專利名稱：環(huán)孢菌素類似物混合物及其作為免疫調(diào)節(jié)劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與環(huán)孢菌素A有關(guān)的環(huán)孢菌素類似物的異構(gòu)體混合物。該混合物與各異構(gòu)體、天然存在的環(huán)孢菌素和其它現(xiàn)有的環(huán)孢菌素和環(huán)孢菌素衍生物相比，具有增強(qiáng)的功效和降低的毒性。此外，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)環(huán)孢菌素A類似物異構(gòu)體的合成路線，這些合成路線因具體反應(yīng)條件的不同而立體選擇性程度不同。
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以上各專利、專利申請書和出版物的內(nèi)容整體納入本文作為參考。
背景技術(shù)：
環(huán)孢菌素衍生物由一類環(huán)狀多肽組成，該多肽含有11個(gè)氨基酸，作為真菌Tolypocladium inflatum Gams的次級代謝物而產(chǎn)生。已觀察到它們能可逆地抑制處于細(xì)胞周期G0或G1期的免疫活性淋巴細(xì)胞、特別是T-淋巴細(xì)胞。還觀察到環(huán)孢菌素衍生物能可逆地抑制淋巴因子的產(chǎn)生和釋放(Granelli-Piperno等，1986)。雖然已知有許多環(huán)孢菌素衍生物，但最廣泛使用的是環(huán)孢菌素A。環(huán)孢菌素A的抑制作用涉及到對T-細(xì)胞參與的活化的抑制。該抑制作用是通過環(huán)孢菌素與普遍存在的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)cyclophilin的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。該復(fù)合物進(jìn)而抑制鈣調(diào)磷酸酶的鈣-和調(diào)鈣蛋白-依賴性的絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶活性。鈣調(diào)磷酸酶的抑制阻止了轉(zhuǎn)錄因子(如NFATp/c和NF-B)的活化，這些轉(zhuǎn)錄因子是誘導(dǎo)T-細(xì)胞活化的細(xì)胞因子基因(IL-2、IFN-、IL-4、和GM-CSF)所必需的。環(huán)孢菌素還抑制T-輔助細(xì)胞體外產(chǎn)生淋巴因子，并且使胸腺中成熟CD8和CD4細(xì)胞的發(fā)育停止(Granelli-Piperno et al.，1986)。環(huán)孢菌素的其它體外性能包括抑制產(chǎn)生IL-2的T-淋巴細(xì)胞和細(xì)胞毒T-淋巴細(xì)胞、抑制活化T-淋巴細(xì)胞釋放IL-2、在對同種抗原和外源性淋巴因子的應(yīng)答時(shí)抑制靜止T-淋巴細(xì)胞、抑制IL-1產(chǎn)生、以及抑制產(chǎn)生IL-2的T-淋巴細(xì)胞的有絲分裂素活化(Graneeli-Piperno et al.，1986)。
環(huán)孢菌素是一種強(qiáng)力免疫抑制劑，已顯示能抑制體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)(如同種移植排異、遲發(fā)超敏性、實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊椎炎、福氏佐劑關(guān)節(jié)炎和移植物抗宿主疾病)。可用于預(yù)防器官移植后的器官排異；治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；治療牛皮癬；和治療其它自免疫疾病，包括I型糖尿病、Crohn氏病、紅斑狼瘡，等等。
自從最初發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素以來，已經(jīng)分離并鑒定了多種天然存在的環(huán)孢菌素，并且通過全合成或半合成方法或通過應(yīng)用改進(jìn)的培養(yǎng)技術(shù)制備了許多非天然的環(huán)孢菌素。環(huán)孢菌素組成的這一類物質(zhì)現(xiàn)在內(nèi)容豐富，包括，例如，天然存在的環(huán)孢菌素A-Z[參見Traber et al.，(1977)；Traber et al.，(1982)；Kobel et al.，(1982)；von Warburg et al.，(1986)]以及各種非天然的環(huán)孢菌素衍生物和人造的或合成的環(huán)孢菌素包括二氫-和異-環(huán)孢菌素；衍生的環(huán)孢菌素(如，其中-MeBmt-殘基的3’-O-原子被?；?-位的肌甘酸殘基的-碳原子上引入了進(jìn)一步的取代基)；分子中-MeBmt-殘基以異構(gòu)體形式存在的環(huán)孢菌素(如，其中跨-MeBmt-殘基6’和7’位的構(gòu)型是順式而不是反式)；和采用R.Wenger開發(fā)的全合成生產(chǎn)環(huán)孢菌素的方法，在該肽序列的特定位置加入變種氨基酸而產(chǎn)生的環(huán)孢菌素——見，例如，Traber et al.，(1977)，Traber et al.，(1982)，Kobel et al.，(1982)，美國專利4108985，4210581，4220641，4288431，4554351和4396542；歐洲專利出版物0034567和0056782；國際專利出版物WO86/02080；Wenger(1983)；Wenger(1985)；Wenger(1986)。在1-含有修飾氨基酸的環(huán)孢菌素A類似物已由Rich et al.報(bào)道(1986)。免疫抑制性、抗炎性、和抗寄生蟲性環(huán)孢菌素A類似物見美國專利4384996、4771122、5284826和5525590中所述，全都轉(zhuǎn)讓給了山道士(Sandoz)。其它的環(huán)孢菌素類似物公開在WO99/18120中，轉(zhuǎn)讓給了Isotechnika。術(shù)語Ciclosporin，ciclosporin，cyclosporine，和Cyclosporine可互相使用，都指環(huán)孢菌素。
環(huán)孢菌素A治療相關(guān)副作用有許多，在此列舉幾種，包括腎毒性、肝毒性、致白內(nèi)障作用、多毛癥、和牙齦增生(Sketris et al.，1995)。其中，腎毒性是最嚴(yán)重的服用環(huán)孢菌素導(dǎo)致的劑量相關(guān)性副作用之一。其藥物產(chǎn)品(如Neoral和Sandimmune)可能引起腎毒性和其它毒副作用，是由于該藥物的快速釋放和高血濃度吸收所致。已有人提出，此藥物的峰值濃度與其副作用相關(guān)聯(lián)(Bennett，1998)。環(huán)孢菌素A引起腎損傷的確切機(jī)理尚不知道；但是，已有人提出，腎臟中血管收縮物質(zhì)濃度增加可導(dǎo)致腎小球輸入小動脈血管收縮。這可能導(dǎo)致腎局部缺血，腎小球過濾速度降低，長時(shí)間后發(fā)生間質(zhì)纖維化。當(dāng)降低劑量或用另一種免疫抑制劑代替時(shí)，腎功能得到改善(Valatine和Schroeder，1995)。
因此，存在著對有效低毒性免疫抑制劑的需要。
含1-氨基酸修飾的環(huán)孢菌素類似物公開在WO99/18120中，已轉(zhuǎn)讓給本申請的受讓人，其整體內(nèi)容納入本文中。還有轉(zhuǎn)讓給本受讓人的是美國臨時(shí)專利申請60/346201，其中申請人公開了特別優(yōu)選的環(huán)孢菌素A類似物，稱為“ISATX247”。該類似物結(jié)構(gòu)上與環(huán)胞孢素A相同，只是在1-氨基酸殘基上作了修飾。申請人披露，ISATX247的順式和反式異構(gòu)體的某些混合物，與天然存在的和現(xiàn)有的環(huán)孢菌素比較，顯示出效力增強(qiáng)、和/或毒性降低的組合。還公開了某些烷基化、芳基化、和氘化ISATX247衍生物。
通常，在美國臨時(shí)專利申請60/346201中所公開的混合物含約10-90重量％的反式異構(gòu)體和約90-10重量％的順式異構(gòu)體；在另一個(gè)實(shí)施方案中，此混合物含約15-85重量％反式異構(gòu)體和約85-15重量％的順式異構(gòu)體；在另一個(gè)實(shí)施方案中，此混合物含約25-75重量％的反式異構(gòu)體和約75-25重量％的順式異構(gòu)體；在另一個(gè)實(shí)施方案中，此混合物含約35-65重量％的反式異構(gòu)體和約65-35重量％的順式異構(gòu)體；在另一個(gè)實(shí)施方案中，此混合物含約45-55重量％的反式異構(gòu)體和約55-45重量％的順式異構(gòu)體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該異構(gòu)體混合物是ISATX247混合物，它含有約45-50重量％的反式異構(gòu)體和約50-55重量％的順式異構(gòu)體。這些重量百分?jǐn)?shù)是根據(jù)組合物的總重量計(jì)算的。換句話說，混合物可含65重量％的(E)-異構(gòu)體和35重量％的(Z)-異構(gòu)體，反之亦然。在另一種命名法中，順式異構(gòu)體也可以稱為(Z)-異構(gòu)體，反式異構(gòu)體也可以稱為(E)-異構(gòu)體。
因此，在本領(lǐng)域存在對制備環(huán)孢菌素類似物(包括ISATX247的異構(gòu)體)的方法的需要。需要能產(chǎn)生富含各異構(gòu)體的組合物，以及產(chǎn)生具有此二異構(gòu)體理想比例的異構(gòu)體混合物合成方法。也需要制備ISATX247的衍生物的方法。
發(fā)明的公開內(nèi)容環(huán)孢菌素及其類似物是一類具有強(qiáng)力免疫抑制活性的環(huán)狀多肽的成員。盡管這些藥物為免疫抑制、抗炎和抗寄生蟲活性提供了許多優(yōu)點(diǎn)，但存在許多與環(huán)孢菌素A治療相關(guān)的不良作用，包括腎毒性和肝毒性。因此，需要新的免疫抑制劑，它們具有與天然存在的化合物環(huán)孢菌素A同樣的藥理活性，但沒有相關(guān)的毒副作用。
本發(fā)明的實(shí)施方案提供環(huán)孢菌素A類似物的順式和反式異構(gòu)體的某些混合物，它們是藥學(xué)上有用的。一種優(yōu)選的類似物稱為ISATX247。與天然存在的現(xiàn)在已知的環(huán)孢菌素相比，ISATX247異構(gòu)體的混合物顯示效力增強(qiáng)和毒性降低的組合。
本發(fā)明部分是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢菌素類似物的某些異構(gòu)體混合物可提供優(yōu)越的免疫抑制作用而沒有與環(huán)孢菌素A相關(guān)不良作用。具體說，我們意外地發(fā)現(xiàn)，異構(gòu)體混合物(即，順式和反式異構(gòu)體二者的混合物)即含有約10∶90到約90∶10(反式∶順式)范圍的1-氨基酸殘基修飾的環(huán)孢菌素類似物可提供優(yōu)越的效能和安全性。這些類似物的例子公開在WO99/18120中，并包括氘化和非氘化化合物。具體地，發(fā)現(xiàn)約45∶55至約50∶50(反式∶順式)范圍的混合物和約50％至約55％反式和約45％至約50％順式范圍的混合物是特別有效的。而且，已證明這些異構(gòu)體混合物與天然存在的和其它現(xiàn)在已知的環(huán)孢菌素和環(huán)孢菌素衍生物相比，顯示了優(yōu)越的效力和毒性降低的組合。
一種特別優(yōu)選的類似物(本文為“ISATX274”)在結(jié)構(gòu)上與環(huán)孢菌素A相似，只是在分子的周邊1-氨基酸有一個(gè)修飾功能基團(tuán)。此具體異構(gòu)體類似物混合物的結(jié)構(gòu)，與環(huán)孢菌素A的結(jié)構(gòu)比較如下 ISATX247環(huán)孢菌素該異構(gòu)體混合物可用于免疫抑制，和用于各種免疫失調(diào)、疾病和病癥，包括對它們的預(yù)防、控制、緩解和治療。
按照本發(fā)明的實(shí)施方案，ISATX247異構(gòu)體(及其衍生物)可通過立體選擇性路線合成，其選擇性程度不同。立體選擇性路線產(chǎn)生的組合物富含(E)-異構(gòu)體或(Z)-異構(gòu)體，可將這些組合物組合，使得產(chǎn)生的混合物具有兩種異構(gòu)體的理想比例?；蛘撸梢哉{(diào)整立體選擇性路線的反應(yīng)條件，以在制備的混合物中直接產(chǎn)生此理想比例?；旌衔镏幸环N異構(gòu)體或另一種異構(gòu)體的百分比可用核磁共振譜(NMR)或其它本領(lǐng)域已知的技術(shù)驗(yàn)證。
每條路線通常都要對敏感的醇功能基團(tuán)采用保護(hù)基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，保護(hù)醇為乙酸酯；在另一個(gè)實(shí)施方案中，保護(hù)基團(tuán)是苯甲酸酯或硅醚。雖然本領(lǐng)域中乙酸酯保護(hù)基團(tuán)常用，但重要的是要強(qiáng)調(diào)在本文所述的許多示范實(shí)施方案中，通過使用苯甲酸酯或硅醚作為保護(hù)基團(tuán)可以避免與乙酸酯有關(guān)的許多不良副反應(yīng)。
該受保護(hù)化合物然后可用作前體，進(jìn)行各種立體選擇性的合成路線，包括有些路線在Wittig反應(yīng)中采用含磷試劑作為反應(yīng)物，和無機(jī)元素作為有機(jī)金屬試劑成員的反應(yīng)。后一種類型可能通過六元環(huán)過渡態(tài)進(jìn)行，其中立體位障支配著構(gòu)型結(jié)局。許多有機(jī)金屬試劑是可以得到的，包括那些特征性無機(jī)元素如硼、硅、鈦、鋰和硫。各個(gè)異構(gòu)體可從單一或多個(gè)前體制備。
任何混合物中(E)對(Z)-異構(gòu)體的比例，無論是立體選擇性或非立體選擇性產(chǎn)生的，可取寬廣的數(shù)值范圍。例如，此混合物可含約10-90％的(E)-異構(gòu)體到約90-10％的(Z)-異構(gòu)體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此混合物可含約15-85重量％的(E)-異構(gòu)體和約85-15重量％的(Z)-異構(gòu)體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此混合物可含約25-75重量％的(E)-異構(gòu)體和約75-25重量％的(Z)-異構(gòu)體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此混合物可含約35-65重量％的(E)-異構(gòu)體和約65-35重量％的(Z)-異構(gòu)體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此混合物可含約45-55重量％的(E)-異構(gòu)體和約55-45重量％的(Z)-異構(gòu)體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此異構(gòu)體混合物是ISATX247混合物，含約45-50重量％的(E)-異構(gòu)體和約50-55重量％的(Z)-異構(gòu)體。這些百分?jǐn)?shù)是根據(jù)組合物的總重量計(jì)算的，并應(yīng)理解，(E)-異構(gòu)體和(Z)-異構(gòu)體的重量百分?jǐn)?shù)之和是100。換句話說，混合物可含有65重量％的(E)-異構(gòu)體和35重量％的(Z)-異構(gòu)體，反之亦然。
因此，一方面，本發(fā)明提供1-氨基酸殘基被修飾的環(huán)孢菌素A類似物的異構(gòu)體混合物的組合物，其中異構(gòu)體混合物的范圍是約10∶90至約90∶10(反式比順式)。優(yōu)選的組合物(本文稱為“ISATX247”)含有E-和Z-異構(gòu)體的異構(gòu)體混合物
E-異構(gòu)體 E-異構(gòu)體通常，此異構(gòu)體混合物包含約10-90％(E)-異構(gòu)體至約90-10％(Z)-異構(gòu)體；優(yōu)選此混合物含有約15-85重量％的(E)-異構(gòu)體和約85-15重量％的(Z)-異構(gòu)體；更優(yōu)選此混合物含有約25-75重量％的(E)-異構(gòu)體和約75-25重量％的(Z)-異構(gòu)體；還優(yōu)選此混合物含有約35-65重量％的(E)-異構(gòu)體和約65-35重量％的(Z)-異構(gòu)體；甚至還優(yōu)選此混合物可含有約45-55重量％的(E)-異構(gòu)體和約55-45重量％的(Z)-異構(gòu)體。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，此異構(gòu)體混合物可以是ISATX247混合物，它含有約45-50重量％的(E)-異構(gòu)體和約50-55重量％的(Z)-異構(gòu)體；約50％-55％的(E)-異構(gòu)體和約45％-50％的(Z)-異構(gòu)體；約55％-65％的(E)-異構(gòu)體和約35％-45％的(Z)-異構(gòu)體；約65％-75％的(E)-異構(gòu)體和約25％-35％的(Z)-異構(gòu)體；約75％-85％的(E)-異構(gòu)體和約15％-25％的(Z)-異構(gòu)體；約85％-90％的(E)-異構(gòu)體和10％-15％的(Z)-異構(gòu)體。還要優(yōu)選的異構(gòu)體混合物包含那些約75％-65％的(Z)-異構(gòu)體和約25％-35％的(E)-異構(gòu)體，和那些含有約65％-55％的(Z)-異構(gòu)體和約35％-25％的(E)-異構(gòu)體的混合物。(這些百分?jǐn)?shù)是以重量為基礎(chǔ)計(jì)算的)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及的藥物組合物，包含上述的異構(gòu)體環(huán)孢菌素類似物混合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。此異構(gòu)體類似物混合物優(yōu)選ISATX247混合物。
在還有一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生免疫抑制的方法，該方法包括給予需要的動物有效量的上述異構(gòu)體環(huán)孢菌素類似物混合物，或包含該異構(gòu)體環(huán)孢菌素混合物的組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該混合物是ISATX247混合物。該方法可用來治療或減輕移植物排斥，自身免疫疾病或病癥，或炎性疾病或病癥。
在再一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過制備用作免疫抑制劑的類似物異構(gòu)體混合物，降低免疫抑制性環(huán)孢菌素類似物毒性的方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該混合物是ISATX247混合物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過制備用作免疫抑制劑的類似物異構(gòu)體混合物，提高免疫抑制性環(huán)孢菌素類似物藥效的方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該混合物是ISATX247混合物。
還有一個(gè)方面，本發(fā)明提供合成此異構(gòu)體類似物混合物的方法。
附圖簡要說明

圖1A是環(huán)孢菌素A的結(jié)構(gòu)，表明構(gòu)成該分子的環(huán)狀肽的11個(gè)氨基酸殘基，以及1-氨基酸殘基側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)；圖1B是環(huán)孢菌素A的結(jié)構(gòu)的另一個(gè)說明，特別強(qiáng)調(diào)用于本發(fā)明的術(shù)語”CsA”的定義；圖2A是環(huán)孢菌素A類似物稱為ISATX247的E-異構(gòu)體(或反式異構(gòu)體)的結(jié)構(gòu)；圖2B是環(huán)孢菌素A類似物稱為ISATX247的Z-異構(gòu)體(或順式異構(gòu)體)的結(jié)構(gòu)；圖3是示范性合成路線的概括，可用來制備本發(fā)明環(huán)孢菌素類似物，其中的立體選擇性路線按反應(yīng)條件分組；圖4是一條合成路線，可從溴化物前體產(chǎn)生ISATX247的(E)-和(Z)-異構(gòu)體；圖5是另一條合成路線，可從醛前體產(chǎn)生ISATX247的(E)-和(Z)-異構(gòu)體；圖6是示范性的立體選擇性方案，可用來制備富含ISATX247的(E)-或(Z)-異構(gòu)體的組合物，其中任一種異構(gòu)體都可從相同的前體醇制備；圖7是另一反應(yīng)方案，用于立體選擇性合成富含ISATX247的(Z)-異構(gòu)體的組合物；圖8是另一反應(yīng)方案，用于立體選擇性合成富含ISATX247的(E)-異構(gòu)體的組合物；圖9A-C是一示范性合成路線，用于產(chǎn)生ISATX247的(E)-和(Z)-異構(gòu)體混合物，每種反應(yīng)的條件已經(jīng)過調(diào)整，以產(chǎn)生此2種異構(gòu)體的具體示范性比例；
圖10是示范性合成路線，用于產(chǎn)生ISATX247的(E)-和(Z)-異構(gòu)體混合物，其中首先制備富含2種異構(gòu)體之一的組合物，然后按照預(yù)定的比例混合，達(dá)到所需的比例；圖11是一試驗(yàn)結(jié)果，顯示與環(huán)孢菌素A相比，ISATX247(45-50％E-異構(gòu)體和50-55％Z-異構(gòu)體)對鈣調(diào)磷酸酶磷酸酯酶活性的抑制效力要強(qiáng)3倍(由IC50測定)。
圖12是一些氘化和非氘化類似物異構(gòu)體混合物的結(jié)構(gòu)和異構(gòu)體組成。
圖13是一試驗(yàn)結(jié)果，顯示與環(huán)孢菌素A相比，各種氘化和非氘化類似物異構(gòu)體混合物對鈣調(diào)磷酸酶磷酸酯酶活性的抑制至少一樣強(qiáng)(由IC50測定)。
本發(fā)明的實(shí)施模式合成環(huán)孢菌素及其類似物是一類具有強(qiáng)力免疫抑制活性的環(huán)狀多肽的成員。盡管這些藥物為免疫抑制、抗炎和抗寄生蟲活性提供了許多優(yōu)點(diǎn)，但存在許多與環(huán)孢菌素A治療相關(guān)的不良作用，包括腎毒性和肝毒性。因此，需要具有和天然存在的化合物環(huán)孢菌素A同樣的藥理活性，但沒有相關(guān)毒副作用的新免疫抑制劑。
本申請人早先公開了稱為“ISATX247”的環(huán)孢菌素A類似物。該類似物在結(jié)構(gòu)上與環(huán)孢菌素A相似，只是在1-氨基酸殘基上進(jìn)行了修飾。本申請人發(fā)現(xiàn)，ISATX247的順式和反式異構(gòu)體混合物與天然存在的和現(xiàn)今已知的環(huán)孢菌素相比，顯示出效力增強(qiáng)和毒性降低的組合。
按照本發(fā)明的實(shí)施方案，ISATX247異構(gòu)體(及其衍生物)可通過立體選擇性路線合成，這些路線在其立體選擇性成都上可有不同。此立體選擇性路線產(chǎn)生富含(E)-或(Z)-異構(gòu)體的組合物，這些組合物可混合，從而得到的混合物具有所需的2種異構(gòu)體的理想比例?；蛘?，此立體選擇性路線的反應(yīng)條件可以調(diào)整，以在制備的混合物中直接產(chǎn)生此理想比例。
本發(fā)明稱為ISATX247的一種免疫抑制性環(huán)孢菌素類似物的化學(xué)名稱是，環(huán){{E，Z}-(2S，3R，4R)-3-羥基-4-甲基-(2-甲基氨基)-6，8-壬二烯酰基}-L-2-氨基丁?；?N-甲基-甘氨酰基-N-甲基-L-亮氨?；?L-纈氨?；?N-甲基-L-亮氨酰基-L-丙氨?；?D-丙氨酰基-N-甲基-L-亮氨?；?N-甲基-L-亮氨?；?N-甲基-L-纈氨?；鶀。其經(jīng)驗(yàn)分子式是C63H111N11O12。分子量是約1214.85。術(shù)語“ISATX247”是為這個(gè)藥理活性化合物起的商品名。
ISATX247的結(jié)構(gòu)主要通過核磁共振(NMR)已得到驗(yàn)證。用一系列一維和二維NMR實(shí)驗(yàn)，并通過與已知的環(huán)孢菌素A的NMR排布比較，排布了1H和13C譜圖。ISATX247的(E)和(Z)-異構(gòu)體，絕對排布是用NuclerOverhauser Effect(核Overhauser效應(yīng))(NOE)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的。其它的支持性證據(jù)由質(zhì)譜分析提供，它確認(rèn)了分子量；并由紅外譜提供，發(fā)現(xiàn)它與環(huán)胞菌素A極為相似。由于此2化合物之間的相似性，后者是在預(yù)料之中的。
環(huán)孢菌素A的結(jié)構(gòu)見圖1A說明。該結(jié)構(gòu)包括組成分子的環(huán)狀肽環(huán)的11個(gè)氨基酸殘基的身份。這11個(gè)氨基酸殘基按順時(shí)針方向遞增編號，從環(huán)中央最高處的氨基酸開始(并用參考標(biāo)記“1-氨基酸“表示)。為清楚起見，第一位氨基酸放在虛線方框中。1-氨基酸殘基的側(cè)鏈按化學(xué)方法畫出，因?yàn)樗幵诒景l(fā)明所采取的合成反應(yīng)的首位。通常，與氨基酸羰基相鄰的碳標(biāo)為α-碳，從此肽環(huán)沿此鏈向下，用漸進(jìn)的希臘字母標(biāo)記相鄰的碳。對于環(huán)孢菌素A，如圖1A所示，該側(cè)鏈的β-碳與羥基連接，在該側(cè)鏈的ε和ζ碳之間有一個(gè)反式取向的雙鍵。
環(huán)孢菌素A結(jié)構(gòu)的另一個(gè)示意圖見圖1B，其中此分子的不同部分包含在虛線方框內(nèi)。此圖定義了本發(fā)明中所用的命名，其中術(shù)語”CsA”指方框中包括的環(huán)孢菌素A的部分。本命名提供了顯示將要發(fā)生的本文所述合成反應(yīng)區(qū)域的簡便方法(即1-氨基酸殘基的側(cè)鏈，它已在圖1B中畫在虛線方框的外面)，在每次敘述反應(yīng)時(shí)，無需再畫出此分子的其余部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會明白，此側(cè)鏈的α和β-碳之間的鏈具有正常的鍵長度，只是在該圖中為了有助于術(shù)語”CsA”的定義而將其放大。
如上所述，特別優(yōu)選的環(huán)孢菌素A類似物稱為“ISATX247”，其2種立體異構(gòu)體E(或反式)和Z(或順式)分別示于圖2A和2B。這些立體異構(gòu)體的順式和反式的性質(zhì)指此側(cè)鏈的ε和ζ碳之間雙鍵(即，更靠近肽環(huán)，與鏈末端的雙鍵相反)的構(gòu)型。
關(guān)于立體化學(xué)命名也應(yīng)該說一下。本發(fā)明中術(shù)語“順式”和(Z)可互換使用，術(shù)語“反式”和(E)也可互換使用。術(shù)語“赤式”和“蘇式”的使用將盡可能減少，因?yàn)殛P(guān)于它們的含義文獻(xiàn)中出現(xiàn)明顯混亂。參見R.W.Hoffmann和H.-J.Zei“Seteroselective synthesis of alcohols.8.Diastereoselective synthesis of beta-methylhomoallyl alcohol viacrotylboronates”，J.Org.Chem.，Vol.46，pp.1309-1314(1981)；A.Streitwieser andC.H.Heathcock，Introduction to organic chemistry，2nded.(Macmillan，NewYork，1981)，pp.845-846；and M.B.Smith and J.March，March’s Advancedorganic chemistry(Wiley，New York，2001)，pp.144-147。在本發(fā)明少數(shù)幾個(gè)使用蘇式/赤式術(shù)語的例子中，使用Streiwieser和Heathcock的慣例，其中“赤式”異構(gòu)體指(R，S)和(S，R)構(gòu)型，“蘇式”異構(gòu)體指(R，R)和(S，S)構(gòu)型。
關(guān)于命名的最后評論是關(guān)注圖2A和2B中所示的末端碳-碳雙鍵。在另一種編號的圖式中，1-氨基酸殘基側(cè)鏈中的碳可從此末端(θ)碳開始編號，然后朝著肽環(huán)返回。在此系統(tǒng)中，按照有機(jī)化學(xué)常規(guī)的命名法，ISATX247異構(gòu)體可被看作1，3-二烯，其中各雙鍵以其最低編號的碳表示。
現(xiàn)在討論圖3-8說明的合成路線。按照本發(fā)明實(shí)施方案，可以直接制備異構(gòu)體混合物，其中具體合成路線的反應(yīng)條件可以調(diào)節(jié)，以在混合物中達(dá)到理想的異構(gòu)體比例?；蛘?，可以制備富含環(huán)孢菌素A類似物2種幾何異構(gòu)體之一的組合物，按預(yù)定的比例混合這些組合物，獲得所需的混合物。
本發(fā)明實(shí)施方案合成路線的概況見圖3，其中特別強(qiáng)調(diào)按化學(xué)和立體選擇性將反應(yīng)路線分組。參見圖3，應(yīng)用Wittig反應(yīng)的合成路線通常示于此圖的右側(cè)，用標(biāo)號31表示，而采用有機(jī)金屬試劑(認(rèn)為是形成六元環(huán)過渡態(tài))的路線32和33示于此圖中間和左側(cè)。這些路線的任何一個(gè)都能產(chǎn)生此異構(gòu)體混合物，或能產(chǎn)生富含2種異構(gòu)體之一的組合物。
本發(fā)明實(shí)施方案提供了獲得所需異構(gòu)體混合物的多種路線。本文公開的合成策略的可行性和多用途性可部分從圖3的對稱性和不對稱性得到反映。每條路線共同的反應(yīng)是環(huán)孢菌素A34中功能基團(tuán)的保護(hù)；在該示范性實(shí)施方案中此反應(yīng)是環(huán)孢菌素A34轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴；h(huán)孢菌素A35。圖3的不對稱性是使用乙酰基環(huán)孢菌素A醛化合物51作為前體用于所有的鈦和鋰有機(jī)金屬試劑路線，但只用于一些含磷Wittig反應(yīng)路線。
一般，對圖3的合成路線(可調(diào)整其反應(yīng)條件，以產(chǎn)生具有理想比例的異構(gòu)體混合物)采用含磷試劑作為Wittig反應(yīng)中的反應(yīng)物。其它立體選擇性路線也采用無機(jī)元素，通常是作為有機(jī)金屬試劑的成員，通過六元環(huán)過渡態(tài)進(jìn)行，其中立體位障決定了構(gòu)型結(jié)局。許多有機(jī)金屬試劑可用于本發(fā)明，包括那些特征性無機(jī)元素如硼、硅、鈦、鋰、和硫。
富含一對異構(gòu)體中的一種或另一種的組合物可從一種前體制備；或者，可從不同的前體制備2種組合物。圖3的立體選擇性路線之一(路線32)，取決于所選的反應(yīng)條件，一種前體可產(chǎn)生ISATX247的2種異構(gòu)體。在另一個(gè)立體選擇性路線中(路線33)，需要2種不同的前體來產(chǎn)生每一種富含的組合物。
現(xiàn)在詳細(xì)討論圖3的反應(yīng)。各路線共同的反應(yīng)是1-氨基酸殘基側(cè)鏈β-位醇的保護(hù)。這種保護(hù)方案說明了有機(jī)合成中共同遇到的問題，其中第一功能基團(tuán)被打算用于此分子別處的第二(類似和/或相同的)功能基團(tuán)的反應(yīng)錯(cuò)誤地修飾。為了實(shí)施此方案，第一功能基團(tuán)與一保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)，然后在第二功能基團(tuán)上進(jìn)行所需的反應(yīng)，再去除第一功能基團(tuán)的保護(hù)基。
有機(jī)合成中的保護(hù)基是人們熟知的，在J.R.Hanson的出版物ProtecitingGroups in Organic Synthess(Sheffield Academic Press，Sheffield，England，1999)，第二章“The protection of alcohols”中，pp.24-25有所討論。Hanson教我們?nèi)绾瓮ㄟ^轉(zhuǎn)變羥基成為酯或醚來保護(hù)羥基。乙酸酯也許是保護(hù)羥基最常用的類型。有許多條件可用來引入乙酸酯基團(tuán)。這些試劑和溶劑包括乙酐和吡啶；乙酐、吡啶和二甲基氨基吡啶(DMAP)；乙酐和乙酸鈉；乙酐和對甲苯磺酸；乙酰氯、吡啶和DMAP；和乙烯酮。DMAP是有用的?；磻?yīng)催化劑，因?yàn)樗蓮乃狒纬筛叻磻?yīng)性N-?；拎ゆf鹽。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)孢菌素A34的β-醇通過使34與乙酰氯、乙酸乙酯或其組合反應(yīng)形成化合物乙?；h(huán)孢菌素A35而得到保護(hù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此β-醇經(jīng)歷對乙酐的親核加成，形成乙酰基環(huán)孢菌素A35和乙酸。這些反應(yīng)可在DMAP存在下進(jìn)行，過量的乙酐起溶劑作用。在這些情況下，前綴“乙?；笨稍谡麄€(gè)合成路線的命名中使用，直到此乙酰基被去除。例如，在一路線中β-碳具有乙?；淖詈笠粋€(gè)中間體稱為“乙酰-(E)-1，3-二烯”。
雖然乙?；h(huán)孢菌素A的制備已在文獻(xiàn)已有充分報(bào)道，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，可以采用乙酸酯以外的保護(hù)基來保護(hù)環(huán)孢菌素A34 1-氨基酸殘基的β-醇。這些保護(hù)基可包括苯甲酸酯、取代的苯甲酸酯、醚、和硅烷基醚。在某些反應(yīng)條件下，此乙酸酯保護(hù)基有引起不良副反應(yīng)(如消除和水解)的傾向。因?yàn)楸郊姿狨?、醚和硅烷基醚在這些相同條件下更能抵抗這種副反應(yīng)，所以使用這些保護(hù)基代替乙酸酯常常是更有利的。已經(jīng)受乙?；蛉魏纹渌Ｗo(hù)基保護(hù)的環(huán)孢菌素或環(huán)孢菌素衍生物稱為“受保護(hù)的環(huán)孢菌素A”。同樣，此示范性路線中的最終中間體稱為“受保護(hù)的-(E)-1，3-二烯”而不是“乙酰-(E)-1，3-二烯”。所選保護(hù)基的性質(zhì)可能對此反應(yīng)程序中的后續(xù)步驟所需的進(jìn)程有影響。
參見圖3，乙?；h(huán)孢菌素A35在該示范性路線中保護(hù)了β-醇，該化合物在幾條合成路線中的作用是合成ISATX247異構(gòu)體的前體。以下先討論Witting反應(yīng)路線。
通過Wittig反應(yīng)合成ISATX247的(E)和(Z)-異構(gòu)體混合物本文舉例的Wittig反應(yīng)路線見圖3中參照標(biāo)號31。所示方法1通過溴中間體乙酰-η-溴代環(huán)孢菌素41進(jìn)行，而方法2使用乙?；h(huán)孢菌素A醛51作為起始點(diǎn)。以下敘述的示范性方法采用Wittig反應(yīng)以立體化學(xué)構(gòu)型的混合物引入烯功能團(tuán)。
本文的一示范性實(shí)施方案中采用Wiitig反應(yīng)來合成ISATX247的(E)和(Z)-異構(gòu)體混合物，可任選地在鹵化鋰存在下進(jìn)行。Wittig反應(yīng)中鹵化鋰的存在已知對產(chǎn)生的幾何異構(gòu)體的比例有影響，因此加入此類化合物可能有助于產(chǎn)生ISATX247的(E)和(Z)-異構(gòu)體的所需混合物。
方法1在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，ISATX24的(E)和(Z)-異構(gòu)體混合物如圖4所示那樣制備。圖4中用波狀線(見化合物43和44)表示該示范性反應(yīng)產(chǎn)生的(E)和(Z)-異構(gòu)體混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生的(E)和(Z)-異構(gòu)體的百分比例的范圍約為10-90％的(E)-異構(gòu)體和90-10％的(Z)-異構(gòu)體，但這些范圍只是示范性的，許多其他范圍也是可能的。例如，此混合物可含有約15-85％的(E)-異構(gòu)體和約85-15％的(Z)-異構(gòu)體。在其他實(shí)施方案中，此混合物可含有約25-75％的(E)-異構(gòu)體和75-25％的(Z)-異構(gòu)體；約35-65％(E)-異構(gòu)體和約65-35％(Z)-異構(gòu)體；約45-55％(E)-異構(gòu)體和約55-45％(Z)-異構(gòu)體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此異構(gòu)體混合物是ISATX247混合物，含有約45-50重量％的(E)-異構(gòu)體和50-55重量％的(Z)-異構(gòu)體。這些重量百分?jǐn)?shù)是根據(jù)組合物的總重量計(jì)算，應(yīng)該理解，(E)異構(gòu)體和(Z)異構(gòu)體的重量百分?jǐn)?shù)之和是100重量％。換句話說，混合物可含有65重量％的(E)-異構(gòu)體和35重量％的(Z)-異構(gòu)體，反之亦然。
參見圖4，乙?；h(huán)孢菌素A 1-氨基酸殘基側(cè)鏈的末端η-碳，在反應(yīng)的下一步通過將乙?；h(huán)孢菌素A35與N-溴琥珀酰亞胺和偶氮二異丁腈在溶劑(如四氯化碳)中回流而被溴化，形成中間體乙酰-η-溴代環(huán)孢菌素A41。N-溴琥珀酰亞胺是常用于用溴取代烯丙基氫的試劑，據(jù)信這是通過自由基機(jī)理。中間體41的制備見M.K.Eberle and F.Nuninger在“Synthesis of the main metabolite(OL-17)of cyclosporin A”，J.Org.Chem.，Vol.57，pp.2689-2691(1992)中敘述。
乙?；h(huán)孢菌素A 42的新中間體三苯基膦鎓溴化物可從乙酰-η-溴代環(huán)孢菌素A41通過后者與三苯膦在溶劑(如甲苯)中加熱而制備。
新中間體42，以及類似的其他中間體，在許多1-氨基酸殘基含共軛二烯體系的環(huán)孢菌素A類似物的合成中被認(rèn)為是關(guān)鍵性中間體。例如，除了三苯膦外，三芳基膦、三烷基膦、芳基烷基膦和三芳基砷等化合物可以與乙酰-η-溴代環(huán)孢菌素A41反應(yīng)，從而制備其他與42類似的活化的化合物。
參見圖4，乙酰-1，3-二烯43的(E)和(Z)-異構(gòu)體混合物，可通過室溫在甲苯中攪拌乙?；h(huán)孢菌素A42的三苯基磷鎓溴化物與過量的甲醛而制備。加入甲醛后，滴加堿如氫氧化鈉，二烯的異構(gòu)體混合物用乙酸乙酯提取。
許多有機(jī)化學(xué)教科書都敘述了Wittig反應(yīng)。特別是在J.McMurry的Organic chemistry，5thed.(Brooks/Cole，Pacific Grove，2000)，pp.780-783。Wittig反應(yīng)可用來將酮或醛轉(zhuǎn)變?yōu)橄N。在該過程中，磷內(nèi)鎓鹽，也稱為正磷，可與醛或酮反應(yīng)，生成稱為內(nèi)銨鹽的偶極中間體。通常不必分離該內(nèi)銨鹽，它可自發(fā)地通過四元環(huán)分解，產(chǎn)生烯烴和三苯膦氧化物。最終結(jié)果是羰基氧原子被原來結(jié)合于磷的R2C＝基團(tuán)取代。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，許多試劑可用來代替上述Wittig反應(yīng)的示范性試劑。例如，各種烷基、芳基、醛和酮化合物可代替甲醛，來制備各種各樣的環(huán)孢菌素衍生物。本申請人已用醛類、如乙醛、氘化甲醛、氘化乙醛、2-氯苯甲醛、苯甲醛和丁醛代替甲醛進(jìn)行了上述合成。這樣的Wittig反應(yīng)可以用三苯基膦鎓衍生物以外的化合物進(jìn)行，例如三芳基膦、三烷基膦、芳基烷基膦、和三芳基砷。各種其他堿可用來代替氫氧化鈉，如碳酸鈉、丁基鋰、己基鋰、酰胺鈉、鋰的位阻堿(如二異丙基酰胺鋰)、和堿金屬醇化物。除了改變這些試劑外，反應(yīng)可在各種有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑和水的混合物中，在各種鹽的存在下，特別是鋰的鹵化物存在下，在不同的溫度進(jìn)行。上述所有因素都可由本領(lǐng)域技術(shù)人員合理地選擇，以便對所形成的雙鍵立體化學(xué)具有所需的影響；即，對順式與反式的比例具有所需的影響。
在該合成的最后一步，用以下程序脫去β-碳的保護(hù)基。將乙酰-(E)-1，3-二烯和乙酰-(Z)-1，3-二烯的混合物溶解在甲醇中，加入水。加入堿(如碳酸鉀)，室溫?cái)嚢璐朔磻?yīng)混合物?？捎贸妓徕浺酝獾膲A，包括氫氧化鈉、碳酸鈉、醇鈉和醇鉀。通常用乙酸乙酯提取最終產(chǎn)物ISATX247的(E)和(Z)-異構(gòu)體的混合物。
方法2在通過Wittig反應(yīng)策略合成ISATX247的(E)和(Z)-異構(gòu)體混合物的另一條反應(yīng)路線中，可采用如下四步合成路線(1)如方法1那樣保護(hù)β-醇；(2)氧化第一步產(chǎn)生的乙?；h(huán)孢菌素A，產(chǎn)生醛；(3)Wittig反應(yīng)；(4)脫去Wittig反應(yīng)產(chǎn)物的乙?；蛘叩葍r(jià)地，水解乙酸酯重新回到醇。該反應(yīng)程序見圖5中說明。
這個(gè)合成路線以圖4 Wittig反應(yīng)路線類似方式開始進(jìn)行，第一步用乙酸酯基保護(hù)β-醇。但是，這2條路線從此開始不同，方法2的第二步將乙?；h(huán)孢菌素A35轉(zhuǎn)變?yōu)槿匆阴；h(huán)孢菌素A醛51。該反應(yīng)使用強(qiáng)度足以斷裂C＝C鍵的氧化劑產(chǎn)生2個(gè)片段。烯烴的斷裂在本領(lǐng)域是已知的。臭氧大概是最常用的雙鍵斷裂試劑，但是其他氧化劑如高錳酸鉀(KMnO4)或四氧化鋨也可引起雙鍵斷裂。
釕基氧化劑的應(yīng)用見H.J.Carlsen et al.，在“A greatly improvedprocedure for ruthenium tetroxide catalyzed oxidations of organic compounds”，J.Org.Chem.，Vol.46，No.19，pp.3736-3738(1981)中所述。Carlsen et al.說，歷史上，昂貴的釕金屬為催化程序的開發(fā)提供了推動力，其中應(yīng)用最廣的是過碘酸鹽和次氯酸鹽用作化學(xué)計(jì)量的氧化劑。研究者發(fā)現(xiàn)在常規(guī)采用釕的反應(yīng)過程中催化活性喪失，推測是由于存在羧酸。并發(fā)現(xiàn)，將腈類(特別是乙腈)加入反應(yīng)混合物中顯著提高了CCl4/H2O/IO4-體系中烯烴的氧化斷裂的速度和程度。
按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，乙?；h(huán)孢菌素A醛51可通過將它溶解于乙腈和水的混合物中，然后先加入過碘酸鈉，后加入氯化釕水合物，從乙酰基環(huán)孢菌素A35產(chǎn)生。醛51可用乙酸乙酯提取。應(yīng)注意的是，通過該氧化斷裂策略合成醛51對于下述許多立體選擇性路線是重要的，因此讀者在以后還會回來參考這一節(jié)。
方法2的第三步包括通過Wittig反應(yīng)將醛51轉(zhuǎn)變成為(E)和(Z)-二烯混合物，所用方法與方法1類似。如在方法1中一樣，磷內(nèi)鎓鹽加入醛中，生成甜菜堿(不分離)，最終結(jié)果是此醛的碳氧原子被原來結(jié)合于磷的R2C＝基團(tuán)取代。另外，這種Wittig反應(yīng)可以用三苯基膦鎓衍生物以外的含磷化合物進(jìn)行，例如三芳基膦、三烷基膦、芳基烷基膦、和三芳基砷在不同的溫度，采用各種堿性溶液和溶劑，或加入可用于影響新形成雙鍵的立體化學(xué)的各種無機(jī)鹽。
在一個(gè)實(shí)施方案中將乙?；h(huán)孢菌素A醛51溶于甲苯中，加入溶解在水中的堿(如氫氧化鈉)。然后加入三苯基膦鎓溴化物52，將反應(yīng)物攪拌一些時(shí)間。乙酰(E)和(Z)-1，3-二烯52的產(chǎn)物混合物的后處理包括用己烷和/或乙酸乙酯提取，在此術(shù)語“后處理”意指從反應(yīng)物、產(chǎn)物和溶劑等的混合物中提取和/或分離反應(yīng)產(chǎn)物的過程。
方法2的最后一步，與方法1的最后一步類似，將受保護(hù)β-碳位上的醇的乙酸酯基團(tuán)用碳酸鉀脫除，產(chǎn)生ISATX247的(E)和(Z)-異構(gòu)體混合物。除了碳酸鉀以外的堿也可用來脫除此保護(hù)基團(tuán)，包括氫氧化鈉、碳酸鈉、醇鈉、和醇鉀。
通過有機(jī)金屬路線合成富含ISATX247的(E)和(Z)-異構(gòu)體之一的組合物按照本發(fā)明的實(shí)施方案，立體選擇性合成路線可以利用含有元素如硅、硼、鈦、硫、磷和/或鋰的無機(jī)試劑。這些路線可通過六元環(huán)過渡態(tài)進(jìn)行，其中六元環(huán)的一個(gè)成員是有機(jī)金屬試劑的無機(jī)元素。在一些實(shí)施方案中，與過渡態(tài)相關(guān)的立體位障作用可能影響此反應(yīng)的立體化學(xué)結(jié)果。
在本發(fā)明中將要討論2個(gè)示范性的立體選擇性方案中，第一個(gè)立體選擇性方案(方法3，示于圖3的路線32)，使含硅化合物發(fā)生消除反應(yīng)，產(chǎn)生(E)或(Z)異構(gòu)體，這取決于是在酸性還是在堿性條件下進(jìn)行。這是Peterson烯化的例子。第二個(gè)立體選擇性方案中，(方法4，也示于圖3的路線33)，從不同前體產(chǎn)生各個(gè)異構(gòu)體。(Z)異構(gòu)體從含鈦和磷的中間體產(chǎn)生，而(E)-異構(gòu)體通過含鋰中間體產(chǎn)生。
方法3該合成路線通過乙酰基環(huán)孢菌素A醛51進(jìn)行。
D.J.S.Tsai and D.S.Matteson在“A stereocontrolled synthesis of(Z)and(E)terminal dienes from pinacol(E)-1-trimethylsilyl-1-propene-3-boronate”，Tetrahedron Letters，Vol.22.No.29，pp.2751-2752(1981)一般討論了類似的反應(yīng)方案。此方法見圖6中說明。一般，該合成包括制備三甲基甲硅烷基烯丙基硼酸酯試劑62，然后用62處理乙酰基環(huán)孢菌素A醛51，形成β-三甲基甲硅烷基醇64。該醇據(jù)信是由含硼過渡態(tài)63形成的。由于在烯丙基硼化反應(yīng)中該硼酸酯是慢反應(yīng)的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道使用快反應(yīng)的硼烷試劑如E-γ-三甲基甲硅烷基二乙基硼烷或9-(E-γ-三甲基甲硅烷基烯丙基)-9-BBN是有利的。β-三甲基甲硅烷基醇64然后可發(fā)生Peterson烯化反應(yīng)以制備烯烴，在此情況下是二烯65或二烯67。
烯烴的形成有2條不同的路線，取決于消除反應(yīng)(烯化)是在酸性條件下還是在堿性條件下進(jìn)行。在酸性條件下，發(fā)生反式消除產(chǎn)生(E)-異構(gòu)體，而在堿性條件下發(fā)生順式消除形成(Z)-異構(gòu)體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道，使用這個(gè)合成路線，可從相同的前體合成二異構(gòu)體任何一種。各消除反應(yīng)的產(chǎn)物都包含富含2種異構(gòu)體之一的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，富含是指組合物含有大于或等于75重量％的一種異構(gòu)體。在其他實(shí)施方案中，富含組合物可含有80、85、90重量％的一種異構(gòu)體。然后可以按預(yù)定的比例合并富含一種異構(gòu)體的組合物，以得到如圖10所示的理想混合物。
現(xiàn)在詳細(xì)討論圖6的反應(yīng)，從含硼試劑62的制備開始。在碳-碳鍵形成反應(yīng)中采用硅試劑的一般研究見E.Ehlinger and P.Magnus在“Silicon insynthesis.10.The(trimethylsilyl)allyl anionA β-acyl anion equivalentfro the conversion of aldehydes and ketones into γ-lactones”，J.Am.Chem.Soc.，vol.102，No.15，PP.5004-5011(1980)所述。具體地，這些研究者說明了(三甲基甲硅烷基)烯丙基陰離子和醛之間的反應(yīng)。該陰離子可通過用仲丁基鋰在四氫呋喃(含1當(dāng)量四甲基亞乙基二胺(TMEDA))中-76℃脫去稀丙基三甲基甲硅烷的質(zhì)子而制備。
烯丙基三甲基硅烷的去質(zhì)子化(該步在圖6未示出)見J.-F.Biellmamm and J.-B.Ducep在“Allylic and benzylic caranionssubstituted by heteroatoms”，Organic Reactions，Vol.27(Wiley，New York，1982)，p.9中所述。對取代的烯丙基系統(tǒng)中雜原子α位質(zhì)子可用更加堿性的試劑除去。有許多這樣的試劑可以得到，也許正丁基鋰最為常用。采用正丁基鋰以化學(xué)計(jì)量與待金屬化的化合物在四氫呋喃(THF)溶液中反應(yīng)。溫度通常維持在0℃以下(常常是-76℃以下)，由于正丁基鋰的聚合性質(zhì)，此時(shí)它具有低的反應(yīng)性。加入螯合試劑如N，N，N’，N’-四甲基亞乙基二胺(TMEDA)使聚合物解離。但是，該反應(yīng)也可在室溫進(jìn)行，甚至在不存在TMEDA的情況下。
烯丙基硅烷易脫去質(zhì)子，因?yàn)樯傻年庪x子不僅通過與相鄰的雙鍵共軛，而且通過此臨近的硅烷基反應(yīng)而穩(wěn)定化。該陰離子可通過其α-碳或其γ-碳與親電子試劑反應(yīng)。這些反應(yīng)的區(qū)域化學(xué)和立體化學(xué)產(chǎn)出結(jié)果取決于幾個(gè)因素，最重要的一個(gè)是抗衡離子的種類。參見烯丙基硅烷的討論，S.E.Thomas在Organic SynthesisThe roles of boron and silicon(Oxford University Press，New York，1991)，pp.84-87。
在該反應(yīng)方案中，去質(zhì)子的烯丙基硅烷然后被三甲基硼酸酯親電子捕獲，產(chǎn)生一個(gè)中間體，此中間體與頻那醇反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生反式-(三甲基甲硅烷基)硼酸酯化合物62。硼酸酯62也可稱為“烯丙基硼烷”(烯丙基硼酸酯)?；蛘?，如果9-甲氧基-9二烷基硼烷用于親電子捕獲，它將產(chǎn)生硼酸酯復(fù)合物，該復(fù)合物可用三氟化硼試劑(如BF3Et2O)脫甲氧基，產(chǎn)生相應(yīng)的9-(γ-反式-三甲基甲硅烷基烯丙基)-9-二烷基硼烷。
S.E.Thomas在上述參考文獻(xiàn)p34-35中討論了醛對烯丙基硼烷的加成。將醛加入稀丙基硼烷中，后者在碳-碳雙鍵的遠(yuǎn)端(“遠(yuǎn)端”指離硼原子最遠(yuǎn))被不對稱取代，產(chǎn)生含2個(gè)相鄰手性中心的高烯丙基醇。(E)-烯丙基硼烷產(chǎn)生蘇式非對映體，而(Z)-烯丙基硼烷產(chǎn)生赤式非對映體。(E)-烯丙基硼烷62與環(huán)孢菌素A醛51的示范性反應(yīng)示于圖6，其中在THF溶液中攪拌反應(yīng)物幾天后形成了硼中間體63。
硼中間體63中的編號69(圖6)是指在硼的位置上任何數(shù)目的結(jié)構(gòu)都是可能的。例如，如果硼酸酯試劑62是三烷基甲硅烷基稀丙基硼酸酯，則69上的結(jié)構(gòu)將含有包括2個(gè)氧原子的5-元環(huán)。在62中使用的在硼酸酯或硼烷試劑上的取代將會出現(xiàn)在63的結(jié)構(gòu)中。
據(jù)推測，在涉及烯丙基硼烷與醛的反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)立體選擇性可能是由于六元環(huán)椅形過渡態(tài)，見圖6的硼中間體63所示。只有醛的2個(gè)羰基原子(由雙鍵連接的碳和氧)成此為六元環(huán)過渡態(tài)的成員；醛的其余部分從環(huán)中伸出。推測伸出遠(yuǎn)離此六元環(huán)的醛的CsA部分，相對于此環(huán)是以平伏位而非直立位存在，因?yàn)楹笠粋€(gè)構(gòu)型在取代基和烯丙基硼烷62的氧原子之間會產(chǎn)生不利的空間障礙。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，如圖6所示SiMe3基團(tuán)相對于(三甲基甲硅烷基)烯丙基陰離子的位置是占據(jù)了平伏位置的?；蛘?，如果起始的烯丙基硼烷是(Z)-非對映體，SiMe3基團(tuán)可能是直立位置。
或者，可考慮制備赤式-甲硅烷基醇，其酸可消除將產(chǎn)生的順式異構(gòu)體，而堿消除則產(chǎn)生反式異構(gòu)體，與上述消除反應(yīng)的方式相反。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得合成結(jié)束時(shí)會得到相同的產(chǎn)物。
過渡態(tài)產(chǎn)物63用三乙醇胺處理，產(chǎn)生β-三甲基甲硅烷基醇64。另一方面，(三甲基甲硅烷基烯丙基)二烷基硼酸酯的烯丙基硼化產(chǎn)物在用NaOH/H2O2氧化或水性后處理時(shí)，產(chǎn)生甲硅烷基醇64。圖6所示的醇64是蘇式非對映體，因?yàn)檫^渡態(tài)烯丙基硼烷63是(E)-構(gòu)型的，雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，如果從Z-烯丙基硼烷試劑開始，也可以制備其他非對映異構(gòu)體。由于在合成的后階段這些手性中心的除去，新產(chǎn)生的手性中心中的非對映選擇性在本階段不能確定。圖6顯示的β-三甲基甲硅烷基醇64的結(jié)構(gòu)本申請人采用光譜技術(shù)已予以證實(shí)。
在稱為Peterson烯化的烯烴合成方法中，從β-三甲基甲硅烷基醇64消除三烷基甲硅烷基和羥基產(chǎn)生了烯烴，在此情況下是二烯；這是由于此鏈2個(gè)末端碳之間已存在雙鍵。β-羥基硅烷轉(zhuǎn)變?yōu)橄N的討論見S.E.Thomas的參考文獻(xiàn)p.68-69敘述。該反應(yīng)的進(jìn)一步討論見P.F.Hurdlik and D.Peterson在 “Stereospecific olefin-formingelimination reaction of β-hydroxysilane”，J.Am.Chem.Soc.，Vol.97，No.6，pp.1464-1468(1975)。
參見圖6，將醇64轉(zhuǎn)變?yōu)槎┑南磻?yīng)可能按2種不同機(jī)理的路線進(jìn)行，取決于反應(yīng)在酸性還是堿性條件下進(jìn)行。一條路線產(chǎn)生二烯65，而另一條路線產(chǎn)生二烯67。在酸性條件下發(fā)生反式消除，而堿性條件下發(fā)生順式消除。換句話說，β-羥基硅烷的消除反應(yīng)是立體專一性的，酸-和堿-催化的反應(yīng)采取相反的立體化學(xué)過程。用于酸催化反應(yīng)的典型的酸包括乙酸、硫酸和各種路易斯酸；典型的堿包括氫化鈉和氫化鉀或叔丁醇鉀。情況可能是用氫化鈉在THF中進(jìn)行的消除反應(yīng)在室溫的反應(yīng)緩慢，而用氫化鉀的消除反應(yīng)則進(jìn)行得比較快。
在此反應(yīng)路線的此階段產(chǎn)生立體專一性，因?yàn)樵谒嵝詶l件下消除反應(yīng)要求三甲基甲硅烷基和羥基處于反迫扭轉(zhuǎn)角180°(antiperiplanar)關(guān)系。相反，在堿性條件下消除反應(yīng)要求三甲基甲硅烷基和羥基采取順疊(synperiplanar)關(guān)系。后一個(gè)條件有利于牢固硅-氧鍵和中間體四元環(huán)的形成，以Wittig反應(yīng)最后一步類似的方式斷裂。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，牢固硅-氧鍵取代弱硅-氧鍵，超過用弱的碳-碳π鍵取代牢固碳-氧鍵。
因此，β-羥基烷基硅烷的立體專一性消除產(chǎn)物是乙酰-(E)-1，3-二烯化合物和乙酰-(Z)-二烯化合物65。如先前方法中一樣，此時(shí)可在甲醇和水中用K2CO3處理脫除這兩種二烯的保護(hù)基。這種脫除了與1-氨基酸殘基的β-碳連接的乙酸酯基，使該碳上的功能基團(tuán)返回到醇。可用于脫除保護(hù)基的碳酸鉀以外的堿包括氫氧化鈉、碳酸鈉、醇鈉、和醇鉀。
在制備的這個(gè)階段合成基本上完成了。富含二種異構(gòu)體之一的組合物可以混合，以在混合物中達(dá)到理想的異構(gòu)體比例。此處“富含”表示產(chǎn)物含有至少約75重量％的那種異構(gòu)體；換句話說，產(chǎn)物可含有高達(dá)25重量％“不需要”的另一種異構(gòu)體。通過設(shè)計(jì)可使該混合物達(dá)到所需的藥理學(xué)結(jié)果。
方法4該路線也通過乙?；h(huán)孢菌素A醛51進(jìn)行。
用于產(chǎn)生立體選擇性異構(gòu)體的另一個(gè)方案見圖7-8說明。該合成路線與先前所述的不同，其中(1)產(chǎn)生ISATX247的(E)-異構(gòu)體的合成路線通過與生成(Z)-異構(gòu)體不同的中間體進(jìn)行；(2)這些合成路線采用含鈦和含鋰的試劑和/或中間體。
已知鈦試劑在有機(jī)合成中特別有用，因?yàn)樵谂c醛和酮的反應(yīng)中，鈦試劑是區(qū)域-和立體選擇性的。在立體選擇性化學(xué)中鈦的一般性質(zhì)見M.T.Reetz在Organotitanium Reagents in Organic Synthesis(Spriger-Verlage，Berlin，1986)，pp.VII，148-149，和164-165中所述。此處要說的是，鈦配體的性質(zhì)可以改變，以便可以操縱該試劑的電子和立體個(gè)性，許多C-C鍵形成反應(yīng)的立體化學(xué)結(jié)果可以預(yù)測。按照立體化學(xué)，非手性分子的2個(gè)前手性中心的聯(lián)合可產(chǎn)生2個(gè)手性中心。控制立體選擇性結(jié)果的一般規(guī)律是Z-構(gòu)型的烯醇鹽或巴豆?；饘倩衔飪?yōu)先生成順式加成物，而E-構(gòu)型的試劑有利于生成反式非對映體。該傾向可再次用假定具有椅形幾何的六元環(huán)狀過渡態(tài)加以解釋。
這種類型的立體選擇性合成的具體例子見Y.Ikeda et al.，在“Stereoselective synthesis of(Z)-and(E)-1，3-alkadienes fromaldehydes using organotitanium and lithium reagents”，Tetrahedron，Vol.43，No.4，pp.723-730(1987)中所述。該參考文獻(xiàn)披露了烯丙基二苯基膦可用來產(chǎn)生[3-(二苯基膦基)烯丙基]鈦試劑，進(jìn)而可與醛縮合，再形成磷鎓鹽，產(chǎn)生高區(qū)域-和立體選擇性的(Z)-1，3-烷二烯。相反，鋰化的烯丙基二苯基膦氧化物可與醛縮合，直接產(chǎn)生(E)-1，3-烷二烯，仍具有所需的立體選擇性。
參看圖7，ISATX247的(Z)-異構(gòu)體合成(如先前方案那樣)可通過從環(huán)孢菌素A34產(chǎn)生乙酰基環(huán)孢菌素A醛進(jìn)行。[3-(二苯基膦基)烯丙基]鈦試劑72可通過烯丙基二苯基膦71用強(qiáng)堿如t-BuLi去質(zhì)子化，然后使產(chǎn)物與四異丙氧化鈦反應(yīng)而制備。理論上提出過渡態(tài)73產(chǎn)生赤式-α-加成物74，然后導(dǎo)致用碘甲烷(MeI)處理74可將其轉(zhuǎn)變?yōu)棣?氧化膦鎓鹽75。據(jù)推測過渡態(tài)73的存在至少部分導(dǎo)致合成路線的立體選擇性。
按照本發(fā)明所述的示范性方法，有機(jī)金屬試劑的金屬位點(diǎn)可能是控制區(qū)域選擇性的主體(Ikeda，p.725)。這意味著圖7中的醛51與二苯基膦基化合物72的α位發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的α-加成物74，因?yàn)槎交⒒摩?碳與金屬配位，在此情況下該金屬是鈦。觀察到的二烯產(chǎn)物的Z選擇性可認(rèn)為是六元環(huán)過渡態(tài)73而致來解釋。因?yàn)槿?5的龐大環(huán)孢菌素A側(cè)鏈和二苯基膦基據(jù)推測在過渡態(tài)中采取平伏位置，所以選擇性地形成了赤式α-加成物74，產(chǎn)生(Z)-1，3-二烯76。
與圖7反應(yīng)路線相反，圖7中經(jīng)過鈦過渡態(tài)產(chǎn)生ISATX247的(Z)-異構(gòu)體，用此方法不那么容易產(chǎn)生(E)-異構(gòu)體。事實(shí)上，因此方法合成(E)-異構(gòu)體的嘗試通常得到低產(chǎn)率。相反，如圖8所示，鋰衍生物82可與醛51反應(yīng)，生成含鋰過渡態(tài)83，它以E/Z比例超過約75∶25的范圍形成1，3-二烯。如圖7所示，反應(yīng)產(chǎn)物的高立體選擇性可能是由于過渡態(tài)83，其中鋰試劑82的乙烯基和醛51的環(huán)孢菌素A的側(cè)鏈據(jù)推測是占據(jù)了平伏位置的，因此以立體選擇性方式產(chǎn)生(E)-1，3-二烯84。如先所述，通過采用保護(hù)基(如苯甲酸酯或甲硅烷基醚)在所有的立體選擇性合成中可以避免與乙酸酯保護(hù)基有關(guān)的某些不需要的副反應(yīng)。
混合物的制備如前所述，發(fā)現(xiàn)ISATX247的順式和反式異構(gòu)體的某些混合物已被發(fā)現(xiàn)能顯示比天然存在的和現(xiàn)今已知的環(huán)孢菌素增強(qiáng)的效力和毒性降低。
按照本發(fā)明的實(shí)施方案，ISATX247異構(gòu)體(和它的衍生物)通過立體選擇性程度不同的立體選擇性合成路線合成。此立體選擇性路線可產(chǎn)生富含(E)-異構(gòu)體的第一材料或組合物，和富含(Z)-異構(gòu)體的第二材料或組合物，然后可以混合這些材料，以使得到的混合物具有2種異構(gòu)體的理想比例?；蛘?，可考慮通過分離反應(yīng)產(chǎn)物，以分離并富集(E)-異構(gòu)體而制備第一材料，或通過分離反應(yīng)產(chǎn)物，以分離并富集(Z)-異構(gòu)體而制備第二材料。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以調(diào)整立體選擇性合成路線的反應(yīng)條件，以在制備的混合物中直接產(chǎn)生理想的比例。
這些原理見圖9A-C和10中說明。圖9A-C中，顯示了3種假定的合成反應(yīng)，分別產(chǎn)生(E)對(Z)-異構(gòu)體的比例為約65∶35重量％、50∶50重量％、和35∶65重量％。當(dāng)然，這些比例是示范性的，目的只用于說明，可以選出任何假定的數(shù)字組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，用于產(chǎn)生圖9A比例的反應(yīng)條件可能與圖9B和9C不同，以便在產(chǎn)物混合物中達(dá)到二種異構(gòu)體的不同比例。各反應(yīng)的條件都已被調(diào)整，以便產(chǎn)生在該情況下2種異構(gòu)體的特定比例。
與一些產(chǎn)生異構(gòu)體混合物的合成路線相反，可以先分別制備二種異構(gòu)體，然后以預(yù)定的比例混合，以達(dá)到理想比例。這個(gè)概念見圖10中說明，一立體選擇性路線的產(chǎn)物富含一種異構(gòu)體，其產(chǎn)物含有75重量％以上的(E)異構(gòu)體，另一條立體選擇性路線的產(chǎn)物富含另一種異構(gòu)體，使得產(chǎn)物含有75重量％以上的(Z)異構(gòu)體。這些數(shù)字也是說明性的，立體選擇性路線產(chǎn)生的所需異構(gòu)體的純度在一個(gè)實(shí)施方案中可以大于或等于75重量％。在其它實(shí)施方案中所需異構(gòu)體可分別含有大于或等于約80、85、90、或95重量％。
分別合成了各異構(gòu)體后，可混合它們，達(dá)到所需的比例，如圖10所示那樣。為了說明的目的，圖10中和圖9A-C中一樣選擇了相同的假定比例。參見圖10，混合(E)和(Z)-異構(gòu)體，產(chǎn)生3種不同的混合物，分別含有(E)∶(Z)的比例大約為65∶35重量％、50∶50重量％和35∶65重量％。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以分離ISATX247異構(gòu)體的(E)和(Z)-異構(gòu)體的混合物，使該混合物富含一種異構(gòu)體超過另一種。例如，可利用Diels-Alder反應(yīng)使順式異構(gòu)體與烯烴反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)殚]環(huán)化合物。如果烯烴連接于一種能夠分離(如可過濾)的底物，該順式異構(gòu)體就能基本上從混合物中分離出來，留下富含反式異構(gòu)體的組合物。通過加熱可從閉環(huán)化合物重建該順式異構(gòu)體，產(chǎn)生富含順式異構(gòu)體的組合物。因此，用這種方式，可以分開順式和反式異構(gòu)體。
實(shí)際上，任何混合物中的(E)∶(Z)-異構(gòu)體比例，無論產(chǎn)生它們的方法的立體選擇性程度如何，可有寬廣的數(shù)值范圍。例如，此混合物可含約10-90重量％的(E)-異構(gòu)體和約90-10重量％的(Z)-異構(gòu)體。在其它實(shí)施方案中，此混合物可含約15-85重量％的(E)-異構(gòu)體和約85-15重量％的(Z)-異構(gòu)體；或約25-75重量％的(E)-異構(gòu)體和約75-25重量％的(Z)-異構(gòu)體；或約35-65重量％的(E)-異構(gòu)體和約65-35重量％的(Z)-異構(gòu)體；或約45-55重量％的(E)-異構(gòu)體和約55-45重量％的(Z)-異構(gòu)體。在還有其它實(shí)施方案中，此異構(gòu)體混合物是ISATX247混合物，含約45-55重量％的(E)-異構(gòu)體和約55-45重量％的(Z)-異構(gòu)體。約45-55重量％的(E)-異構(gòu)體和約55-45重量％的(Z)-異構(gòu)體。這些重量百分?jǐn)?shù)是根據(jù)組合物的總重量計(jì)算的，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，(E)和(Z)-異構(gòu)體的重量百分?jǐn)?shù)之和是100重量％。換句話說，此混合物可含有65重量％的(E)-異構(gòu)體和35重量％的(Z)-異構(gòu)體，反之亦然。
混合物中一種異構(gòu)體或另一個(gè)異構(gòu)體的百分?jǐn)?shù)可用核磁共振(NMR)或本領(lǐng)域公知的其它技術(shù)來驗(yàn)證。
藥物組合物本發(fā)明也涉及治療需要免疫抑制的病人的方法，包括給予含有本發(fā)明混合物作為活性組分的藥物組合物。該組合有興趣的病征，具體包括自身免疫和炎癥疾病以及與移植物排斥有關(guān)或引起的疾病，如以下疾病的治療(包括改善、減輕、消除或治愈病原學(xué)或癥狀)或預(yù)防(包括基本或完全限制、預(yù)防或避免)(a)急性器官或組織移植排斥，如接受心、肺、心-肺聯(lián)合、肝、腎、胰、皮膚、腸、或角膜移植者的治療，特別是預(yù)防和/或治療T-細(xì)胞介導(dǎo)的排斥，以及移植物抗宿主疾病，如骨髓移植后產(chǎn)生的。
(b)移植器官的慢性排斥，特別是，預(yù)防移植物的血管疾病，此病的特征是由于平滑肌細(xì)胞增生和相關(guān)作用致內(nèi)膜增厚，結(jié)果移植物的動脈發(fā)生狹窄。
(c)異種移植物排斥，包括器官的急性、亞急性、或慢性排斥，當(dāng)器官供體和受體屬于不同物種時(shí)發(fā)生，最特別是B-細(xì)胞介導(dǎo)的排斥或抗體介導(dǎo)的排斥。
(d)自身免疫疾病和炎癥疾病，特別是病原學(xué)包括免疫學(xué)或自身免疫成分的炎癥疾病，諸如關(guān)節(jié)炎(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)炎變形)和其他風(fēng)濕性疾病?？刹捎帽景l(fā)明的協(xié)同性組合治療的具體自身免疫疾病包括自身免疫血液疾病(包括，如溶血性貧血、再生障礙性貧血、純紅細(xì)胞貧血和自發(fā)性血小板減少)、全身性紅斑狼瘡、多軟骨炎，硬皮病，Wengener肉芽腫病，皮肌炎，慢性活動性肝炎、重癥肌無力，牛皮癬、Steven-Johnson綜合癥、自發(fā)性口炎性腹瀉，(自免疫)炎性腸病(包括如潰瘍性結(jié)腸炎和Crohn氏病)、內(nèi)分泌眼病、Graves氏病、肉樣瘤病，多發(fā)性硬化病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、少年糖尿病(I型糖尿病)、眼色素層炎(前和后)、干性角膜結(jié)膜炎和春季角膜結(jié)膜炎，間質(zhì)性肺纖維化、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、腎小球性腎炎(有或無腎病綜合癥，如包括自發(fā)性腎病綜合癥或最小改變腎病)和青春性皮肌炎。皮膚的自身免疫和炎疾病也考慮可用本發(fā)明協(xié)同性組合進(jìn)行預(yù)防和治療，如牛皮癬、接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎、簇狀脫發(fā)、多形態(tài)紅斑、皰疹樣皮炎、硬皮病、白斑、過敏性血管炎、蕁麻疹、大皰天皰瘡、紅斑狼瘡、天皰瘡、獲得性大皰性表皮松解、和其它炎性或過敏性皮膚疾病，如肺和氣道炎性疾病，包括哮喘、過敏癥和塵肺病。
可單純給予本發(fā)明的異構(gòu)體類似物或與藥學(xué)上可接受的載體一起給予有此需要的溫血動物。藥物載體可是液體或固體。本發(fā)明混合物可以含有常規(guī)的無毒性藥學(xué)上可接受的載體、輔佐劑、和運(yùn)載體的單位劑量制劑，經(jīng)口服、局部應(yīng)用、胃腸外、吸入噴霧或直腸給藥。本文所用術(shù)語“胃腸外”在此包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或灌注技術(shù)。
含有本發(fā)明混合物的藥物組合物可優(yōu)選是適合于口服應(yīng)用的形式，例如，藥片、錠劑、糖錠、水性或油性懸浮液、可分散的粉末或顆粒、乳劑、硬或軟膠囊、或糖漿或酏劑。打算口服應(yīng)用的組合物可按照本領(lǐng)域已知的制造藥物組合物的方法制備，這樣的組合物可含有一種或多種選自以下的藥劑甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、和防腐劑，以提供藥學(xué)上優(yōu)雅的和可口的制劑。含有與無毒性藥學(xué)上可接受的賦形劑混合的活性成分的藥片，也可通過已知的方法制造。所用的賦形劑例如是(1)惰性稀釋劑，如碳酸鈣、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；(2)造粒劑或崩解劑，如玉米淀粉、或海藻酸；(3)黏結(jié)劑，如淀粉、明膠或阿拉伯膠；(4)潤滑劑，如硬脂酸鎂硬脂酸或滑石。藥片可以無包衣或用已知的技術(shù)包衣，以便延緩在胃腸道內(nèi)崩解和吸收，因此在較長的時(shí)間內(nèi)提供持續(xù)的作用。例如，可以使用時(shí)間延遲材料如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。它們也可用美國專利4256108；4160452；4265874中所述的技術(shù)包衣，形成滲透性治療藥片用于受控釋放。
在某些情況下，用于口服的制劑可以是硬明膠膠囊形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合。它們也可以是軟明膠膠囊形式，其中活性成分與水或油性介質(zhì)混合，例如花生油、液體石蠟或橄欖油。
水性懸浮液通常含有活性成分與適合制造水性懸浮液的賦形劑混合。這樣的賦形劑可包括(1)懸浮劑，如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠、和阿拉伯膠；或(2)分散劑或潤濕劑，可以是天然存在的磷脂如卵磷脂、氧化烯與脂肪酸的縮合產(chǎn)物如聚氧乙烯硬脂酸酯、環(huán)氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物如十七亞乙基氧十六烷醇、環(huán)氧乙烷與部分酯(衍生自脂肪酸和己糖醇)的縮合產(chǎn)物如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯、或環(huán)氧乙烷與部分酯(衍生自脂肪酸和己糖醇酐)的縮合產(chǎn)物如聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯。
水性懸浮液還可含有一種或多種防腐劑，例如對羥基苯甲酸乙酯或正丙酯；一種或多種著色劑；一種或多種調(diào)味劑；和一種或多種甜味劑，如蔗糖、阿司巴坦或糖精。
油性懸浮液可將活性成分懸浮在植物油中配制，例如，花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油，含ω3脂肪酸的魚油或礦物油如液體石蠟。油性懸浮液可含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或十六烷醇。也可加入甜味劑和調(diào)味劑，提供可口的口服制劑。這些組合物可通過加入抗氧化劑如抗壞血酸保存。
可分散的粉劑和顆粒劑適合于制備水性懸浮液。它們可提供與分散劑或潤濕劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑混合的活性成分。合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑上述已有舉例。也可存在其它的賦形劑，例如，上述的那些甜味劑、調(diào)味劑和著色劑。
含本發(fā)明混合物的藥物組合物還可以是水包油乳劑形式。油相可以是植物油，如橄欖油或花生油，或礦物油如液體石蠟，或它們的混合物。合適的乳化劑可以是(1)天然存在的樹膠，如阿拉伯膠和黃蓍膠；(2)天然存在的磷脂如大豆和卵磷脂；(3)酯或部分酯30，衍生自脂肪酸和己糖醇酐，如失水山梨糖醇單油酸酯；(4)所述部分酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，如聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯。乳劑也可含甜味劑和調(diào)味劑。
糖漿劑和酏劑可用甜味劑配制，如甘油、異丙醇、山梨糖醇、阿司巴坦或蔗糖。這樣的制劑還可含濕潤劑、防腐劑和調(diào)味劑及著色劑。
藥物組合物可以是滅菌可注射的水性或油性懸浮液。該懸浮液可按照已知的方法用上述那些合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑配制。滅菌可注射制劑也可以是以無毒性胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑(如1，3-丁二醇)配制的滅菌可注射溶液或懸浮液?？刹捎玫目山邮茌d體和溶劑是水、Ringer氏溶液、等滲氯化鈉溶液。此外，滅菌的固定油常規(guī)用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此目的，任何溫和固定的油均可使用，包括合成的單或二甘油酯。此外，脂肪酸如油酸也可用在注射液中。
本發(fā)明混合物還可以栓劑的形式用于直腸給藥。這些組合物可通過將藥物與合適的無刺激性的賦形劑混合制備，賦形劑在常溫下是固體，但在直腸溫度下是液體，因此在直腸中會融化釋放出藥物。這樣的材料是可可脂和聚乙二醇。
對于局部外用，含有本發(fā)明公開的環(huán)孢菌素的霜劑、軟膏、凝膠、溶液、或懸浮液等等都可使用。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用含有表面活性劑、乙醇、親脂和/或兩性溶劑作為非活性成分的液體溶液。特別是，采用含此異構(gòu)體類似物混合物和以下非藥物成分的口服多重乳液配方d-α生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯(維生素E TPGS)、中鏈三甘油酯(MCT)油、Tween 40、和乙醇。也可優(yōu)選采用含此異構(gòu)體類似物混合物和與口服溶液相同的非藥物成分的軟明膠膠囊(包含明膠、甘油、水和山梨糖醇)。
0.05mg/kg體重/天-50mg/kg體重/天的劑量水平可用于治療上述疾病。劑量水平和給藥安排可按照所用的具體異構(gòu)體混合物、待治療的疾病、和其它因素(如年齡和患者的狀況)而變化。優(yōu)選的劑量是約0.5-約10mg/kg/天和約0.1-約10mg/kg/天。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，約2-約6mg/kg/天，口服，b.i.d.。特別優(yōu)選實(shí)施例中，口服Bid給予約0.5-3mg/kg/天。
可與載體材料混合產(chǎn)生單劑型的活性成分的量，根據(jù)治療的宿主和具體的給藥方式而不同。例如，用于人口服給藥的制劑可含2.5mg-2.5g活性化合物，與合適的常用量的載體材料混合，載體材料的量可在總組合物的約5-95％范圍內(nèi)變化。單位劑型一般含約5mg-約500mg活性成分。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，單個(gè)膠囊含約50mg異構(gòu)體混合物用于口服給藥。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，含約50mg異構(gòu)體混合物的口服溶液可用于口服給藥。
但是，應(yīng)該明白，對于任何具體患者的具體劑量水平取決于各種因素，包括所用的具體化合物的活性、年齡、體重、總體健康狀況、性別、飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄速度、藥物配伍以及所治療具體疾病或病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重性。
方法學(xué)環(huán)孢菌素衍生物(一類由真菌Tolypocladium inflatum Gams產(chǎn)生的環(huán)狀多肽)，由于主要作用于T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)而在免疫抑制治療中越來越多地使用。已經(jīng)觀察到環(huán)孢菌素衍生物能可逆地抑制免疫活性淋巴細(xì)胞，特別是T-淋巴細(xì)胞，以及抑制淋巴因子的產(chǎn)生和釋放。該作用主要通過環(huán)孢菌素A-誘導(dǎo)的鈣調(diào)磷酸酶(在細(xì)胞的胞漿中發(fā)現(xiàn)的一種磷酸酯酶)抑制而介導(dǎo)(Schreiber and Crabtree，1992)。環(huán)孢菌素A或環(huán)孢菌素A衍生物的相應(yīng)指示物，是其抑制鈣調(diào)磷酸酶的磷酸酯酶活性的能力。鈣調(diào)磷酸酶抑制試驗(yàn)可測量此藥物在其作用位點(diǎn)的活性，并因此是評價(jià)環(huán)孢菌素A類似物藥效的最精確和直接的體外評價(jià)方法(Fruman et al.，1992)。
ISATX247是與環(huán)孢菌素A類似的環(huán)孢菌素A類似物，不同之處是對該分子準(zhǔn)氨基酸殘基上的功能基團(tuán)作了新穎修飾。在體外鈣調(diào)磷酸酶抑制試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，ISATX247顯示的藥效比環(huán)孢菌素A強(qiáng)3倍。
藥效學(xué)研究(體內(nèi)和體外)表明，ISATX247比現(xiàn)有的其它環(huán)孢菌素化合物更為強(qiáng)效。環(huán)孢菌素類似物的異構(gòu)體混合物(約10∶90至約90∶10，反式∶順式)，特別是具有50-55％Z-異構(gòu)體和45-50％E-異構(gòu)體的ISATX247，作為免疫抑制劑(相對于環(huán)孢菌素A)的藥效，已在體外鈣調(diào)磷酸酶活性試驗(yàn)、大鼠心臟移植模型、胰島細(xì)胞同種移植小鼠模型、膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型、和/或抗原誘導(dǎo)的兔關(guān)節(jié)炎模型中得到證明。數(shù)據(jù)顯示，這些異構(gòu)體混合物的藥效相當(dāng)于或更強(qiáng)于環(huán)孢菌素A，因此可用于免疫調(diào)節(jié)失調(diào)的治療。
與環(huán)孢菌素A治療有關(guān)的副作用有許多，列舉幾個(gè)，包括腎毒性、肝毒性、致白內(nèi)障作用、多毛癥、和牙齦增生(Sketris et al.，1995)。其中，腎毒性是最嚴(yán)重之一，是應(yīng)用環(huán)孢菌素導(dǎo)致的劑量相關(guān)不良作用。環(huán)孢菌素引起腎損傷的確切機(jī)理尚不知道；但是，已經(jīng)提出，血管收縮物質(zhì)在腎臟中濃度的增加會導(dǎo)致腎小球輸入小動脈局部血管收縮。這可能導(dǎo)致腎局部缺血，腎小球過濾速度降低，長時(shí)間以后發(fā)生間質(zhì)性纖維化。
ISATX247的非臨床安全性已經(jīng)在許多動物種類中作了評價(jià)。對大鼠、狗、和靈長類的重復(fù)劑量口服毒性研究表明，ISATX247是良好耐受的，并產(chǎn)生與免疫抑制相一致的作用。在所有種類動物中觀察到的唯一毒理學(xué)作用是腹瀉。
在體外細(xì)菌逆向突變和染色體畸變試驗(yàn)中，和體內(nèi)大鼠小核試驗(yàn)中，已證明ISATX247不顯示致突變活性。迄今致癌性研究尚未完成。ISATX247的生殖毒性研究已在妊娠大鼠和兔中完成。沒有發(fā)現(xiàn)與治療有關(guān)的畸形和改變。觀察了導(dǎo)致母系中毒性及相應(yīng)的胚胎毒性的所有劑量。
實(shí)施例實(shí)施例1環(huán)孢菌素A的乙?；瘜⒁音?140mL)加入環(huán)孢菌素A(50.0克，41.6mmol)中，室溫氮?dú)庵袛嚢杌旌衔铮钡江h(huán)孢菌素A溶解。加入二甲基氨基吡啶(7.62g，62.4mmol)，反應(yīng)在室溫氮?dú)庵袛嚢?小時(shí)，或直到反應(yīng)完全。將反應(yīng)混合物冷卻到5℃然后過濾。用己烷洗滌收集到的固體，洗去多余的乙酐。將得到的糊狀固體緩慢轉(zhuǎn)移到劇烈攪拌的5％碳酸氫鈉水溶液(1.5L)中。攪拌得到的懸浮液，直到得到細(xì)漿和CO2停止釋放。過濾收集固體，用水洗滌，直到濾液的pH呈中性。固體產(chǎn)物在真空烘箱中(55℃)干燥過夜，得到44.0g(85％)無色固體產(chǎn)物。
實(shí)施例2實(shí)施例1產(chǎn)物的氧化將乙腈(320mL)和水(80mL)加入乙酰基環(huán)孢菌素A(42.97g，34.54mmol)中，攪拌混合物，直到全部物質(zhì)溶解。加入過碘酸鈉(14.77g，69.08mmol)，然后加入氯化釕水合物(0.358g，1.73mmol)，在氮?dú)庵惺覝財(cái)嚢璺磻?yīng)物3小時(shí)。加入水(300毫升)，混合物轉(zhuǎn)移到分液漏斗。混合物用乙酸乙酯(300mL，然后250mL)提取2次。合并暗黑色乙酸乙酯提取液，用250毫升水，然后用250毫升鹽水洗滌。有機(jī)溶液用硫酸鎂干燥，蒸發(fā)溶劑，得到墨綠色固體。粗產(chǎn)物硅膠層析，用40％丙酮/60％己烷洗脫，得到無色固體產(chǎn)物(29.1g，68％)。
實(shí)施例3乙?；鵌SATX247的制備(i)內(nèi)鎓鹽的原位產(chǎn)生將乙?；h(huán)孢菌素A醛(31.84g，25.84mmol)加到340毫升甲苯中，攪拌混合物，直到完全溶解。向生成的溶液加入340毫升1當(dāng)量氫氧化鈉水溶液。劇烈攪拌混合物，然后加入烯丙基三苯基膦鎓溴化物(58.22g，151.90mmol)。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物24小時(shí)。再加入烯丙基三苯基膦鎓溴化物(16.64g，43.42mmol)，再攪拌24小時(shí)。將混合物轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，分出甲苯層。水層用200毫升甲苯提取。合并2次甲苯層，依次用200毫升去離子水、200毫升飽和氯化鈉水溶液洗滌，用硫酸鎂干燥。過濾，蒸發(fā)甲苯，得到極粘的膠質(zhì)。該物質(zhì)用120毫升乙酸乙酯處理，攪拌至形成細(xì)漿?？焖贁嚢柘聦⒓和?570毫升)緩慢加入。再攪拌30分鐘。過濾得到的懸浮液。用160毫升5∶1己烷/乙酸乙酯洗滌。收集的固體合并的濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，得到粘性的半固體。該物質(zhì)用75毫升乙酸乙酯處理，攪拌到形成細(xì)漿?？焖贁嚢柘戮徛尤爰和?225毫升)。再攪拌30分鐘，過濾得到的懸浮液。用100毫升5∶1己烷/乙酸乙酯洗滌收集的固體。濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，得到淡黃色固體。粗產(chǎn)物上硅膠層析，用40％丙酮/60％己烷洗脫，得到無色固體產(chǎn)物(14.09g)。
(ii)預(yù)先形成內(nèi)鎓鹽和在LiBr存在下的反應(yīng)將烯丙基三苯基膦鎓溴化物(7.67g，20mmol)在THF(20mL)中攪拌懸浮并冷卻到0℃，加入KOBut的THF(20mL，20mmol，1M溶液)溶液。在此溫度再攪拌30分鐘，加入LiBr的THF(10mL，10mmol，1M溶液)溶液。再攪拌反應(yīng)混合物30分鐘，通過插管加入乙?；鵆sA-醛(4.93g，4mmol)在THF(10mL)中的溶液。室溫?cái)嚢?5分鐘后，用飽和NH4Cl溶液(25毫升)終止反應(yīng)。后處理和層析如前所述，得到乙?；腎SATX247無色固體(3.5g)。
實(shí)施例4ISATX247的制備將乙酰ISATX247(14.6g，11.62mmol)溶于340毫升甲醇中，然后加入135毫升去離子水。加入碳酸鉀(13.36g，96.66mmol)，室溫?cái)嚢杌旌衔?4-48小時(shí)，直到反應(yīng)完全。蒸發(fā)去大部分甲醇，攪拌下加入250毫升乙酸乙酯。緩慢加入10％檸檬酸水溶液(120毫升)，然后分出乙酸乙酯層。水層用另外200毫升乙酸乙酯提取。合并的乙酸乙酯提取物依次用150毫升去離子水、100毫升10％檸檬酸水溶液、150毫升飽和氯化鈉洗滌，用硫酸鎂干燥。蒸發(fā)乙酸乙酯，得到淡黃色固體。粗產(chǎn)物硅膠層析，用40％丙酮/60％己烷洗脫，得到無色固體產(chǎn)物ISATX247(10.51g，75％)。ISATX247含45-50％E-異構(gòu)體和50-55％Z-異構(gòu)體。
實(shí)施例1-4的產(chǎn)物用質(zhì)譜和/或核磁共振譜特征分析。
實(shí)施例5乙酰-η-溴代環(huán)孢菌素A的制備如實(shí)施例1制備乙酰基環(huán)孢菌素A(41.48g，33.3mmol)，將N-溴代琥珀酰亞胺(10.39g，58.4mmol)和偶氮二異丁腈(1.09g，6.67mmol)溶于250毫升四氯化碳中，加熱回流混合物2.5小時(shí)。冷卻混合物，蒸發(fā)溶劑。用350毫升乙醚處理殘留物，過濾除去不溶性物質(zhì)。濾液依次用150毫升水和150毫升鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥。蒸發(fā)溶劑。粗產(chǎn)物上硅膠層析，用40％丙酮/60％己烷洗脫，得到乙酰-η-溴代環(huán)孢菌素A黃色固體28.57g(65％)。
實(shí)施例6乙酰基環(huán)孢菌素A的三苯基膦鎓溴化物的制備將乙?；?η-溴代環(huán)孢菌素A(28.55g，21.6mmol)和三苯膦(7.55g，28.8mmol)溶解在210毫升甲苯得到的溶液加熱100℃ 21小時(shí)。冷卻溶液，蒸發(fā)甲苯。得到的油狀半固體用250毫升己烷/乙醚(1∶4)處理，充分混合，輕輕倒出溶劑。用150毫升乙醚再重復(fù)該過程3次。然后將殘留物溶于50毫升乙酸乙酯，用220毫升己烷沉淀。過濾收集產(chǎn)生的固體，得到乙?；h(huán)孢菌素A的三苯基膦鎓溴化物褐色固體22.5g(66％)。
實(shí)施例7Wittig反應(yīng)乙?；h(huán)孢菌素A的三苯基膦鎓溴化物(100mg，0.06mmol)、過量的37％甲醛(0.25mL)和甲苯(2mL)室溫快速攪拌。滴加1N氫氧化鈉水溶液(2mL)，再攪拌3.5小時(shí)。用20毫升乙酸乙酯和10毫升水稀釋反應(yīng)混合物。分出乙酸乙酯層，依次用10毫升水、10毫升鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，蒸發(fā)溶劑。粗產(chǎn)物上硅膠層析，用丙酮/己烷(2∶3)洗脫，得到70mg(88％)乙酰ISATX247的E-異構(gòu)體和Z-異構(gòu)體混合物無色固體。
實(shí)施例8Wittig反應(yīng)產(chǎn)物的脫乙?；瘜?shí)施例7的異構(gòu)體混合物(70mg，0.056mmol)溶于5毫升甲醇，然后加入1毫升水。加入碳酸鉀(75mg)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物19小時(shí)。蒸發(fā)大部分甲醇，在殘留物中加入15毫升乙酸乙酯，再加入10毫升10％檸檬酸水溶液。分出乙酸乙酯層，水層再用10毫升乙酸乙酯提取。合并的乙酸乙酯提取物依次用10毫升水、10毫升10％檸檬酸水溶液和10毫升鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，蒸發(fā)溶劑。粗產(chǎn)物上硅膠層析，用40丙酮/己烷(2∶3)洗脫，得到37mg(54％)ISATX247無色固體，含85％E-異構(gòu)體和15％Z-異構(gòu)體。
實(shí)施例5-8的產(chǎn)物用質(zhì)譜和/或核磁共振譜特征分析。
實(shí)施例9ISATX247的幾何異構(gòu)體的制備ISATX247的順式和反式異構(gòu)體可用以下反應(yīng)方案分別合成。該反應(yīng)順序包括烯丙基三甲基甲硅烷的金屬化、用硼酸三甲酯的親電捕獲、接著水解、然后轉(zhuǎn)酯化，產(chǎn)生中間體反式-(三甲基甲硅烷基)烯丙基硼酸酯。環(huán)孢菌素醛的烯丙基硼化產(chǎn)生硼中間體，通過螯合此中間體轉(zhuǎn)變成為所需的β-三甲基甲硅烷基醇。由于產(chǎn)生的新的手性中心將在下一個(gè)階段被除去，這些手性中心的非對映選擇性不取決于這個(gè)階段。應(yīng)該注意，在β-三甲基甲硅烷基醇中的2個(gè)中心的相對立體化學(xué)是與預(yù)料相一致的反式排列，這是由于在反式-(三甲基甲硅烷基)烯丙基硼酸酯前體中的反式雙鍵所致。
β-三甲基甲硅烷基醇的堿催化去除(Hudrlick et al.，1975)產(chǎn)生富含乙酰-(Z)-1，3-二烯的組合物，而酸催化去除產(chǎn)生產(chǎn)生富含乙酰-(E)-1，3-二烯的組合物。脫保護(hù)產(chǎn)生各自二烯醇，分別為ISATX247的E-異構(gòu)體和Z-異構(gòu)體。
產(chǎn)生二烯的另一條途徑是利用烯丙基正膦。金屬化烯丙基二苯基膦然后用Ti(OPri)4轉(zhuǎn)金屬化，產(chǎn)生鈦中間體。烯丙基鈦化隨后被立體專一性消除產(chǎn)生富含(Z)-二烯的組合物。
另一方面，當(dāng)烯丙基二苯基膦氧化物發(fā)生類似的反應(yīng)順序時(shí)(圖8)，則主要(75％)產(chǎn)生E-異構(gòu)體。
(i)乙酰CsA-CHO的烯丙基硼化按照先前報(bào)告的方法(Ikeda，et al.，1987)制備(E)-1-三甲基甲硅烷基-1-丙烯-硼酸酯。向攪拌的(E)-1-三甲基甲硅烷基-1-丙烯-硼酸酯(0.2g，0.832mmol)的THF溶液在氮?dú)庵屑尤胍阴；h(huán)孢菌素A醛(1.026g，0.832mmol)。用高效液相層析(C-8柱，反相)監(jiān)測反應(yīng)混合物，共攪拌7天。然后加入三乙醇胺(0.196g，1.3mmol)，再攪拌4天。用硅膠柱純化得到的β-三甲基甲硅烷醇。MS(ES)m/z 1368.9(M++Na+)。
向KH(3.5mg，26.4μmol，30％礦物油分散液，用無水己烷洗滌)的無水THF(1mL)懸浮液中加入β-三甲基甲硅烷基醇(10mg，7.4μmol)，室溫?cái)嚢?0分鐘。用乙醚(10mL)稀釋反應(yīng)混合物，用飽和NaHCO3溶液(2×5mL)洗滌。干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)去除溶劑，得到富集的(Z)-乙?；?1，3-二烯。MS(ES)m/z 1294.8(M++K+)。
(ii)乙酰CsA-CHO的烯丙基鈦化向攪拌并冷卻(-78℃)的烯丙基二苯基膦(0.54g，2.4mmol)的無水THF(8mL)溶液加入t-BuLi(1.42mL，2.4mmol，1.7m戊烷溶液)。同一溫度攪拌磚紅色溶液15分鐘，然后0℃攪拌30分鐘。再冷卻到-78℃，加入Ti(OPri)4(0.71mL，2.4mmol)。在此溫度攪拌此棕色溶液15分鐘，然后通過插管加入乙酰CsA-CHO(2.5g，2mmol)的THF(10mL)溶液。再攪拌淡黃色溶液30分鐘，然后溫加熱至室溫過夜。0℃向反應(yīng)混合物加入MeI(0.15mL，2.4mmol)。在此溫度再攪拌1小時(shí)，然后室溫?cái)嚢?小時(shí)。將反應(yīng)混合物倒入冰冷的1％HCl(100mL)。水層用EtOAc(3×50mL)提取。合并的有機(jī)提取物用水(2×25mL)和鹽水(25mL)洗滌。蒸發(fā)溶劑得到黃色固體，用硅膠柱層析純化。用1∶3丙酮己烷洗脫。得到ISATX247的(Z)-富集異構(gòu)體(Z/E比例75∶25)。
實(shí)施例10ISATX247異構(gòu)體的(E)-富集的混合物的制備在-78℃向烯丙基二苯基膦氧化物(1mmol)和六甲基磷酰胺(2mmol)的THF(5mL)溶液加入正丁基鋰(1mmol，溶于己烷)。-78℃攪拌混合物30分鐘。加入乙酰環(huán)胞菌素醛(0.8mmol)的THF(7mL)溶液，讓反應(yīng)混合物逐漸升溫至室溫，然后攪拌18小時(shí)。將混合物倒入冰冷的1N鹽酸(50mL)中，然后用乙酸乙酯提取。用水洗滌有機(jī)提取物，用硫酸鎂干燥，蒸發(fā)溶劑。殘留物用硅膠柱層析純化。用25％丙酮/75％己烷洗脫。得到乙酰ISATX247的(E)-和(Z)-異構(gòu)體的混合物。如實(shí)施例4脫除乙酸酯保護(hù)基團(tuán)，得到ISATX247的(E)-富集異構(gòu)體。質(zhì)子NMR譜表明此混合物含有ISATX247的75％(E)-和25％(Z)-異構(gòu)體。該反應(yīng)也可按Schlosser改進(jìn)法進(jìn)行(R.Liu，M.Schlosser，Synlett，1996，1195)。向攪拌并冷卻的(-78℃)的烯丙基二苯基膦氧化物(1.21g，5mmol)的THF(20mL)溶液中加入n-BuLi(2mL，5mmol，2.5M在己烷中)。-78℃攪拌紅色溶液40分鐘。在15分鐘內(nèi)通過插管加入乙?；鵆sA-CHO(1.25g，1.02mmol)的THF(12mL)溶液。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物2小時(shí)。如上后處理和層析得到乙?；鵌SATX247(Z∶E比例40∶60，由NMR分析確定)。
實(shí)施例11苯甲酰基保護(hù)的環(huán)孢菌素A的制備將環(huán)孢菌素A(6.01g，5mmol)和4-二甲基氨基吡啶(305mg，2.5mmol)溶于吡啶(5mL)中。加入苯甲酸酐(3.4g，15mmol)，50℃攪拌混合物19小時(shí)。再加入苯甲酸酐(1.7g，7.5mmol)和DMAP(305mg，2.5mmol)。50℃再攪拌24小時(shí)。加入苯甲酸酐(0.85g，3.8mmol)，再攪拌反應(yīng)物23小時(shí)。攪拌下將反應(yīng)混合物緩慢倒入水中。過濾沉淀的環(huán)孢菌素A苯甲酸酯，用水洗滌。收集的濾餅溶解在最小體積的甲醇中，將其加入10％檸檬酸溶液，攪拌1小時(shí)。過濾收集沉淀的產(chǎn)物，用水洗滌，直到濾液的pH和水一樣。50℃真空干燥固體環(huán)孢菌素A苯甲酸酯，得到無色固體。
實(shí)施例12三乙基甲硅烷基醚保護(hù)的環(huán)孢菌素A的制備將環(huán)孢菌素A(3.606g，3mmol)溶解在無水吡啶(8mL)中，加入DMAP(122mg，1mmol)。反應(yīng)混合物冷卻到0℃，滴加三乙基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯(3.6mmol)。將混合物升溫至室溫，攪拌過夜。攪拌下將混合物緩慢倒入水中。過濾沉淀的三乙基甲硅烷基醚，用水洗滌。收集的濾餅溶解在最小體積的甲醇中，將其加入5％檸檬酸溶液，攪拌30分鐘。過濾收集沉淀的產(chǎn)物，用水洗滌，直到濾液的pH和水一樣。50℃真空干燥固體，得到無色固體三乙基甲硅烷基醚。通過類似方法，引入三異丙基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基保護(hù)基團(tuán)。
實(shí)施例13用鈣調(diào)磷酸酶抑制試驗(yàn)測定免疫抑制活性環(huán)孢菌素A或環(huán)孢菌素A衍生物的指標(biāo)是其抑制鈣調(diào)磷酸酶磷酸酯酶活性的能力。鈣調(diào)磷酸酶抑制試驗(yàn)可測定該藥物在其作用位點(diǎn)的活性，因此是可直接提供外評估環(huán)孢菌素A類似物的藥效(Fruman et al.，1992)。
對ISATX247(45-50％E-異構(gòu)體和50-55％Z-異構(gòu)體)與環(huán)孢菌素A的免疫抑制活性已用鈣調(diào)磷酸酶(CN)抑制試驗(yàn)作了評估。該試驗(yàn)的結(jié)果顯示，ISATX247(45-50％E-異構(gòu)體和50-55％Z-異構(gòu)體)對鈣調(diào)磷酸酶磷酸酯酶活性的抑制比環(huán)孢菌素A強(qiáng)3倍(由IC50測定)(圖11)。
各種氘化和非氘化異構(gòu)體類似物混合物與環(huán)孢菌素A免疫抑制活性已用鈣調(diào)磷酸酶(CN)抑制試驗(yàn)作了評估。這些類似物的結(jié)構(gòu)和異構(gòu)體組成見圖12，圖12中，標(biāo)號“I4”相應(yīng)于ISATX247的結(jié)構(gòu)。I4-M2指用實(shí)施例5-8所述方法制備的ISATX247(在該圖中標(biāo)為方法2)。I4-D4指氘化的ISATX247，由實(shí)施例1-4所述方法產(chǎn)生。I4-D2指氘化的ISATX247，由實(shí)施例5-8所述方法產(chǎn)生。其他異構(gòu)體混合物如圖中所示。
該測試結(jié)果顯示，這些異構(gòu)體類似物混合物對鈣調(diào)磷酸酶磷酸酯酶活性的抑制作用至少和環(huán)孢菌素A的強(qiáng)度相同(通過IC50測定)(圖13)。CsA指環(huán)孢菌素A；Isocyclo4指用敘述在實(shí)施例1-4的方法產(chǎn)生的ISATX247。Isocyclo5相應(yīng)于圖12的I5-M1。Isocyclo4-d4相應(yīng)于圖12的I4-D4。Isocyclo5-d5相應(yīng)于圖12的I5-D5。Isocyclo4-d2相應(yīng)于圖12的I4-D2。Isocyclo4-M2相應(yīng)于圖12的I4-M2。Isocyclo5-m2相應(yīng)于圖12的I5-M5。
實(shí)施例14用大鼠心臟移植模型測定免疫抑制活性評價(jià)了ISATX247(45-50％E-異構(gòu)體和50-55％Z-異構(gòu)體)對不同品系大鼠之間心臟移植排異的預(yù)防效果，并與環(huán)孢菌素A作比較。大鼠心臟移植模型是用來評價(jià)新的免疫抑制藥物體內(nèi)效果的最常用模型，因?yàn)橛捎诿庖吲懦猓四Ｐ偷囊浦搀w長期存活很難達(dá)到。
該方法涉及將Wistar Furth大鼠的心臟異位移植給Lewis大鼠(腹部主動脈和下靜脈腔)。環(huán)孢菌素A或異構(gòu)體類似物混合物的腹膜內(nèi)注射移植前3天開始給予移植物接受大鼠并在移植后繼續(xù)30天。如果在移植后30天期間觀察到移植物機(jī)能不良，即處死該動物。如果在移植后動物存活超過30天，停止試驗(yàn)和對照，該讓動物繼續(xù)生存，直到移植物機(jī)能不良或在移植后生存至100天。
每組接受體移植大鼠的平均存活率總結(jié)在表1中。這些結(jié)果顯示，ISATX247(45-50％E-異構(gòu)體和50-55％Z-異構(gòu)體)在1.75mg/kg/天最佳劑量時(shí)比環(huán)孢菌素A增加存活時(shí)間大約3倍。許多接受ISATX247的動物在移植后100天(停止給藥后70天)移植物仍能發(fā)揮機(jī)能。這些數(shù)據(jù)證明該異構(gòu)體類似物混合物在預(yù)防移植物排斥中具有免疫抑制活性。
表1 ISATX247和環(huán)孢菌素A腹膜內(nèi)給藥對移植的大鼠心臟平均存活時(shí)間的作用[2次分別研究的平均值，n 13]

a.c沒有顯著差異b有顯著差異(p＜0.01)對各種氘化和非氘化異構(gòu)體類似物混合物(結(jié)構(gòu)見圖12)在預(yù)防不同品系大鼠之間心臟移植排斥中的作用也作了評價(jià)，并與環(huán)孢菌素A比較。劑量是1.75mg/kg/天共30天。結(jié)果總結(jié)在表2中。這些結(jié)果顯示，劑量為1.75mg/kg/天的異構(gòu)體混合物增加存活時(shí)間至少和環(huán)孢菌素A一樣多，并證明這些異構(gòu)體類似物混合物在預(yù)防移植物排斥中具有免疫抑制活性。
表2各種異構(gòu)體類似物混合物和環(huán)孢菌素A以1.75mg/kg/天腹膜內(nèi)給藥對移植的大鼠心臟平均存活時(shí)間的作用

實(shí)施例15在胰島細(xì)胞同種異體移植中的免疫抑制活性研究了ISATX247(45-50％E-異構(gòu)體和50-55％Z-異構(gòu)體)與環(huán)孢菌素A在小鼠模型中延長移植的胰島細(xì)胞的存活的能力，將CBA/J小鼠的500個(gè)胰島移植給糖尿病Balb/c接受小鼠的腎囊中進(jìn)行研究。
移植后，ISATX247或環(huán)孢菌素A通過腹膜內(nèi)(ip)注射(劑量為0(載體)、1.75、10、20、或25mg/kg/天)給藥，共30天。每天監(jiān)測血糖，直到移植物衰竭時(shí)，以連續(xù)2天血糖水平大于17mmol/L定義。
結(jié)果表明，ISATX247以20mg/kg/天的劑量增加了移植物存活時(shí)間40％(表3)。還注意到，當(dāng)劑量增大時(shí)，ISATX247的毒性比環(huán)孢菌素A低。這在25mg/kg/天劑量水平時(shí)特別明顯。
表3在1.75、10、20、或25mg/kg/天劑量水平腹膜內(nèi)注射ISATX247或環(huán)孢菌素A時(shí)，小鼠胰島同種異體移植物在受體糖尿病小鼠中的存活


*在該組中10個(gè)動物有7個(gè)死于CsA的毒性。因此，僅有3個(gè)動物完成實(shí)驗(yàn)，沒有作統(tǒng)計(jì)。
實(shí)施例16在關(guān)節(jié)炎中的免疫抑制活性在過去30年中，有3種人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型已獲得深入研究并廣泛應(yīng)用于新的抗類風(fēng)濕藥物的臨床前篩選和開發(fā)。這些包括佐劑誘導(dǎo)的、膠原誘導(dǎo)的、和抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型。設(shè)計(jì)以下研究來評價(jià)ISATX247(45-50％E-異構(gòu)體和50-55％Z-異構(gòu)體)在小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型和兔抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中的抗炎效果。在這2種模型中觀察到的組織病理學(xué)和免疫病理學(xué)與在人類疾病中的發(fā)現(xiàn)相似。在這2種模型中，考察了ISATX247預(yù)防關(guān)節(jié)炎發(fā)作(預(yù)防方案)和治療關(guān)節(jié)炎(治療方案)的效果。這些研究支持了本發(fā)明所主張的異構(gòu)體類似物混合物的免疫抑制作用。
膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎將雄性DBA1 Lac J小鼠飼養(yǎng)在無病毒抗體的條件下，8-10周齡時(shí)用100微克小雞II型膠原(用Freund氏完全佐劑乳化)皮下免疫。將ISATX247、環(huán)孢菌素A或載體(Chremophor EL/乙醇72∶28，體積/體積)原藥用生理鹽水稀釋1-50倍(0.25、0.5、或1mg/mL)得到濃度為0(載體)；125、250、或500μg/每鼠(ISATX247)；和250或500μg/每鼠(環(huán)孢菌素A)，每天腹膜內(nèi)注射給藥。設(shè)計(jì)用于預(yù)防方案的動物(12只/組)從用膠原免疫的那天(第0天)開始給藥，直到第40天處死。設(shè)計(jì)為治療方案的動物(12只/組)從發(fā)病那天(～第28天)開始給藥，直到第38天處死。
評價(jià)參數(shù)包括死亡率、血清肌酸酐、組織學(xué)和結(jié)局評價(jià)，如臨床評分(目測)、后爪腫脹、組織學(xué)評分、糜爛評分、和免疫組織化學(xué)。糜爛評分以盲法檢查中趾近端趾節(jié)間(PIP)關(guān)節(jié)前后部位，查看有無糜爛(以在軟骨或骨中充滿炎性組織作為區(qū)別性缺陷來確定)。該方法能用于相同關(guān)節(jié)的比較。過去的研究證明未治療動物的該關(guān)節(jié)90％以上發(fā)生糜爛。
該結(jié)果表明，ISATX247高劑量治療組(500μg/每鼠)負(fù)糜爛評分顯著高于載體治療組的負(fù)糜爛評分(p＜0.05)。中劑量ISATX247(250μg/每鼠)和高劑量環(huán)孢菌素A(500μg/每鼠)治療組的負(fù)糜爛評分均比載體治療組高(p＜0.1)。而且，低劑量ISATX247(125μg/每鼠)和中劑量環(huán)孢菌素A對照(250μg/每鼠)治療組，當(dāng)與載體對照組比較時(shí)，雖然統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著，但也顯示更高的負(fù)糜爛評分。
顯著防止關(guān)節(jié)糜爛發(fā)生的唯一治療是ISATX247 500μg/每鼠。相對于載體對照組小鼠，ISATX247治療組小鼠顯示糜爛變化的PIP關(guān)節(jié)比例顯著減少，證明了ISATX247具有改善疾病的性能。
B.抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎將新西蘭白兔，飼養(yǎng)在無特定病原體的條件下，用10mg生理鹽水配的卵白蛋白(用Freund氏完全佐劑乳化)免疫，頸背部多點(diǎn)肌肉內(nèi)和皮下注射給藥。14天后，所有的動物開始接受每天2次關(guān)節(jié)內(nèi)注射5mg卵白蛋白和65ng人重組轉(zhuǎn)化生長因子2的生理鹽水溶液。
將ISATX247、環(huán)孢菌素A或載體(Chremophor EL/乙醇72∶28，體積/體積)原藥(在載體中)用生理鹽水稀釋1-4倍，得到濃度為0(載體)；2.5、5.0、或10mg/kg/天(ISATX247)；和5.0、10、或15mg/kg/天(環(huán)孢菌素A)，每天皮下注射給藥。設(shè)計(jì)用于預(yù)防方案的動物(8只/組)從用卵白蛋白免疫的那天(第0天)開始給藥，直到第42天處死。設(shè)計(jì)用于治療方案的動物(8只/組)從發(fā)病那天(～第28天)開始給藥，直到在第42天處死。
評價(jià)參數(shù)包括死亡率、體重、血清肌酸酐、組織學(xué)、和結(jié)局評價(jià)，如膝關(guān)節(jié)腫脹、滑液液體計(jì)數(shù)、總尸體解剖分析、和組織學(xué)。
與載體對照組動物比較，治療28天后(預(yù)防方案)，在ISATX247(P0.05)和環(huán)孢菌素A(P 0.05)組動物中觀察到滑液組織病理學(xué)評分顯著降低。這伴隨著滑液液體計(jì)數(shù)顯著降低(ISATX247，P 0.05；環(huán)孢菌素A，P0.05)。與載體對照組比較，ISATX247(P 0.05)和環(huán)孢菌素A(P 0.05)治療14天后，患關(guān)節(jié)炎動物的滑液組織病理學(xué)評分顯著減少(治療方案)。ISATX247(P＝0.01)組，宏觀關(guān)節(jié)炎評分顯著降低是明顯的，但環(huán)孢菌素A治療動物則不明顯。根據(jù)血清肌酸酐分析或尸體解剖組織學(xué)分析，治療耐受性良好，沒有顯著毒性。
數(shù)據(jù)顯示，家兔的抗體誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型中，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療和預(yù)防，ISATX247與環(huán)胞孢素A等價(jià)或可能更為強(qiáng)效。
實(shí)施例17；藥物動力學(xué)和毒物動力學(xué)性能在兔模型中測試了ISATX247(45-50％E-異構(gòu)體和50-55％Z-異構(gòu)體)和環(huán)孢菌素A的藥物動力學(xué)和毒物動力學(xué)參數(shù)。家兔也可用作研究環(huán)孢菌素A腎毒性的模型，但遠(yuǎn)不如大鼠常用。研究發(fā)現(xiàn)，給予家兔環(huán)孢菌素A可引起結(jié)構(gòu)和機(jī)能的改變，所用劑量不僅低于先前其它動物模型中已報(bào)道的劑量，而且也至少在人的治療范圍上限中(Thliveris et al.，1991，1994)。除了腎小管的細(xì)胞學(xué)改變外，間質(zhì)纖維化和動脈病理的發(fā)現(xiàn)也提示，家兔是研究腎毒性的更合適模型，因?yàn)檫@些結(jié)構(gòu)變化是在人類中觀察到的腎毒性的標(biāo)志。按照以下時(shí)間安排，在頭7天靜脈(i.v.)給予、然后23天皮下(s.c.)給予ISATX247。
表4家兔模型中ISATX247的藥物動力學(xué)和毒物動力學(xué)性能研究的劑量給藥時(shí)間安排

用無病原家兔(SPF)來確保觀察到的任何腎改變都是由于ISATX247的作用而非病原體的作用。在第一天和第7天，在給藥前和在給藥后0.5、1、2、4、8、12、18、和24小時(shí)收集血樣，制作藥物動力學(xué)曲線。其它評價(jià)參數(shù)包括臨床觀察、體重、飼料消耗、血液學(xué)、臨床化學(xué)、總病理學(xué)、和所選組織/器官的組織病理學(xué)考察檢查。
通過與質(zhì)譜聯(lián)用的高效液體層析(LCMS)分析血樣。表5總結(jié)了接受10mg/kg環(huán)孢菌素A或ISATX247家兔的平均藥物動力學(xué)參數(shù)。
表5雄兔靜脈給予環(huán)孢菌素A和ISATX247，劑量10mg/kg/天的藥物動力學(xué)參數(shù)結(jié)果表示為平均值±SD

在接受10mg/kg/天的環(huán)孢菌素A和ISATX247的雄兔藥物動力學(xué)參數(shù)之間沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。接受相同劑量的雌兔ISATX247藥物動力學(xué)參數(shù)與雄兔中觀察到的沒有顯著差異，例外是第7天為最大濃度。
接受載體對照、環(huán)孢菌素A或ISATX247家兔的血液學(xué)參數(shù)中沒有看到顯著改變。研究過程中在不同組中觀察到肌酸酐水平的差異，如下表6所示。這些差異表明，環(huán)孢菌素A與載體對照或ISATX247相比，對腎臟具有顯著更大的負(fù)面作用。應(yīng)注意，甚至在50％的較高劑量，即15mg/kg/天，與環(huán)孢菌素A 10mg/kg/天比較，ISATX247也沒有造成任何顯著的血清肌酸酐水平升高。
表6接受載體、環(huán)孢菌素A或ISATX247注射30天的雄性家兔血清肌酸酐水平相對于基線的變化百分?jǐn)?shù)

檢查所有接受載體對照、10mg/kg環(huán)孢菌素A、5mg/kg ISATX247或10mg/kg ISATX247兔的器官，沒有發(fā)現(xiàn)顯著的不正常。對腎臟而言尤其如此，腎臟中沒有發(fā)現(xiàn)通常在環(huán)孢菌素A處理的動物中常見的間質(zhì)纖維化(Thliveris，et al.，1991，1994)的證據(jù)。接受15mg/kg ISATX247的雄兔中，發(fā)現(xiàn)精子發(fā)生減少。15mg/kg ISATX247劑量研究的3只雌兔中沒有發(fā)現(xiàn)變化。
實(shí)施例18ISATX247的免疫抑制作用將獼猴(n＝4)的全血與ISATX247或環(huán)孢菌素A共溫育，并在培養(yǎng)介質(zhì)中用不同的有絲分裂及刺激。通過氚標(biāo)胸腺嘧啶摻入法和對SG2M、期細(xì)胞的增殖性細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)作流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，評價(jià)淋巴細(xì)胞增生。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)也用于評價(jià)T-細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子以及T淋巴細(xì)胞活化抗原的表達(dá)。EC50(達(dá)到最大效應(yīng)50％所需的藥物濃度)用WinNonlinTM軟件計(jì)算。結(jié)果顯示，淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生、和T細(xì)胞表面抗原的表達(dá)受ISATX247的抑制較受環(huán)孢菌素A的抑制更強(qiáng)，如下表7中EC50(以ng/mL表示)所示。
表7

因此，用體外全血試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，ISATX247對各種免疫功能的抑制比環(huán)孢菌素要強(qiáng)2.3-6倍。
實(shí)施例19；采用三丁基烯丙基膦鎓溴化物的Wittig反應(yīng)將叔丁醇鉀(0.31g，2.8mmol)溶于20mL四氫呋喃中。在約-40℃緩慢加入三丁基烯丙基膦鎓溴化物(0.99g，3.1mmol)的3mL四氫呋喃溶液。生成的黃色混合物在約-40℃攪拌10分鐘，然后緩慢加入乙酰基環(huán)孢菌素A醛(1.5g，1.2mmol)的6mL四氫呋喃溶液。攪拌黃橙色反應(yīng)混合物1.5小時(shí)后，反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到磷酸(1.2g，1.0mmol)水溶液中終止反應(yīng)。用100mL甲苯然后用50mL甲苯提取得到的水溶液。合并有機(jī)層用水洗滌，然后減壓濃縮至干。產(chǎn)物乙酰化的ISATX247為淡黃色固體(產(chǎn)率～90％)。異構(gòu)體比例約為87％E-異構(gòu)體和13％Z-異構(gòu)體(由1H NMR測定)。
實(shí)施例20采用三丁基烯丙基膦鎓溴化物和鋰堿的Wittig反應(yīng)將三丁基烯丙基膦鎓溴化物(1.38g，4.3mmol)溶于20mL甲苯和3mL四氫呋喃的混合物中。在約-78℃，緩慢加入丁基鋰(1.6M溶于己烷中，2,43mL，3.9mmol)。形成的黃色混合物在約-78℃攪拌10分鐘，然后緩慢加入乙?；h(huán)孢菌素A醛(1.5g，1.2mmol)的6mL甲苯溶液。攪拌黃橙色反應(yīng)混合物3.5小時(shí)后，反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到50mL甲苯和磷酸(0.25g，2.2mmol)水溶液中終止反應(yīng)。得到的兩相混合物升溫至室溫，然后分離兩相層。甲苯層用20mL水洗滌，然后減壓濃縮至干。產(chǎn)物乙?；腎SATX247為淡黃色固體(產(chǎn)率～80％)。異構(gòu)體比例約為70％E-異構(gòu)體和30％Z-異構(gòu)體(由1H NMR測定)。
實(shí)施例21采用三丁基烯丙基膦鎓溴化物和鋰堿的Wittig反應(yīng)如上述進(jìn)行SAP018，但在約-40℃進(jìn)行。重復(fù)實(shí)施例20的實(shí)驗(yàn)條件，這次采用約-40℃的反應(yīng)溫度。在這些條件下分離到的產(chǎn)物乙?；腎SATX247的異構(gòu)體比例約為74％E-異構(gòu)體和26％Z-異構(gòu)體(由1H NMR測定)。
實(shí)施例22；采用三丁基烯丙基膦鎓溴化物的Wittig反應(yīng)將乙?；h(huán)孢菌素A醛(1.5g，1.2mmol)和三丁基烯丙基膦鎓溴化物(0.99g，3.1mmol)的15mL四氫呋喃溶液冷卻到約-80℃。緩慢加入叔丁醇鉀(0.19g，1.7mmol)溶解在9mL四氫呋喃中的溶液。在約-80℃攪拌產(chǎn)生的黃色反應(yīng)混合物1小時(shí)完成反應(yīng)，然后緩慢加入6mL四氫呋喃溶液。攪拌黃橙色反應(yīng)混合物1.5小時(shí)至反應(yīng)完全。加入磷酸(0.15g，1.3mmol)水溶液以中終止反應(yīng)。濃縮所得混合物，殘留物用5mL甲醇溶解。將混合物緩慢加入5mL水中。過濾產(chǎn)生的沉淀物，用4mL甲醇/水(1∶1)洗滌，真空干燥。產(chǎn)物乙?；腎SATX247為無色固體(產(chǎn)率～90％)。異構(gòu)體比例約為91％E-異構(gòu)體和9％Z-異構(gòu)體(由1H NMR測定)。
實(shí)施例23乙?；鵆sA的臭氧解將乙?；鵆sA(15g，12.1mmol)的200mL甲醇溶液約-78℃在1.1巴用Sander臭氧發(fā)生器臭氧化，流速為300L O2/小時(shí)，直到反應(yīng)完全(約5分鐘)。溶液用氬氣通氣，用溶于甲醇的二甲基硫醚終止反應(yīng)。為了使還原完全，室溫?cái)嚢杌旌衔镞^夜。濃縮到約50mL后，將溶液緩慢加入500mL水中。過濾產(chǎn)生的沉淀，用60mL水洗滌，真空干燥。獲得的產(chǎn)物乙酰CsA醛為無色固體，產(chǎn)率約95％，純度約98％(由HPLC測定)。
實(shí)施例24三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A的制備將環(huán)孢菌素A(40g，1當(dāng)量)在30℃溶于二氯甲烷(100mL)中。加入N，N-二(三甲基甲硅烷基)脲(1.1當(dāng)量)。30℃攪拌5分鐘后，加入對甲苯磺酸(0.02當(dāng)量)。加熱回流反應(yīng)混合物，直到反應(yīng)完全，用薄層層析(TLC)、高壓或高效液體層析(HPLC)或質(zhì)譜(MS)檢測，然后冷卻到室溫。加入碳酸氫鈉半飽和溶液(100mL)。分離水相，用二氯甲烷再提取。合并的有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾。減壓蒸發(fā)掉溶劑，得到三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A粗產(chǎn)物。
實(shí)施例25三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A醛的制備將三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A(5g，1當(dāng)量)溶于二氯甲烷(50mL)中。溶液冷卻到-78℃，然后將臭氧鼓泡通入溶液，直到出現(xiàn)藍(lán)色。然后，為了除去過量的臭氧，將氬氣鼓泡通入溶液，直到得到無色溶液；進(jìn)行這一步驟是為了除去過量的臭氧。加入三乙胺(5當(dāng)量)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物17小時(shí)。在用水處理后，得到三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A醛。
實(shí)施例26通過Wittig反應(yīng)制備三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A二烯的Z∶E雙鍵異構(gòu)體＝3∶1的混合物向已經(jīng)先攪拌60分鐘的叔丁醇鉀(3當(dāng)量)和烯丙基三苯基膦鎓溴化物(2當(dāng)量)的甲苯(10mL)混合液加入三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A醛(1g，1當(dāng)量)。室溫反應(yīng)1小時(shí)后，反應(yīng)物后處理得到三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A二烯的Z和E雙鍵異構(gòu)體3∶1混合物(由NMR測定)。
實(shí)施例27通過Wittig反應(yīng)制備三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A二烯的Z∶E雙鍵異構(gòu)體＝1∶1的混合物將三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A醛(2.5g)溶于25mL甲苯中，用1N氫氧化鈉水溶(10當(dāng)量)液處理。劇烈攪拌反應(yīng)混合物，加入烯丙基三苯基膦鎓溴化物(7.5當(dāng)量，滴加)。室溫?cái)?shù)小時(shí)后，反應(yīng)混合物后處理得到三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A二烯的Z和E雙鍵異構(gòu)體約1∶1混合物(由NMR測定)。
實(shí)施例28通過Wittig反應(yīng)制備三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A二烯的Z∶E＝1∶2雙鍵異構(gòu)體混合物將三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A醛(1g)，與碳酸鉀(1.5當(dāng)量)和烯丙基三苯基膦鎓溴化物(1.5當(dāng)量)一起溶于5mL甲苯中。反應(yīng)混合物劇烈攪拌回流4小時(shí)，后處理得到三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A二烯的Z和E雙鍵異構(gòu)體約1∶2混合物(由NMR測定)。
實(shí)施例29通過Wittig反應(yīng)制備三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A二烯的Z∶；E＝1∶3雙鍵異構(gòu)體混合物將烯丙基三苯基膦鎓溴化物(3當(dāng)量，從烯丙基溴和三丁基膦制備)溶于THF(3.5mL)中。加入甲苯(7.5mL)，接著加入叔丁醇鈉(4當(dāng)量)。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，溶液冷卻到約-30℃。滴加入三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A醛(1g，1當(dāng)量)的5mL甲苯溶液。約-30℃攪拌45分鐘，處理反應(yīng)混合物后得到約1∶3三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A二烯的Z和E雙鍵異構(gòu)體混合物(由NMR測定)。
下面的2個(gè)實(shí)施例(實(shí)施例30和31)涉及烯丙基金屬化。
實(shí)施例30乙?；Ｗo(hù)的環(huán)孢菌素A β-三甲基甲硅烷基醇的制備室溫向烯丙基三甲基硅烷(10.1當(dāng)量)的THF(15mL)溶液加入丁基鋰(1.6M溶于己烷中，10當(dāng)量)。反應(yīng)30分鐘后，溶液冷卻到-75℃，用二乙基-B-甲氧基硼烷(10.1當(dāng)量)處理。1小時(shí)后，加入三氟化硼二乙醚復(fù)合物(10.1當(dāng)量)，生成B-(γ-三甲基甲硅烷基-烯丙基)-二乙基硼烷試劑。1小時(shí)后，滴加乙?；Ｗo(hù)的環(huán)孢菌素A醛(5克，1當(dāng)量)的THF(15mL)溶液。20分鐘后，反應(yīng)混合物升溫至-10℃，加入飽和NH4Cl水溶液。室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入45mL水，反應(yīng)混合物用25mL乙酸乙酯提取3次。有機(jī)層依次用水(25mL)、飽和NH4Cl水溶液(25mL)洗滌。合并的有機(jī)層用Na2SO4干燥，過濾，減壓濃縮。粗產(chǎn)物層析(硅膠，二氯甲烷/甲醇或乙酸乙酯/庚烷)，得到乙?；Ｗo(hù)的環(huán)孢菌素A β-三甲基甲硅烷基醇。
實(shí)施例31三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A β-三甲基甲硅烷基醇的制備室溫向烯丙基三甲基硅烷(10.1當(dāng)量)的THF(15mL)溶液加入丁基鋰(1.6M溶于己烷中，10當(dāng)量)。反應(yīng)30分鐘后，溶液冷卻到-65℃，用二乙基-B-甲氧基硼烷(10.1當(dāng)量)處理。1小時(shí)后，加入三氟化硼二乙醚復(fù)合物(10.1當(dāng)量)，生成B-(γ-三甲基甲硅烷基-烯丙基)-二乙基硼烷試劑。1小時(shí)后，滴加三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A醛(5克，1當(dāng)量)的THF(15mL)溶液。15分鐘后，反應(yīng)混合物升溫至10℃，加入飽和NH4Cl水溶液。室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入12.5mL水和25mL飽和NaHCO3水溶液，反應(yīng)混合物用25mL甲基叔丁基醚提取3次。有機(jī)層依次用水(2×25mL)、飽和NaCl水溶液(25mL)洗滌二次。合并的有機(jī)層用Na2SO4干燥，過濾，減壓濃縮。粗產(chǎn)物層析(硅膠，乙酸乙酯/庚烷)，得到三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A β-三甲基甲硅烷基醇。
以下的3個(gè)實(shí)施例(實(shí)施例32、33、和34)涉及Peterson消除反應(yīng)。
實(shí)施例32E-乙?；Ｗo(hù)的環(huán)孢菌素A二烯的制備將乙酰基保護(hù)的環(huán)孢菌素A β-三甲基甲硅烷基醇(100mg，1當(dāng)量)溶于THF(1mL)中。加入濃硫酸(10微升)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物過夜。加入水(10mL)，反應(yīng)混合物用二氯甲烷(10mL)提取。水相用二氯甲烷(10mL)再提取。合并的有機(jī)相用硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，得到粗制乙酰基保護(hù)的環(huán)孢菌素A二烯(乙?；Ｗo(hù)的ISATX247)。粗產(chǎn)物用甲基叔丁基醚/THF結(jié)晶，用甲基叔丁基醚/DCM重結(jié)晶，得到乙?；Ｗo(hù)的環(huán)孢菌素A二烯(乙?；Ｗo(hù)的ISATX247)，為99-97％∶1-3％的E和Z雙鍵異構(gòu)體混合物(由400MHz NMR測定，2％測量誤差)。
E-乙?；Ｗo(hù)的環(huán)孢菌素A二烯的水解如下進(jìn)行將乙?；h(huán)孢菌素A二烯(4g，1當(dāng)量)溶于甲醇(80mL)和水(32mL)中。加入碳酸鉀(3.65g，8.3當(dāng)量)。室溫?cái)嚢?5小時(shí)后，反應(yīng)混合物加熱到40℃ 4小時(shí)。減壓濃縮反應(yīng)混合物，殘留物溶解在乙酸乙酯(70mL)中。緩慢加入15％檸檬酸水溶液(30mL)，接著加入水(10mL)。分離水層，用乙酸乙酯(56mL)再提取。有機(jī)層用水(30mL)、15％檸檬酸溶液(40mL)和飽和NaCl溶液(30mL)洗滌。合并有機(jī)層，用Na2SO4干燥，減壓濃縮，得到環(huán)孢菌素A二烯(ISATX247)。
實(shí)施例33Z-三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A二烯的制備及其轉(zhuǎn)變?yōu)閆-環(huán)孢菌素A二烯(ISATX247)將三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A β-三甲基甲硅烷基醇(2g，1當(dāng)量)溶于THF(20mL)中。溶液冷卻到0-2℃，加入叔丁醇鉀(4當(dāng)量)。反應(yīng)1.5小時(shí)后，加入乙酸乙酯(20mL)和水(40mL)。分離水層，用乙酸乙酯(20mL)再提取。有機(jī)層用飽和氯化鈉水溶液(20mL)洗滌。合并的有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，得到Z-三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A二烯(三甲基甲硅烷基保護(hù)的ISATX247)和Z-環(huán)孢菌素A二烯(ISATX247的Z-異構(gòu)體)的混合物。通過將粗產(chǎn)物混合物溶解在甲醇中(10重量％溶液)，加入1M鹽酸水溶液(1當(dāng)量)完成脫甲硅基。室溫15分鐘后，加入水和乙酸乙酯。分離水層，用乙酸乙酯再提取。有機(jī)層用飽和氯化鈉水溶液洗滌，合并的有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，得到環(huán)孢菌素A二烯(ISATX247)94∶6的Z和E雙鍵異構(gòu)體混合物(由NMR測定)。
實(shí)施例34E-環(huán)孢菌素A二烯(ISATX247)的制備將三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A β-三甲基甲硅烷基醇(500mg，1當(dāng)量)溶于二氯甲烷中。溶液冷卻到0-2℃，用三氟化硼二乙醚復(fù)合物(5當(dāng)量)處理。1小時(shí)后，加入水(20mL)和二氯甲烷(20mL)。分離有機(jī)層，用水(20mL)洗滌。用硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，直接得到環(huán)孢菌素A二烯(ISATX247)91∶9的E和Z雙鍵異構(gòu)體混合物(由NMR測定)。
實(shí)施例35三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A二烯的脫保護(hù)將三甲基甲硅烷基保護(hù)的環(huán)孢菌素A二烯溶于甲醇(10重量％溶液)中。該溶液用1M鹽酸水溶液(1當(dāng)量)處理。室溫15分鐘后，加入水和乙酸乙酯。分離水層，用乙酸乙酯再提取。有機(jī)層用飽和氯化鈉水溶液洗滌。合并的有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，得到環(huán)孢菌素A二烯(ISATX247)。
實(shí)施例36乙?；h(huán)孢菌素A的環(huán)氧化將乙?；h(huán)孢菌素(2.0g，1.61mmol)溶于乙腈(30mL)中，加入1，3-二乙酸基丙酮(0.14g，0.8mmol)，接著加入0.0004M乙二胺四乙酸二鈉鹽水溶液(20mL)和碳酸氫鈉(0.405g，4.82mmol)。向攪拌的混合物中，在2小時(shí)內(nèi)分批加入oxone過硫酸氫鉀(43.8％KHSO5)(2.23g，6.43mmol)。通過用pH stat恒定加入1N NaOH(總共6.4mL)保持pH于8.2。通過偶然用冷水浴冷卻，使溫度保持在22-25℃。2.5小時(shí)后，加入幾滴亞硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。加入水(100mL)，混合物用叔丁基甲基醚(100mL，然后75mL)提取2次。有機(jī)層后用稀的氯化鈉水溶液(100mL)洗滌，合并，用硫酸鈉干燥，濃縮，得到粗制乙酰基環(huán)孢菌素環(huán)氧化物(1.92g，95％；HPLC99.4％面積)白色固體泡沫狀物。
實(shí)施例37乙?；h(huán)孢菌素A醛的制備將粗制乙?；h(huán)孢菌素環(huán)氧化物(1.92g，1.52mmol)溶于乙腈(25mL)中。加入水(20mL)，接著加入過碘酸鈉(489mg，2.28mmol)和0.5M硫酸(3.05mmL，1.52mmol)。40℃攪拌反應(yīng)混合物18小時(shí)，然后加入亞硫酸鈉破壞過量的過碘酸鈉。加入稀氯化鈉水溶液(100mL)并用叔丁基甲基醚(每次100mL)提取2次。用稀氯化鈉水溶液(100mL)洗滌有機(jī)抽提物，合并，用硫酸鈉干燥，濃縮，得到粗制乙酰基環(huán)孢菌素A醛(1.74g，92％；HPLC95.7％面積)，為白色泡沫狀物。粗產(chǎn)物上硅膠層析，用40％丙酮/60％己烷為洗脫液，得到產(chǎn)物(1.41g，71％以乙?；h(huán)孢菌素環(huán)A計(jì)；HPLC100％面積)，為白色泡沫固體。
實(shí)施例38用一鍋法制備乙酰基環(huán)孢菌素A醛將乙?；h(huán)孢菌素A(2.0g，1.61mmol)溶于乙腈(30mL)中，加入1，3-二乙酸基丙酮(0.084g，0.48mmol)，接著加入0.0004M乙二胺四乙酸二鈉鹽水溶液(20mL)和碳酸氫鈉(0.405g，4.82mmol)。向攪拌的混合物中在2小時(shí)內(nèi)分批加入oxone(43.8％KHSO5)(1.67g，4.82mmol)。通過用pH stat恒定加入1N NaOH(總共3.4mL)保持pH于8.2。使溫度保持在22-25℃。3.5小時(shí)后，向反應(yīng)混合物加入0.5M硫酸(5mL，2.5mmol)，接著加入幾滴濃硫酸。使pH達(dá)到1.3。然后加入過碘酸鈉(516mg，2.41mmol)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物2小時(shí)，40℃攪拌22小時(shí)。加入水(100mL)，混合物用叔丁基甲基醚(100mL，然后75mL)提取2次。有機(jī)層用稀的氯化鈉水溶液(100mL)洗滌，合并，用硫酸鈉干燥，濃縮，得到粗制乙?；h(huán)孢菌素A醛(1.9g，96％；HPLC83.4％面積)白色固體泡沫狀物。粗產(chǎn)物上硅膠層析，用40％丙酮/60％己烷為洗脫液，得到產(chǎn)物(1.35g，68％以乙?；h(huán)孢菌素A計(jì)；HPLC100％面積)，為白色泡沫固體。
實(shí)施例39(ISO)乙?；h(huán)孢菌素A醛與3-二甲基氨基丙基三苯基膦酰烯(phosphorylidene)的Wittig反應(yīng)使六甲基二硅烷氮化鉀和3-(二甲基氨基)丙基三苯基膦鎓溴化物反應(yīng)產(chǎn)生的不含鹽的內(nèi)鎓2與乙?；h(huán)孢菌素A醛1反應(yīng)(E.J.Corey和M.Cdesai在Tetrahedron Letters，Vol.26，No.47，pp.5747-8，(1985))。順式化合物3的選擇性N-氧化可用間氯過苯甲酸在0℃進(jìn)行。在高溫真空條件下進(jìn)行N-氧化物的Cope消除反應(yīng)，得到乙?；?(Z)-異構(gòu)體。如上所述進(jìn)行脫保護(hù)，得到ISATX247的Z-異構(gòu)體。該化合物的1H NMR(500MHz)譜線在δ6.58顯示二個(gè)三重峰(J＝16.99和10.5Hz)(這是ISATX247Z/E混合物中Z-異構(gòu)體的特征)證實(shí)了Z-幾何構(gòu)型。該異構(gòu)體純度≥99％。因?yàn)闆]有檢測出作為ISATX247Z/E混合物中E-異構(gòu)體的特征性δ6.28的二個(gè)三重峰(J＝17.5和10.0Hz)。
向3-(二甲基氨基)丙基三苯基膦鎓溴化物(2.5g，5.83mmol)的無水甲苯(20mL)懸浮液攪拌下用注射器加入六甲基二硅氮化鉀(11.6mL，5.8mmol，0.5M甲苯溶液)。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，離心紅色溶液，通過插管將上清液轉(zhuǎn)移到燒瓶中。向固體加入無水甲苯(10mL)，攪拌并離心。上清液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)燒瓶中，向合并的紅色溶液加入OAc-CsA-CHO(1.44g，1.17mmol)。室溫繼續(xù)攪拌2小時(shí)，顏色轉(zhuǎn)變成淡黃色。用乙酸乙酯(50mL)稀釋反應(yīng)混合物，依次用飽和碳酸氫鈉溶液(50mL)和鹽水(50mL)洗滌。干燥，蒸發(fā)掉溶劑，得到淡黃色固體。硅膠柱層析，用丙酮-己烷混合物洗脫(梯度10-75％丙酮和90-25己烷)，除去所有與磷有關(guān)的雜質(zhì)。再用丙酮洗脫，得到所需無色固體產(chǎn)物(1.28g，84％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)2.23(s，6H)，2.03(s，3H).13C NMR(300MHz，CDCl3)129.33，126.95；MS m/z1301(M+)，1324(M++Na+)。
轉(zhuǎn)變?yōu)镹-氧化物將Wittig反應(yīng)中得到的二甲基氨基化合物(0.44g，0.34mmol)的氯仿(3mL)溶液攪拌并冷卻(0℃)，加入m-CPBA(0.07g，0.405mmol)的氯仿(2mL)溶液。攪拌30分鐘后，加入二甲基硫醚(0.5mL)，然后加入二氯甲烷(50mL)。用碳酸氫鈉溶液(25mL)和水(25mL)洗滌，干燥，蒸發(fā)溶劑，得到固體(0.43g)。1H NMR(300MHz，CDCl3)3.19(s，3H)，3.18(s，3H)，2.03(s，3H).13C NMR(300MHz，CDCl3)131.89，124.13；MS m/z1340(M+)。
N-氧化物的Cope消除。乙酰ISATX247的Z-異構(gòu)體的制備N-氧化物(350mg)不加溶劑攪拌并在100℃真空加熱2小時(shí)。然后通過硅膠柱。用丙酮-己烷混合物洗脫(梯度5-25％丙酮，95-75％己烷)，得到無色固體(314mg)。1H NMR(500MHz，CDCl3)6.49(dt，J＝16.99，10.5Hz，1H).13C NMR(400MHz，CDCl3)132.20，131.09，129.70，116.85；MS m/z1279(M+Na+)。
ISATX247的Z-異構(gòu)體向(Z)-乙酰ISATX247(50mg)的MeOH(4mL)溶液加入水(1.5mL)和K2CO3(60mg)，室溫?cái)嚢?8小時(shí)。蒸發(fā)溶劑，用乙酸乙酯(20mL)提取。有機(jī)層用水(10mL)和鹽水(10mL)洗滌。干燥，除去溶劑，得到無色固體。1H NMR(500MHz，CDCl3)6.58(dt，J＝16.99，10.5Hz，1H).MS m/z1236。8(M+Na+)。得到的化合物是ISATX247的Z-異構(gòu)體。用NMR未觀察到E-異構(gòu)體。
雖然本發(fā)明只特別公開和敘述了優(yōu)選的實(shí)施方案，但應(yīng)知道，按照上述內(nèi)容，并在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，可對本發(fā)明作出許多修改和變化而不背離本發(fā)明的思路和包括的范圍。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其特征在于，該組合物含有用1，3-二烯取代基修飾1-氨基酸殘基的環(huán)孢菌素類似物的異構(gòu)體混合物，所述二烯取代基的異構(gòu)體混合物的范圍是約10-90％的E-異構(gòu)體和約90-10％的Z-異構(gòu)體。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，非氘化異構(gòu)體是結(jié)構(gòu)如下的E-和Z-異構(gòu)體 E-異構(gòu)體 Z-異構(gòu)體
3.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于，該異構(gòu)體混合物含有約15-85％的E-異構(gòu)體和約85-15％的Z-異構(gòu)體。
4.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于，該異構(gòu)體混合物含有約25-75％的E-異構(gòu)體和約75-25％的Z-異構(gòu)體。
5.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于，該異構(gòu)體混合物含有約35-65％的E-異構(gòu)體和約65-35％的Z-異構(gòu)體。
6.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于，該異構(gòu)體混合物含有約45-55％的E-異構(gòu)體和約55-45％的Z-異構(gòu)體。
7.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于，該異構(gòu)體混合物含有約45-50％的E-異構(gòu)體和約55-50％的Z-異構(gòu)體。
8.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于，該異構(gòu)體混合物含有約50-55％的E-異構(gòu)體和約45-50％的Z-異構(gòu)體。
9.如權(quán)利要求1或2的所述組合物，其特征在于，該異構(gòu)體混合物含有約55-65％的E-異構(gòu)體和約35-45％的Z-異構(gòu)體。
10.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于，該異構(gòu)體混合物含有約65-75％的E-異構(gòu)體和約25-35％的Z-異構(gòu)體。
11.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于，該異構(gòu)體混合物含有約75-85％的E-異構(gòu)體和約15-25％的Z-異構(gòu)體。
12.如權(quán)利要求1或2的組合物，其特征在于，該異構(gòu)體混合物含有約85-90％的E-異構(gòu)體和約10-15％的Z-異構(gòu)體。
13.一種藥物組合物，其特征在于，此組合物含有如權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
14.如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其特征在于，含有一種液體溶液，所述溶液含有表面活性劑、乙醇、親脂和/或兩性溶劑。
15.如權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其特征在于，含有d-α-生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯(維生素E TPGS)、中鏈三甘油酯油(MCT)、Tween 40、和乙醇。
16.如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其特征在于，含有一種明膠膠囊，此膠囊含有所述的類似物異構(gòu)體混合物、和一種液體溶液，該液體溶液含有表面活性劑、乙醇、親脂和/或兩性的溶劑。
17.如權(quán)利要求15或16所述的藥物組合物，其特征在于，它是單位劑量形式。。
18.如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其特征在于，它含有約5毫克-500毫克之間的活性成分。
19.如權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其特征在于，它含有約50毫克的異構(gòu)體混合物。
20.如權(quán)利要求14或15所述的藥物組合物，其特征在于，所述溶液含有50毫克/毫升的異構(gòu)體混合物。
21.如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其特征在于，它適合口服給藥。
22.一種產(chǎn)生免疫抑制的方法，其特征在于，此方法包括給予需要的動物有效量的權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物，或權(quán)利要求13-21任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述的動物是人。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.05毫克-50毫克/千克體重/天。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.1毫克-10毫克/千克體重/天。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.5毫克-10毫克/千克體重/天。
27.如權(quán)利要求26的方法，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約2毫克-6毫克/千克體重/天，口服，b.i.d.。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.5毫克一3毫克/千克體重/天，口服，b.i.d.。
29.一種疫抑制性環(huán)孢菌素類似物毒性的方法，其特征在于，該方法通過制備所述類似物的異構(gòu)體混合物用作免疫抑制劑。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述的異構(gòu)體混合物含有權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的組合物。
31.如權(quán)利要求29或30所述的方法，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.05毫克-50毫克/千克體重/天。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.1毫克-10毫克/千克體重/天。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.5毫克-10毫克/千克體重/天。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約2毫克-6毫克/千克體重/天，口服，b.i.d.。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.5毫克-3毫克/千克體重/天，口服，b.i.d.。
36.一種疫抑制性環(huán)孢菌素類似物藥效的方法，其特征在于，該方法通過制備所述類似物的異構(gòu)體混合物用作免疫抑制劑。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述的異構(gòu)體混合物含有權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的組合物。
38.如權(quán)利要求36或37所述的方法，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.05毫克-50毫克/千克體重/天。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.1毫克-10毫克/千克體重/天。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.5毫克-10毫克/千克體重/天。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約2毫克-6毫克/千克體重/天，口服，b.i.d.。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.5毫克-3毫克/千克體重/天，口服，b.i.d.。
43.如權(quán)利要求22-42任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的免疫抑制或免疫抑制劑用于治療或減輕急性器官或組織移植排斥。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述的移植排斥選自心、肺、心-肺聯(lián)合、肝、腎、胰、皮膚、腸、和角膜移植的排斥。
45.如權(quán)利要求22-42任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的免疫抑制或免疫抑制劑用于治療或減輕T-細(xì)胞介導(dǎo)的排斥。
46.如權(quán)利要求22-42任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的免疫抑制或免疫抑制劑用于治療或減輕移植物抗宿主疾病。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述的疾病發(fā)生在骨髓移植后。
48.如權(quán)利要求22-42任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的免疫抑制或免疫抑制劑用于治療或減輕移植器官或組織的排斥。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述的慢性排斥是移植物血管疾病所致。
50.如權(quán)利要求22-42任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的免疫抑制或免疫抑制劑用于治療或減輕異種移植物排斥。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述的異種移植物排斥選自急性、亞急性、和慢性器官排斥，該排斥發(fā)生于器官供體與受體屬于不同種動物時(shí)。
52.如權(quán)利要求51的方法，其特征在于，所述的異種移植排斥是B-細(xì)胞介導(dǎo)的排斥或抗體-介導(dǎo)的排斥。
53.如權(quán)利要求22-42任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的免疫抑制或免疫抑制劑用于治療或減輕自身免疫疾病或病癥或炎性疾病或病癥。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述的疾病或病癥選自關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎變形和其它風(fēng)濕性疾病。
55.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述的所述的疾病或病癥選自血液疾病(溶血性貧血、再生障礙性貧血、純紅細(xì)胞貧血和自發(fā)性血小板減少)、全身性紅斑狼瘡、多發(fā)性軟骨炎，硬皮病，Wengener肉芽腫病，皮肌炎，慢性活動性肝炎、重癥肌無力，牛皮癬、Steven-Johnson綜合征、自發(fā)性口炎性腹瀉，(自身免疫)炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn氏病、內(nèi)分泌性眼病、Graves氏病、肉瘤樣病，多發(fā)性硬化病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、少年糖尿病(I型糖尿病)、眼色素層炎(前和后)、干性角膜結(jié)膜炎和春季角膜結(jié)膜炎，間質(zhì)肺纖維化、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、腎小球性腎炎、自發(fā)性腎病綜合征、最小改變性腎病和青春性皮肌炎。
56.如權(quán)利要求53的所述方法，其特征在于，所述的疾病或病癥選自牛皮癬、接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎、簇狀脫發(fā)、多形態(tài)紅斑、皰疹樣皮炎、硬皮病、白斑、過敏性血管炎、蕁麻疹、大皰天皰瘡、紅斑狼瘡、天皰瘡、獲得性大皰性表皮松解、和其它炎性或過敏性皮膚疾病，如肺和氣道炎性疾病，包括哮喘、過敏癥和塵肺病。
57.如權(quán)利要求1-12所述的組合物，其特征在于，是作為治療用的組合物。
58.如權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的組合物的用途，其特征在于，該用途用于制備提供免疫抑制的藥物，來預(yù)防同種移植物或異種移植物排斥，優(yōu)選預(yù)防腎、心、肝的排斥，或預(yù)防或治療自身免疫病癥，特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或牛皮癬。
59.如權(quán)利要求22--42任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的免疫抑制或免疫抑制劑用于預(yù)防急性器官或組織移植物排斥。
60.如權(quán)利要求22-42任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的免疫抑制或免疫抑制劑用于預(yù)防自身免疫疾病或病癥，或炎性疾病或病癥。
61.如權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物或如權(quán)利要求13-21任一項(xiàng)所述的藥物組合物的用途是制造給予動物時(shí)能產(chǎn)生免疫抑制的藥物。
62.如權(quán)利要求61所述的用途，其特征在于，所述的動物是人。
63.如權(quán)利要求61所述的用途，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.05毫克-50毫克/千克體重/天。
64.如權(quán)利要求63所述的用途，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.1毫克-10毫克/千克體重/天。
65.如權(quán)利要求64所述的用途，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.5毫克-10毫克/千克體重/天。
66.如權(quán)利要求65所述的用途，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約2毫克-6毫克/千克體重/天，口服，b.i.d.。
67.如權(quán)利要求66所述的用途，其特征在于，所給予的環(huán)孢菌素類似物異構(gòu)體混合物的量是約0.5毫克-3毫克/千克體重/天，口服，b.i.d.。
全文摘要
本發(fā)明涉及環(huán)孢菌素類似物的異構(gòu)體混合物，該類似物在結(jié)構(gòu)上與環(huán)孢菌素A相似。該混合物與各異構(gòu)體、天然存在的環(huán)孢菌素和其它現(xiàn)有的環(huán)孢菌素和環(huán)孢菌素衍生物相比，具有增強(qiáng)的功效和降低的毒性。本發(fā)明實(shí)施方案涉及稱為ISATX247的環(huán)孢菌素A類似物的順式和反式異構(gòu)體及其衍生物。ISATX247異構(gòu)體的混合物與天然存在的環(huán)孢菌素和其它現(xiàn)有的各種環(huán)孢菌素相比，具有增強(qiáng)的功效和降低的毒性的組合。ISATX247異構(gòu)體及其烷基化、芳基化、和氘化衍生物可通過立體選擇性路線合成，其中具體的反應(yīng)條件決定了立體選擇性的程度。立體選擇性路線可利用Wittig反應(yīng)，或含無機(jī)元素(如硼、硅、鈦、和鋰)的有機(jī)金屬試劑。混合物中各異構(gòu)體的比例范圍是(E)－異構(gòu)體(Z)－異構(gòu)體＝10－90重量％90－10重量％，以混合物的總重量為基礎(chǔ)計(jì)算。
文檔編號A61P17/00GK1571794SQ02820798
公開日2005年1月26日 申請日期2002年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月19日
發(fā)明者S·奈克, R·W·亞茨科夫, R·T·福斯特 申請人:伊索泰克尼卡股份有限公司