專利名稱：非免疫抑制的環(huán)孢菌素類似分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于環(huán)孢菌素家族且特別屬于環(huán)孢菌素A(CsA)的新類似物的分子， 其具有降低的或沒有免疫抑制活性且結(jié)合親環(huán)素(CyP)。
背景技術(shù)：
環(huán)孢菌素是具有有效免疫抑制劑活性的環(huán)狀多肽種類的成員。至少部分這類化合物(如環(huán)孢菌素A (CsA))是由物種多孢木屬真菌ijolypocladium inflatum)的次級(jí)代謝物產(chǎn)生的。CsA為有效的免疫抑制劑，已證明其能抑制體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，諸如同種異體移植物排斥、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎、弗氏佐劑性關(guān)節(jié)炎和移植物抗宿主疾病。其被用于在器官移植中預(yù)防器官排斥；以及用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和用于治療銀屑病。盡管環(huán)孢菌素家族中許多化合物是已知的，CsA是醫(yī)學(xué)上可能最為廣泛應(yīng)用的。 CsA的免疫抑制效應(yīng)涉及抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的激活事件。免疫抑制是通過環(huán)孢菌素與普遍存在的稱為親環(huán)素(cyclophilin) (CyP)的胞內(nèi)蛋白相結(jié)合來完成的。該復(fù)合物又抑制鈣神經(jīng)素酶的鈣和鈣調(diào)蛋白-依賴性絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶活性。鈣神經(jīng)素的抑制阻止轉(zhuǎn)錄因子如NFATP/。和NF- κ B的激活，這對(duì)于T細(xì)胞激活中細(xì)胞因子基因(JL-2、IFN- γ、IL-4和 GM-CSF)的誘導(dǎo)是必需的。自從最初發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素以來，已經(jīng)分離和鑒定了廣泛多樣的天然存在的環(huán)孢菌素。另外，已經(jīng)通過部分或完全合成手段和通過應(yīng)用改良的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備了許多并非天然存在的環(huán)孢菌素。因此，包含環(huán)孢菌素的物種基本上包括例如天然存在的環(huán)孢菌素 A Z ；多種非天然存在的環(huán)孢菌素衍生物；人工或合成的環(huán)孢菌素，包括二氫環(huán)孢菌素和異環(huán)孢菌素；衍生的環(huán)孢菌素(例如Mefeit殘基的3’ _0_原子可進(jìn)行?；?，或3_位置上肌氨?；鶜埢峡梢肫渌〈?；其中Metot殘基以異構(gòu)形式存在的環(huán)孢菌素(例如其中Mefeit殘基位置6’和V位上的構(gòu)型為順式而非反式)；和其中肽序列中特定位置上摻入變體氨基酸的環(huán)孢菌素。在位置1含有改性氨基酸的環(huán)孢菌素類似物公開于WO 99/18120和WO 03/033527 中，在此將其整體引入作為參考。這些申請(qǐng)描述了稱為“ ISATX247 ”或“ ISA247 ”或“ ISA”的環(huán)孢菌素衍生物。該類似物除了在氨基酸-1殘基上的修改外，結(jié)構(gòu)上與環(huán)孢菌素A相同。 申請(qǐng)人:先前發(fā)現(xiàn)ISA247的順式和反式異構(gòu)體的一些混合物(包括主要包含反式ISA247的混合物)顯示了增強(qiáng)免疫抑制性效力和降低毒性的組合作用，優(yōu)于天然存在和目前已知的環(huán)孢菌素。已經(jīng)確定環(huán)孢菌素有三個(gè)細(xì)胞靶標(biāo)；鈣神經(jīng)素，CyP亞型(包括但不限于CyP-A、 CyP-B和CyP-D)，和P-糖蛋白(PgP)。環(huán)孢菌素與鈣神經(jīng)素的結(jié)合導(dǎo)致顯著的免疫抑制，且負(fù)責(zé)與移植和自體免疫跡象的傳統(tǒng)聯(lián)系。親環(huán)素家族
CyPs (酶委員會(huì)(EC)編號(hào)5. 1.2. 8)屬于一類蛋白質(zhì)，具有肽酰_脯氨酰順-反式異構(gòu)酶活性；這種蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為親免素，包括Π(-506-結(jié)合蛋白質(zhì)和小細(xì)胞蛋白(parvulins)。 CyI3S被發(fā)現(xiàn)在所研究的所有生物體(原核生物和真核生物)的所有細(xì)胞中，且在進(jìn)化中結(jié)構(gòu)上是保守的。人類有 7 個(gè)主要 CyPs，即 CyP-A、CyP-B, CyP-C, CyP-D, CyP-E, CyP_40、 和CyP-NK(首次從人天然殺傷細(xì)胞中鑒定出來)，總計(jì)16種獨(dú)特的蛋白質(zhì)(Galat A. Peptidylprolyl cis/trans isomerases (immunophilins) biological diversity -targets - functions. CurrTop Med Chem 2003, 3:1315-1347; Waldmeier PC 等· Cyclophilin D as a drug target. Curr Med Chem 2003, 10:1485—1506)。在哺乳動(dòng)物中鑒定的第一個(gè)Cyl^s成員是CyP-A。CyP-A是18_kDa的細(xì)胞溶質(zhì)蛋白質(zhì)，且是CsA結(jié)合最豐富的蛋白質(zhì)。據(jù)估計(jì)，CyP-A組成0.6%的總細(xì)胞溶質(zhì)蛋白質(zhì) (Mikol V 等.X-ray structure of monmeric cyclophilin A-cycloporin A crystal complex at 2. 1 A resolution. J. Mol. Biol. 1993，234:1119—1130; Galat A 等. Metcalfe SM. Peptidylproline cis/trans isomerases. Prog. Biophys. MoL Biol. 1995， 63:67-118)。親環(huán)素的細(xì)胞位置
Cyl^s可發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)組織的大多數(shù)細(xì)胞腔隙中，且編碼獨(dú)特的功能。在哺乳動(dòng)物中，CyP-A和CyP-40是細(xì)胞溶質(zhì)的，而CyP-B和CyP-C具有氨基-末端的信號(hào)序列， 靶向其至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)分泌途徑(綜述于feilat，2003; Dornan J等.Mructures of immunophilins and their ligand complexes. Curr Top Med Chem 2003, 3:1392-1409)。CyP-D 具有信號(hào)序列，其直接指向線粒體(Andreera, 1999; Hamilton GS 等· Immunophilins beyond immunosuppression. J Med Chem 1998, 41 5119-5143)； CyP-E具有氨基-末端的RNA-結(jié)合域，且位于胞核(Mi H等.A nuclear RNA-binding cyclophilin in human T cells. FEBS Lett 1996，398:201-205)，CyP-40 具有 TPRs， 且位于細(xì)胞溶膠(Kieffer LJ 等· cyclophilin-40, a protein with homology to the P59 component of the steroid receptor complex. Cloning of the cDNA and further characterization. J Biol Chem 1993，268:12303-12310)。人 CyP-NK 是最大的CyP，具有巨大的親水性和帶正電荷的羧基端，且位于細(xì)胞溶膠(Anderson SK等. A eyelophilin-related protein involved in the function of natural killer cells. Proc Natl Acad Sci USA 1993，90:542-546; Rinfret A 等· The N-terminal cyclophilin-homologous domain of a 150—kilodalton tumor recognition molecule exhibits both peptidylprolyl cis~transisomerase and chaperone activities. Biochemistry 1994， 33:1668-1673)。親環(huán)素的功能與活性
CyPs是在許多細(xì)胞過程中涉及的多功能蛋白質(zhì)。因?yàn)镃yI^s在進(jìn)化自始至終是高度保守的，這表明CyI^s有至關(guān)重要的作用。最初，人們發(fā)現(xiàn)CyI^s具有催化肽基_脯氨酰鍵順反異構(gòu)化的特異酶性能(Galat, 1995; Fisher GA, Halsey J, Hausforff J,等.Aphase I study of paclitaxel (taxol) (T) in combination with SDZ valspodar, a potentmodulator of multidrug resistance (MDR). Anticancer Drugs. 1994； 5 (Suppl 1): 43)。因此，Cyl^s被稱為肽酰-脯氨酰-順反式異構(gòu)酶(PPI酶)，它可以在新合成的蛋白質(zhì)的固有折疊中充當(dāng)加速因子，PPI酶也參與修復(fù)由于環(huán)境應(yīng)激受損的蛋白質(zhì)，所述環(huán)境應(yīng)激包括熱應(yīng)激、紫外線照射、細(xì)胞環(huán)境的PH變化、和氧化劑的治療。此功能被稱為分子陪伴活性(Yao Q 等· Roles of cyclophilins in Cancers and Other Organs Systems. World J. Surg. 2005，29: 276- 280)。此外，最近顯示，CyPs的PPI酶活性涉及不同的細(xì)胞過程，包括細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸(Andreeva L 等.Cyclophilins and their possible role in the stress response. Int J Exp Pathol 1999，80:305-315，Caroni P 等· New member of the cyclophilin family associated with the secretory pathway. J Biol Chem 1991 ，266:10739-42)、線粒體功能(Halestrap AP 等.CsA binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Mol Cell Biochem 1997， 174:167-72； Connern CP, Halestrap AP. Recruitment of mitochondrial cyclophilin to the mitochondrial inner membrane under conditions of oxidative stress that enhance the opening of a calcium-sensitive non-specific channel. Biochem J 1994，302:321-4)、mRNA 前體力口工(Bourquin JP 等· A serine/argininerich nuclear matrix cyclophilin interacts with the Cterminal domain of RNA polymerase II. Nucleic Acids Res 1997，25:2055-61)、和多蛋白復(fù)合體穩(wěn)定性維護(hù)(Andreeva，1999)。環(huán)孢菌素在疏水口袋內(nèi)經(jīng)由接觸以納摩爾親和力與CyP-A結(jié)合(Colgmi J 等.cyclophilin A-Deficient Mice Are Resistant to Immunosuppression by Cyclosporine. The Journal of Immunology 2005， 174: 6030- 6038， Mikolj 1993), 并抑制PPI酶活性。然而，這種效應(yīng)被認(rèn)為是與免疫抑制不相關(guān)的。更正確地，CsA和 CyP-A之間的復(fù)合體建立了復(fù)合表面，其結(jié)合并阻止鈣神經(jīng)素調(diào)控細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄 (Friedman J 等.Two cytoplasmic candidates for immunophilin action are revealed by affinity for a new cyclophilin: one in the presence and one in the absence of CsA. Cell 1991 , 66: 799-806; Liu J 等· Calcineurin is a common target of cyclophilin-CsA and FKBP-FK506 complexes. Cell 1991 ， 66: 807- 815)。親環(huán)素的同源性
CyP-A，典型的家族成員，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高度保守的蛋白質(zhì)(Handschumacher RE 等· cyclophilin: a specific cytosolic binding protein for CsA. Science 1984, 226: 544-7)。人CyP-A的序列同源性分析顯示，其與人CyP_B、CyP_C、和CyP-D是高度同源的(Harding MW, Handschumacher RE, Speicher Dff. Isolation and amino acid sequence of cyclophilin. J Biol Chem 1986，261 :8547-55)。通過高度保守區(qū)域的約109個(gè)氨基酸，形成了結(jié)合口袋內(nèi)所有CyI^s的環(huán)孢菌素。已知的CyI^s中，CyP-D具有與CyP-A最高的同源性。事實(shí)上，在這一地區(qū)的序列同一性100%在CyP-A和CyP-D之間(Waldmeier 2003； Kristal BS 等· The Mitochondrial Permeability Transition as a Target for Neuroprotection. Journal of Bioenergetics and Biomembranes 2004，36( 4) ； 309- 312)。因此，CyP-A親和性能非常好的預(yù)測(cè)CyP-D親和性，反之亦然(Hansson MJ 等.The Nonimmunosuppressive Cyclosporine analogues NIM811 and UNIL025 Display Nanomolar Potencies on Permeability Transition in Brain-Derived Mitochondria. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 2004, 36(4): 407—413)。 這種關(guān)系已經(jīng)反復(fù)得到環(huán)孢菌素類似物的經(jīng)驗(yàn)性證明(Hansson，2004; Ptak Rg等. Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication in Human Cells by Debio—025， a Novel cyclophilin Binding kgerit_Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2008: 1302- 1317 ； Millay DP 等· Genetic and pharmacologic inhibition of mitochondrial dependent necrosis attenuates muscular dystrophy. Nature Medicine 2008, 14(4) : 442-447； Harris R φ . The Discovery of Novel Non-Immunosuppressive Cyclosporine Ethers and Thioethers With Potent HCV Activity. Poster # 1915， 59th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD), 2008)。CyPs 的序列同源性提議，所有 CyPs 是環(huán)孢菌素類似物的潛在靶標(biāo)。因?yàn)镃yI^s涉及眾多的細(xì)胞過程，這進(jìn)一步提議，保持顯著結(jié)合 CyP的CsA類似物可用于治療許多疾病的適應(yīng)證。
親環(huán)素介導(dǎo)的疾病
人免疫缺陷病毒(HIV)
HIV是逆轉(zhuǎn)錄病毒家族的慢病毒屬，并充當(dāng)CyP在某些病毒感染和復(fù)制過程中參與的實(shí)例。CyP-A在十年前就已被確定為抗HIV化療中有效的靶標(biāo)(Rosenwirth BA等. Cyclophilin A as a novel target in anti-HIV-1 chemotherapy. Int. Antivir. News 1995，3:62-63)。CyP-A在HIV-I復(fù)制周期中滿足早期的基本功能。它被發(fā)現(xiàn)特異性結(jié)合 HIV-I Gag 多聚蛋白(Luban JKL 等.Human immunodeficiency virus type 1 Gag protein binds to cyclophilins A and B. Cell 1993，73: 1067-107 。衣殼蛋白pM (CA)的G89和P90周圍確定的氨基酸序列被鑒定為CyP-A的結(jié)合位點(diǎn) (Bukovsky AAA 等.Transfer of the HIV-I cyclophilin-binding site to simian immunodeficiency virus from Macaca mulatta can confer both cyclosporine sensitivity and cyclosporine dependence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 10943-10948； Gamble TRF 等· Crystal structure of human cyclophilin A bound to the amino- terminal domain of HIV-I capsid. Cell 1996, 87: 1285-1294)。 CyP-A對(duì)CA的親和力促進(jìn)CyP-A在組裝中摻入病毒體顆粒(Thali MA等.Functional association of cyclophilin A with HIV-I virions. Nature 1994, 372: 363-365)。 實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，CyP-A-CA的相互作用是HIV-I復(fù)制必不可少的；抑制這種相互作用會(huì)損害人類細(xì)胞中 HIV-I 的復(fù)制(Hatziioannou TD 等· Cyclophilin interactions with incoming human immunodeficiency virus type 1 capsids with opposing effects on infectivity in human cells. J. Virol. 2005, 79: 176-183; Steinkasserer AR 等.Mode of action of SDZ NIM 811, a nonimmunosuppressive CsA analog with activity against human immunodeficiency virus type 1 (HIV-I): interference with early and late events in HIV- 1 replication. J. Virol 1995, 69: 814-824)。 在CyP-A涉及的病毒復(fù)制周期的步驟被證明是病毒顆粒滲透之后和雙鏈病毒DNA整合到細(xì)胞基因組之前的事件(Braaten DEK 等· Cyclophilin A is required for an earlystep in the life cycle of human immunodeficiency virus type 1 before the initiation of reverse transcription. J. Virol 1996 70: 3551—3560，Mlynar ED 等· The non-immunosuppressive CsA analogue SDZ NIM 811 inhibits cyclophilin A incorporation into virions and virus replication in human immunodeficiency virus type 1—infected primary and growth- arrested T cells. J. Gen. Virol 1996，78: 825-835; Steinkassererj 1995)。CsA 抗 HIV-1 的活性首先報(bào)道于 1988 年 (Wainberg MA 等· The effect of CsA on infection of susceptible cells by human immunodeficiency virus type 1. Blood 1998，72: 1904-1910)。對(duì)CsA和許多衍生物抑制HIV-I復(fù)制的評(píng)價(jià)揭示非免疫抑制的CsA類似物具有抗HIV-I的活性，其相當(dāng)于或者甚至優(yōu)于那些免疫抑制的類似物(Bartz SRE等.hhibition of human immunodeficiency virus replication by nonimmunosuppressive analogs of CsA. Proa Natl. Acad. Sci. USA 1995，92: 5381- 5385，Billich AF 等.Mode of action of SDZ NIM 811，a nonimmunosuppressive CsA analog with activity against human immunodeficiency virus (HIV) type 1: interference with HIV protein-cyclophilin A interactions. J. Virol 1995，69: 2451-2461 ； Ptakj 2008)。炎癥
疾病中的炎癥涉及白細(xì)胞(白血細(xì)胞)流入感染區(qū)域。白細(xì)胞被趨化因子(化學(xué)吸引劑家族)吸引到該區(qū)域。體外研究表明，細(xì)胞外的CyP-A是人白細(xì)胞和T細(xì)胞有效的化學(xué)吸弓I劑(Kamalpreet A 等· Extracellular cyclophilins Contribute to the Regulation of Inflammatory Responses Journal of Immunology 2005； 175: 517—522; Yurchenko VG 等· Active-site residues of cyclophilin A are crucial for its signaling activity via CD147. J. Biol. Chem. 2002; 277: 22959-22965; Xu QMC 等· Leukocyte chemotactic activity of cyclophilin. J. Biol. Chem. 1992； 267: 11968-11971 ； Allain FC 等· Interaction with glycosaminoglycans is required for cyclophilin B to trigger integrin-mediated adhesion of peripheral blood T lymphocytes to extracellular matrix. Proc· Natl. Acad. ScL USA 2002; 99: 2714—2719)。此外當(dāng)體內(nèi)注入時(shí)，CyP-A可誘導(dǎo)迅速的其特征在于白細(xì)胞流入的炎癥應(yīng)答(Sherry BN 等.Identification of cyclophilin as a proinflammatory secretory product of lipopolysaccharide-activated macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992； 89: 3511-351 。CyP-A是普遍分布在細(xì)胞內(nèi)的，然而在炎癥應(yīng)答過程中，CyP-A通過活的和瀕死的細(xì)胞釋放到細(xì)胞外組織間隙(Sherry，1992)。事實(shí)上，在幾種不同的炎癥性疾病(包括敗血癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)和血管平滑肌細(xì)胞疾病中，已經(jīng)報(bào)告了升高水平的CyP-ACJin ZG 等.Cyclophilin A is a secreted growth factor induced by oxidative stress. Circ. Res. 2000; 87: 789-796; Teger, 1997; Billich, 1997)。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的情形中，報(bào)道了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑液中的CyP-A水平和嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量之間的正相關(guān)性 (Billich, 1997)。癌癥
最近在許多癌癥組織和細(xì)胞系中，包括但不限于在小和非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌和乳腺癌中，CyP-A顯示出過度表達(dá)(Li，2006; Yang H等.CyclophilinA is upregulated in small cell lung cancer and activates ERK1/2 signal. Biochemical and Biophysical Research Communications 2007； 361 : 763—767; Campa, 2003)。在提供外源性CyP-A的情況下，顯示出刺激癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(Li，2006; Yang, 2007)，而CsA阻止該生長(zhǎng)(CampEi，2003)。最近，已經(jīng)證明了 CyP (A和B)錯(cuò)綜復(fù)雜地參與允許人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的生化途徑，和CyP敲除實(shí)驗(yàn)降低了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和運(yùn)動(dòng)(Fang F 等.The expression of Cyclophilin B is Associated with Malignant Progression and Regulation of Genes Implicated in the Pathogenesis of Breast Cancer. The American Journal of Pathology 2009; 174(1) : 297—308; Zheng J 等. Prolyl lsomerase Cyclophilin A Regulation of Janus-Activated Kinase 2 and the Progression of Human Breast Cancer. Cancer Research 2008； 68 (19): 7769-7778)。 最有趣地，異種移植乳腺癌細(xì)胞的小鼠的CsA治療誘發(fā)腫瘤壞死和完全地抑制轉(zhuǎn)移 (Zheng, 2008)。研究人員得出“親環(huán)素B的作用可顯著地促成人乳腺癌的發(fā)病機(jī)制”和“親環(huán)素的抑制可能是一種人乳腺癌治療的新治療策略”(Fang，2009; Zheng, 2008)。丙型肝炎
丙型肝炎病毒(HCV)是世界上最普遍的肝臟疾病，被世界衛(wèi)生組織視為一種流行病。 因?yàn)镠CV可以在被發(fā)現(xiàn)之前感染患者數(shù)十年，它通常被稱為“靜息的”流行病。研究表明，全世界超過2億人感染了 HCV，約世界人口 3. 3 %的總發(fā)病率。僅在美國(guó)，近4百萬人感染或已經(jīng)感染HCV ；其中270萬人經(jīng)歷慢性感染。所有HCV感染個(gè)體處于正發(fā)展為嚴(yán)重威脅生命的肝臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。慢性丙型肝炎當(dāng)前的標(biāo)準(zhǔn)治療包括聚乙二醇干擾素與利巴韋林這兩種廣義的抗病毒劑組合的聯(lián)用(Craxi A 等· Clinical trial results of peginterferons in combination with ribavirin. Semin Liver Dis 2003 ； 23 (Suppl 1): 35- 46)。這禾中 ^c 1^(^^^50% (MoIino BF. Strategic Research Institute: 3rd annual viral hepatitis in drug discovery and development world summit 2007. AMRI Technical Reports ； 12(1))。最近已證實(shí)，CyP-B是丙型肝炎病毒(HCV)基因組有效復(fù)制的關(guān)鍵(Watashi K 等.Cyclophilin BIsa Functional Regulator of Hepatitis C Virus RNA Polymerase. Molecular Cell 2005, 19: 111-122)。對(duì)于其有效的基因組復(fù)制，病毒依賴于宿主衍生的因子諸如CyP-B。CyP-B與HCV RNA聚合酶NS5B相互作用，直接刺激其RNA 結(jié)合活性。RNA干擾(RNAi)介導(dǎo)減少的內(nèi)源性CyP-B表達(dá)和引起NS5B結(jié)合CyP-B的損失均降低了 HCV的復(fù)制水平。因此，CyP-B充當(dāng)HCV復(fù)制機(jī)構(gòu)中NS5B的刺激調(diào)節(jié)劑。這種對(duì)病毒復(fù)制的調(diào)節(jié)機(jī)制可鑒別CyP-B為抗病毒治療策略的靶標(biāo)。不像其他的HCV的治療，親環(huán)素抑制不直接靶向作用于HCV病毒。因此，認(rèn)為對(duì)CyP結(jié)合的藥物耐受將比目前HCV治 '-ffM^^MU^E'U (Manns MP,等.The way forward in HCV treatment- finding the right path. Nature Reviews Drug Discovery 2007; 6: 991—1000)。此夕卜，通過干擾宿主-病毒相互作用的水平，CyP抑制可能會(huì)打開抗HCV治療的新途徑，它不僅對(duì)干擾素為基礎(chǔ)的治療，而且對(duì)直接靶向HCV復(fù)制酶如蛋白酶和聚合酶抑制劑的未來治療均可為互補(bǔ)的 (Flisiak R, Dumont JM, Crabbe R. Cyclophilin inhibitors in hepatitis C viral infection. Expert Opinion on Investigational Drugs 2007, 16(9): 1345- 1354)。 影響HCV病毒復(fù)制的新型抗HCV藥物的開發(fā)已顯著受礙于缺乏合適的實(shí)驗(yàn)室HCV模型。這一障礙最近通過開發(fā)幾種合適的細(xì)胞培養(yǎng)模型(Subgenomic HCV Replicon Systems)和含有人肝細(xì)胞的小鼠模型(Goto K,等.Evaluation of the anti-hepatitis C virus effects of cyclophilin inhibitors, CsA, and NIM811. Biochem Biophys Res Comm 2006； 343: 879-884； Mercer DF,等· Hepatitis C virus replication in mice with chimeric human livers. Nat Med 2001 ； 7: 927-933)剛剛得到克服。環(huán)孢菌素最近在篩選模型和小型臨床試驗(yàn)中證實(shí)了抗HCV活性(Watashi K，等.CsAsuppresses replication of hepatitis C virus genome in cultured hepatocytes. Hepa to logy 2003； 38:1282-1288； lnoue K, Yoshiba Μ. Interferon combined with cyclosporine treatment as an effective countermeasure against hepatitis C virus recurrence in liver transplant patients with end-stage hepatitis C virus related disease. Transplant Proc 2005; 37:1233-1234)。肌肉退行性障礙
CyP-D是所有細(xì)胞中線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MTP)的組成部分。MTP孔的功能是提供細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。在正常條件下，MTP孔的開放和關(guān)閉是可逆的。在涉及過量鈣流入細(xì)胞內(nèi)的病理?xiàng)l件下，這使線粒體超負(fù)荷了且誘導(dǎo)了 MPT孔的不可逆開放，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡。據(jù)報(bào)道，CsA在烏爾里希(Ullrich)先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥和Bethlam肌病的患者中糾正了其線粒體的功能障礙和肌細(xì)胞凋亡[(Merlini L等.CsA corrects mitochondrial dysfunction and muscle apoptosis in patients with collagen Vl myopathies. PNAS 2008; 105(13) : 5225-5229]。CsA已在體外證實(shí)了其劑量依賴性地抑制離體心肌線粒體的 mPTP開放，從而阻止細(xì)胞凋亡和允許細(xì)胞有修復(fù)的寶貴時(shí)間(Gomez L等.hhibition of mitochondrial permeability transition improves functional recovery and reduces mortality following acute myocardial infarction in mice Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007，293: H16M-H1661)。在58例存在急性心肌梗死患者的臨床研究中， 與觀察安慰劑的結(jié)果相比，證實(shí)了在再灌注時(shí)間施用CsA與較少的梗死相關(guān)(Piot C等. Effect of Cyclosporin on Reperfusion Injury in Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine 2008; 395(5): 474—481 ))。慢性神經(jīng)退行性疾病
CsA可作為由于頭部外傷的急性腦缺血和損壞情況下的神經(jīng)保護(hù)劑(Ke印M,等. Intrathecal cyclosporine prolongs survival of late-stage ALS mice. Brain Research 2001 ； 894: 327-331)。CsA治療的動(dòng)物顯示出引人注目的80%的存活率，而在缺乏治療的情況下相對(duì)地只有10%存活率。在后來確立了這在很大程度上是CsA結(jié)合線粒體CyP-D的結(jié)果。隨后確立了 CsA的效用延伸到慢性神經(jīng)退行性變，正如后來在盧伽雷(Lou Gerhig)病(ALS)的大鼠模型中證實(shí)的(美國(guó)專利號(hào)5，972，擬4)，其中CsA治療增加了一倍以上的剩余壽命。最近還表明，在CyP-D敲除小鼠中CyP-D失活保護(hù)了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(多發(fā)性硬化癥的動(dòng)物模型)的軸突(Forte M等.Cyclophilin D inactivation protects axons in experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model of multiple sclerosis. PNAS 2007; 104(18) : 7558-7563)。在阿爾茨海默氏病小鼠模型中，缺乏CyP-D基本上提高了學(xué)習(xí)和記憶以及突觸的功能(Du H等. Cyclophilin D deficiency attenuates mitochondrial and neuronal perturbation andameliorates learning and memory in Alzheimer's disease Nature Medicine 2008, 14(10) : 1097-1105)。此外，CsA在亨廷頓大鼠模型中被證明是有效的(Leventhal L等. CsA protects striatal neurons in vitro and in vivo from 3-nitropropionic acid toxicity. Journal of Comparative Neurology 2000， 425(4) : 471—478)，禾口在中白金森小鼠模型是部分有效的(Matsuura K 等· CsA attenuates degeneration of dopaminergic neurons induced by 6-hydroxydopamine in the mouse brain. Brain Research 1996, 733(1): 101-104)。因此，線粒體依賴性壞死代表突出的發(fā)病機(jī)制，提議抑制CyP-D可以提供對(duì)這些疾病新的藥理學(xué)治療策略O(shè)u，2008)。由于細(xì)胞鈣離子(Ca2+)穩(wěn)態(tài)喪失的細(xì)胞、組織和器官的損傷
Ca2+在細(xì)胞水平上參與許多生理進(jìn)程，包括健康的線粒體功能。在某些病理?xiàng)l件，如心肌梗死、中風(fēng)、急性肝毒性、膽汁淤積、和移植器官的存儲(chǔ)/再灌注損傷中，線粒體喪失調(diào)節(jié)鈣水平的能力，過多鈣累積在線粒體基質(zhì)中，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜大量的孔開放(Rasola A. 等· The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis 2007，12: 815-833)。高達(dá) 1. 5 千道爾頓的離子和分子通過孔的非選擇性傳導(dǎo)，被稱為線粒體通透性轉(zhuǎn)變的過程，導(dǎo)致線粒體膨脹和其他事件，其達(dá)到細(xì)胞死亡，包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的成分之一是CyP-D。CyP-D是親免素分子，其異構(gòu)酶活性調(diào)節(jié)MPTP的開放，通過CsA或CsA類似物抑制異構(gòu)酶活性可抑制產(chǎn)生MPTP，從而防止細(xì)胞死亡。非免疫抑制的環(huán)孢菌素類似物親環(huán)素抑制劑
盡管在上述適應(yīng)證中CsA存在有利效應(yīng)，但免疫抑制伴發(fā)的效應(yīng)限制了 CsA作為CyP 抑制劑在臨床實(shí)踐中的實(shí)用性。目前，只有少數(shù)CsA類似物已被證明有很少或降低的免疫抑制活性(即<10%的CsA免疫抑制效能)，并且仍然保留其結(jié)合CyP的能力(即與CsA相比>10%的結(jié)合能力)。NIM 811 (Melle4 -環(huán)孢菌素)
NIM 811是真菌雪白彎頸霉iTolypocladimi niveum)的發(fā)酵產(chǎn)物，在第4個(gè)氨基酸上的改性顯示無免疫抑制活性(由于缺乏鈣神經(jīng)素結(jié)合)，但保留對(duì)CyP-A的結(jié)合親禾口力(Rosenwirth BA 等.Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by SDZ NIM 811, a nonimmunosuppressive Cyclosporine Analogue. Antimicrob Agents Chemother 1994, 38: 1763—1772)。DEBIO 025 (MeAla3EtVal4-環(huán)孢菌素)
DEBIO 025是在第3和4個(gè)氨基酸上的雙元化學(xué)改性的CsA，也顯示沒有免疫抑制活性，仍還保留對(duì)CyP-A PPI酶活性的結(jié)合親和力(Kristal, 2004)。SCY-635 (二甲氨基乙基硫代Sar3-羥基Leu4-環(huán)孢菌素)
SCY-635在第3和4個(gè)氨基酸上的雙元化學(xué)改性的CsA，也顯示沒有免疫抑制活性，仍還保留對(duì)CyP-A PPI酶活性的結(jié)合親和力(PCT公布號(hào)W02006/039668)?！銇碚f，這些化合物具有對(duì)負(fù)責(zé)結(jié)合鈣神經(jīng)素的CsA方面的修改，且一般需要修改第3和4個(gè)氨基酸。第3和4個(gè)氨基酸的修改是艱苦和復(fù)雜的，因?yàn)檫@一做法通常涉及開放環(huán)孢菌素的環(huán)，取代和/或修改這些氨基酸，然后閉合環(huán)以產(chǎn)生修改的環(huán)孢菌素。與此相反，第1個(gè)氨基酸側(cè)鏈的改性不需要打開環(huán)孢菌素的環(huán)。然而，第1個(gè)氨基
權(quán)利要求
1.式I的化合物
2.式II的化合物
3.權(quán)利要求1的化合物，其中R2包含選自如下
4.式IV的化合物
5.制備其中Rl和R2如權(quán)利要求1定義的式I化合物的方法
6.權(quán)利要求5的方法，其中R2選自
7.制備式XIV化合物的方法
8.制備式XXI化合物的方法
9.制備式XIV化合物的方法
10.制備式XXIV化合物的方法
11.
12.制備式XXXII化合物的方法
13.制備式XXVI化合物的方法
14.制備式XXIX化合物的方法
15.制備式XLIII化合物的方法
16.制備式XLVI化合物的方法
17.藥物組合物，其包括治療有效量的權(quán)利要求1 4任何一項(xiàng)的化合物和一種或多種藥用輔料。
18.治療哺乳動(dòng)物中親環(huán)素介導(dǎo)的疾病的方法，其包括給要治療親環(huán)素介導(dǎo)的疾病或損傷的條件下的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求1 4任何一項(xiàng)的化合物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述疾病是由親環(huán)素過表達(dá)介導(dǎo)的。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述疾病是由親環(huán)素先天性過表達(dá)介導(dǎo)的。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述親環(huán)素介導(dǎo)的疾病選自a.病毒感染；b.炎癥性疾病；c.癌癥；d.肌肉退行性障礙；e.神經(jīng)退行性障礙；和f.與細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)喪失相關(guān)的損傷。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述病毒感染是由選自人類免疫缺陷病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、和戊型肝炎的病毒引起的。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述炎癥性疾病選自哮喘、自身免疫性疾病、慢性炎癥、 慢性前列腺炎、腎小球腎炎、過敏性疾病、炎性腸病、敗血癥、血管平滑肌細(xì)胞疾病、動(dòng)脈瘤、 盆腔炎性疾病、再灌注損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、移植排斥、和脈管炎。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述癌癥選自小和非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌和乳腺癌。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述肌肉退行性障礙選自心肌再灌注損傷、肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、和膠原VI肌病。
26.權(quán)利要求21的方法，其中所述神經(jīng)退行性障礙選自阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、 亨廷頓氏病、多系統(tǒng)萎縮、多發(fā)性硬化、大腦性麻痹、中風(fēng)、糖尿病神經(jīng)病變、肌萎縮側(cè)索硬化(盧伽雷病)、脊髓損傷、和腦損傷。
27.權(quán)利要求21的方法，其中所述與細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)喪失相關(guān)的損傷選自心肌梗死、中風(fēng)、 急性肝毒性、膽汁淤積、和移植器官的存儲(chǔ)/再灌注損傷。
全文摘要
本發(fā)明的化合物是非免疫抑制的能夠結(jié)合親環(huán)素的環(huán)孢菌素類似分子。所述化合物包括環(huán)孢菌素A的氨基酸I的改性側(cè)鏈，其由具有取代基R'、R1和R2的氧基烷基組成，其中R'是H或乙?；?；R1是飽和或不飽和的直鏈或支鏈的脂肪族碳鏈；和R2可以是氫；未取代的、N取代的或NN二取代的酰胺；N取代的或未取代的?；Ｗo(hù)的胺；羧酸；N取代的或未取代的胺；腈；酯；酮；羥基、二羥基、三羥基或多羥基的烷基；或取代的或未取代的芳基。
文檔編號(hào)C07K1/113GK102164948SQ200980137575
公開日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月30日
發(fā)明者赫曼斯 A., W. 芬斯克 B., J. 特勒帕尼耶 D., P. 查科夫斯基 D., R. 烏雷 D., 麥格拉德 D., D. 阿貝爾 M., 蘇吉亞馬 S. 申請(qǐng)人:伊索技術(shù)制藥公司