropenoids)。此外，專利申請(qǐng)4985249中證實(shí)該物質(zhì)在體外對(duì)人免疫缺陷病毒(HIV)復(fù)制具有抑制活性。
為了提供一種有效的治療方式從而降低首次感染和重復(fù)激活感染后HSV-1和HSV-2的復(fù)制水平，本發(fā)明人評(píng)估了松果氫氧化鉀提取物的抗-HSV活性。
在松果提取物中添加鉀提高了抗-HSV藥物的總的健康方面的有益效果。已知鉀在體內(nèi)是一種非常重要的電解質(zhì)，其功能為維持水的平衡和分布；維持酸堿平衡；維持肌肉和神經(jīng)細(xì)胞的功能；維持心臟功能以及腎和腎上腺功能。
因此，可以了解目前存在對(duì)新的改良的HSV藥物的持續(xù)需求，該藥物可用于解決現(xiàn)有技術(shù)中依然未解決的病毒復(fù)制和再活化方面的問(wèn)題?；诖丝紤]，本發(fā)明滿足了該項(xiàng)需求。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種采用來(lái)源于植物的抗-HSV藥物抑制HSV-1和HSV-2病毒復(fù)制的方法，即一種用于生產(chǎn)具有抗-HSV活性和含有鉀的松果提取物的氫氧化鉀提取方法。
經(jīng)廣泛研究和試驗(yàn)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用氫氧化鉀溶液可從松果中獲得高產(chǎn)量的提取物。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，稱為類聚苯丙烯-多糖復(fù)合體(PPC或PCE)的提取物具有抗病毒活性。因此，本發(fā)明的主要目的是提供一種具有潛在抗-HSV活性的植物來(lái)源的物質(zhì)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種采用植物來(lái)源的抗-HSV藥物抑制HSV-1和HSV-2病毒復(fù)制的方法。
本發(fā)明的又一目的是提供一種從松果中獲得抗-HSV物質(zhì)的方法。
本發(fā)明的更進(jìn)一步的目的是提供一種包含鉀的抗-HSV藥物。
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)松果提取物的方法。本發(fā)明的更進(jìn)一步的目的是提供一種由該方法生產(chǎn)的松果提取物。
本發(fā)明的抗-HSV劑其特征在于，所述的藥物含有來(lái)源于各種松果的氫氧化鉀提取物例如，日本五針?biāo)?Pinus parviflroa Sieb.EtZucc.)，特別是該提取物中的高分子量的抗-HSV物質(zhì)。上述高分子量的抗-HSV物質(zhì)可以通過(guò)用氫氧化鉀溶液提取松果得到。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供一種采用可以容易和有效地制造和市場(chǎng)化的抗-HSV劑抑制HSV-1和HSV-2病毒復(fù)制的新的改良方法。
本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供一種生產(chǎn)具有抗-HSV活性的氫氧化鉀松果提取物的方法，該方法從原料和勞動(dòng)方面考慮允許低成本生產(chǎn)，同時(shí)相應(yīng)地允許低價(jià)格銷售給消費(fèi)大眾，因此，促使該具有抗病毒活性的松果提取物的生產(chǎn)方法對(duì)于購(gòu)買大眾來(lái)說(shuō)，經(jīng)濟(jì)上可承受。
這些與本發(fā)明的其他目的，以及使本發(fā)明具有新穎性的各種特征一起，在所附的、并形成公開(kāi)一部分的權(quán)利要求書中特別指出。為了更好的理解本發(fā)明，理解其操作性的優(yōu)點(diǎn)和其應(yīng)用達(dá)到的特定目的，都必須參考本發(fā)明的附圖和相應(yīng)的描述，其中闡明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
附圖簡(jiǎn)介當(dāng)考慮到下述的詳細(xì)描述時(shí)，將有助于更好的理解本發(fā)明和除上述描述之外的其他目的。該描述參考附圖，其中

圖1顯示了在被不同量的病毒感染后24小時(shí)的眼睛的平均滴度。
圖2顯示了感染后24小時(shí)，并隨后給予不同濃度的PCE提取物后眼睛的平均滴度。
圖3顯示了感染后24小時(shí)，并隨后給予不同量的提取物后眼睛的幾何平均滴度。
發(fā)明詳述千百年來(lái)，植物是藥物化合物的主要來(lái)源。目前，來(lái)源于植物材料的化學(xué)成分和類似物占臨床應(yīng)用的藥物的主要部分。一種這樣的植物產(chǎn)物來(lái)源于各種松樹(shù)的松果。任何一種可商業(yè)化得到的松果原料均可用于制備抗-HSV物質(zhì)。具有確定活性程度的該物質(zhì)可以采用KOH堿水溶液從松果中提取。在提取物中含有的、并作為活性成分使用的所述物質(zhì)為高分子量的物質(zhì)。最有效的物質(zhì)被命名為PCC或PCE。
提取溶液應(yīng)當(dāng)被濃縮至理想的濃度，如果需要，應(yīng)采用適當(dāng)?shù)乃醽?lái)中和，并隨后冷凍干燥以形成適當(dāng)濃度的溶液或固體。該產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)一步的分級(jí)純化即可用作活性成分。將沒(méi)有進(jìn)一步處理的物質(zhì)冷藏。
就本發(fā)明來(lái)說(shuō)，有用的松果可以是松屬(Pinus)的任何種和變種，尤其是表1所列的那些種，并無(wú)意圖限定該表分類學(xué)分類的正確性。
優(yōu)選的松果為赤松(P.Densiflora)，紅松(P.Koraiensis)，日本五針?biāo)?P.parviflora)，和黑松(P.thunbergii)的松果。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，一般的松果和優(yōu)選種的松果特別都含有在疫苗和/或治療方法中有用的物質(zhì)和成分(活性成分)。
表1用于制備松果提取物的產(chǎn)松果松樹(shù)
本發(fā)明將通過(guò)下述實(shí)施例被進(jìn)一步闡明，但是，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
PPC或PCE的純化過(guò)程選擇任何可商業(yè)上獲得的預(yù)先破碎的松果原料。一旦選擇了一種預(yù)先破碎的松果原料，則需要進(jìn)行加熱提取脫脂的磨碎的松果原料。在含有氫氧化鉀的水性溶劑存在的條件下，進(jìn)行加熱提取。一旦提取松果原料，首先，將平均粒子大小大于0.2μm的顆粒物質(zhì)除去。然后，將所得的提取液的pH值調(diào)至6.0-8.0，得到提取物。
優(yōu)選破碎的松果原料是因?yàn)檫@樣有助于隨后的提取。同時(shí)，由于它是商業(yè)上可獲得的，從而容易得到。此外，在許多批次中，破碎的松果能保持足夠穩(wěn)定和均一的成分。
在用于提純過(guò)程之前，先洗滌破碎的松果原料。在該過(guò)程中，采用大約10升去離子水連續(xù)洗滌破碎的松果原料兩次。然后，在提取前，采用95％的乙醇漂洗已洗滌的原料1次，從而使其脫脂。攪拌乙醇和已洗滌的松果原料，然后將液體排干。并將洗凈的松果材料空氣干燥過(guò)夜。最后將脫脂的松果材料置于密封容器中，室溫下保存。
在提取步驟前，優(yōu)選地將脫脂松果磨成小顆粒。這樣的處理有助于活性物質(zhì)的釋放。優(yōu)選的顆粒大小在80-120目的范圍。
用于加熱提取松果的溶劑為含有氫氧化鉀(KOH)的水溶液。所述溶液包含至少0.25％w/w的氫氧化鉀，優(yōu)選含有0.5-2％的氫氧化鉀，更優(yōu)選含有1％w/w的氫氧化鉀。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在這些氫氧化鉀濃度下，可以獲得特別有效的提取。溶劑的pH值優(yōu)選至少為8，更優(yōu)選至少為10，最優(yōu)選其范圍為11-13。
松果原料的提取是通過(guò)向松果中加入溶劑，并加熱混合物來(lái)進(jìn)行的，優(yōu)選加熱溫度是80℃(176°F)或高于80℃的溫度。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶劑沸騰時(shí)，提取可以方便快捷，且在足夠的提取速率下進(jìn)行。特別優(yōu)選通過(guò)高壓滅菌方式提取松果原料，也就是在121℃條件下提取。采用這種方式可以達(dá)到對(duì)活性物質(zhì)的快速，溫和且徹底的提取。
在提取后，很方便將混合物冷卻，優(yōu)選冷卻至室溫。如果需要，在進(jìn)一步處理前可將混合物在冰箱中保存12小時(shí)。
然后，從混合物中將平均粒子大小大于0.20μm的顆粒物質(zhì)除去?？梢圆捎萌魏晤w粒分離方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，一種特別方便和有效的方式為一種兩步法，其中在第一步中通過(guò)過(guò)濾將粗顆粒物質(zhì)除去，然后通過(guò)離心，優(yōu)選在4℃±2℃條件下將剩下的不想要的顆粒物質(zhì)除去。
然后處理所獲得的去除顆粒的混合物，調(diào)節(jié)pH至6.0-8.0之間。優(yōu)選地通過(guò)采用1N HCL滴定而完成，直至混合物的pH為7.0。在用HCL中和的過(guò)程中，產(chǎn)生了副產(chǎn)物氯化鉀，并存在于混合物中。然后將混合物分裝至包裝單元。
在調(diào)節(jié)pH后，可以將混合物滅菌。優(yōu)選地采用在121℃下，在液體循環(huán)下高壓滅菌20分鐘。也可以采用其他的滅菌方法，例如輻射法，均化作用等。
在調(diào)節(jié)pH值和任選的滅菌步驟后，可以保存該混合物。通過(guò)低溫保存可以最大限度地保證長(zhǎng)期保存的穩(wěn)定性，優(yōu)選的溫度為4℃或低于4℃，更優(yōu)選的為冷凍狀態(tài)，最優(yōu)選的溫度為-20℃。然而，優(yōu)選的為不保存該混合物，而是立即使用。
松果提取物的生產(chǎn)方法的實(shí)施例將購(gòu)于國(guó)際森林公司(International Forest Company)的大約5kg的破碎松果原料，例如火炬松(loblolly)，splash松和長(zhǎng)葉松(longleaves)，采用大約10升的去離子水連續(xù)洗滌兩次，然后置于10升的95％的乙醇中洗滌一次。振蕩乙醇和漂洗過(guò)的松果原料，然后排干液體。并將洗凈的松果原料空氣干燥過(guò)夜。在摻和器中研磨洗凈的松果原料，從而獲得80-120目范圍的粒子大小。取600克洗凈、研磨好的松果原料置于燒瓶中。加入4.5升1％KOH。采用干酪包布包裹的棉球塞緊燒瓶開(kāi)口。將1％KOH中的松果原料高壓滅菌1小時(shí)，并緩慢排氣(液體循環(huán)，121℃)。使燒瓶冷卻。如果所述原料不立即進(jìn)行進(jìn)一步的處理，則可將燒瓶置于4℃冰箱中保存。
用放在與施加了真空的吸濾瓶相連的布氏漏斗上的尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾器將大顆粒從高壓滅菌懸液中過(guò)濾除去。通過(guò)將濾液離心，使用中速離心，以800rpm離心4分鐘，將細(xì)小顆粒除去。將得到的上清液倒出，進(jìn)一步處理。將顆粒物質(zhì)保存。
然后處理得到的去除顆粒后的混合物，調(diào)節(jié)pH至6.0-8.0之間。優(yōu)選地通過(guò)采用1NHCL滴定，直至混合物的pH為7.0而進(jìn)行。所獲得的物質(zhì)為PPC或PCE，可以將其分裝為包裝單元。
調(diào)節(jié)pH值且在室溫下置于包裝單位中后的混合物，可以被置于盛有去離子水的平盤中高壓滅菌20分鐘(液體循環(huán)，121℃)。也可以采用其他的滅菌方法，例如輻射法，均化作用等。
在調(diào)節(jié)pH值和任選的滅菌步驟后，可以保存該混合物。通過(guò)低溫保存混合物可以最大限度地保證長(zhǎng)期保存的穩(wěn)定性，優(yōu)選的溫度為4℃或低于4℃，更優(yōu)選的為冷凍狀態(tài)，最優(yōu)選的溫度為-20℃。然而，優(yōu)選的是根本不保存該混合物，而是立即使用。
分析過(guò)程通過(guò)讀取分光光度計(jì)在280nm處的吸光值(以蒸餾水為空白對(duì)照)以獲得木質(zhì)素的濃度，并通過(guò)200-700nm掃描獲得一光譜。將所得物質(zhì)保存于冰箱中。
HSV感染測(cè)試系統(tǒng)由來(lái)源于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCulture Collection)的Vero細(xì)胞組成。HSV-1(F)來(lái)源于Dr.Bernard Roizman，芝加哥大學(xué)(University of Chicago)。在Vero細(xì)胞中制備病毒，并在Vero細(xì)胞單層培養(yǎng)物上滴定病毒原種和組織提取物。
PPC或PCE(松果提取物)為一種在260-280nm處有吸收肩峰的棕色液體。它溶于水，溶于水和乙醇的混合物，以及溶于丙酮。其含有多糖和類聚苯丙烯的復(fù)合體。通過(guò)快速蛋白質(zhì)液相層析法(FPLC)測(cè)定其分子量。五種主要成分的分子量為大于100kDa，21.0kDa，13.5kDa，3.6kDa和2.1kDa。
PPC/PCE的抗-HSV活性提取物口服給藥將提取物溶于飲用水給藥。在感染前5天開(kāi)始處理，并持續(xù)試驗(yàn)全過(guò)程，每天換水和添加新鮮提取物。在最高250μg/ml濃度下持續(xù)給藥最多10天，未觀察到提取物有毒或小鼠飲用的水量減少。
通過(guò)采用HSV-1(F)感染5周齡的CBA/J小鼠的角膜來(lái)研究PPC/PCE對(duì)動(dòng)物中的HSV感染的影響。采用30g的針劃傷角膜8-10次，并向每只眼睛滴入10ul含有104-106pfu，HSV-1(F)/只眼睛的病毒接種物。
如圖1所示，在濃度最高達(dá)250μg/ml的情況下，在極其高的病毒接種劑量105和106下幾乎沒(méi)有效果。然而，在104病毒的較低接種劑量情況下，可以觀察到病毒滴度顯著下降。在測(cè)試的提取物的最高濃度下，可以觀察到最好的效果，同時(shí)在一采用104pfu/只眼睛感染的實(shí)驗(yàn)中，也觀察到最好效果。在該實(shí)施方案中，與未處理的對(duì)照相比，經(jīng)過(guò)處理的小鼠眼睛的幾何平均滴度降低了100倍。在幾個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，滴度降低了3-5倍。在從雄鼠感染和雌鼠感染得到的結(jié)果之間沒(méi)有觀察到差異。
劑量確定為了確定提取物的最優(yōu)化的劑量，用1×104pfu/只眼睛感染小鼠，同時(shí)給藥各種劑量的提取物。在給藥20，50，100，250μg條件下，沒(méi)有觀察到提取物的效果方面的差異。與對(duì)照組相比，所有的治療組的眼睛滴度大約下降了8倍(圖2，250μg/ml與對(duì)照相比，p＜0.05)。但是，在來(lái)源于眼睛的病毒的幾何平均滴度方面卻觀察到差別，與用最低劑量提取物(20μg/ml，圖3)處理的小鼠相比，采用最高劑量提取物(250μg/ml)處理的小鼠，其滴度有實(shí)質(zhì)性的降低。該差異主要是由在250μg/ml組的許多只眼睛中沒(méi)有回收到病毒引起的，這表明提取物已經(jīng)完全預(yù)防了這些眼睛的感染。
目前的數(shù)據(jù)表明，在上述條件下，從松果的氫氧化鉀提取物制備的PPC提取物能有效地減少小鼠角膜中的HSV-1(F)復(fù)制。如上所述，本發(fā)明的PPC具有有效的抗-HSV活性。因此，極有可能該藥物將會(huì)改善患有HSV的病人的狀況，同時(shí)，與其他化學(xué)治療劑(例如，阿昔洛韋，萬(wàn)乃洛韋，噴昔洛韋和泛昔洛韋)聯(lián)合治療，其效果可以得到增強(qiáng)。
因此，上述內(nèi)容被認(rèn)為僅僅是對(duì)本發(fā)明原理的說(shuō)明。其無(wú)意于窮舉或限定本發(fā)明至所公開(kāi)的精確形式。在上述教導(dǎo)的指引下，可以進(jìn)行顯而易見(jiàn)的改進(jìn)或變化。當(dāng)按照公平、合法、公正授權(quán)的權(quán)利要求的寬度來(lái)解釋時(shí)，所有這些改進(jìn)或變化均落入所附的本發(fā)明的權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抗-HSV劑，其含有采用氫氧化鉀溶液從松果中提取的提取物作為活性成分。
2.如權(quán)利要求1所述的抗-HSV劑，其中所述的氫氧化鉀為1％的氫氧化鉀溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的抗-HSV劑，其中所述的活性成分為PPC，它包含于利用氫氧化鉀從松果中提取的提取物中。
4.如權(quán)利要求1所述的抗-HSV劑，其中所述的提取物從松屬的任何變種或種的松果中提取。
5.如權(quán)利要求4所述的抗-HSV劑，其中所述的松果選自赤松、紅松、日本五針?biāo)珊秃谒伞?br> 6.如權(quán)利要求3所述的抗-HSV劑，其中所述的活性成分呈棕色，在260-280nm處有吸收肩峰，其溶于水和乙醇以及丙酮，且它由一種多糖和類聚苯丙烯的復(fù)合體組成，它含有五種主要成分，采用蛋白質(zhì)快速液相層析法(FPLC)測(cè)定分子量，其分子量為約大于100kDa、21.0kDa、13.5kDa、3.6kDa和2.1kDa，所述的PPC從松果的氫氧化鉀提取物在pH 7下的沉淀物獲得。
7.權(quán)利要求1的抗-HSV劑，其中所述的提取物是采用pH至少為8的氫氧化鉀提取得到的。
8.權(quán)利要求7的抗-HSV劑，其中所述的氫氧化鉀的pH為6到8。
9.一種生產(chǎn)PPC的方法，包括下述步驟在除去乙醇和熱水可提取的物質(zhì)，并空氣干燥24小時(shí)后，采用1％KOH提取松果；除去平均顆粒大小大于0.2μm的顆粒物質(zhì)；并調(diào)節(jié)所得上清液的pH至6-8。
10.一種含有有效量的根據(jù)權(quán)利要求5制備的PPC和鉀的抗-HSV的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗－HSV劑，它來(lái)源于植物，且能抑制HSV－1和HSV－2復(fù)制。此外，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)具有抗－HSV活性的松果的氫氧化鉀提取物和抗－HSV劑的方法。
文檔編號(hào)A61KGK1604786SQ02825066
公開(kāi)日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2002年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月24日
發(fā)明者田中昭子, 約翰·杰西普, 艾米·西爾斯 申請(qǐng)人:田中昭子, 約翰·杰西普, 艾米·西爾斯