專利名稱：鉤蟲疫苗的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明大體上涉及鉤蟲的疫苗。尤其是，本發(fā)明提供了基于寄生蟲來源的抗原的疫苗。
背景技術(shù)：
鉤蟲感染是世界范圍內(nèi)發(fā)展中國家的一個重要的公共衛(wèi)生問題，其引起腸炎，腸道內(nèi)失血，貧血，發(fā)育遲緩以及營養(yǎng)不良。據(jù)估計世界范圍內(nèi)具有多于十億的人類鉤蟲感染病例，單單在中國就有一億九千四百萬的病例(Hotez等人，1997年)。在中國的某些地區(qū)，諸如在南海的海南省，多于60％的人群攜帶鉤蟲(Gandhi等人，2001年)。
大多數(shù)由鉤蟲引起的病理學癥狀產(chǎn)生于人類腸道內(nèi)成熟階段的寄生蟲。成熟鉤口線蟲屬(Ancylostoma)鉤蟲對脊椎動物小腸的粘膜和粘膜下層的吸附是所有寄生蟲學中一種最詳細定義寄主-寄生蟲之間關(guān)系的例子。在寄生蟲的口鞘中包括幾個立方毫米的寄主粘膜和粘膜下層組織，可以在驗尸或者尸體檢查的過程中真正觸及寄主-寄生蟲的關(guān)聯(lián)(Kalkofen，1970年；Kalkofen，1974年)。
犬鉤口線蟲(Ancylostoma caninum)是包括北美亞熱帶地區(qū)的世界各地的犬類發(fā)病和死亡的主要原因。引起嚴重貧血甚至死亡的與鉤蟲相關(guān)的缺血可以發(fā)生在狗單次最初感染后2和3周之間(Soulsby，1982年；Jones和Hotez，2002年)。值得注意的是，犬鉤口線蟲(A.canium)最近已被鑒定為一種重要的人類病原體。感染有成熟犬鉤口線蟲寄生蟲的人畜共患病可以引起嗜酸性腸炎綜合征，即一種腸道響應于寄生蟲攻擊的炎癥狀態(tài)(Prociv和Croese，1990年)。犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)感染的發(fā)病機理與腸道內(nèi)缺血相關(guān)，所述缺血可以發(fā)生在成熟寄生蟲在哺乳動物小腸中吸附和攝取食物的階段(Kalkofen，1970年；Kalkofen，1974年)。
目前對鉤蟲蔓延的治療和控制的努力集中在用驅(qū)蟲藥從病人體內(nèi)周期性去除成熟鉤蟲。這種方法具有幾種局限性，包括治療后的快速重復感染，需要多次就診，以及在多年大量使用驅(qū)蟲藥治療后最終發(fā)展出鉤蟲的抗驅(qū)蟲藥株(Savioli等人，1997年；Geerts和Gryseels，2000年)。因此，如果具有治療和預防哺乳動物鉤蟲感染的可用的其它方法將是十分有益的。例如，如果具有治療或預防鉤蟲感染的有用疫苗將是非常有益的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了引發(fā)針對鉤蟲的免疫應答的制劑。所述制劑含有多種鉤蟲抗原，這些抗原已被證實可用于引發(fā)免疫應答。這些制劑可被用作疫苗抗哺乳動物，例如人類體內(nèi)的鉤蟲。施用制劑后，免疫接種的哺乳動物可以發(fā)展抗鉤蟲的免疫應答，產(chǎn)生對寄生蟲感染的免疫性，或者可以顯示較少的蟲載量，缺血的緩解，或者寄生的鉤蟲大小的降低。為此，本發(fā)明提供了含有來自鉤蟲的重組或者合成的抗原或者其片段以及一種可可藥用載體的組合物。重組的或者合成的抗原可以顯示與諸如如下所述的抗原有至少80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API或者Ay-TTR。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗原為Ac-TMP，Ac-MEP-1或者Ac-MTP-1?？乖梢詠碓从谥T如美洲板口線蟲(Nector americanus)，犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)，錫蘭鉤口線蟲(Ancylostoma ceylancium)，和十二指腸鉤口線蟲(Ancylostoma duodenale)種類的鉤蟲。
本發(fā)明也提供了引發(fā)哺乳動物對鉤蟲免疫應答的方法。所述方法包括給哺乳動物施用有效量的組合物的步驟，所述組合物包括來源于鉤蟲的重組或者合成的抗原(或者抗原的片段)和可藥用載體。重組或者合成的抗原與諸如如下所述的抗原表現(xiàn)出至少大約80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API和Ay-TTR。在優(yōu)選的實施方案中，抗原為Ac-TMP，Ac-MEP-1或者Ac-MTP-1?？乖梢詠碓从谥T如美洲板口線蟲，犬鉤口線蟲，錫蘭鉤口線蟲，和十二指腸鉤口線蟲種類的鉤蟲。
本發(fā)明進一步提供了免疫接種哺乳動物抗鉤蟲的方法。所述方法包括給哺乳動物施用有效量的組合物的步驟，所述組合物包括來源于鉤蟲的重組或者合成的抗原(或者抗原的片段)和可藥用載體。重組或者合成的抗原表現(xiàn)出與諸如如下所述的抗原有至少大約80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API和Ay-TTR。在優(yōu)選的實施方案中，抗原為Ac-TMP，Ac-MEP-1或者Ac-MTP-1。抗原可以來源于諸如美洲板口線蟲，犬鉤口線蟲，錫蘭鉤口線蟲，和十二指腸鉤口線蟲種類的鉤蟲。
本發(fā)明進一步提供了一種組合物，其包括來源于鉤蟲的重組或者合成的抗原(或者抗原的片段)。重組或者合成的抗原表現(xiàn)出與諸如如下所述的抗原有至少大約80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API和Ay-TTR。組合物進一步包括一種可藥用載體。在優(yōu)選的實施方案中，抗原為Ac-TMP，Ac-MEP-1或者Ac-MTP-1?？乖梢詠碓从谥T如美洲板口線蟲，犬鉤口線蟲，錫蘭鉤口線蟲，和十二指腸鉤口線蟲種類的鉤蟲。
本發(fā)明進一步提供了一種疫苗，其包括來源于鉤蟲的重組或者合成的抗原(或者抗原的片段)。重組或者合成的抗原表現(xiàn)出與諸如如下所述的抗原有至少大約80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API和Ay-TTR。所述疫苗進一步包括一種可藥用載體。在優(yōu)選的實施方案中，抗原為Ac-TMP，Ac-MEP-1或者Ac-MTP-1。抗原可以來源于諸如美洲板口線蟲，犬鉤口線蟲，錫蘭鉤口線蟲，和十二指腸鉤口線蟲種類的鉤蟲。
本發(fā)明進一步提供了一種引發(fā)免疫應答的組合物，所述組合物包括來源于鉤蟲的重組或者合成的抗原(或者抗原的片段)。重組或者合成的抗原表現(xiàn)出與諸如如下所述的抗原有至少大約80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API和Ay-TTR。所述疫苗進一步包括一種可藥用載體。在優(yōu)選的實施方案中，抗原為Ac-TMP，Ac-MEP-1或者Ac-MTP-1。抗原可以來源于諸如美洲板口線蟲，犬鉤口線蟲，錫蘭鉤口線蟲，和十二指腸鉤口線蟲種類的鉤蟲。
本發(fā)明進一步提供了能夠給病人接種疫苗抗傳染性疾病的方法。所述方法包括如下步驟治療鉤蟲感染到足以提高淋巴細胞增殖的水平，并且免疫接種病人抗諸如HIV，結(jié)核病，瘧疾，麻疹，破傷風，白喉，百日咳或者脊髓灰質(zhì)炎(polio)的傳染性疾病。
本發(fā)明也提供了能夠接種免疫鉤蟲的方法。所述方法包括如下步驟化學治療鉤蟲感染的病人以緩解鉤蟲感染，并且在緩解鉤蟲感染后給病人接種來源于鉤蟲的重組或者合成的抗原(或者其抗原片段)。在所述方法中，通過治療鉤蟲感染可被完全根除或者可降低到鉤蟲免疫接種有效的程度。重組或者合成的抗原可能顯示與諸如如下抗原有至少大約80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API和Ay-TTR。
本發(fā)明還提供了減少感染有鉤蟲的病人缺血的方法。所述方法包括給病人施用一種組合物的步驟，所述組合物包括一種來源于鉤蟲的重組或者合成抗原(或者其抗原的片段)以及一種可藥用載體。
本發(fā)明還提供了降低感染有鉤蟲的病人體內(nèi)鉤蟲大小的方法。所述方法包括給病人施用一種組合物的步驟，所述組合物包括一種來源于鉤蟲的重組或者合成抗原(或者其抗原的片段)以及一種可藥用載體。
本發(fā)明進一步提供了一種降低感染有鉤蟲的病人體內(nèi)鉤蟲數(shù)量的方法。所述方法包括給病人施用一種組合物的步驟，所述組合物包括一種來源于鉤蟲的重組或者合成抗原(或者其抗原的片段)以及一種可藥用載體。
本發(fā)明也提供了下列的核酸和氨基酸序列SEQ ID NO.11，SEQID NO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15，SEQ IDNO.16，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12，SEQID NO.21，SEQ ID NO.22，SEQ ID NO.23，SEQ ID NO.24，SEQ IDNO.25，SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.34，SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.37，SEQID NO.38，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.40，SEQ ID NO.41，SEQ IDNO.42，SEQ ID NO.43，SEQ ID NO.44，SEQ ID NO.47，SEQ ID NO.48，SEQ ID NO.49，SEQ ID NO.50，SEQ ID NO.51，SEQ ID NO.52，SEQ ID NO.55，SEQ ID NO.56，SEQ ID NO.57，SEQ ID NO.58，SEQID NO.59，SEQ ID NO.60，SEQ ID NO.61，SEQ ID NO.62，SEQ IDNO.63和SEQ ID NO.64。


圖1A和B.Na-ASP-1A，cDNA(SEQ ID NO.1)和B，推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。GeneBank登錄號AF079521。
圖2A和B.Na-ACEA，cDNA(SEQ ID NO.3)和B，推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)。GeneBank登錄號AF536813。
圖3A和B.Na-CTLA，cDNA(SEQ ID NO.5)和B，推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)。
圖4A和B.Na-APR-1A，cDNA(SEQ ID NO.7)和B，推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)。
圖5A和B.Na-APR-2A，cDNA(SEQ ID NO.9)和B，推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.10)。
圖6A和B.Ac-TMPA，cDNA(SEQ ID NO.11)和B，推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.12)。
圖7A和B.Ac-MEP-1A，cDNA(SEQ ID NO.13)和B，推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.14)。GeneBank登錄號AF273084。
圖8A和B.Ac-MTP-1A，cDNA(SEQ ID NO.15)和B，推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.16)。GeneBank登錄號AY036056。
圖9A和B.Ac-ASP-1A，cDNA(SEQ ID NO.17)和B，推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.18)。GeneBank登錄號AF132291。
圖10A和B.Ac-ASP-2A，cDNA(SEQ ID NO.19)和B，推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.20)。GeneBank登錄號AF089728。
圖11A和B.Ac-ASP-3A，cDNA(SEQ ID NO.21)和B，推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.22)。
圖12A和B.Ac-ASP-4A，cDNA(SEQ ID NO.23)和B，推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.24)。
圖13A和B.Ac-ASP-5A，cDNA(SEQ ID NO.25)和B，推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.26)。
圖14A和B.Ac-ASP-6A，cDNA(SEQ ID NO.27)和B，推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.28)。
圖15 A和B.Ac-TTRA，cDNA(SEQ ID NO.29)和B，自核苷酸25-531推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.30)。
圖16A和B.Ac-103A，cDNA(SEQ ID NO.31)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.32)。
圖17A和B.Ac-VWFA，cDNA(SEQ ID NO.33)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.34)。
圖18A和B.Ac-CTLA，cDNA(SEQ ID NO.35)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.36)。
圖19A和B.Ac-API-1A，cDNA(SEQ ID NO.37)和B，自核苷酸23-706推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.38)。
圖20A和B.Ac-MTP-1A，cDNA(SEQ ID NO.39)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.40)。
圖21A和B.Ac-MTP-2A，cDNA(SEQ ID NO.41)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.42)。
圖22A和B.Ac-MTP-3A，cDNA(SEQ ID NO.43)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.44)。
圖23A和B.Ac-FAR-1A，cDNA(SEQ ID NO.45)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.46)。GeneBank登錄號AF529181。
圖24A-C.Ac-KPI-1A和B，cDNA(SEQ ID NO.47)和C，自核苷酸12-2291推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.48)。
圖25A和B.Ac-APR-1A，cDNA(SEQ ID NO.49)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.50)。
圖26A和B.Ac-APR-2A，部分cDNA序列(SEQ ID NO.51)和B，部分氨基酸序列(SEQ ID NO.52)。
圖27A和B.Ac-APA，cDNA(SEQ ID NO.53)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.54)。
圖28A和B.Ay-ASP-1A，cDNA(SEQ ID NO.55)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.56)。
圖29A和B.Ay-ASP-2A，cDNA(SEQ ID NO.57)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.58)。
圖30A和B.Ay-MTP-1A，cDNA(SEQ ID NO.59)和B，氨基酸序列(SEQ ID NO.60)。
圖31A和B.Ay-API-1A，cDNA(SEQ ID NO.61)和B，自核苷酸23-703推導的氨基酸序列(SEQ ID NO.62)。
圖32A和B.Ay-TTRA，部分cDNA(SEQ ID NO.63)和B，部分氨基酸序列(SEQ ID NO.64)。
圖33A和B.鉤蟲數(shù)量和抗-MTP-1抗體滴度之間的皮爾曼(Spearman)等級相關(guān)。A)總蟲數(shù)；B)中值EPG。
圖34A-C.免疫接種有犬鉤口線蟲重組融合蛋白的犬體內(nèi)抗原-特異性幾何平均數(shù)IgG1抗體滴度作為時間的函數(shù)。幾何平均數(shù)計算為每組6只狗，除了Ac-AP組，其中只有一只狗發(fā)展了抗原-特異性抗體應答。箭頭顯示時控的免疫接種。(A)抗-Ac-APR-1應答(n＝6)。(B)抗-Ac-TMP應答(n＝6)。(C)抗Anti-Ac-AP應答(n＝1)。
圖35.從免疫接種或者注射明礬的狗的結(jié)腸回收的雄性和雌性成熟犬鉤口線蟲鉤蟲。
圖36A和B.鉤蟲數(shù)量和抗-MTP-1抗體滴度之間的皮爾曼等級相關(guān)。
圖37A和B.A)抗-TTR IgE抗體和鉤蟲數(shù)量減少之間的關(guān)聯(lián)；B)抗-TTR IgG1抗體和鉤蟲數(shù)量減少之間的關(guān)聯(lián)。
圖38A和B.在L3攻擊后，HV-4犬血紅蛋白(B)和血細胞比容(A)的改變。
圖39.相比于佐劑對照組，TTR免疫接種的小組中鉤蟲大小(在1和2mm之間)在統(tǒng)計上顯著減小。
圖40.來自用鉤口線蟲(Ancylostoma)L3抗原刺激后的鉤蟲感染(蟲卵陽性)個體的CD4+淋巴細胞。
圖41.來自用表達重組Na-ASP-1的畢赤酵母(Pichia)刺激后的鉤蟲感染(蟲卵陽性)個體的CD4+淋巴細胞。
本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細描述本發(fā)明提供了用于引發(fā)哺乳動物針對鉤蟲的免疫應答的組合物。這種組合物可被用作疫苗用于治療和/或預防鉤蟲感染。所述疫苗包括純化的抗原制劑和可藥用載體，所述抗原來源于鉤蟲。術(shù)語“來源于”是指抗原起源于(即，分離自)鉤蟲的生物分子。例如，抗原可以是蛋白，多肽或者蛋白或者多肽的抗原片段，所述蛋白或者多肽組成了鉤蟲生物體的一部分。通常，這種抗原是分離自并且至少部分純化自鉤蟲，分離和純化方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的(例如參見下述實施例部分)。當制造用于引發(fā)免疫應答或者作為疫苗時，這種抗原可以是“合成的”，即合成獲得(例如，在多肽和蛋白片段的情況下通過肽合成制成)，或者是“重組的”，即通過遺傳工程技術(shù)獲得(例如，通過在含載體的宿主細胞中產(chǎn)生，所述載體具有編碼抗原的DNA)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到多種這樣的合適表達系統(tǒng)都可以采用，包括但不限于那些使用大腸桿菌，酵母(例如，畢赤酵母)，桿狀病毒/昆蟲細胞，植物細胞和哺乳動物細胞的表達系統(tǒng)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，抗原表達在酵母或者桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)中。
這里給出了特異性抗原，其氨基酸一級序列以及編碼它們的核酸序列的例子。為了參考的方便，表I列舉了一些示范性抗原和它們相應的SEQ ID NOS。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應該認識到這里列舉的序列可以存在或者構(gòu)建多種變體，這些變體在實施本發(fā)明的過程中也可作為抗原。例如，根據(jù)氨基酸序列，可以存在或者構(gòu)建變體，所述變體表現(xiàn)保守氨基酸取代；非保守氨基酸取代；例如通過在氨基末端或者羧基末端或者在分子內(nèi)部缺失氨基酸進行截短；或者通過在氨基末端或者羧基末端或者在分子內(nèi)部添加氨基酸(例如，添加有助于蛋白分離的組氨酸標記)，取代殘基以改變?nèi)芙馓匦?，替換包括蛋白酶剪切位點的殘基以消除剪切位點并提高穩(wěn)定性，添加或者去除糖基化位點等或者為了其它任意原因)。這種變體可以是自然發(fā)生的(例如，作為在種之間或者個體之間自然變異的結(jié)果)；或者可以是有目的的導入(例如，利用遺傳工程技術(shù)的試驗裝置)。如果抗原變體顯示與描述的序列有充分的同一性，則這里公開的序列的所有變體都應該包括在本發(fā)明的教導中。優(yōu)選的，與公開的序列的同一性在大約50到100％的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在大約75到100％的范圍內(nèi)，而最優(yōu)選在80到100％的范圍內(nèi)。同一性是參考相應于原始抗原序列的氨基酸序列部分，即不包括可被添加的其它元件，諸如下列描述的嵌合抗原。
表I.鉤蟲抗原，描述，和相應的SEQ ID NOS。

本發(fā)明也包括嵌合抗原，例如由這里描述的氨基酸序列加上其它序列組成的抗原，所述其它序列當分離時與公開的序列不必須相連，但是添加這些氨基酸賦予了一些其它的優(yōu)點。例如，這些優(yōu)點可被用于分離和純化蛋白(例如，組氨酸標記，GST，麥芽糖結(jié)合蛋白)；指引蛋白到特定的細胞內(nèi)位置(例如酵母分泌蛋白)；提高蛋白的抗原性(例如，KHL，半抗原)。所有的這些嵌合構(gòu)建體都應該包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要基于此處公開的序列的部分構(gòu)建體的存在至少顯示同源性的水平。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到為了引發(fā)對抗原所起源的寄生蟲有足夠的抗原應答，無須使用蛋白和或者多肽的全部一級序列。在一些情況下，蛋白的片段足以賦予免疫性。因此，本發(fā)明也包括此處公開的序列的抗原片段，及其在疫苗制劑中的應用。通常，這種片段的長度至少大約10-13氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該認識到合適的序列通常是親水的并且常常是表面可接近的。
同樣，根據(jù)這里公開的核酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員應該認識到序列可以存在或構(gòu)建多種變體，這種變體仍然能夠提供編碼的抗原或者其需要的部分。例如，由于遺傳密碼的冗余，一種以上密碼子可被用于編碼一種氨基酸。此外，如上所述，可希望對抗原一級序列進行改變，而且這對于編碼核酸序列的改變是必須的。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應該認識到核酸序列的多種變體可得以構(gòu)建用于涉及克隆策略的目的(例如，為了便于操作序列插入載體，諸如導入限制酶剪切位點等)，用于修飾轉(zhuǎn)錄的目的(例如，導入啟動子或者增強子序列等)，或者用于其它任意合適目的。這里公開的核酸序列的所有這樣的變體都應該包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要序列表現(xiàn)出與原始序列大約50到100％的同一性，并且優(yōu)選，顯示大約75到100％的同一性，而最優(yōu)選，大約80到100％的同一性。同一性參照相應原始序列的部分核酸序列，并且不應該包括其它元件，諸如，啟動子，載體來源的序列，來源于其它來源的限制酶切位點等。
本發(fā)明的抗原可以來自于任何種類的鉤蟲，例子包括但不限于美洲板口線蟲，犬鉤口線蟲，錫蘭鉤口線蟲和十二指腸鉤口線蟲。
合適的鉤蟲抗原的例子包括但不限于Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR。
在本發(fā)明的一些實施方案中，抗原實體是與激活相關(guān)的分泌蛋白，這些蛋白的例子包括但不限于Na-ASP-1，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ay-ASP-1，和Ay-ASP-2。
在本發(fā)明的其它實施方案中，抗原部分是蛋白酶，這些蛋白酶的例子包括但不限于金屬蛋白酶(例如，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3；半胱氨酸蛋白酶；天冬氨酸蛋白酶(例如，Ac-APR-1和Ac-APR-2)；以及絲氨酸蛋白酶。
在本發(fā)明的其它實施方案中，抗原可以是凝集素(例如，Na-CTL，Ac-CTL)。
在本發(fā)明的其它實施方案中，抗原可以是蛋白酶抑制劑(例如，Ac-API-1，Ay-API-1，Ac-AP，Ac-KPI-1)。
在優(yōu)選的實施方案中，在實施本發(fā)明中使用的抗原為Ac-TMP，其DNA編碼序列列在圖6A(SEQ ID NO.11)中，并且其氨基酸序列列在圖6B(SEQ ID NO.12)中。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，在實施本發(fā)明中使用的抗原為Ac-MEP-1，其DNA編碼序列列在圖7A(SEQ ID NO.13)中，并且其氨基酸序列列在圖7B(SEQ ID NO.14)中。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，在實施本發(fā)明中使用的抗原為Ac-MTP-1，其DNA編碼序列列在圖8A(SEQ ID NO.15)中，并且其氨基酸序列列在圖8B(SEQ ID NO.16)中。
其它的優(yōu)選抗原包括但不限于Na-CTL(SEQ ID NOS.5-6)；Na-APR-1(SEQ ID NOS.7-8)；Na-APR-2(SEQ ID NOS.9-10)；Ac-TMP(SEQID NOS.11-12)；Ac-ASP-3(SEQ ID NOS.21-22)；Ac-ASP-4(SEQ IDNOS.23-24)；Ac-ASP-5(SEQ ID NOS.25-26)；Ac-ASP-6(SEQ ID NOS.27-28)；Ac-TTR(SEQ ID NOS.29-30)；Ac-103(SEQ ID NOS.31-32)；Ac-VWF(SEQ ID NOS.33-34)；Ac-CTL(SEQ ID NOS.35-36)；Ac-API-1(SEQ ID NOS.37-38)；Ac-MTP-1(SEQ ID NOS.39-40)；Ac-MTP-2(SEQID NOS.41-42)；Ac-MTP-3(SEQ ID NOS.43-44)；Ac-KPI-1(SEQ IDNOS.47-48)；Ac-APR-1(49-50)；Ac-APR-2(SEQ ID NOS.51-52)；Ay-ASP-1(SEQ ID NOS.55-56)；Ay-ASP-2(SEQ ID NOS.57-58)；Ay-MTP-1(SEQ ID NOS.59-60)；Ay-API-1(SEQ ID NOS.61-62)；Ay-TTR(SEQ ID NOS.63-64)。
本發(fā)明提供了用于引發(fā)免疫應答的組合物，所述組合物可被用作疫苗抗鉤蟲。術(shù)語“引發(fā)免疫應答”是指一種抗原刺激特異性抗體的合成，滴度為大約＞1到大約1×106或者更大。優(yōu)選的，滴度為從大約10,000到大約1×106或者更大，而最優(yōu)選的，滴度大于1×106，例如通過3H胸腺嘧啶的摻入進行測定。術(shù)語“疫苗”是指一種引發(fā)免疫應答的抗原，與未免疫接種(例如只有佐劑)的對照組生物體相比引起生物體內(nèi)鉤蟲數(shù)量至少降低大約30％。優(yōu)選的，下降水平為大約50％，更優(yōu)選的大約60到大約70％或者更高。
本發(fā)明提供了用于引發(fā)免疫應答的組合物，可被用作疫苗抗鉤蟲。所述組合物包括這里所述的基本上純化的鉤蟲抗原或者其變體，以及可藥用載體。用作疫苗的這種組合物的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常，這種組合物可被制備成液體溶液或者懸浮液，然而諸如，片劑，丸劑，粉末等的固體形式也在考慮的范圍內(nèi)。在給藥前適合溶解于或者懸浮于液體中的固體形式也可被制備。制劑也可以是乳化的形式。活性組分可以與可藥用的并與活性組分相容的賦形劑混合在一起。合適的賦形劑為，例如，水，鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇等等，或者其組合物。此外，組合物可以含有少量的輔助物質(zhì)，諸如潤濕劑或者乳化劑，pH緩沖劑等。另外，組合物可含有其它佐劑。如果需要施用口服形式的組合物，可以添加各種增稠劑，調(diào)味劑，稀釋劑，乳化劑，分散助劑或者粘合劑等。本發(fā)明的組合物可以含有任意的這種添加成分從而提供適合給藥形式的組合物。制劑中鉤蟲抗原的最終量可以變化。但是，通常，制劑中的量大約從1％到99％。
本發(fā)明的疫苗制劑可以進一步包括佐劑，合適的例子包括但不限于Seppic，Quil A，Alhydrogel等。
本發(fā)明的制劑可以含有一種單一的鉤蟲抗原?；蛘?，一種以上鉤蟲抗原可被用于制劑中，即，制劑可含有“雞尾酒”抗原。
本發(fā)明也提供了引發(fā)針對鉤蟲的免疫應答的方法以及免疫接種哺乳動物抗鉤蟲的方法。術(shù)語引發(fā)免疫應答是指施用抗原引起特異性抗體(滴度范圍為1到1×106，優(yōu)選1×103，更優(yōu)選1×103到大約1×106，而最優(yōu)選大于1×106)的合成和/或細胞增殖，例如通過3H胸腺嘧啶的摻入進行測定。所述方法包括給哺乳動物施用在可藥用載體中含有鉤蟲抗原的組合物。本發(fā)明的疫苗制劑可通過任意的多種合適的方式進行給藥，所述方式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，包括但不限于注射，口服，鼻內(nèi)，通過攝取含有抗原的食品等等。在優(yōu)選的實施方案中，給藥方式為皮下或者肌內(nèi)。
本發(fā)明提供了引發(fā)針對鉤蟲的免疫應答的方法以及免疫接種哺乳動物抗鉤蟲的方法。在一個實施方案中，哺乳動物為人類。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應該認識到其它哺乳動物也存在，因為對此接種免疫抗鉤蟲也是有益的，即制劑也用于獸用目的。所述例子包括但不限于伴侶“寵物”，諸如狗，貓等；食物來源，工作和娛樂動物，諸如牲畜，馬，牛，綿羊，豬，山羊等等。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應該認識到，通常為了免疫接種(或者引發(fā)免疫應答)目的物種(例如，人)抗鉤蟲，使用的抗原應該來源于寄生于目的物種的鉤蟲種。例如，通常來源于美洲板口線蟲的抗原對于免疫人類是優(yōu)選的，并且來源于犬鉤口線蟲的抗原對于免疫犬類是優(yōu)選的。但是并非總是這種情況。例如，犬鉤口線蟲已知寄生人類及其原始的犬類宿主。此外，交叉物種的鉤蟲抗原有時可能對于引發(fā)非宿主動物，即通常不作為抗原所來源的寄生蟲的宿主的免疫應答高度有效。甚至，抗原適合用于免疫刺激或者疫苗制劑的測定依賴于其賦予的防止寄生蟲攻擊和寄生的能力，如通過例如鉤蟲數(shù)量的降低或者抑制與鉤蟲相關(guān)的缺血所表明(例如，通過血球比容積和/或血紅蛋白的濃度進行測定)所顯示。例如，為了用于疫苗制劑，給藥后抗原引起鉤蟲數(shù)量降低至少大約30％，優(yōu)選至少大約50％，而最優(yōu)選至少大約60％到大約70％。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了能夠免疫接種病人抗傳染病的方法。所述方法包括治療鉤蟲感染到足以增加淋巴細胞增殖的水平，然后通過免疫接種病人抗所述傳染病。所述方法基于實施例10中提供的事實，所述實施例顯示鉤蟲滋生引起細胞對鉤蟲和可能的其它抗原刺激無免疫反應性。因此，通過在免疫接種抗鉤蟲或任意傳染劑前化學處理鉤蟲感染病人，對于免疫接種的應答會得以提高。免疫接種抗所述傳染病的結(jié)果得以改善的傳染病的例子包括但不限于HIV，結(jié)核病，瘧疾和常規(guī)兒童免疫接種(例如，麻疹，破傷風，白喉，百日咳，脊髓灰質(zhì)炎等等)。
可通過其進行化學處理的鉤蟲藥劑的例子包括但不限于丙硫咪唑(albendazole)和其它的驅(qū)蟲藥。
這里描述的特定抗原也可用于治療其它腫瘤，自身免疫和心血管疾病，以及治療促炎狀態(tài)。其它鉤蟲抗原的這種應用已被描述在，例如，授權(quán)給Capello等人的美國專利5,427,937和授權(quán)給Hawdon的美國專利5,753,787中。
本發(fā)明也提供了下列核酸和氨基酸序列SEQ ID NO.11，SEQ IDNO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15，SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.21，SEQ ID NO.22，SEQ ID NO.23，SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.25，SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.29，SEQID NO.30，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.33，SEQ IDNO.34，SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.37，SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.40，SEQ ID NO.41，SEQ ID NO.42，SEQ ID NO.43，SEQ ID NO.44，SEQ ID NO.47，SEQ ID NO.48，SEQID NO.49，SEQ ID NO.50，SEQ ID NO.51，SEQ ID NO.52，SEQ IDNO.55，SEQ ID NO.56，SEQ ID NO.57，SEQ ID NO.58，SEQ ID NO.59，SEQ ID NO.60，SEQ ID NO.61，SEQ ID NO.62，SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64。所述序列代表cDNA序列以及其編碼的氨基酸序列(開放閱讀框架)。雖然序列本身已經(jīng)被要求保護，但是其它與那些描述的序列相比具有高水平同一性的序列也被考慮在內(nèi)，例如與給出的序列具有至少65％到100％同一性，或者優(yōu)選大約75％到100％同一性，或者最優(yōu)選至少大約80％到100％同一性的序列。
尤其是，Ac-APR-2(SEQ ID NOS.51和52)以及Ay-TTR(SEQ IDNOS.63和64)是代表大部分抗原序列的部分序列。因此，本發(fā)明包括完整的Ac-APR-2抗原和完整的Ay-TTR抗原。
另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應該認識到在本申請中提供的Ay-TTR抗原代表在很多物種線蟲中存在的Ay-TTR族的抗原。同樣，來自任意線蟲的Ay-TTR抗原應該包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。尤其是，來自于包括但不限于美洲板口線蟲，犬鉤口線蟲，錫蘭鉤口線蟲，和十二指腸鉤口線蟲的種類鉤蟲的任意Ay-TTR也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實施例實施例1.Ac-TMP的分子克隆和純化材料和方法成熟犬鉤口線蟲文庫的免疫篩選制備抗-犬鉤口線蟲分泌性產(chǎn)物抗體。如上所述(Hotez和Cerami，1983)，從尸檢(感染后6周)感染狗的腸道內(nèi)回收一百只活的成熟階段的犬鉤口線蟲(Ancylostomacaninum)鉤蟲。成熟鉤蟲在無菌PBS中沖洗3次，然后在37℃(5％CO2)保存在15ml含有25mM的HEPES，100單位/ml的氨芐青霉素和100μg/ml的鏈霉素的RPM 1640中24小時。收集上清液，用PEG6000濃縮，并用1L的磷酸鹽緩沖液((pH 7.2)在4℃透析過夜。透析后，析出的產(chǎn)物在10,000xg離心10分鐘，并回收上清液。
通過皮下注射用完全弗氏佐劑乳化的鉤蟲分泌的蛋白(400μg)免疫兔子。隨后，用相同量的弗氏不完全佐劑乳化的鉤蟲分泌的蛋白以2周的時間間隔免疫兔子，總共進行三次免疫。最終免疫后10天獲得終血，并且從全血分離血清并保存在-20℃。
cDNA表達ZapII(Stratagene，La Jolla CA)文庫的構(gòu)建以前曾經(jīng)報道過(Capello等人，1996)。根據(jù)廠商的說明書用兔子抗-犬鉤口線蟲成熟分泌產(chǎn)物抗體篩選到據(jù)估計5×105的噬斑。簡而言之，5×104的噬斑涂鋪在LB瓊脂培養(yǎng)板中。通過用10mM IPTG浸潤的硝酸纖維膜覆蓋噬斑誘導犬鉤口線蟲抗原的表達。在37℃培養(yǎng)4小時后，提起膜，用5％脫脂奶的PBS進行封閉，然后與兔抗體(1∶500稀釋)在24℃培養(yǎng)1小時。膜用含有0.1％Tween-20的PBS(PBS-Tween)清洗三次并用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗-兔IgG(Sigma)以1∶1000的稀釋比在24℃繼續(xù)溫育1小時。用PBS-Tween再次清洗膜三次，然后用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物和過氧化氫顯色。對可能的陽性克隆打分并分離用于第二次篩選。
根據(jù)廠商的說明書(Stratagene)將免疫陽性克隆切除到pBluscript噬菌體中，利用堿性裂解的方法(Qiagen)提取噬粒DNA，并利用側(cè)翼載體引物(T3和T7)進行雙鏈測序。通過BLAST搜索將核苷酸和推導的氨基酸序列與GenBank中的現(xiàn)有序列進行比較。利用ESEE 3.1軟件進行序列分析。
反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增RT-PCR被用于鑒定Ac-tmp mRNA轉(zhuǎn)錄的發(fā)育階段特異性。犬鉤口線蟲(A.Caninum)卵，L1和L2幼蟲階段，和L3傳染幼蟲階段如上所述獲得(Hawdon等人，1999)。利用TRIzol試劑(GIBCO BRL)從每個生活史階段分離總RNA。利用寡d(T)引物和MMLV-RT(GIBCOBRL)合成單鏈cDNA?；趶?0bp到440bp的Ac-tmp序列的特異性引物(TIMP3′-1HR和TIMP5′-2ER)用于擴增Ac-tmp cDNA。PCR反應參數(shù)為94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘?？偣策M行30個循環(huán)。
純化Ac-TMP天然產(chǎn)物用于犬鉤口線蟲成熟分泌產(chǎn)物分級分離的半制備性反相色譜分析條件的優(yōu)化在510HPLC系統(tǒng)(Waters)上進行，所述系統(tǒng)安裝了帶有一個半制備性流動池的490 E多波長檢測器，波長設(shè)定在214，280，260和254mm，以及一根250mm×4.6I.D.YMC-Pack Protein-RP，200，5μm C4柱(Waters)。15個小時以后從1260只成熟鉤蟲收集作為起始材料的成熟犬鉤口線蟲分泌產(chǎn)物到37℃的含有25mM HEPES，100單位/ml的氨芐青霉素，100μg/ml的鏈霉素和100μg/ml的慶大霉素的15ml RPMI 1640中。在7,500xg離心1小時之前，上清液通過超濾在Centricon-3的微型濃縮裝置(Amicon)中濃縮到0.3倍體積。將大約0.6mg的寄生蟲分泌蛋白進行層析分析。洗脫液A為0.01％三氟乙酸(TFA)的水，而洗脫液B為0.01％TFA的乙腈。以1ml/分鐘的流速從0到80％B的線性梯度洗脫40-分鐘。收集0.5分鐘的級分并進行冷凍干燥，然后用于進一步的純化和通過SDS-PAGE(Laemmli，1970)進行分析。為了進行SDS-PAGE，2μl的分泌產(chǎn)物以及10μl的HPLC分離級分編號51與相同體積的2XSDS-PAGE樣品緩沖液(4％SDS，2.5％2-巰基乙醇，15％甘油)混合，并煮5分鐘。樣品以100V在4-20％梯度的SDS-PAGE凝膠上電泳2小時。根據(jù)廠商的說明書(BIO-RAD)對凝膠進行銀染。
級分51在安裝了如上所述的使用250mm.×3.0 I.D.YMC蛋白RP，200A，5μm C4柱的510 HPLC系統(tǒng)上進行RP-HPLC，所述級分含有從半制備分離的大多數(shù)的犬鉤口線蟲分泌蛋白。洗脫液A為0.01％TFA的水，而B為0.01％TFA的乙腈。從0到60％B的線性梯度以1ml/分鐘的流速洗脫30分鐘。收集0.5分鐘的級分并進行冷凍干燥。從這種分離中收集的主蛋白峰部分進行氨基酸序列分析和SDS-PAGE(Laemmli，1970)?；诘鞍譋dman降解的氨基酸序列分析在安裝了785A可編程檢測器和140C泵系統(tǒng)(由ProSeq，Inc.(Boxford MA)提供)的精確494型蛋白測序儀(Applied Biosystems)上進行。利用標準精確610A軟件鑒定測序產(chǎn)物。
為了證實相應于Ac-TMP的N-末端序列，在相應于51號級分的部分N-末端肽序列的兩個方向合成簡并寡核苷酸引物。成對的側(cè)翼簡并載體引物被用于從構(gòu)建在ZapII內(nèi)的成熟cDNA文庫獲得的DNA中擴增產(chǎn)物?！盁崞鹗肌盤CR條件是含有50mM KCl的10mMTris-HCl(pH 8.5)，2.0mM的MgCl2，0.2mM的每種dNTP，以及1μl的cDNA文庫，共20μl反應物。反應物在94℃加熱5分鐘，而后降低到85℃，歷時5分鐘，然后加入1單位的Taq DNA聚合酶(GIBCO BRL)。隨后進行三十個如下循環(huán)在94℃變性1分鐘，在55℃退火1分鐘，并在72℃延伸2分鐘。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳并用溴化乙錠進行染色。用QIAEX II的凝膠提取試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)對PCR產(chǎn)物進行凝膠純化，并進行測序。
實施例1的結(jié)果Ac-TMP cDNA.從成熟鉤蟲cDNA文庫通過免疫篩選用針對所有犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)成熟分泌產(chǎn)物的兔抗體克隆Ac-TMP cDNA。分離到兩個陽性的相同克隆。全長cDNA為559 bp(SEQ IDNO.11)，其編碼140個氨基酸(SEQ ID NO.12)的開放閱讀框架(ORF)和3′末端的聚腺苷酸尾。預測的ORF計算得到的分子量為16,100道爾頓并且理論pI為7.55。疏水信號肽序列帶有一個信號肽酶酶切位點，酶切位點位于氨基酸16和17之間。緊接著信號肽之后，Ac-TMP具有一個識別標志N末端Cys-X-Cys序列。推導的N連接的糖基化位點(N-X-T)存在于氨基酸119和122之間(圖6B)。
GenBank數(shù)據(jù)庫搜索顯示，這個分子的預測的氨基酸序列與人類金屬蛋白酶2的組織抑制劑(TIMP-2)的N-末端結(jié)構(gòu)域具有33％的同一性和50％的相似性。來自自生線蟲美麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的Ac-TMP和推測的TIMP含有一個單結(jié)構(gòu)域并且缺乏第二個脊椎動物TIMP的特征性C-末端結(jié)構(gòu)域(數(shù)據(jù)未顯示)。
RT-PCR擴增.為了鑒定生活史階段特異性表達的Ac-TMP，從不同發(fā)育階段的犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)提取mRNAs，并用Ac-TMP特異性引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR產(chǎn)生一個380bp的特異性條帶，所述條帶只從成熟的cDNA中擴增而來。沒有從卵，Li-L2和L3生活史階段的cDNA中觀察到擴增結(jié)果。犬鉤口線蟲(A.caninum)基因組DNA的擴增顯示兩條帶，表明有可能的內(nèi)含子或者存在第二個相關(guān)Ac-TMP基因(數(shù)據(jù)未顯示)。
在犬鉤口線蟲成蟲的分泌產(chǎn)物中鑒定Ac-TMP.為了證實Ac-TMP是由成熟犬鉤口線蟲鉤蟲釋放的，通過RP-HPLC將蛋白鑒定在寄生蟲分泌產(chǎn)物中并從寄生蟲分泌產(chǎn)物中純化。每個主峰都進行氨基酸序列分析作為較大犬鉤口線蟲蛋白組學研究的一部分(數(shù)據(jù)未顯示)。選擇相應于“級分51”的蛋白峰進行進一步的研究并且重新進行層析分析。銀染后級分51包括一條突出的條帶，遷移表觀分子量分子量Mr＝16,000。這個級分的N-末端肽序列(20個氨基酸)與預測的信號肽酶切位點后的Ac-TMP的ORF序列完全匹配?；谙鄬τ谌糠置诋a(chǎn)物譜總面積的HPLC峰51的曲線以下的計算面積，Ac-TMP被確定為包括大約6.3％的總?cè)^口線蟲(A.caninum)分泌產(chǎn)物。這就將這種分子鑒定為一種由成熟犬鉤口線蟲(A.caninum)釋放的最多的蛋白。通過在SDS-PAGE上目測證實在鉤蟲分泌產(chǎn)物中Ac-TMP的豐度?；陬^七個氨基酸的序列的成對簡并引物被用于從成熟鉤蟲cDNA文庫構(gòu)建PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物的DNA序列證實了與Ac-TMP cDNA的同一性(數(shù)據(jù)未顯示)。
這個實施例顯示TMP是鉤蟲分泌最多的蛋白，并且所述蛋白已被克隆和表達并且重組蛋白被分離。
實施例2.Ac-mep-1的分子克隆和鑒定。
材料和方法寄生蟲如上所述犬鉤口線蟲寄生蟲生長在小獵犬體內(nèi)(Schad1982)。從木炭糞培養(yǎng)物中分離第三階段的感染幼蟲(L3)并保存在BU緩沖液中(Hawdon等人，1995)。成熟犬鉤口線蟲(A.caninum)鉤蟲從尸檢后感染的狗體內(nèi)收集。這些鉤蟲在PBS中清洗三次，在液氮中急速冷凍，并保存在-80℃。
核酸通過常規(guī)方法(Ausubel等人，1993)從成熟犬鉤口線蟲分離基因組DNA。在存在Trizol試劑(Gibco BRL)的條件下根據(jù)廠商的操作流程通過研磨事先冷凍(-80℃)的成熟鉤蟲分離犬鉤口線蟲RNA。根據(jù)廠商的說明書，通過ProSTAR第一條鏈RTPCR試劑盒(Stratagene)從RNA制備cDNA。
犬鉤口線蟲基因組和cDNA文庫根據(jù)如下操作構(gòu)建犬鉤口線蟲(A.caninum)基因組DNA文庫在100μl體積的推薦緩沖液中，30μg的犬鉤口線蟲(A.caninum)基因組DNA由8單位的Sau3A限制酶(NEB)部分降解(37℃5分鐘)。然后將降解的DNA進行乙醇沉淀并通過標準方法收集沉淀。將產(chǎn)生的沉淀干燥，溶解在水中，并且根據(jù)廠商的說明書將其連接到λ-FIXII載體(Stratagene)中。然后用Gigapack Gold包裝提取物(Stratagene)將連接反應物包裝并進行擴增。犬鉤口線蟲成熟體的cDNA文庫從前(Capello等人，1996年)構(gòu)建在λZAPII(Stratagene)載體中。
金屬蛋白酶克隆Ac-mep-1 cDNA的克隆開始于利用簡并引物和寡-dT在成熟鉤蟲文庫cDNA上進行的PCR。簡并引物被設(shè)計為與含有鋅結(jié)合基元的保守序列相反，所述鋅結(jié)合基元觀察在來自美麗隱桿線蟲(C.elegan)的兩個假定的鋅金屬蛋白酶基因的BLAST比對中(GenBankTM，登錄號T22668和Q22523)。反應條件如下85ng的模板DNA，1X嗜熱DNA緩沖液(Promega)，2.5mM的MgCl2，0.2mM的dNTP，2μM的每種引物，1U的taq DNA聚合酶(Promega)，20μl的總體積。反應進行如下的35個循環(huán)94℃1分鐘，55℃1分鐘，和72℃1分鐘。這個PCR產(chǎn)生一個片段，當其克隆(pGEM-T，Promega)和測序時代表458bp(包括聚腺苷酸尾的21個殘基)的3′Ac-mep-1cDNA(克隆MP-1)。利用MP-1作為特異性引物設(shè)計的基礎(chǔ)，通過PCR用T3(載體)和MEP-R1基因特異性引物在文庫DNA上鑒定到其它的Ac-mep-1(克隆MP-2)序列。在系列稀釋的文庫DNA上進行反應，一直擴增到獨特的產(chǎn)物并進行克隆。反應條件如上所述。
在類似的克隆中，用T3和MEP-R2引物擴增MP-3。使用來自GibcoBRL的5′-RACE試劑盒鑒定Ac-mep-1的5′末端。簡而言之，第一條cDNA鏈用Ac-mep-1特異性引物RACE-R1在新近制備的RNA上產(chǎn)生在反轉(zhuǎn)錄反應物中。然后利用末端脫氧轉(zhuǎn)移酶給這個cDNA在3′末端加聚胞嘧啶尾并且用作含有錨定引物AAP(GibcoBRL)和基因特異性反向引物MEP-R2的PCR反應中的模板。產(chǎn)生的產(chǎn)物進行稀釋，并用作含有錨定引物UAP(GibcoBRL)和基因特異性引物MEP-R3的半巢式PCR反應的模板。克隆產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物并命名為MP-4。
從Ac-mep-1類似序列的基因組DNA克隆(G-MEP)鑒定更多的5’序列。對多個克隆進行測序以證實Ac-mep-1 cDNA和Ac-mep-1的全長編碼區(qū)在上述條件下作為使用合適引物的單獨片段進行PCR擴增(克隆FL-1)。
序列分析利用DNASTAR公司的MEGALIGN軟件(3.7.1版本)對部分Ac-mep-1克隆進行比對。用于簡并引物設(shè)計的最初的序列和預測的Ac-mep-1開放閱讀框架(ORF)的BLAST分析利用美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)的BLAST應用程序進行。利用Curatools序列分析應用程序(CuragenCorp.，New Haven，CT).進行Ac-mep-1的序列分析。帶有分析美麗隱桿線蟲DNA設(shè)置的FGENESH基因查詢程序(finder utility)(CGG網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(genomic.sanger.ac.uk))被用于從基因組DNA克隆G-MEP進行基因預測。GMEP中可能外顯子序列的鑒定用Wise2序列分析應用程序(sanger.ac.uk/Software Wise2/)完成。
Northern印跡在從十只成熟鉤蟲的Trizol(GibcoBRL)分離的總RNA上進行Northern印跡分析。在1.2％甲醛凝膠上分級分離RNA，并且通過標準方法印跡在Hybond-N膜(Amersham)上。用32P隨機最初標記的DNA片段探測印跡，所述DNA片段代表Ac-mep-1 cDNA的堿基對780到2688。
發(fā)育階段的RT-PCRRT-PCR用來研究犬鉤口線蟲各個生活史階段的Ac-mep-1的轉(zhuǎn)錄。對于這些反應，來自蟲卵，L1，未激活的和活化的L3以及成熟鉤蟲的cDNA用Acmep-1特異性引物MEP-F1和MEP-R1進行試驗。如果這些cDNA的質(zhì)量在利用引物PKA-F和PKA-R的分離反應中得以驗證，那么這些cDNA對于犬鉤口線蟲(A.caninum)蛋白激酶A將是特異性的(Hawdon等人，1995)。這些反應條件與在2.4部分定義的條件一致。
抗-Ac-mep-1抗體代表來自Ac-MEP-1C末端部分的610個氨基酸的cDNA片段從成熟犬鉤口線蟲的cDNAλ文庫中利用合適的引物通過PCR進行擴增。這個片段被T/A克隆進入到pGEM(Promega)中，通過標準方法(Sambrook和Russell，2001)將其克隆進入pET28c表達載體(Novagen)的HindIII位點。通過添加1mM的IPTG到用tAc-MEP-1/pET28c構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)PlysS(Stratagene)細胞的培養(yǎng)物中誘導截短的Ac-MEP-1(tAc-MEP-1)的細菌蛋白表達。
表達的蛋白是不溶的。為了純化tAc-mep-1，冷凍(冷凍后，BL21(DE3)PlysS細胞裂解)誘導的細胞沉淀，再懸浮在十分之一體積的50mM的tris pH 8.0，2μM的EDTA中，超聲波破碎直到?jīng)]有粘性，然后在12,000xg離心15分鐘(Sorvall RC5B，GSA轉(zhuǎn)頭)。產(chǎn)生的沉淀再懸浮在15ml的1％SDS，0.5％的B-巰基乙醇中，超聲波破碎，煮5分鐘，然后在室溫下培養(yǎng)2小時。通過反復離心作用除去不溶解的碎片。上清液徹底地對磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)進行透析以除去BME。根據(jù)廠商的操作流程不用變性劑在HisBind(Novagen)鎳樹脂親和性柱上純化蛋白。5只雄性Balb/c小鼠(6-周齡)組用20μg的明礬-沉淀的tAc-MEP-1或者只有明礬作為對照進行腹膜內(nèi)免疫。隨后以2-周的間隔加強免疫小鼠兩次。第三次和最終的免疫后一周，收集血清，混合血清并用作蛋白印跡和免疫染色分析的初級抗體。
蛋白印跡法通過10％的SDS-PAGE分離的蛋白在轉(zhuǎn)移緩沖液(39mM的甘氨酸，48mM的tris堿，0.037％SDS，pH 8.3)中在30V轉(zhuǎn)移18個小時到甲醇帶電荷的Immobilon-P PVDF膜(Millipore)上。用5％脫脂乳的PBS(封閉緩沖液)隨著溫和的振蕩在室溫下(RT)對膜進行封閉1小時并和大腸桿菌吸收的初級小鼠抗tAc-MEP-1抗體(1∶1500)在室溫下培養(yǎng)1小時，所述小鼠抗tAc-MEP-1抗體稀釋在封閉緩沖液中。然后在封閉緩沖液中沖洗三次膜(每次10分鐘)，并在RT下伴隨振蕩與辣根過氧化酶-結(jié)合的山羊抗小鼠IgG次級抗體(1∶5000)的封閉緩沖液一起培養(yǎng)1小時。最終，在PBS中沖洗膜15分鐘并用Renaissance(NEN Life Science產(chǎn)品)化學發(fā)光劑顯色。
免疫定位成熟犬鉤口線蟲鉤蟲通過標準方法進行石蠟包埋和切片。通過將脫石蠟的鉤蟲切片RT下溫育在1∶100稀釋度(以PBS稀釋，pH 7.4)的小鼠抗tAc-MEP或?qū)φ昭?同上)中1小時完成Ac-MEP-1的原位免疫定位。切片在PBS中沖洗三次并在25℃溫育在1∶200稀釋度的山羊抗小鼠IgG中1小時，繼之以在PBS中沖洗(三次)。然后用Olympus IX-50倒置熒光顯微鏡(U-MWIG濾光器)觀察切片并拍照。
實施例2的結(jié)果Ac-mep-1的cDNA結(jié)構(gòu)用于獲得完全的Ac-mep-1編碼序列的克隆策略如下通過測序簡并PCR克隆MP-1，PCR來源的克隆MP-2，MP-3和5′RACE克隆MP-4鑒定大約2.6kb的Ac-mep-1轉(zhuǎn)錄本。雖然接近于RACE產(chǎn)物5’末端有一個甲硫氨酸密碼子，但是這個密碼子之前為不包含終止子的58個符合讀框的氨基酸，顯示MP-4不代表實際的Ac-mep-1的5′末端。此外，我們不能獲得包括剪接前導序列的cDNA克隆(通過PCR)。因此，Ac-mep-1類似序列(98.7％的外顯子同一性)的基因組DNA克隆G-MEP的檢查利用美麗隱桿線蟲DNA的基因預測程序以及除通過5′RACE鑒定到的以外不同的潛在轉(zhuǎn)錄起始位點。這個預測延伸超過5′RACE序列158個bp并且增加推導的編碼區(qū)91個氨基酸。運用這種預測，Ac-mep-1的整個編碼區(qū)被擴增作為2.7kb的單一產(chǎn)物并且通過其兩端的部分測序驗證了所述克隆。Ac-mep-1轉(zhuǎn)錄本的總長度通過Northern印跡(5′和3′末端的非編碼區(qū)在全長PCR中沒有被擴增)證實為大約2.8kb。這種轉(zhuǎn)錄本推導的氨基酸順序編碼了870個氨基酸的單一ORF，這些氨基酸具有四個可能的N-連接的糖基化位點(預測pI＝5.5，m.w.＝98.7kDa)。Ac-MEP-1的氨基末端氨基酸包含一個疏水的信號肽測序，在殘基22后具有一個預測酶切位點(參見具有AC-MEP-1序列的圖)。鑒定到表征金屬蛋白酶的內(nèi)肽酶24.11族的兩個識別標記鋅結(jié)合基元。
Ac-mep-1與相關(guān)毛圓線蟲血液給食的線蟲捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(H.Contortus)的一種金屬蛋白酶(Hc-MEP 2b)存在66％的類似性和48％的同一性。它也同樣類似于來自非寄生的線蟲美麗隱桿線蟲(C.elegans)的金屬蛋白酶(T25B6.2)(Gen-BankTMT28906)。十四個半胱氨酸殘基在這些三個分子之間高度保守。其他兩個半胱氨酸(僅僅一個是保守的)存在于Ac-MEP-1和Hc-MEP1b中。
Ac-mep-1表達的Northern印跡和顯色分析Northern印跡分析顯示成熟鉤蟲mRNA中有一個大約2.8kb的單一mRNA轉(zhuǎn)錄本(未顯示)。采用RT-PCR研究Ac-mep-1轉(zhuǎn)錄的發(fā)育特異性。在試驗的cDNA中有可能鑒定寄生蟲僅僅成熟期而非鉤蟲卵，L1或者活化和未活化的L3幼蟲的轉(zhuǎn)錄。相反，用特異于犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)蛋白激酶A的引物在相同cDNA上實施的陽性對照PCR顯示從所有模板cDNA的擴增。因此，Ac-mep-1好象是專門地表達在成熟鉤蟲體內(nèi)。
成熟鉤蟲切片內(nèi)Ac-mep-1的蛋白印跡分析和免疫定位通過蛋白印跡法，小鼠抗MEP-1抗血清顯著地識別到大約90和100kDa的成熟犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)蛋白。成熟鉤蟲切片的免疫組化分析將Ac-MEP-1定位到鉤蟲內(nèi)臟的微絨毛的表面。與用對照血清溫育的切片相比，抗血清與成熟鉤蟲切片的內(nèi)臟微絨毛激烈地反應。也偶而記錄到成熟鉤蟲皮膚中的微弱染色。雖然Ac-MEP-1的功能是未知的，沿著寄生蟲內(nèi)臟微絨毛表面的位置將顯示所述酶與干血直接接觸，并且可能因此具有營養(yǎng)物消化的作用。
這個實施例顯示MEP-1是一種重要的酶，其使鉤蟲消化血液，因此是一個有吸引力的疫苗靶。重組MEP-1蛋白已被克隆和表達。
實施例3.AC-MTP抗原研究傳染性第三階段的鉤口屬鉤蟲幼蟲(L3)釋放一種鋅-依賴的金屬蛋白酶，其遷移的表觀分子量為50kDa(Hawdon等1995a)。所述酶響應于L3階段誘導給食和發(fā)育的刺激特異性的釋放(Hawdon等，1995b)，并且可能在寄生蟲皮膚和組織入侵或者蛻皮中發(fā)揮作用(Hotez等，1990)。因為其在寄生蟲-來源的組織入侵和脫皮中的作用，直接針對Ac-MTP-1的抗酶抗體反應可能阻斷幼蟲移行以及寄生蟲進入腸內(nèi)。Ac-MTP-1是階段特異性的，并且由在類似宿主的環(huán)境下激活的鉤蟲L3釋放以重新開始在體外給食。在激活期間Ac-MTP-I的釋放使得這個分子成為有吸引力的疫苗靶。
實施例3A.從編碼蝦紅素家族的鋅-金屬蛋白酶(Ac-mtp-1)的犬鉤口線蟲(A.caninum)L3表達文庫分離cDNA。
材料和方法抗血清經(jīng)過IRB-同意的人研究協(xié)議，從中國安徽省的Nanlin縣的5位居民收集用于免疫篩選犬鉤口線蟲(A.caninum)L3表達文庫的血清。十二指腸鉤口線蟲是這個地區(qū)的主要鉤蟲，根據(jù)從感染病人的幼蟲和成熟鉤蟲的回收率，十二指腸鉤口線蟲與美洲板口線蟲的比率大于20∶1(Yong等人.1999)。如其他文獻(Xue等人，2000)所述，從具有高滴度的針對犬鉤口線蟲L3所有裂解抗原的循環(huán)抗體的安徽居民獲得血清。兩個居民為鉤蟲卵陰性，而剩余的3個人每克糞便帶有低于400個蟲卵的定量糞便蟲卵。因為他們較高的抗體滴度以及較低的感染強度，這些個體被看作假設(shè)有抗性并且混合他們的血清用于免疫篩選。從上海的大學生體內(nèi)收集陰性對照血清。
表達文庫的篩選根據(jù)廠商的說明書利用混合的抗血清篩選構(gòu)建在X ZapIl中的犬鉤口線蟲(A.caninum)(Baltimore株)L3的cDNA文庫(Stratagene，La Jolla，CA)(Hawdon等人1995)。簡而言之，通過將硝酸纖維膜在37℃浸入10mM的IPTG中4小時誘導5×104的噬斑表達蛋白。溫育后，將膜溫育在5％的脫脂奶粉的PBS中1小時。在22℃用1∶100稀釋度的混合人血清將封閉的膜溫育在PBS中1小時，在22℃用PBS清洗三次共10分鐘，并與1∶1000稀釋度的辣根過氧化物酶結(jié)合的抗-人IgG(Sigma，St.Louis MO)共培養(yǎng)。用底物3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和0.015％的過氧化氫對膜進行顯色。通過再次涂鋪平板和再次篩選對陽性噬斑進行多輪噬斑純化。通過體內(nèi)切除拯救質(zhì)粒(Short和Sorge，1992)，并且利用互補于側(cè)接載體序列的引物對兩條鏈進行測序。核苷酸和推測的氨基酸序列通過BLAST搜索(Altschul等人，1997)在GeneBank數(shù)據(jù)庫中與現(xiàn)有序列進行比較。
全長Ac-MTP cDNA的克隆所有分離的陽性克隆在5′進行截短。為了獲得5′末端，利用基因特異性引物PI和相應于保守線蟲剪接前導序列的引物的PCR被用來從犬鉤口線蟲(A.caninum)L3的第一條cDNA鏈擴增5′末端。20μl的含有100ng的每種引物，1U的Taq聚合酶(Promega，Madison WI)和1μl的cDNA的反應物在95℃變性2分鐘，然后進行30個如下循環(huán)在94℃1分鐘，在55℃1分鐘，以及在72℃2分鐘。擴增子進行凝膠純化并通過常規(guī)方法克隆到pGEM Easy-T載體(Promega，Madison，WI)中。
階段特異性通過RT-PCR確定mtp-1轉(zhuǎn)錄的階段特異性(Hawdon等人，1995)。通過蔗糖浮選法從感染犬的糞便中分離犬鉤口線蟲蟲卵(Nolan等人，1994)，通過用NaOCl進行無菌化(axenize)處理，并涂鋪在線蟲生長培養(yǎng)基瓊脂平板中(Sulston等人，1988)。隨后在26℃溫育24-30小時，用BU緩沖液(Hawdon和Schad，1991)從平板清洗溫育物(混合的L1/L2)并在干冰/乙醇浴中進行快速冷凍。未孵化的蟲卵也進行快速冷凍以制造cDNA。在尸檢過程中從感染犬的小腸收集犬鉤口線蟲(A.caninum)成熟鉤蟲。在犬鉤口線蟲蟲卵，混合的L1/L2血清-刺激的和未刺激的L3(如下所述)，以及成熟犬鉤口線蟲樣品上如下進行RT-PCR。在預先冷凍(液N2)的研缽中將樣品研磨成粉末，并根據(jù)廠商的說明書利用TRIzol試劑(Life Technologies，Gaithersburg，MD)分離總RNA。用10單位的DNAse 1(不含RNase，BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)處理RNA，并用TRIzol再次提取。在存在TRIzol的條件下利用BeadBeater機器(BioSpec，Bartlesville，OK)用玻璃珠機械破碎分離總的蟲卵RNA，如上所述進行DNAse處理和再次提取。從含有如下組分的50μL反應物內(nèi)的每種樣品中在37℃合成第一條cDNA鏈共1小時50mM的Tris HCl，pH 8.3，75mM的KCl，3mM的MgCl2，10mM的DTT，500ng的寡(dT)引物，1μg的總RNA，以及200U的Moloney鼠白血病毒反轉(zhuǎn)錄酶(LifeTechnologies)。反應物在94℃溫育5分鐘，并用dH2O補充到100μL。1μL的第一條cDNA鏈被用于PCR中，引物為MTP5′-I(5′-CTTCTCATGATCAACAAACACTACG)SEQ ID NO.65和MTP3′-1(5′-AATCTAACTCCAACATCTTCTGGTG)SEQ ID NO.66。反應物進行30個如下循環(huán)在94℃1分鐘，在55℃1分鐘，以及在72℃2分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳分離擴增子并用溴化乙錠進行染色觀察。
重組蛋白的表達和純化利用常規(guī)技術(shù)將全長Ac-mtp-1 cDNA以符合讀框的方式克隆到表達載體pET28(Novagen)中并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL-21大腸桿菌(E.coli)細胞中。在含有編碼5′末端的6個載體編碼的組氨酸殘基(His-標記)重組蛋白的表達通過加入1mM IPTG在37℃進行誘導3小時。1ml表達rMTP-1的細胞通過在5000xg離心5分鐘進行沉淀，丟棄上清液，將細胞在100ml的TE(pH 8.0)中進行裂解，所述100ml的TE含有100μg/ml的溶解酶和0.1％的Triton X-100。在30℃溫育20分鐘后，在冰上將樣品用超聲波處理(功率水平2-3，20-30％的占空因素)，每個樣品進行5秒鐘10次的破碎，直到樣品不再發(fā)粘。在還原條件下通過12％SDS-PAGE的電泳分離可溶性和不溶性細胞部分，用考馬斯亮蘭染色觀察溶解的蛋白。為了純化rMTP-1，來自2升誘導的細菌培養(yǎng)物的細胞沉淀懸浮在60ml的1.0％SDS，0.5％2-巰基乙醇中，煮5分鐘，并冷卻到室溫。提取物在2升0.1％SDS的PBS透析48小時，更換兩次緩沖液，并施加到10ml的HisBind鎳樹脂柱(Novagen)中。根據(jù)廠商的說明書進行層析，除了向所有緩沖液中添加0.1％的SDS。
在努力提高溶解性和研究MTP-1的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的過程中，3個缺乏氨基His標記序列的構(gòu)建體通過PCR進行制備。全長Ac-MTPcDNA(1-1642bp)，沒有5′-前肽(408-1642bp)的cDNA，以及推測的催化結(jié)構(gòu)域(408-1101bp)以符合讀框的方式被克隆到pET28中Nco I位點上游，從而從載體中將His標記編碼序列去除。在如上所述的相同條件下表達重組蛋白?？寡迳a(chǎn)通過用純化的rMTP免疫BABL/C小鼠獲得抗-rMTP多克隆抗血清。20μg的柱純化的rMTP用明礬(Ghosh等人，1996)以及皮下注射進行共沉淀。其它加強劑與明礬沉淀的rMTP(每種20μg)一起在第3，6和9周時進行給藥。
吸附針對大腸桿菌BL21株的細菌裂解物的小鼠血清以去除與細菌蛋白反應的抗體。25ml的誘導細胞進行離心，溶解在25ml的2X樣品緩沖液中(100mM Tris，pH6.8，2％的SDS，2.5％的2-巰基乙醇)，并在12,000xg離心10分鐘。將硝酸纖維素膜(4cm×8cm)浸入上清液中20分鐘，然后溫育在轉(zhuǎn)移緩沖液中(48mM的Tris，39mM的甘氨酸(glyine)，0.037％的SDS，20％的甲醇)共30分鐘。在含有0.1％Tween-2的PBS中清洗膜3次，并在22℃溫育與1∶100稀釋度的小鼠抗血清一起溫育1小時。用新鮮的膜重復溫育兩次。為了證實抗體的特異性，第二次吸附針對表達全長rMTP-1的BL21(DE3)細胞裂解物的等份的吸附的小鼠抗血清。吸附的抗血清用于蛋白印跡。
體外激活L3并收集ES產(chǎn)物在類似于宿主體內(nèi)的條件下如上所述(Hawdon等人1999)活化犬鉤口線蟲(A.caninum)L3。簡而言之，在22℃從糞培養(yǎng)物收集的L3用1％HCl的BU緩沖液(Hawdon和Schad，1991)凈化30分鐘。大約5000個L3在37℃，5％CO2培養(yǎng)在24孔組織培養(yǎng)平板單個孔的0.5ml RPM1640組織培養(yǎng)基中24小時，所述培養(yǎng)基添加了25mM的HEPES pH 7.0以及抗生素(Hawdon等人1999)。通過包括15％(v/v)的＜10kD超濾犬血清和25mM的S-甲基-谷胱苷肽(Hawdon等人1995)活化L3從而重新開始給食。未活化的L3在沒有刺激的情況下溫育在RPMI中。如上所述確定給食的幼蟲的百分比(Hawdon等人1996)。
含有活化的和未活化的L3的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到分離微離心管中并在14,000rpm離心5分鐘。從相同處理組而來的上清液進行混合，通過0.45μm的注射用過濾器進行過濾從而去除任意的L3和脫落表皮，并保存在-20℃。在電泳之前，通過利用Centricon 10濾芯(Amicon，Beverley，MA)的超濾將上清液濃縮。濃縮的ES用1ml的BU進行清洗，超濾并冷凍干燥。
為了收集成熟ES，1260只成熟鉤蟲在37℃，10％CO2培養(yǎng)在RPMI1640組織培養(yǎng)基(Hawdon等人1999)中15小時。通過在Centricon 3旋轉(zhuǎn)柱中超濾將上清液濃縮3倍。
蛋白印跡表達rMTP-1融合蛋白的細菌細胞的裂解物和冷凍干燥的ES產(chǎn)物重新懸浮在2x SDS-PAGE的樣品緩沖液中(4％SDS，5％2-巰基乙醇，15％的甘油)并在4-20％的梯度SDS-PAG(Invitrogen，Carlsbad，CA)上進行分離。分離的蛋白通過在25V電印跡1小時而轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore，Bedford，MA)上(Towbin等人，1979)。在22℃，膜用5％脫脂干奶粉的沖洗緩沖液(PBS，pH7.4，0.1％的Tween 20)中封閉1小時。封閉的膜在22℃與1∶5000稀釋度的小鼠rMTP抗血清一起溫育1小時，所述小鼠rMTP抗血清針對表達全長rMTP的細菌裂解物，已被預吸。在24℃用沖洗緩沖液沖洗膜三次共10分鐘，隨后在22℃下與1∶5000稀釋度的辣根過氧化酶-結(jié)合的山羊抗小鼠IgG(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)一起培養(yǎng)1小時。利用化學發(fā)光檢測試劑(ECL+，Amersham.Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)觀察條帶。
實施例3A的結(jié)果犬鉤口線蟲(A.caninum)MTP cDNA的克隆利用從中國內(nèi)地病人收集的具有高抗-鉤蟲L3滴度的混和血清篩選犬鉤口線蟲(A.caninum)L3 cDNA表達文庫。鑒定到12個陽性克隆，其中6個通過DNA測序被確定為是相同的。每個克隆含有一個3′聚腺苷酸尾，但是在5′末端是截短的。利用來自線蟲剪接前導序列的引物連同基因特異性引物P1通過PCR從犬鉤口線蟲(A.caninum)L3cDNA分離到5’末端(Hawdon等人1995；Bektech等人，1988)。
不帶聚腺苷酸尾的全長cDNA為1703bp(參見圖8A，SEQ ID NO.15)并且編碼547個氨基酸的開放閱讀框架(參見圖8B，SEQ ID NO.16)計算分子量為61,730，以及pI為8.72。ATG起始密碼子開始于剪接前導序列末端下游的兩個核苷酸處，在Ac-mtp-1 cDNA的5′末端產(chǎn)生總共23個未翻譯的核苷酸。一個TAA終止子位于核苷酸1666到1668，接著一個含有AATAAA聚腺苷化信號的35bp 3′UTR(Blumenthal和Steward，1997)，其在聚腺苷酸尾上游的12bp處(堿基1687-1692)。推導的蛋白序列的氨基酸1到16被預測代表一個疏水信號肽，可能的剪切位點位于第6位的Ala和第7位的Gly之間(Nielson等人，1995)。推測的序列在Asn39和Asn159含有2個可能的N-連接的糖基化位點(N-X-S/T)。
利用Ac-MTP-1預測的氨基酸序列通過BLAST搜索(Altschul等人，1997)GenBank顯示與稱作蝦紅素的鋅金屬蛋白酶的家族成員有顯著的同源性(Bond和Benyon，1995)，蝦紅素的鋅金屬蛋白酶由小龍蝦螯蝦(Astacus astacu)的消化蛋白酶蝦紅素命名而來。用Ac-MTP-1推導的氨基酸序列搜索蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Apweiler等人，2000)顯示存在特征性蝦紅素指紋圖譜，包括延伸的鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及保守的Met轉(zhuǎn)角，所述轉(zhuǎn)角位于下游37個氨基酸處。含有鋅結(jié)合位點的催化結(jié)構(gòu)域接著一個同源于表皮生長因子(EGF)的結(jié)構(gòu)域，從氨基酸334到368。從氨基酸374到484是與CUB結(jié)構(gòu)域有較差同源的結(jié)構(gòu)域，該命名是因為其在補體亞組分C1r/C1s，胚胎海膽蛋白Uegf和BMP-1中的存在。EGF和CUB結(jié)構(gòu)域在蝦紅素金屬蛋白酶中是一樣的，并且相信會參與蛋白-蛋白的互作(Bond和Benyon，1995)。
N-信號肽后為一段119個氨基酸富含螺旋的前-肽結(jié)構(gòu)域。前肽結(jié)構(gòu)域的C-末端含有一個從第132位氨基酸到第135位氨基酸的4個堿性氨基酸(R-E-K-R)，其是弗林蛋白酶或者其它類似胰蛋白酶加工酶的可能的識別位點(Bond和Benyon，1995)。在這個位點的蛋白水解將活化Ac-MTP-I成為一種推測的412個氨基酸加工后的形式，計算的MW為46419，并且pI為8.04。
階段特異性的RT-PCR分析Ac-mtp-1表達的階段特異性通過來自不同發(fā)育階段的犬鉤口線蟲的cDNA的定性RT-PCR進行研究。Ac-mtp-1特異性引物被設(shè)計成擴增相應于完全序列的核苷酸985到1419的Ac-mtp-1 cDNA的434bp部分。預測大小的產(chǎn)物從未活化的和活化的L3cDNA擴增而來，而非從犬鉤口線蟲蟲卵或者L1/L2混合階段的cDNA擴增。在成熟的cDNA中觀察到一條強度較小的條帶。較長的片段自基因組DNA擴增而來，顯示所述引物跨越一個內(nèi)含子，并且證實來自cDNA的擴增子來源于cDNA的擴增而非污染的基因組DNA。對照引物擴增部分組成型表達的犬鉤口線蟲蛋白激酶A催化亞基(Hawdon等人，1995年)，其從所有的DNA樣品中成功的擴增出產(chǎn)物，顯示存在可擴增的模板。
重組MTP的表達和免疫印跡重組MTP-1產(chǎn)生于大腸桿菌中，并通過Ni柱層析純化，用于免疫BALB/c小鼠產(chǎn)生特異性抗血清。吸附針對大腸桿菌的裂解物的抗血清并且用于確定Ac-MTP-1是否是由犬鉤口線蟲(A.caninum)L3體外分泌的。從10,000只未活化的(未給食)和活化的(給食)L3獲得的ES產(chǎn)物利用rMTP-1抗血清通過蛋白印跡進行分析?？寡遄R別大腸桿菌BL21(DE3)細胞中表達的全長和加工(即，沒有前肽結(jié)構(gòu)域)形式的rMTP-1，但是不能識別只含有載體的誘導細胞裂解物中的任意條帶。
rMTP抗血清識別10,000只犬鉤口線蟲(A.caninum)L3的ES產(chǎn)物中MW為47.5和44.5的條帶，所述犬鉤口線蟲(A.caninum)L3已被活化從而體外重新開始給食?？寡宀荒茏R別只在培養(yǎng)基中10,000只未活化的L3的ES中或者成熟犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)ES產(chǎn)物或者鉤蟲裂解物(未顯示)中的任意條帶。在活化的ES中遷移較慢的條帶與加工形式的rMTP具有類似的MW(47.5對46.5)，這顯示在體外活化期間犬鉤口線蟲(A.caninum)L3釋放加工的MTP-1。較低的MW條帶也被免疫前小鼠血清(未顯示)識別，顯示抗血清識別與Ac-MTP-1不相關(guān)的蛋白。為了證實這種識別是非特異性的，吸附針對表達全長MTP-1的BL21(DE3)細胞的小鼠抗血清并用于探測蛋白印跡。吸附的抗血清沒能識別任意的rMTP-1，但是識別活化的ES產(chǎn)物中MWr＝44.5的條帶，顯示由抗血清識別低分子量的條帶是非特異性的。
雖然重組MTP-1由用于篩選文庫的混合血清識別，但是生活在非傳染區(qū)(上海)的個體的血清不能識別rMTP-1(未顯示)。
實施例3B.MTP-1 cDNA的分離和鑒定中國感染鉤蟲的病人的血清用作探針從而對來自犬鉤口線蟲(A.caninum)L3表達文庫的cDNA進行分離和鑒定，所述表達文庫編碼一個蝦紅素家族的鋅金屬蛋白酶(Ac-mtp-1)。根據(jù)廠商的說明書利用來自中國安徽省的病人的混合抗血清篩選構(gòu)建在1 ZapII(Stratagene，La Jolla，CA)的犬鉤口線蟲(A.caninum)(Baltimore strain)L3 cDNA表達文庫(Hawdon等人，1995年)，在中國安微省十二指腸鉤口線蟲(A.Duodenale)為主要的鉤蟲物種。使用具有低糞便蟲卵數(shù)的和對于犬鉤口線蟲(A.caninum)L3全裂解物抗原的高滴度的循環(huán)抗體的病人的血清，這種情況顯示這些病人可能抗鉤蟲的感染。在噬斑純化后回收六個相同的截短的克隆。利用線蟲剪接前導序列連同兩種基因特異性引物通過巢式PCR從犬鉤口線蟲(A.caninum)L3 cDNA分離5′末端(Hawdon等人，1995年)，并測序兩個獨立的5′末端克隆。
實施例3B的結(jié)果擴增的序列被認為是代表轉(zhuǎn)錄本的全部5′末端，因為預測的ATG起始密碼子之后是剪接前導序列的第一個甲硫氨酸，前16個推測的氨基酸編碼分泌蛋白的特征性信號肽(Nielson等人，1997年)，并且與類似金屬蛋白酶的比對顯示這是完整的氨基酸序列。不帶聚腺苷酸尾的全長cDNA為1703bp并且編碼一段547個氨基酸的開放閱讀框架，計算的分子量為61,730，pI為8.72。推導的蛋白序列中的第1個到第16個氨基酸被預測代表一種疏水信號肽，可能的剪切位點位于Ala16和Gly17之間(Nielson等人1997)。所述蛋白序列在Asn39和Asn159含有兩個可能的N-連接的糖基化位點(NX-S/T)。利用Ac-MTP-1預測的氨基酸序列通過BLAST搜索(Altschul等人，1997年)GenBank顯示與稱作蝦紅素(Bond和Beynon，1995年)的鋅金屬蛋白酶家族的成員具有顯著的同源性，所述蝦紅素命名為小龍蝦Astacus astacus的降解蛋白酶。這個家族成員的特征在于一段將其靶向用于分泌的短-末端信號肽，接著一個前肽，以及一個含有特征性鋅結(jié)合區(qū)和“甲硫氨酸轉(zhuǎn)角”的催化結(jié)構(gòu)域。不象蝦紅素，大多數(shù)的其它家族成員含有C-末端結(jié)構(gòu)域，包括不同數(shù)目的EGF和CUB結(jié)構(gòu)域(Bond和Beynon，1995)。用Ac-MTP-1推導的氨基酸序列搜索蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Apweiler等人，2000年)顯示特征性蝦紅素指紋的存在，包括一個延伸的鋅結(jié)合區(qū)，和一個位于37個氨基酸下游的保守的甲硫氨酸轉(zhuǎn)角。含有鋅結(jié)合位點的催化結(jié)構(gòu)域之后是一個同源于表皮生長因子(EGF)的結(jié)構(gòu)域，從第334位到第368位氨基酸。從第374位到第484位氨基酸是一個與CUB結(jié)構(gòu)域具有較低同源性的結(jié)構(gòu)域，該命名是因為其在補體亞組分中C1r/C1s，胚胎海膽蛋白Uegf和BMP-1中的存在(Bork和Beckman，1993年)。
蝦紅素金屬蛋白酶被合成為失活的前酶。通過加工酶去除前肽激活了所述酶(Bond和Beynon，1995年)。Ac-MTP-1含有一段119個氨基酸的N-末端結(jié)構(gòu)域，其預測的用于胰蛋白酶-或者弗林蛋白加工酶的4個氨基酸識別位點(R132E133K134R135)位于其C-末端(Bond和Benyon，1995)。在這個位點的蛋白水解將活化Ac-MTP-1成為一種推測的412個氨基酸加工后的形式，計算的MW為46419，并且pI為8.04。前肽也被預測含有四個兩性分子的α-螺旋，由一個短的連接區(qū)(從第23位氨基酸到第86位氨基酸)分隔開來(Kelley等人，2000)。
通過將來自犬鉤口線蟲(A.caninum)多個發(fā)育階段的cDNA進行定性RT-PCR來研究Ac-mtp-1的階段特異性表達。特異性引物被設(shè)計用于擴增相應于全序列核苷酸985-1419的434bp的部分Ac-mtp-1cDNA。推測大小的產(chǎn)物從非活化和活化的L3 cDNA中擴增得到，但是沒有從犬鉤口線蟲(A.caninum)蟲卵或者L1/L2混合階段的cDNA擴增得到，顯示Ac-mtp-1主要表達在L3階段。較弱強度的條帶觀察在成熟cDNA中。雖然這個條帶是微弱的，但是不可能得出關(guān)于基因表達量的結(jié)論，因為RT-PCR只用于定性分析。然而利用小鼠抗-rMTP血清對成熟裂解物進行的蛋白印跡沒能識別成熟ES或者裂解物中的任意蛋白(未顯示)。這就顯示Ac-MTP-1的表達限于L3階段，而且存在于成熟階段的信使沒有被翻譯或者可能部分被降解了。
重組MTP-1產(chǎn)生于大腸桿菌中，并通過Ni柱層析進行純化，且用于免疫BALB/c小鼠產(chǎn)生特異性抗血清。吸附針對大腸桿菌裂解物的抗血清并被用于確定Ac-MTP-1是否是由犬鉤口線蟲(A.caninum)L3在體外分泌的。從10,000只未活化的(未給食的)和活化的(給食)的L3收集的ES產(chǎn)物(Hawdon和Schad，1993)利用rMTP-1抗血清通過蛋白印跡進行分析?？寡遄R別在大腸桿菌BL21(DE3)細胞中表達的全長和加工(即，沒有前肽結(jié)構(gòu)域)形式的rMTP-1，但是不能識別只含有載體的誘導的細胞裂解物中的任意條帶。一條較小分子量的條帶被觀察到并且大小類似于加工的rMTP(即缺少前序列)，顯示在大腸桿菌中表達的一些rMTP在前肽的C-末端接受過體外剪切。這可能是自身催化的剪切，雖然由細菌蛋白酶進行的非特異性剪切也是可能的。自身催化也可能代表了Ac-MTP-1的體內(nèi)生理活化機制。
rMTP抗血清識別已被活化以在體外重新給食的10,000只犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)L3的ES產(chǎn)物中Mr為47.5和44.5的條帶。抗血清不能識別來自未活化L3的ES中，只在培養(yǎng)基中，或在成熟犬鉤口線蟲(A.aninum)ES產(chǎn)物或鉤蟲裂解產(chǎn)物(未顯示)中的任意特異性條帶。在活化ES中一條慢慢遷移的條帶具有與rMTP的加工形式類似的分子量(47.5對46.5)，表明了犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)L3在體外激活過程中釋放已加工的MTP-1。此外，MTP-1僅僅響應于活化L3重新開始給食的刺激而進行釋放，因此，最可能在傳染過程的某些階段起作用(Hawdon等，1996)。先前描述的金屬蛋白水解活性在激活期間也被特異性的釋放，且具有類似的分子大小(Hawdon等，1995)，表明Ac-MTP-1可能對至少部分的這種活性負責。
活化ES產(chǎn)物中的一條較低分子量的條帶(分子量為44.5kDa)也通過免疫前的小鼠血清識別(未顯示)，表明抗血清識別一種與Ac-MTP-1無關(guān)的蛋白。為了證實此種識別是非特異性的，吸附針對表達全長MTP-1的大腸桿菌細胞的小鼠抗血清且用于探測蛋白印跡。被吸附的抗血清不能識別任意的rMTP-1，但識別活化的ES產(chǎn)物中分子量為44.5的條帶，表明抗血清對低分子量條帶的識別是非特異性的。重組體MTP-1被用于篩選文庫的混合血清識別，但來自生活在非發(fā)病區(qū)域(上海)的個體的血清不能識別rMTP-1(未顯示)。
雖然Ac-MTP-1的確切功能是未知的，表達的階段特異性以及激活期間的特異性釋放表明了在傳染性過程中的決定性作用。因此，對Ac-MTP-1體內(nèi)功能的干預提供了一種開發(fā)控制鉤蟲病的疫苗的有用策略。
這個實施例證明了MTP-1是一種由鉤蟲寄生蟲入侵所用的重要酶，且所述蛋白是免疫顯性抗原，因為其被來自盡管反復暴露于鉤蟲但帶有低鉤蟲數(shù)量的患者的血清所識別。因此MTP是一種用于疫苗抗原的引人注目的候選物。
實施例3C.用Ac-MTP-1抗原進行的犬疫苗試驗為試驗Ac-MTP-1是否是一種有效的疫苗，兩組8+1周齡的5只目的性-育種的雄性小獵犬用重組(從大腸桿菌中表達和分離)融合蛋白與AS02A佐劑的制劑，或僅僅佐劑來免疫接種。AS02A的組合物其已被成功地用于幾種瘧疾疫苗臨床研究，描述在別處(Lalvani等，1999；Bojang等，2001；Kester等，2001)。具體的動物管理和飼養(yǎng)條件先前已被報道(Hotez等，2002a)。含有多聚組氨酸標記的重組融合蛋白純化自溶于6M HCl胍的10mM Tris HCl，pH8.0中的已洗滌的E.coli包涵體。溶解的包涵體通過凝膠過濾色譜法(在含有0.1NaH2PO4，10mMTris-HCl和6M胍的緩沖液中預平衡過的SaphacrylS-300，26/60凝膠過濾柱[AmershamPharmacia])在室溫下(2ml/分鐘的流速)以5-10ml批量加工。根據(jù)Singh等的方法(2001)將所選擇的含有Ac-MTP-1(如通過在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳[SDS-PAGE]上分析測定)的級分混合，再折疊，然后上樣到5ml的Hi-Trap IMAC柱(Amersham Pharmacia)上，所述Hi-TrapIMAC柱用ZnCl2帶電荷并平衡在50mM的磷酸鈉(pH7.2)，1M的尿素，和0.5M的NaCl中。隨后用15倍柱體積的平衡緩沖液沖洗柱，且用50mM的磷酸鈉(pH7.2)，1M的尿素，0.5M的NaCl，以及50mM的乙二胺四乙酸(EDTA)洗脫結(jié)合的蛋白。洗脫的含有蛋白的樣品進行混合且用10mM的Tris-HCl(pH8.0)，5％的甘油，1mM的二硫蘇糖醇，以及2mM的EDTA進行透析。純化的重組Ac-MTP-1沒有顯示出酶活性(數(shù)據(jù)未顯示)。
重組Ac-MTP-1融合蛋白與SBAS2佐劑混合并在第1，4，43，和50天進行4次肌內(nèi)注射施用于5只狗中的每一個。每只狗接受每劑量大約140μg的重組融合蛋白和0.5ml的ASO2A。根據(jù)相同的給藥流程給5只狗肌內(nèi)注射AS02A。免疫之后，每周通過靜脈穿刺收集血液并分離血清冷藏在-20℃。抗原-特異性犬IgG2和IgE抗體通過如先前所描述(Hotez等，2002a)的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)進行測定。來自未活化的L3和在宿主刺激條件下活化的L3的分泌產(chǎn)物的免疫印跡法如前所述(Zhan等，2002)利用從Ac-MTP-1-免疫接種的狗獲得的混合血清進行。每個研究用的狗在最后一次免疫后14天用500只犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)L3皮下感染。用于研究的鉤蟲株的來源描述在別處(Hotez等，2002c)。用于研究的鉤蟲種類的確認通過聚合酶鏈式反應繼之以限制性片段長度多態(tài)性(Hawdon，1996)得以證實。感染后，通過靜脈穿刺每周對狗取血來獲得全部血球數(shù)(CBC)。在接種疫苗流程的最后和尸體解剖之前也獲得了血清的化學特性。每只狗的定量鉤蟲卵計數(shù)(McMaster技術(shù))在感染后(PI)第12天開始每周3天獲得。感染后第5周，通過靜脈注射巴比妥酸鹽處死狗，并在驗尸過程中回收成熟鉤蟲并計數(shù)來自小腸和大腸的成熟鉤蟲(Hotez等，2002c)。成熟鉤蟲數(shù)量之間的統(tǒng)計顯著性差異利用方差分析實驗(Anovatest)來確定，正如血液學參數(shù)和定量的鉤蟲卵數(shù)量的差異。鉤蟲數(shù)量以及卵數(shù)量與抗體滴度的比較利用皮爾曼等級(非參數(shù)的)相關(guān)來測定。
Ac-MTP-1重組融合蛋白的SDS-PAGE分析之后用考馬斯藍染色，顯示遷移的蛋白具有酶原預測的61kDa的表觀分子量。同樣顯示了與具有低表觀分子量一起遷移的三個一組的條帶，可能對應于部分被加工的Ac-MTP-1。免疫之后，每個接受疫苗的狗顯現(xiàn)了介于1∶40,500和1∶364,500的范圍之間的高滴度的IgG2抗-Ac-MTP-1-特異性抗體；介于1∶500和1∶1,500范圍之間的抗Ac-MTP-1-特異性IgE抗體應答。來自接種疫苗的狗的血清識別三個一組的緊密遷移的蛋白，其具有酶原和在宿主活化L3的分泌產(chǎn)物中加工形成的Ac-MTP-1的預測分子量，而在非未活化的L3分泌產(chǎn)物中則沒有。其它條帶可能也對應于其它由犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)L3分泌的相關(guān)金屬蛋白酶；至少3個來自犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)L3的密切相關(guān)表達的序列標記被發(fā)現(xiàn)在dbEST數(shù)據(jù)庫中(ncbi.nim.nih.gov/dbEST/index.html)。
總的來說，從接種疫苗的狗回收的成熟鉤蟲數(shù)目(154+34只鉤蟲)(平均數(shù)+標準偏差)與從對照狗回收的成熟鉤蟲數(shù)目(143+30只鉤蟲)相比沒有統(tǒng)計學上的顯著差異。然而，如圖33A所示，回收自接種疫苗的具有高度抗犬鉤口線蟲IgG2抗體滴度的狗腸道內(nèi)的成熟鉤蟲數(shù)目有統(tǒng)計學上的顯著減少?？贵w滴度和成熟鉤蟲數(shù)量之間的皮爾曼相關(guān)系數(shù)是-0.89(P＝0.04)?；厥兆跃哂凶罡呖贵w滴度的狗鉤蟲數(shù)目(98只鉤蟲)與回收自具有最低抗體滴度的狗的成熟鉤蟲數(shù)目(189只鉤蟲)相比相當于50％腸蟲數(shù)的減少。相同的關(guān)系被表示在IgG2抗體滴度和中值卵計數(shù)之間(圖33B)。
這些研究表明Ac-MTP-1可提供作為一種抗鉤蟲疫苗抗原的下游預示。
實施例4.用Ac-TMP，Ac-AP，以及Ac-APR-1抗原進行的犬疫苗試驗為了評價直接針對寄生蟲酶和酶抑制劑的抗體是否對鉤蟲病具有的治療效果，進行犬類免疫接種試驗，所述試驗使用編碼成熟犬鉤口線蟲(A.caninum)蛋白酶或蛋白酶抑制劑的重組融合蛋白。因為從活鉤蟲只能獲得少量蛋白，實驗這些作為候選疫苗的分子需要在原核或真核宿主系統(tǒng)中的重組載體的表達，然后用純化的重組融合蛋白對犬進行免疫。
用于實施例4的材料和方法。
狗和畜牧業(yè)的研究在方案由喬治華盛頓大學設(shè)立的動物保護和使用委員會(IACUC)的批準后，購買了特定給食的，寄生蟲幼稚的8±1周齡的雄性小獵犬，通過耳刺紋進行標識，并飼養(yǎng)在喬治華盛頓大學動物研究機構(gòu)授權(quán)的AALAC(實驗動物保護的評估和鑒定協(xié)會)。在70+4°F的室溫下，狗被圈養(yǎng)在一個房間內(nèi)用于研究，每小時換氣10-15次，由100％新鮮空氣組成，且12小時的照明周期與12小時的暗周期反復交替。每天監(jiān)控氣流和計時器功能。用Teklad認證的狗食#8727的食譜飼養(yǎng)狗，倘若厭食則補充以罐裝軟食。飲用水是輸自過濾水廠并通過自動供水系統(tǒng)傳遞；水質(zhì)分析由U.S.Army Corps ofEngineers進行。來自設(shè)施自動系統(tǒng)的水每年對其中的細菌和真菌進行培養(yǎng)。圍圈被天天沖洗并每兩周進行一次消毒。給定研究組中的狗在鉤蟲幼蟲攻擊之前被允許在一起生活和活動，但感染后被分開圈養(yǎng)。所有的狗在開始進行疫苗試驗之前被隔離檢疫大約一周。在接種疫苗之前，獲得全部血球數(shù)(CBC)，血清化學特性，以及接種疫苗之前的血清樣品。
疫苗研究方案以及樣品數(shù)量疫苗試驗被設(shè)計來試驗三種不同的抗原，每種與明礬配制，以及明礬佐劑對照。總共24只狗被隨機分配為四個組，每組包括6只狗。犬樣本的數(shù)量基于檢測所述免疫接種組小腸內(nèi)的成熟鉤蟲數(shù)目相對于對照狗減少40-50％的能力進行選擇，以80％的統(tǒng)計功率(α＝0.05，雙-尾)。所述數(shù)據(jù)來自先前回收自用400只犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)L3感染的年齡-匹配的狗的成熟鉤蟲的平均數(shù)和標準偏差(Hotez等，2002)。
重組抗原每一組的6只狗用重組鉤蟲蛋白免疫接種，其中的重組鉤蟲蛋白作為融合蛋白被表達在帶有桿狀病毒的大腸桿菌或昆蟲細胞系中。Ac-AP(Cappello等，1995；1996)和Ac-TMP被表達在大腸桿菌中作為含有多聚組氨酸標記的pET 28(Novagen)融合蛋白(Cappello等，1996)。Ac-APR-1(Harrop等，1996)表達在桿狀病毒pBacPAK6載體(Clontech)中，所述載體被修飾含有一種多聚組氨酸-編碼序列和其它的限制性內(nèi)切酶位點(Brindley等，2001)。然后通過鎳親和色譜法純化重組Ac-AP和Ac-TMP融合蛋白，隨后進行第二步純化。在Ac-AP的情況下(Cappello等，1995；1996)，重組蛋白通過mono-S(Amersham-Pharmacia)離子交換色譜法純化，而Ac-TMP(Zhan等，2002)通過superdex 75(Amersham-Pharmacia)凝膠過濾色譜法純化。Ac-APR-1(Harrop等，1996)通過底物親和色譜法利用胃酶抑制劑瓊脂糖純化(Brindley等，2001)?？乖旱鞍诐舛韧ㄟ^Pierce Micro BCA分析(Pierce Chemicals)或通過樣品在289nm處的吸光率利用消光系數(shù)進行測定，所述消光系數(shù)由推導的所述融合蛋白的氨基酸組成計算得到。每一劑量抗原中明礬吸附的蛋白量通過Pierce Micro BCA分析利用牛血清清蛋白標準進行測定。每一抗原相對于污染大腸桿菌或昆蟲細胞蛋白的相對純度通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的分析進行測定。
佐劑制劑重組Ac-TMP和Ac-APR融合蛋白如前面描述(Ghosh等，1996)用硫酸鋁鉀十二水合物和碳酸氫鈉的混合物進行明礬沉淀。所述方法需要將蛋白的水溶液用鋁鹽在堿性條件下沉淀，然后離心和洗滌(Ghosh和Hotez，1999)。利用這種方法，重組Ac-AP融合蛋白沒有在明礬沉淀物中檢測到。因此，開始兩劑量的Ac-AP的給藥沒有佐劑。然而，最后兩次劑量的Ac-AP被吸附到無定形的非結(jié)晶磷酸鈣凝膠上。
犬免疫選擇4-劑量免疫程序(表II)。每只狗通過22號針在肩的兩個位點通過皮下免疫進行接種。注射的體積介于0.5和1.0ml之間。每種抗原的四劑量在38-天的時間內(nèi)給藥。開始的兩次注射(初級免疫)在第1天和第4天施用，而最后的兩次免疫接種(加強)在第34天和第38天施用。對照組的狗注射相同量的明礬。
表II.用于每只犬免疫接種的抗原量和佐劑。

犬抗體測定通過靜脈穿刺每周收集血液并分離血清和冷藏于-20℃。抗原-特異性犬IgG1抗體通過間接的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定。由于未獲得合適的高品質(zhì)的犬-特異性試劑，其它的IgG亞類沒有被測定。樣品血清和酶-聯(lián)檢測抗體的最佳濃度通過測試板滴定法測定。最佳的抗原濃度利用飽和技術(shù)來測定。NUNC Maxisorp F96認證平板(Rosklide，丹麥；批號045638)用每孔0.1ml抗原的0.05M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)進行包被。密封的平板在4℃過夜(ON)培養(yǎng)，然后通過DYNEX OpsysTM平板洗滌機(Chantilly，VA)用PBS(pH 7.2)洗滌3次。該平板用每孔0.25ml的含有0.5％Tween 20的0.15MPBS(PBS-Tween 20)(pH7.2)在室溫(RT)下處理1.5個小時，傾析，并用紙巾吸干。各種連續(xù)稀釋度的測試血清制備在0.1ml的PBS-Tween 20中并在4℃過夜培養(yǎng)。洗滌后，0.1ml偶聯(lián)于堿性磷酸酶(Bethyl實驗室，Montgomery，TX)的抗犬IgG1以1∶1000的稀釋度被加到每個孔中。室溫下1.5小時后，平板在用0.1ml 2.5mM對-硝基苯磷酸酯(Sigma.St.Louis，MO)的10mM二乙醇胺(Sigma，St Louis，MO)和0.5mM氯化鎂(Sigma，St.Louis，MO)(pH9.5)的溶液加到每個孔中之前用PBS-Tween20洗滌10次。平板在暗中培養(yǎng)30分鐘并通過帶有SOFTmax Pro軟件(Molecular Devices，Sunnyvale，Ca)的SpectraMax 240PC讀數(shù)儀(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在405nm波長處讀數(shù)。對照犬血清的平均光密度用作基準。最后大于上述基準3倍的血清稀釋度被看作滴定終點。這些終點的幾何平均值按照來自每一組的六只犬來計算。
犬鉤蟲傳染和寄生蟲回收在最后免疫14天后，所研究的每只狗用包含在膠囊中的400只犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)L3進行口服感染。被用來研究的鉤蟲株的來源描述在別處(Hotez等，2002)。用于研究的鉤蟲種的確認通過聚合酶鏈式反應繼之以限制性片段長度多態(tài)性(Hawdon，1996)進行證實。感染后，狗通過靜脈穿刺每周取血以獲得全部血球數(shù)(CBC)。血清化學特性也在接種疫苗結(jié)束和在尸體檢驗之前獲得。每一只狗定量的鉤蟲卵計數(shù)(McMaster技術(shù))在感染12天后開始以每周三天獲得。感染五周后，狗通過靜脈內(nèi)注射巴比妥酸鹽被處死，在尸體解剖時從小腸和大腸回收成熟的鉤蟲并計數(shù)(Hotez等，2002)。每只成熟鉤蟲的性別通過肉眼觀察來確定。當每天實施安樂死8只狗(兩只狗來自四個組中的每一組)時，尸體解剖在三天時間內(nèi)進行。分離大約1-2cm的小腸并置于福爾馬林中用于將來的組織病理分析。
統(tǒng)計方法在免疫接種的組中成熟鉤蟲數(shù)量相對于對照組減少或增加的百分比通過下式來表示 成熟鉤蟲數(shù)量差異的統(tǒng)計顯著性利用非參量檢驗法；Kruskal-Wallis與Dunn法，以及Mann-Whitney U試驗測定。組之間的血液學參數(shù)以及定量的鉤蟲卵計數(shù)的差異通過ANOVA試驗來評價。當超過兩個試驗通過相同的變量來計算時，顯著性的水平應根據(jù)試驗的數(shù)目進行調(diào)整?；厥盏某墒煦^蟲的性別差異通過用于兩個相關(guān)組的Wilcoxon-Signed Ranks試驗進行統(tǒng)計學比較。如果所計算的P值等于或小于0.10(雙側(cè))或-0.05(單側(cè))，則差異被認為是統(tǒng)計上顯著的。
實施例4的結(jié)果。
成熟的犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)抗原3個重組犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)抗原被選擇用于犬免疫接種。其中的兩個Ac-AP以及Ac-TMP僅僅是由成蟲期鉤蟲分泌的蛋白酶抑制劑。Ac-AP是91個氨基酸的因子Xa抑制劑抗凝血劑(Cappello等，1995；1996)，而Ac-TMP是140個氨基酸的推測的金屬蛋白酶的組織抑制劑，并且是由犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)分泌的最豐度的蛋白。第三個選擇的抗原是Ac-APR-1，為422個氨基酸的天冬氨酸組織蛋白酶(Harrop等，1996)。SDS-PAGE分析重組融合蛋白后進行考馬斯藍染色。正如所預料的，重組融合蛋白Ac-APR-1和Ac-TMP在SDS-PAGE上遷移的表觀分子量分別為45,000和18,000。表示為具有一個N-末端多聚組氨酸標記的pET28融合蛋白的Ac-AP的預測分子量是12,191Da(Cappello，1996)。通過SDS-PAGE，重組Ac-AP融合蛋白被觀察為一個分子量為22,000的主要條帶和一個在大約15,000Da處遷移的較微弱的條帶。這種觀測結(jié)果可對應于多肽寡聚體的構(gòu)成。這種現(xiàn)象從前出現(xiàn)在Ac-AP天然產(chǎn)物的純化過程中(Cappello等，1995)。因子Xa的抑制活性，編碼重組Ac-AP融合蛋白的pET28質(zhì)粒的DNA序列分析，以及22kDa條帶通過Edman降解法進行的氨基末端肽序列分析證實了基因產(chǎn)物的同一性(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
犬抗體應答.選擇的犬免疫接種程序為，在開始的4天期間的兩次(第1天和第4天)皮下劑量的給藥進行初級免疫，接著兩次隨后的皮下免疫加強在初級免疫后30天開始(第34天以及第38天)進行。Ac-TMP以及Ac-APR-1以明礬-沉淀蛋白的形式注射。相反，Ac-AP沒有與明礬形成沉淀物。因此，對于起始的兩次劑量，Ac-AP皮下給藥沒有佐劑。然而，在第二和第三次免疫之間的30-天時間段，使用磷酸鈣凝膠的方案表明可有效地沉淀Ac-AP(數(shù)據(jù)沒有顯示)。因為這種原因，磷酸鈣被選作佐劑用于最后兩次劑量的Ac-AP免疫給藥。
3個疫苗抗原的IgG1抗體滴度的幾何平均值顯示在圖34A-C中。在針對Ac-APR-1免疫接種的狗中(圖34A)，在初級免疫大約6周后接著進行最后的兩次免疫加強，抗原-特異性IgG1增加。與此相反，抗Ac-TMP IgG1抗體應答被進一步加強(圖34B)，且在初級免疫后2周，在第三次和第四次劑量之前開始增加。在最后的兩次加強后抗Ac-TMP抗體滴度第二次增加，滴度超過1∶10,000。六只免疫接種抗Ac-AP的狗中有五只沒有對抗原產(chǎn)生免疫應答。如圖34C所示，對Ac-AP免疫接種應答的單個犬在最后兩次給藥后顯示出抗原-特異性抗體應答。
從小腸回收成熟犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)鉤蟲從免疫接種狗的小腸回收的成熟犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)的數(shù)目顯示在表III中。免疫接種狗相對于僅用明礬單獨注射的狗體內(nèi)鉤蟲數(shù)的減少介于4.5％到18％的范圍之內(nèi)。上述的減少不能充分的表明組之間的統(tǒng)計顯著性(克魯斯凱-沃利斯檢驗，P＝0.19)。然而，從免疫接種有Ac-APR-1的狗的小腸回收的鉤蟲數(shù)目減少18％(在一個組中最大的減少)的概率通過Dunn法小于0.05，而通過Mann-Whitney U單側(cè)檢小于0.03。免疫接種抗Ac-TMP的狗也顯示出成熟鉤蟲數(shù)量的減少(10.8％)，盡管這些不是統(tǒng)計上顯著的。沒有顯示出抗Ac-AP抗體應答的5只狗，也顯示出不顯著的鉤蟲數(shù)量的減少。然而，具有顯著的抗Ac-AP抗體應答的單獨的狗，顯示出成熟鉤蟲數(shù)量減少34.7％。如表III所示，數(shù)據(jù)不能提供充分的證據(jù)證明免疫接種的狗和對照狗之間的定量鉤蟲卵計數(shù)在統(tǒng)計學上有顯著的減少。類似地，免疫接種沒有影響狗的血液學參數(shù)，包括血細胞比容，血紅蛋白，白血細胞數(shù)，以及嗜酸性粒細胞(數(shù)據(jù)沒有顯示)。正如所預料的，用于這個研究中的鉤蟲的攻擊劑量在對照明礬注射的狗中沒有引起貧血(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
從結(jié)腸回收成熟的犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)。
表III.免疫接種的狗相對于明礬-注射的狗小腸中成熟鉤蟲的減少

*陽性免疫應答**P＜0.05(Dunn法)反之，從免疫接種狗的小腸回收的成熟鉤蟲數(shù)目減少，從結(jié)腸回收的成熟鉤蟲數(shù)目卻相應的增加(表IV)。
表IV.免疫接種的狗相對于明礬-注射的狗的結(jié)腸中成熟犬鉤口線蟲的增加

*陽性免疫應答**P＜0.05(Dunn法)從大腸回收的成熟鉤蟲數(shù)目的增加在統(tǒng)計學上是顯著的(克魯斯凱-沃利斯檢驗，P＝0.07)。免疫接種Ac-TMP(增加500％)或Ac-APR-1(300％增加)的狗，相對于用明礬注射的狗顯示出統(tǒng)計學上顯著增加(Dunn法，P＜0.05)。用Ac-AP接種但沒有顯示出抗原-特異性抗體應答的狗在從結(jié)腸回收的成熟鉤蟲數(shù)目方面沒有統(tǒng)計學上顯著增加。然而，單個的具有顯著的抗-Ac-AP抗體應答的狗顯示出其結(jié)腸中成熟鉤蟲數(shù)目有1083％的增加。
總之，在接種以及對照狗之間對于在從小腸以及大腸回收的成熟鉤蟲組合的總數(shù)統(tǒng)計學上沒有顯著的差異(數(shù)據(jù)沒有顯示)。相反，對重組體鉤蟲抗原的抗體應答導致成熟鉤蟲離開小腸并進入結(jié)腸的顯著性遷移。在Ac-TMP和Ac-APR-1接種的狗中，小腸中成熟鉤蟲相對于結(jié)腸中成熟鉤蟲的比率從明礬-注射狗的43.9分別減少至6.6和7.3之間的比率。顯示抗Ac-AP抗體應答的單獨狗小腸中與結(jié)腸中鉤蟲數(shù)量的比率為1.6，表明這條狗中有幾乎一半的鉤蟲數(shù)量已經(jīng)轉(zhuǎn)移到結(jié)腸中。
性別-依賴的差異.遷移遠離小腸并遷移到結(jié)腸的雌雄鉤蟲數(shù)目是不等的。如圖35所示，從結(jié)腸回收的雌性成熟鉤蟲比回收到的雄性鉤蟲更普遍。對用Ac-APR-1(P＝0.04)和Ac-AP(P＝0.06)接種的狗而言，寄生在結(jié)腸中的雌性鉤蟲數(shù)量較多在統(tǒng)計學上是顯著的。雄鉤蟲比雌性鉤蟲更可能被從小腸回收到，盡管差異不是統(tǒng)計學上顯著的。雌雄鑒別不是在附著于1-2cm區(qū)段的被保存用于組織病理學分析的小腸的鉤蟲上進行的。這些區(qū)段中鉤蟲數(shù)目的平均數(shù)介于5和6只腸蟲的范圍之間。這些少量的腸蟲對雌雄依賴性差異的評分沒有顯著性貢獻(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
這些實例證明了用重組融合蛋白接種哺乳動物來引發(fā)抗原特異性應答是可行的，而且所述的抗體應答相關(guān)于腸中鉤蟲數(shù)量的減少或腸中寄生的鉤蟲的轉(zhuǎn)移。
實施例5.Ac-MTP-1和Ac-TTR的犬疫苗試驗實施例5A.抗體滴度和鉤蟲的減少獲得自大腸桿菌的抗原Ac-MTP-1和Ac-TTR在狗的疫苗試驗中進行測試。抗原與佐劑SBAS2一起給藥。接種疫苗的動物顯示出高水平的犬IgG2抗原-特異性抗體，以及抗原-特異性IgE的適度增加。隨后，狗通過皮下注射L3鉤蟲幼蟲進行攻擊。
如圖36A和B所示，自具有高的抗-犬鉤口線蟲(Ancylostomacanium)IgG2抗-MTP-1抗體滴度的免疫接種狗的腸中回收的成熟鉤蟲數(shù)目有統(tǒng)計學上顯著的減少?？贵w滴度和成熟鉤蟲數(shù)量之間的皮爾曼相關(guān)系數(shù)為-0.89(P＝0.04)。自具有最高抗體滴度(98只鉤蟲)的狗回收的鉤蟲數(shù)目與自具有最低抗體滴度(189只鉤蟲)的狗回收的成熟鉤蟲數(shù)目相比有相當于50％腸蟲數(shù)量的減少。相同的關(guān)系被表示在IgG2抗體滴度和中值定量卵計數(shù)之間。
Ac-MTP-1重組融合蛋白的SDS-PAGE分析之后用考馬斯藍染色，顯示遷移蛋白具有酶原的預測分子量61kDa的表觀分子量。同樣地顯示了三個一組的條帶，以較低的表觀分子量遷移，很可能對應于部分加工的Ac-MTP-1。免疫之后，每個接受疫苗的狗顯現(xiàn)高滴度的IgG2抗Ac-MTP-1-特異性抗體，范圍介于1∶40,500和1∶364,500之間；抗Ac-MTP-1-特異性IgE抗體應答范圍介于1∶500和1∶1,500之間。來自免疫接種的狗的血清識別三個一組的緊密遷移的蛋白，具有酶原和加工形式Ac-MTP-1的預測分子量，所述酶原和加工形式Ac-MTP-1處于宿主活化的L3而非未活化的L3的分泌產(chǎn)物中。
關(guān)于TTR抗原的使用，可參見圖37A和B，針對TTR具有高水平IgE和IgG1抗體的一條狗顯示出鉤蟲數(shù)量降低(6％)。
這個實施例證明了用MTP或TTR接種的哺乳動物引發(fā)了保護性抗體應答，而且在具有高抗體滴度的哺乳動物體內(nèi)觀察到鉤蟲數(shù)量的減少。
實施例5B.由于免疫接種鉤蟲抗原防止失血并減少鉤蟲大小動物還被測試以確定用鉤蟲抗原接種是否防止失血。用Ac-TTR接種表明顯著的防止了失血(附圖38A和B)。利用Mann-Whitney試驗，TTR和佐劑對照組之間的血紅蛋白(38B)濃度(P＝0.036)和hematicrit(38A)濃度(P＝0.009)二者的差異是統(tǒng)計學上顯著的。
此外，血紅蛋白濃度的差異被解釋為腸蟲大小統(tǒng)計學上的顯著減小。利用基于從宿主回收腸蟲的掃描的成像系統(tǒng)收集數(shù)據(jù)。腸蟲用CoolSnapPro數(shù)碼攝象機(Media Cybernetics)拍照，并利用宏的ImagePro軟件來測定成像從而確定處理之間所比較的腸蟲長度(mm)。如附圖39所示TTR接種疫苗的組相對于佐劑對照組，腸蟲大小在統(tǒng)計學上顯著減小(在1和2mm之間)。
這個實施例顯示用TTR接種，除了降低體內(nèi)鉤蟲數(shù)量，同樣也減少失血。
實施例6.嵌合鉤蟲抗原本實施例研究了表達對應于Na-ASP-1的氨基酸291-303(同樣也發(fā)現(xiàn)在Ac-ASP-1中)的肽抗原決定簇的兩種不同乙型肝炎核心顆粒的保護效應。之前通過研究Na-ASP-1和Ac-ASP-1推測氨基酸序列的相對親水性(疏水性和親水性)的，人們發(fā)現(xiàn)兩個分子都顯示出親水序列，所述親水序列的模型預測可代表該分子的環(huán)出區(qū)域。肽對KLH(鑰孔血藍素)的共價吸附證實嵌合分子可保護小鼠免于攻擊感染。
構(gòu)建了兩種表達ASP-1的不同嵌合分子。ICC-1546表達ASP-1氨基酸291-303作為“環(huán)出”的栓系結(jié)構(gòu)，而ICC-1564表達相同的肽作為N-末端結(jié)構(gòu)。早先的研究已經(jīng)證明小鼠抗L3抗體識別ICC-1546，而不識別ICC-1564。
抗原嵌合體如上所述用鋁膠作為佐劑被給藥。DSM(成熟犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)的去污劑溶解的膜提取物)用作陰性對照。幼蟲的攻擊通過皮下注射L3階段的幼蟲來進行。
結(jié)果表明用任一粒子免疫接種的狗產(chǎn)生高水平的抗粒子抗體。大多數(shù)抗體直接抗肝炎核心抗原成分。然而，在一只用ICC-1546接種的狗體內(nèi)，具有高水平抗ASP-1(和抗-肽)抗體。這條狗顯示出鉤蟲數(shù)量的明顯減少(表V)。
表V.抗ASP-1抗體和鉤蟲數(shù)量的比較

這個實施例證明針對ASP-1相關(guān)的特異性抗原決定簇的高抗體滴度會導致體內(nèi)鉤蟲數(shù)量降低。
實施例7.抗原在桿狀病毒/昆蟲細胞以及酵母中表達鉤蟲抗原在真核生物表達系統(tǒng)，諸如桿狀病毒/昆蟲細胞以及巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的表達，為獲得可溶性和生物活性的重組蛋白提供了最大可能。
A.在巴斯德畢赤酵母中的表達抗原Na-ASP-1，Ac-TTR，Ac-API，以及Ay-ASP-2已被成功地用畢赤酵母發(fā)酵系統(tǒng)表達。通過用便于分離的多聚組氨酸標記分離抗原。
B.在桿狀病毒/昆蟲細胞系統(tǒng)中的表達抗原Na-CTL，Ac-MEP-1，Ac-ASP-2，以及Ac-MTP-1已被成功地在桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)中表達。利用便于分離的多聚組氨酸標記分離抗原。
實施例8.錫蘭鉤口線蟲直向同源抗原Ay-ASP-1，Ay-ASP-2以及Ay-MTP的cDNAs的克隆在錫蘭鉤口線蟲幼蟲cDNA文庫構(gòu)建之后來自倉鼠寄生鉤蟲錫蘭鉤口線蟲(A.Ceylancium)的直向同源抗原被成功地克隆。
ASP-1的錫蘭鉤口線蟲直源基因(orthologue)通過利用一個900bp的32P-標記的Ac-ASP1 cDNA片段作為探針篩選錫蘭鉤口線蟲L3cDNA文庫進行克隆。篩選大約500,000個克隆得到85個陽性克隆。其中有21個克隆被測序，這其中又有19個編碼相同的cDNA。沒有發(fā)現(xiàn)其它的ASP-1的直源基因。該克隆顯示出與Na-ASP-1有85％的同一性以及92％的相似性。
通過利用一個600bp32P-標記的Ac-asp-2 cDNA片段作為探針篩選錫蘭鉤口線蟲L3 cDNA文庫的大約100,000個噬斑，獲得30個陽性克隆，其中的10個被測序且發(fā)現(xiàn)等同于Ay-ASP-2預測的ORF(直向同源克隆)。
通過利用一個590bp32P-標記的Ac-MTP cDNA片段作為探針篩選大約500,000個錫蘭鉤口線蟲L3 cDNA文庫，獲得700個陽性克隆，且其中的8個被測序。8個中又有7個編碼Ay-MTP-1，而另外的一個編碼一種推定的同種型(Ay-MTP-2)。
這個實施例證明在來自犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)和錫蘭鉤口線蟲種類的鉤蟲抗原之間有高度的相似性，且數(shù)據(jù)顯示大多數(shù)鉤蟲抗原之間有高度的同一性(＞80％)。
實施例9.免疫定位一些主要的疫苗抗原的免疫定位在成熟鉤蟲切片中進行。免疫定位的測定如下Ac-103作為鉤蟲表面抗原，Ac-FAR-1和Ac-API作為假體腔流體的組分，(Ac-API也是一種咽部蛋白)，Ac-CP-1作為雙器腺(amphidial gland)蛋白，分泌腺中的Ac-TMP，和ASP-3作為雙器和食道的蛋白。此外，該鉤蟲ES產(chǎn)物的總蛋白定位到雙器和分泌腺，以及鉤蟲消化道的刷狀邊界膜。
這個實施例證明許多鉤蟲抗原被暴露在腸蟲的表面上或由腸蟲分泌，并因此對通過宿主抗體或宿主免疫活性細胞的靶向敏感。
實施例10.在巴西Minas Gerais州進行人類研究以前在中國和其它地方已有報道，人鉤蟲傳染與其它土壤-傳播的鉤蟲病(例如，蛔蟲病和鞭蟲病)以及血吸蟲病相比較顯示出獨特的流行病學特征(Gandhi等，2001)。其它這些蠕蟲感染的流行程度和強度在童年和青春期間到達高峰且隨后成人期時下降，然而鉤蟲傳染的流行程度和強度隨年齡而增加。在許多中國人和巴西比利亞赫斯村莊(以及假定的其它地方)中中年甚至老年的居民顯示出最嚴重的感染。
解釋這個觀測結(jié)果的基礎(chǔ)免疫學機制已被研究。如附圖40和41所示，CD-4+淋巴細胞從鉤蟲感染居民的全血進行門控，并用L3可溶性鉤蟲抗原(圖40)或畢赤酵母-表達的重組Na-ASP-1(圖41)進行刺激。宿主細胞因子的產(chǎn)生通過胞內(nèi)細胞因子染色技術(shù)進行測定。兩種抗原均刺激高水平的IL-10和IL-5而非IL-4。IL-10是一種具有下調(diào)，抗炎特性的強免疫調(diào)節(jié)劑，而IL-4與抗體產(chǎn)生和TH-2型免疫相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明鉤蟲感染的個體可能對鉤蟲以及其他可能的抗原刺激無反應。
與此相反，研究發(fā)現(xiàn)用鉤蟲處理的個體產(chǎn)生IL-4。這些觀察結(jié)果表明其從腸中去除鉤蟲有助于重構(gòu)患者的免疫力。這是一個重要的觀察結(jié)果，因為其提示缺少重組鉤蟲疫苗的處理可能不會對被主動感染的患者起治療性疫苗的作用，而且提示在免疫接種之前驅(qū)蟲化學療法可能是必要的。
此外，這些觀測結(jié)果也表明鉤蟲傳染可能阻礙針對諸如HIV和瘧疾病原的成功免疫接種。在Subsaharan非洲的一些區(qū)域，鉤蟲與HIV和瘧疾重迭，在HIV或瘧疾免疫接種前監(jiān)控研究參與者的鉤蟲狀況，以及對那些在免疫之前已發(fā)現(xiàn)被主動感染的參與者進行處理可能是必需的。
盡管本發(fā)明已通過優(yōu)選實施方案的方式被描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應認識到本發(fā)明可在附屬權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)經(jīng)過改變來加以實施。因此，本發(fā)明不應被所述的實施方案所限定，而應該進一步包括在此提供的說明書的精神和范圍內(nèi)的所有改變及其等同物。
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權(quán)利要求
1.一種組合物，包括來自鉤蟲的重組或合成的抗原或其片段，以及，可藥用載體。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述重組或合成的抗原顯示與選自下列的抗原有至少大約80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述抗原是Ac-TMP。
4.權(quán)利要求2的組合物，其中所述抗原是Ac-MEP-1。
5.權(quán)利要求2的組合物，其中所述抗原是Ac-MTP-1。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述鉤蟲的種類選自美洲板口線蟲(Nector americanus)，犬鉤口線蟲(Ancylostoma canium)，錫蘭鉤口線蟲(Ancylostoma ceylancium)，和十二指腸鉤口線蟲(Ancylostomaduodenale)。
7.一種引發(fā)哺乳動物體內(nèi)對鉤蟲免疫應答的方法，所述方法包括如下步驟給所述哺乳動物施用有效量的組合物，所述組合物包括來自鉤蟲的重組或合成的抗原或其片段，以及可藥用載體。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述重組或合成的抗原顯示與選自下列的抗原有至少大約80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述抗原是Ac-TMP。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述抗原是Ac-MEP-1。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述抗原是Ac-MTP-1。
12.權(quán)利要求7的方法，其中所述鉤蟲的種類選自美洲板口線蟲，犬鉤口線蟲，錫蘭鉤口線蟲，和十二指腸鉤口線蟲。
13.一種免疫接種哺乳動物抗鉤蟲的方法，所述方法包括如下步驟給所述哺乳動物施用有效量的組合物，所述組合物包括來自鉤蟲的重組或合成的抗原或其片段，以及可藥用載體。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述重組或合成的抗原顯示與選自下列的抗原有至少大約80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述抗原是Ac-TMP。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述抗原是Ac-MEP-1。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述抗原是Ac-MTP-1。
18.權(quán)利要求13的方法，其中所述鉤蟲的種類選自美洲板口線蟲，犬鉤口線蟲，錫蘭鉤口線蟲，和十二指腸鉤口線蟲。
19.一種組合物，包括來自鉤蟲的重組或合成的抗原或其片段，其中所述重組或合成的抗原顯示與選自下列的抗原有至少大約80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR，以及，可藥用載體。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗原是Ac-TMP。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗原是Ac-MEP-1。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗原是Ac-MTP-1。
23.權(quán)利要求19的方法，其中所述鉤蟲的種類選自美洲板口線蟲，犬鉤口線蟲，錫蘭鉤口線蟲，和十二指腸鉤口線蟲。
24.一種疫苗，包括來自鉤蟲的重組或合成的抗原或其片段，其中所述重組或合成的抗原顯示與選自下列的抗原有至少大約80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR，以及，可藥用載體。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗原是Ac-TMP。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗原是Ac-MEP-1。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗原是Ac-MTP-1。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述鉤蟲的種類選自美洲板口線蟲，犬鉤口線蟲，錫蘭鉤口線蟲，和十二指腸鉤口線蟲。
29.一種引發(fā)免疫應答的組合物，所述組合物包括來自鉤蟲的重組或合成的抗原或其片段，其中所述重組或合成的抗原顯示與選自下列的抗原有至少大約80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR，以及，可藥用載體。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述抗原蛋白，多肽或者其片段是Ac-TMP。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述抗原蛋白，多肽或者其片段是Ac-MEP-1。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述抗原蛋白，多肽或者其片段是Ac-MTP-1。
33.權(quán)利要求29的方法，其中所述鉤蟲的種類選自美洲板口線蟲，犬鉤口線蟲，錫蘭鉤口線蟲，和十二指腸鉤口線蟲。
34.一種能夠免疫接種患者抗傳染病的方法，所述方法包括如下步驟a)治療鉤蟲感染到足以增加淋巴細胞增殖的程度；以及b)免疫接種所述患者抗所述傳染病。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述傳染病選自HIV，結(jié)核病，瘧疾，麻疹，破傷風，白喉，百日咳，以及脊髓灰質(zhì)炎。
36.一種用于鉤蟲免疫接種的方法，所述方法包括如下步驟a)化學治療鉤蟲感染的患者來改善鉤蟲傳染；以及b)在改善鉤蟲傳染后用來自鉤蟲的重組或合成的抗原或其片段免疫接種所述患者。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述重組或合成的抗原顯示與選自下列的抗原有至少大約80％的同一性Na-ASP-1，Na-ACE，Na-CTL，Na-APR-1，NA-APR-2，Ac-TMP，Ac-MEP-1，Ac-MTP-1，Ac-ASP-1，Ac-ASP-2，Ac-ASP-3，Ac-ASP-4，Ac-ASP-5，Ac-ASP-6，Ac-TTR-1，Ac-103，Ac-VWF，Ac-CTL，Ac-API，Ac-MTP-1，Ac-MTP-2，Ac-MTP-3，Ac-FAR-1，Ac-KPI-1，Ac-APR-1，Ac-APR-2，Ac-AP，Ay-ASP-1，Ay-ASP-2，Ay-MTP-1，Ay-API，和Ay-TTR。
38.一種降低鉤蟲感染患者失血的方法，所述包括如下步驟給所述患者施用一種組合物，所述組合物包括來自鉤蟲的重組或合成的抗原或其片段，以及，可藥用載體。
39.一種減小鉤蟲感染患者體內(nèi)鉤蟲大小的方法，所述方法包括如下步驟給所述的患者施用一種組合物，所述組合物包括來自鉤蟲的重組或合成的抗原或其片段，以及可藥用載體。
40.一種降低感染鉤蟲患者體內(nèi)鉤蟲數(shù)量的方法，所述方法包括如下步驟給所述的患者施用一種組合物，所述組合物包括來自鉤蟲的重組或合成的抗原或其片段，以及可藥用載體。
41.SEQ ID NO.11。
42.SEQ ID NO.12。
43.SEQ ID NO.13。
44.SEQ ID NO.14。
45.SEQ ID NO.15。
46.SEQ ID NO.16。
47.SEQ ID NO.5。
48.SEQ ID NO.6。
49.SEQ ID NO.7。
50.SEQ ID NO.8。
51.SEQ ID NO.9。
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53.SEQ ID NO.11。
54.SEQ ID NO.12。
55.SEQ ID NO.21。
56.SEQ ID NO.22。
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58.SEQ ID NO.24。
59.SEQ ID NO.25。
60.SEQ ID NO.26。
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66.SEQ ID NO.32。
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71.SEQ ID NO.37。
72.SEQ ID NO.38。
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90.SEQ ID NO.60。
91.SEQ ID NO.61。
92.SEQ ID NO.62。
93.SEQ ID NO.63。
94.SEQ ID NO.64。
95.一種Ac-APR-2抗原。
96.一種來自線蟲的Ay-TTR抗原。
97.權(quán)利要求96的Ay-TTR抗原，其中所述線蟲是鉤蟲。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種引發(fā)對鉤蟲抗原的免疫應答且可被用作鉤蟲疫苗的制劑。此外，本發(fā)明還提供了一種增加感染鉤蟲的患者體內(nèi)抗傳染病的免疫接種有效性的方法。所述方法包括在施用疫苗之前化學治療鉤蟲群襲。
文檔編號A61K39/00GK1571677SQ02820769
公開日2005年1月26日 申請日期2002年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月17日
發(fā)明者彼得·霍特茲, 詹姆斯·阿什科姆, 瑪赫納茲·巴姆錢, 詹彬, 王艷, 約翰·霍當, 亞歷山大·勞卡斯, 安杰拉·威廉森, 布賴恩·瓊斯 申請人:喬治華盛頓大學