專利名稱：：白介素15(il－15)特異性人抗體的制作方法
背景技術：
：白介素15(IL-15)是一種促炎細胞因子即14-15kD糖蛋白。已報道在包括單核細胞和巨噬細胞、成纖維細胞、角質化細胞及樹突細胞的多種細胞和組織中組成型表達(Waldmann和Tagaya，1999；Fehniger和Caligiuri，2001)。該表達在炎癥狀態(tài)下受到正調節(jié)，正如用IFN-γ和LPS刺激的或感染病毒、細菌或原生動物的單核細胞所報道的(Kirman等，1998；Waldmann等，1998；Waldmann和Tagaya，1999；Fehniger和Caligiuri，2001)。此外，在慢性炎性疾病如類風濕性關節(jié)炎中，局部產生的IL-15可能通過募集和激活滑膜T細胞而加重炎癥。已經表明，這種IL-15誘導的效應在疾病發(fā)病機理中起關鍵性的作用(Kirman等，1998；McInnes等，1996；McInnes等，1997；McInnes和Liew，1998；Fehniger和Caligiuri，2001)。體外研究表明IL-15與IL-2由于共享多種受體組分而共享數(shù)種生物活性。T細胞上存在的IL-15受體由獨有的α-鏈即IL-15Rα組成，但與IL-2R共享β-鏈和γ-鏈。結果，這兩種受體使用相同的Jak/STAT-信號元件。然而，已經報道，基于IL-2和IL-15及其受體的復雜調節(jié)和差異表達，其體內功能有顯著差異(Kirman等，1998；Waldmann和Tagaya，1999；Waldmann等，2001)。重要的是注意到，IL-15在天然殺傷(NK)細胞、NK-T細胞和表皮內淋巴細胞發(fā)生、存活、擴充和起作用中的作用并非多余的(Kennedy等，2000；Liu等，2000)McInnes及其同事(McInnes等，1997；McInnes和Liew，1998)報道，在得自類風濕性關節(jié)炎患者的T細胞中IL-15刺激可誘導TNF-α的產生。此外，受IL-15激活的外周血T細胞顯示出通過細胞接觸依賴性機制由巨噬細胞誘導顯著性TNF-α產生。因為TNF-α在類風濕性關節(jié)炎中的破壞性作用，所以該細胞因子的抑制可降低疾病活動性(Bathon等，2000；Klippel，2001；Lovell等，2000；Maini和Taylor，2000)。發(fā)明概述本發(fā)明基于與人IL-15特異性結合并且抑制由IL-15誘導的促炎作用的完全人單克隆抗體的首次產生和分離，以及這種新抗體的表征和它們在治療各種各樣的IL-15介導的疾病中的治療價值的證明。例如，如本文所述，已經表明，人抗體抑制TNFα產生及T細胞增殖，它們兩者都與炎性疾病完全相關。因此，本發(fā)明的人抗體提供了一種治療和預防這些疾病(以及任何其它IL-15介導的疾病)的改進方法，其部分原因是它們的獨特特異性(例如表位和種特異性)、親和性、結構、功能活性以及它們是完全人抗體的事實，使其在給予人類患者時比先前產生的其它IL-15抗體(例如鼠抗體和人源化抗體)的免疫原性顯著降低并且在治療上更有效和更有用。本發(fā)明也基于這樣的發(fā)現(xiàn)IL-15抑制抗體(例如本文描述的人抗體)的新治療應用，包括治療炎性疾病，例如類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、移植排斥和癌癥。本發(fā)明的分離的人抗體包括各種抗體同種型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。通常，它們包括IgG1(例如IgGlk)、IgG3和IgM同種型。所述抗體可以是全長抗體(例如IgG1或IgG3抗體)或者可以僅包括抗原結合部分(例如Fab、F(ab’)2、Fv、單鏈Fv片段、分離的互補性決定區(qū)(CDR)或兩種或兩種以上的分離的CDR的組合)。在一個實施方案中，所述人抗體是重組抗體。在一個具體的實施方案中，所述人抗體由人IgG重鏈和人κ輕鏈核酸編碼，所述核酸在其可變區(qū)中分別包含如SEQIDNO1和SEQIDNO3所示的核苷酸序列及其保守序列修飾。在另一個實施方案中，所述人抗體包括IgG重鏈可變區(qū)和κ輕鏈可變區(qū)，所述可變區(qū)分別包含SEQIDNO2和SEQIDNO4中所示的氨基酸序列及其保守序列修飾。本發(fā)明的人抗體可以在宿主細胞例如含有編碼抗體重鏈和輕鏈的核酸的轉染瘤(例如由無限增殖化CHO細胞或淋巴細胞構成的轉染瘤)中重組產生，或者直接得自表達所述抗體的雜交瘤(例如其包括得自其基因組中包含編碼所述抗體的人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的轉基因非人類動物例如轉基因小鼠的、與無限增殖化細胞融合的B細胞)。在一個具體的實施方案中，所述抗體由本文稱之為146B7的雜交瘤或含有人重鏈和人輕鏈核酸的宿主細胞(例如CHO細胞)轉染瘤產生，所述核酸包含在其可變區(qū)中分別如SEQIDNO1和3所示的核苷酸序列及其保守修飾。在具體的實施方案中，所述抗體由本文稱之為146B7、146H5、404E4和404A8的雜交瘤產生。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體與位于IL-15的β-鏈和/或γ-鏈相互作用結構域上的表位特異性結合。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人抗體與人IL-15特異性結合并抑制IL-15誘導促炎作用的能力，例如抑制TNFα的產生和/或抑制IL-15與IL-15受體結合時T細胞如PBMC或CTLL-2T細胞的增殖。通常，如果在BIACORE3000儀器中，采用重組人IL-15作為被分析物而用所述抗體作為配體，根據(jù)表面胞質團共振(SPR)技術測定，所述人抗體與IL-15結合的解離平衡常數(shù)(KD)小于約10-7M，例如小于約10-8M、10-9M或10-10M或者甚至更低。在一個具體的實施方案中，所述抗體與人IL-15結合的解離平衡常數(shù)(KD)約為6.5×10-8M。另一方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明抗體或抗原結合部分的核酸分子。因此，本發(fā)明還包括含有本發(fā)明抗體編碼核酸的重組表達載體以及用這些載體轉染的宿主細胞，也包括通過培養(yǎng)這些宿主細胞制備本發(fā)明抗體的方法。本發(fā)明還涉及包含編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列的表達載體，所述可變區(qū)分別包含SEQIDNO2和SEQIDNO4中所示的氨基酸序列及其保守修飾。這樣的表達載體是本領域眾所周知的。其實例包括采用例如網(wǎng)織紅細胞裂解物的體外轉錄/翻譯載體。再一方面，本發(fā)明提供得自轉基因非人類動物例如轉基因小鼠的分離的B-細胞，所述B-細胞能夠表達與IL-15特異性結合的人單克隆抗體的各種同種型(例如IgG、IgA和/或IgM)。所述分離的B-細胞優(yōu)選得自已經用IL-15抗原的純化或富集制劑和/或表達IL-15的細胞免疫的轉基因非人類動物，例如轉基因小鼠。所述轉基因非人類動物例如轉基因小鼠的基因組優(yōu)選包含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因。然后將所述分離的B-細胞無限增殖化，以提供抗IL-15人單克隆抗體源(例如雜交瘤)。因此，本發(fā)明還提供能夠產生特異性結合IL-15的人單克隆抗體的雜交瘤。在一個實施方案中，所述雜交瘤包括得自其基因組中包含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的轉基因非人類動物例如轉基因小鼠的、與無限增殖化細胞融合的B-細胞。所述轉基因非人類動物可以用IL-15抗原的純化或富集制劑和/或表達IL-15的細胞進行免疫，以產生抗體生產雜交瘤。本發(fā)明提供的具體雜交瘤包括146B7、146H5、404E4和404A8。另一方面，本發(fā)明提供表達與IL-15特異性結合的人單克隆抗體的轉基因非人類動物，例如轉基因小鼠。在一個具體的實施方案中，所述轉基因非人類動物是其基因組中包含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的轉基因小鼠。所述轉基因非人類動物可以用IL-15抗原的純化或富集制劑和/或表達IL-15的細胞進行免疫。所述轉基因非人類動物例如轉基因小鼠優(yōu)選能夠通過經歷V-D-J重組和同種型轉換，產生抗IL-15人單克隆抗體的多種同種型(例如IgG、IgA和/或IgM)。同種型轉換可以通過例如經典或非經典同種型轉換而產生。另一方面，本發(fā)明提供生產與IL-15特異性反應的人單克隆抗體的方法。在一個實施方案中，所述方法包括用IL-15抗原的純化或富集制劑和/或表達IL-15的細胞，免疫其基因組中包含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的轉基因非人類動物如轉基因小鼠。然后獲取所述動物的B細胞(例如脾B細胞)，將其與骨髓瘤細胞融合，形成分泌抗IL-15人單克隆抗體的無限增殖雜交瘤細胞。另一方面，本發(fā)明的特征在于與治療部分綴合的人抗IL-15抗體，所述治療部分例如細胞毒性藥物、酶活性毒素或其片段、放射性同位素或小分子抗癌藥。另一方面，本發(fā)明提供包含藥學上可接受的載體和至少一種與IL-15特異性結合的本發(fā)明人單克隆抗體的組合物，例如藥用組合物和診斷組合物。所述組合物還可以包含其它治療藥，例如其它免疫抑制劑或化療藥。再一方面，本發(fā)明提供用一種或多種本發(fā)明人抗體抑制IL-15的促炎作用例如抑制IL-15誘導的TNFα產生和/或T細胞增殖、優(yōu)選不抑制結構相關蛋白/細胞因子(例如IL-2)的活性(例如TNFα產生和/或T細胞增殖)的方法。本發(fā)明的人抗體可以用于治療和/或預防各種各樣的IL-15介導的疾病，即通過將所述抗體給予罹患這些疾病的患者?？梢杂帽景l(fā)明的方法和組合物治療(例如緩解)或預防的示例性疾病包括但不限于炎性疾病如關節(jié)炎(例如銀屑病性關節(jié)炎和類風濕性關節(jié)炎，包括活動性類風濕性關節(jié)炎和青少年類風濕性關節(jié)炎)、炎性腸病。例如，已經證明所述抗體可減輕銀屑病中的角化不全、減輕表皮增厚以及減少角質化細胞增殖。也已證明所述抗體可減輕與類風濕性關節(jié)炎相關的炎癥和/或防止活化白細胞的趨化性。所述抗體還可以用于治療感染性疾病例如HIV感染。此外，所述抗體可以用于治療移植排斥。再者，所述抗體可以用于治療各種各樣的涉及IL-15介導的新血管形成的疾病，例如腫瘤生長和癌癥如T細胞白血病。本發(fā)明的人抗體也可以與一種或多種其它治療藥物聯(lián)合使用，所述治療藥物例如抗炎藥、DMARD(疾病調修抗風濕藥)、免疫抑制劑、化療藥和銀屑病藥。在一個實施方案中，患者可以另以一種或多種增強所述抗體抑制促炎作用的藥物進行治療，所述藥物例如抗炎藥如甾體藥或NSAID(非甾體抗炎藥)。優(yōu)選的藥物包括例如阿司匹林和其它水楊酸酯、Cox-2抑制劑如羅非考昔(Vioxx)和塞來考昔(Celebrex)、NSAID如布洛芬(Motrin，Advil)、非諾洛芬(Nalfon)、萘普生(Naprosyn)、舒林酸(Clinoril)、雙氯芬酸(Voltaren)、吡羅昔康(Feldene)、酮洛芬(Orudis)、二氟尼柳(Dolobid)、萘丁美酮(Relafen)、依托度酸(Lodine)、噁丙嗪(Daypro)和吲哚美辛(Indocin)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人抗體可以與一種或多種DMARD聯(lián)合給予，所述DMARD例如甲氨蝶呤(Rheumatrex)、羥氯喹(Plaquenil)、柳氮磺吡啶(Asulfidine)，嘧啶合成抑制劑例如來氟米特(Arava)、IL-1受體阻斷劑例如阿那白滯素(Kineret)以及TNF-α阻斷劑如依那西普(Enbrel)、英夫利昔單抗(Remicade)和阿達木單抗。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人抗體可以與一種或多種免疫抑制劑聯(lián)合給予，所述免疫抑制劑例如環(huán)孢菌素(Sandimmune，Neroal)和硫唑嘌呤(Imural)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人抗體可以與一種或多種化療藥聯(lián)合給予，所述化療藥例如多柔比星(阿霉素)、順鉑(Platinol)、博來霉素(Blenoxane)、卡莫司汀(Gliadel)、環(huán)磷酰胺(環(huán)磷酰胺制劑，Procytox，Neosar)和苯丁酸氮芥(Leukeran)。依照本發(fā)明的人抗體還可以連同放療一起給予。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人抗體可以與一種或多種治療銀屑病的藥物聯(lián)合給予，所述藥物例如含有煤焦油、維生素A、可的松或其它皮質甾體的局部用藥物，口服或注射用藥物如皮質甾體、甲氨蝶呤、類視色素類例如acicretin(Neogitason)或環(huán)孢菌素(Sandimmune，Neroal)。其它治療可包括接觸日光或光線療法。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人抗體可以與其它抗體聯(lián)合給予，所述抗體例如CD4特異性抗體和IL-2特異性抗體。本發(fā)明人抗體與CD4特異性抗體或IL-2特異性抗體的組合被認為對治療自身免疫病和移植排斥特別有用。再一方面，本發(fā)明提供一種在體外或體內檢測樣品中存在IL-15抗原的方法，例如用于診斷IL-15介導的疾病的方法。在一個實施方案中，在抗體和IL-15之間能夠形成復合物的條件下，使待測樣品以及對照樣品與本發(fā)明人抗體或其抗原結合部分接觸，來完成這一步。然后檢測這兩種樣品中的復合物形成(例如采用ELISA)，并且在所述樣品間形成復合物方面的任何統(tǒng)計學顯著性差異，說明所述試驗樣品中存在所述IL-15抗原。根據(jù)下文之詳細描述和權利要求書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將會是顯而易見的。附圖簡述圖1包括顯示人IL-15特異性抗體146B7、147H5、404A8和404E4與人IL-15(hIL-15)以及與突變型IL-15蛋白Q108S和D8SQ108S結合的曲線圖。用ELISA檢測連續(xù)稀釋的抗體與hIL-15或突變型IL-15蛋白D8SQ108S和Q108S的結合。圖2和圖3分別顯示抗體146B7之VH-區(qū)和VL-區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO2和4)及核苷酸序列(SEQIDNO1和3)。標出了構架區(qū)(FR)和互補性決定區(qū)(CDR)。圖4A-D包括顯示IL-15介導的TNF-α釋放被抗體146B7抑制的曲線圖。將人PBMC與hIL-15(0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)以及146B7抗體或同種型對照抗體(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)一起孵育72小時。通過ELISA測量所產生的TNF-α量。顯示了來自兩名健康志愿者的數(shù)據(jù)。圖5是顯示抗體146B7對IL-2或IL-15介導的TNF-α產生的影響的曲線圖。將人PBMC與hIL-15(0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)或hIL-2(100ng/ml)以及146B7(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)一起孵育72小時。通過ELISA測量所產生的TNF-α量。圖6是顯示抗體146B7、146H5、404E4和404A8對hIL-15誘導的CTLL-2增殖的抑制活性的曲線圖。將hIL-2饑餓的CTLL-2細胞與hIL-15(60pg/ml)以及連續(xù)稀釋的146B7、146H5、404E4和404A8一起孵育48小時。測量[3H]-胸苷摻入，以表示增殖(cpm)。結果以平均值表示。圖7-9包括顯示抗體146B7(圖7)、404E4(圖8)和404A8(圖9)對IL-15誘導的PBMC增殖的抑制活性的曲線圖。將人PBMC與hIL-15(0ng/ml、25ng/ml、100ng/ml；分別為圖7A、圖8A和圖9A)或hIL-2(0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml；分別為圖7B、圖8B和圖9B)以及0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml的146B7(圖7)、404E4(圖8)或404A8(圖9)一起孵育72小時。測量[3H]-胸苷摻入，以表示增殖(cpm)。圖10是顯示抗體146B7與INFγ-刺激的單核細胞結合的曲線圖。人PBMC在IFNγ(500U/ml)存在下培養(yǎng)至多2天(37℃)。通過流式細胞術分析且門控單核細胞后，測定每個樣品至少5000個細胞的熒光強度。數(shù)據(jù)表示刺激指數(shù)(S.I.＝(平均熒光正染色)/(平均熒光背景染色))。圖11顯示人單核細胞與抗體146B7(圖B)或同種型對照抗體(圖A)的結合。將所述細胞與IFNγ(500U/ml)一起培養(yǎng)后，分離人PBMC并制備細胞抹片(cytospin)。細胞用蘇木精復染色。圖12顯示人銀屑病皮膚與146B7(圖B)或同種型對照抗體(hIgG1)(圖A)的結合。人銀屑病斑得自征得同意后的患者，并于-80℃下儲存直至測定。組織用生物素化抗體染色并在辣根過氧化物酶激活后顯現(xiàn)。圖13A是顯示用146B7或溶媒處理SCID小鼠后類風濕性關節(jié)炎組織中的有核細胞百分比的曲線圖。組織用蘇木青和曙紅(H&E)染色并用6.0版PhotoShop進行分析。數(shù)據(jù)以146B7處理(n＝4)或溶媒處理(n＝2)后小鼠細胞核(全視野百分率)的平均值和s.e.m表示。圖13B顯示用146B7(圖B)或PBS(圖A)處理后，SCID小鼠中異種移植的RA組織的代表性H&E染色。圖14包括顯示抗體146B7治療對SCID/銀屑病小鼠的作用的曲線圖?；顧z組織在福爾馬林中固定，供石蠟包埋用，并以H&E和Ki-67核抗原染色。圖14A顯示通過測量角質層至表皮突起始處的表皮厚度而評價的銀屑病的嚴重程度。圖14B顯示測量從角質層至表皮突最深處的表皮厚度。圖14C顯示角化不全的等級。圖14D顯示上皮中炎性單核細胞的數(shù)目。圖14E顯示Ki-67+循環(huán)角質化細胞的數(shù)目。圖15顯示用抗體146B7(圖C)、CsA(圖B)或溶媒(圖A)處理后，SCID小鼠中移植的人銀屑病皮膚的H&E染色。移植3周后，小鼠接受PBS(安慰劑)，每隔2天接受10mg/kg劑量的CsA(環(huán)孢菌素A)(Sandoz)達15天，或者在第1天接受20mg/kg劑量以及在第8天和第15天接受10mg/kg劑量的146B7。最后一次注射后1周，處死小鼠，并從每種異種移植物中取4mm穿刺活檢組織?；顧z組織在福爾馬林中固定，供石蠟包埋用，并用H&E染色。圖16顯示用抗體146B7(圖C)、CsA(圖B)或溶媒(圖A)處理后，SCID小鼠中移植的人銀屑病皮膚的Ki-67染色。移植3周后，小鼠接受PBS(安慰劑)，每隔2天接受10mg/kg劑量的CsA(環(huán)孢菌素A)(Sandoz)達15天，或在第1天接受20mg/kg劑量以及在第8天和第15天接受10mg/kg劑量的146B7。最后一次注射后1周，處死小鼠，并從每種異種移植物中取4mm穿刺活檢組織。活檢組織在福爾馬林中固定，供石蠟包埋用，并針對Ki-67核抗原染色。圖17是顯示抗體146B7與受體結合的IL-15結合的曲線圖。各板用IL-15α包被并與IL-15一起孵育。10分鐘后，向各孔中加入生物素化146B7。用ELISA讀出儀于405nm評價146B7與受體結合的IL-15的結合。圖18是顯示IL-15與其在Raji細胞上表達的受體結合后，抗體146B7與IL-15結合的曲線圖。在表達Il-15R的Raji細胞與IL-15一起孵育后，在10分鐘后向所述細胞中加入生物素化146B7。通過FACS分析，評價146B7與受體結合的IL-15的結合。發(fā)明詳述本發(fā)明提供治療和診斷各種各種的IL-15介導的疾病(即由IL-15的促炎作用引起的疾病)的基于抗體的新治療藥物。本文所用的術語“IL-15的促炎作用”包括由IL-15誘導的任何體液介導免疫應答或細胞介導免疫應答，例如TNFα和其它炎癥介質的產生以及T細胞的募集/增殖。本發(fā)明的治療采用與IL-15上存在的表位特異性結合的分離人單克隆抗體。在一個實施方案中，在通過經歷V-D-J重組和同種型轉換而能夠產生抗IL-15人單克隆抗體的多種同種型(例如IgG、IgA和/或IgE)的非人類轉基因動物例如轉基因小鼠中產生所述人抗體。因此，本發(fā)明的各個方面包括抗體及其藥用組合物、以及制備這些單克隆抗體的非人類轉基因動物、B-細胞、宿主細胞轉染瘤和雜交瘤。本發(fā)明也包括應用本發(fā)明抗體檢測與IL-15結合的細胞的方法和/或在體外或體內抑制IL-15介導的功能的方法。也包括將與IL-15結合的藥物靶向細胞的方法。為了更容易地理解本發(fā)明，首先定義某些術語。其它定義在詳述中敘述。術語“IL-15”、“IL-15抗原”和“白介素15”在本文可互換使用，并且包括由細胞天然表達的任何變異體或同種型。本文涉及的術語“抗體”包括完整的抗體及其任何抗原結合片段(即“抗原結合部分”)或單鏈?！翱贵w”是指包含通過二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈或其抗原結合部分的糖蛋白。每條重鏈由一個重鏈可變區(qū)(本文縮寫為VH)和一個重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個結構域一CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由一個輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為VL)和一個輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結構域CL組成。VH和VL可以進一步再分為稱為互補性決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，間插稱為構架區(qū)(FR)的更為保守的區(qū)域。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，并按以下順序從氨基端至羧基端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有一個與抗原相互作用的結合結構域?？贵w的恒定區(qū)可以介導免疫球蛋白與包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如效應細胞)以及經典補體系統(tǒng)的第一組分(C1q)在內的宿主組織或因子的結合。本文所用的術語抗體的“抗原結合部分”(或簡稱為“抗體部分”)是指保留與抗原(例如IL-15)特異性結合能力的抗體的一個或多個片段。已經表明，全長抗體的片段可以執(zhí)行抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合部分”內包括的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VH結構域、VL結構域、CL結構域和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在鉸鏈區(qū)通過一個二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，由VH結構域和CH1結構域組成；(iv)Fv片段，由抗體一條臂的VL結構域和VH結構域組成，(v)dAb片段(Ward等，(1998)，Nature341544-546)，該片段由一個VH結構域組成；和(vi)分離的互補性決定區(qū)(CDR)；或(vii)兩種或兩種以上的分離CDR的組合，其可以任選通過合成接頭連接在一起。此外，盡管Fv片段的兩個結構域一VL和VH由不同基因編碼，但可以采用重組方法，通過合成接頭將它們連接在一起，使其能夠成為單鏈蛋白質，其中VL區(qū)和VH區(qū)配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等(1988)Science242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。這樣的單鏈抗體也包括在術語抗體的“抗原結合部分”內。采用本領域技術人員已知的常規(guī)技術，獲得這些抗體片段，并且可以以與完整抗體相同的方法，所述片段根據(jù)用途進行篩選。本文所用的術語“單克隆抗體”是指對特定表位表現(xiàn)出一種結合特異性和親和性的抗體。因此，術語“人單克隆抗體”是指表現(xiàn)出一種結合特異性并且具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。在一個實施方案中，人單克隆抗體由這樣的雜交瘤產生所述雜交瘤包括得自其基因組中包含人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的轉基因非人類動物例如轉基因小鼠的、與無限增殖化細胞融合的B-細胞。本文所用的術語“重組人抗體”包括通過重組方法制備、表達、構建或分離的所有人抗體，例如(a)從對于人免疫球蛋白基因為轉基因或轉染色體的動物(例如小鼠)或者由此制備的雜交瘤中分離的抗體(進一步描述于下面的第I小節(jié))，(b)從轉化以表達所述抗體的宿主細胞例如從轉染瘤中分離的抗體，(c)從重組體、組合人抗體文庫中分離的抗體，以及(d)通過任何其它方法制備、表達、構建或分離的抗體，所述方法包括將人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列。這樣的重組人抗體具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。然而，在某些實施方案中，這樣的重組人抗體可以經過體外誘變(或者當使用人Ig序列的轉基因動物時，經過體內體細胞誘變)，因而所述重組抗體的VH區(qū)和VL區(qū)的氨基酸序列是盡管來源于并且類似于人種系的VH和VL序列但是可能并非天然存在于人體內抗體種系庫中的序列。本文所用的“異源抗體”被定義為涉及轉基因非人類生物體產生的所述抗體。該術語是指這樣的抗體所述抗體具有對應于在不是由所述轉基因非人類動物構成的生物體中存在的、一般得自非轉基因非人類動物的物種的氨基酸序列或編碼核酸序列。本文所用的“分離的抗體”意指基本上不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體(例如特異性結合IL-15的分離抗體基本上不含特異性結合非IL-15抗原的抗體)。然而，特異性結合IL-15表位的分離抗體，可能與來源于不同物種的其它相關細胞因子或其它IL-15蛋白有交叉反應性。然而，所述抗體最好總是與人IL-15結合。此外，分離的抗體通?；旧喜缓渌毎镔|和/或化學物質。在本發(fā)明的一個實施方案中，將具有不同IL-15特異性的“分離的”單克隆抗體的組合在一種成分充分確定的組合物混合。本文所用的“特異性結合”是指抗體與預定抗原結合。通常，如果在BIACORE3000儀器中，采用重組人IL-15作為被分析物而用所述抗體作為配體，根據(jù)表面胞質團共振(SPR)技術測定，所述抗體結合的親和力(kD)約小于10-7M，例如約小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低，并且與預定抗原結合的親和力比其與除預定抗原以外的非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)或密切相關抗原結合的親和力至少高兩倍。短語“識別抗原的抗體”和“抗原特異性抗體”在本文可與術語“特異性結合抗原的抗體”互換使用。本文所用的術語“KD”意指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)。本文所用的“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別(例如IgM或IgG1)。本文所用的“同種型轉換”是指抗體類別或同種型從一種Ig類別變?yōu)槠渌麵g類別之一的現(xiàn)象。本文所用的“非轉換同種型”是指重鏈在不發(fā)生同種型轉換時產生的同種型類別；編碼所述非轉換同種型的CH基因通常是緊接功能性重排VDJ基因下游的第一個CH基因。同種型轉換分為經典同種型轉換或非經典同種型轉換。經典同種型轉換通過涉及轉基因中至少一個轉換序列區(qū)的重組事件而發(fā)生。非經典同種型轉換可以通過例如人σμ和人∑μ之間的同源重組(δ-相關缺失)而發(fā)生。替代的非經典轉換機制例如其中有可能發(fā)生轉基因間和/或染色體間重組，而完成同種型轉換。本文所用的術語“轉換序列”是指那些負責轉換重組的DNA序列。“轉換供體”序列，通常是μ轉換區(qū)，將是在轉換重組期間將被缺失的構建體區(qū)5’(即上游)。“轉換受體”區(qū)在構建體待缺失區(qū)和取代恒定區(qū)(例如γ、ε等)之間。由于沒有總是發(fā)生重組的特定位點，故此最終的基因序列一般不能根據(jù)構建體來預測。本文所用的“糖基化模式”定義為與蛋白質共價連接、更準確地講與免疫球蛋白共價連接的糖單位的模式。當本領域普通技術人員認為，與所述轉基因的CH基因來源的物種相比，所述異源抗體的糖基化模式與所述非人類轉基因動物物種中的所述糖基化模式更為相似時，異源抗體的糖基化模式可以被描述為與在所述非人類轉基因動物的物種所產生的抗體上正常發(fā)生的糖基化模式基本相似。本文所用的術語“天然存在的”，當用于物體時，是指物體可以在自然界中被發(fā)現(xiàn)的事實。例如，生物體(包括病毒)中存在的、可以從自然界的來源中分離并且未經人類在實驗室中有意修飾的多肽或多核苷酸序列就是天然存在的。本文所用的術語“重排的”是指免疫球蛋白重鏈或輕鏈基因座的構型，其中V片段在分別編碼基本上完整的VH結構域或VL結構域的構象中緊鄰D-J區(qū)段或J區(qū)段定位。通過與種系DNA比較，可以鑒定出經重排的免疫球蛋白基因座；重排的基因座至少有一個重組的七聚體/九聚體同源性元件。本文所用的術語“未重排的”或“種系構型”，對于V區(qū)段，是指其中V區(qū)段未經過重組而緊鄰D區(qū)段或J區(qū)段的構型。本文所用的術語“核酸分子”意指包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈DNA，或者是雙鏈DNA，但最好是雙鏈DNA。本文所用的術語“分離的核酸分子”，對于編碼結合IL-15的抗體或抗體部分(例如VH、VL、CDR3)的核酸，意指其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列不含編碼結合非IL-15抗原的抗體或抗體部分的其它核苷酸序列的核酸分子，所述其它序列可能天然鄰接人類基因組DNA中的核酸。SEQIDNO1-4對應于包含本發(fā)明人抗IL-15抗體146B7的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的核苷酸序列和氨基酸序列。具體地說，SEQIDNO1和2對應于146B7抗體的VH，SEQIDNO3和4對應于146B7抗體的VL。本發(fā)明也包括SEQIDNO1-4中所示序列的“保守序列修飾”，即不顯著影響或改變由所述核苷酸序列所編碼的或者含有所述氨基酸序列的抗體的結合特性的核苷酸序列修飾和氨基酸序列修飾。這種保守序列修飾包括核苷酸和氨基酸的取代、添加和缺失。通過本領域已知的標準技術，例如定點誘變和PCR介導的誘變，可以將修飾引入SEQIDNO1-4中。保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基被具有相似側鏈的氨基酸殘基取代的氨基酸取代。本領域已經確定了具有相似側鏈的氨基酸殘基的類型。這些類型包括具有堿性側鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非極性側鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-支鏈側鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，人抗IL-15抗體的預測非必需氨基酸殘基最好被來自相同側鏈類型的其它氨基酸殘基取代。此外，在另一個實施方案中，例如通過飽和誘變，可以沿整個抗IL-15抗體編碼序列或其一部分隨機引入突變，并且所得的經修飾的抗IL-15抗體可以根據(jù)結合活性進行篩選。因此，由本文公開的(重鏈和輕鏈可變區(qū))核苷酸序列編碼和/或含有本文公開的(重鏈和輕鏈可變區(qū))氨基酸序列(即SEQIDNO1-4)的抗體包括由經過保守修飾的相似序列編碼或者含有所述序列的基本相似的抗體。下文提供關于如何根據(jù)本文作為SEQIDNO1-4公開的部分(即重鏈和輕鏈可變區(qū))序列可以產生這類基本相似的抗體的進一步討論。對于核酸，術語“實質同源性”是指當進行最佳比對和比較時，在適當插入或缺失核苷酸的情況下，兩種核酸序列或其指定序列在至少約80％、通常至少約90％至95％，更優(yōu)選至少有約98％至99.5％的核苷酸中是相同的?；蛘?，當所述區(qū)段在選擇性雜交條件下與該鏈的互補序列雜交時，存在實質同源性?？紤]到進行兩個序列最佳比對所需要引入的空位(gap)數(shù)和每個空位的長度，兩個序列之間的同一性百分率隨所述序列所共享的相同位置數(shù)而變(即％同源性＝相同位置數(shù)/總位置數(shù)×100)。運用數(shù)學算法，可以完成對序列的比較和兩個序列間同一性百分率的測定，如下文非限制性實例中所描述的。運用GCG軟件包中的GAP程序(可以得自http//www.gcg.com)，使用NWSgapdna.CMP矩陣，以及空位加權(gapweight)為40、50、60、70或80，而長度加權(lengthweight)為1、2、3、4、5或6，可以測定兩個核苷酸序列之間的同一性百分率。運用加入了ALIGN程序(2.0版)的E.Meyes和W.Miller的算法(CABIOS，411-17(1989))，使用PAM120加權殘基表，空位長度罰分(gaplengthpenalty)為12，而空位罰分(gappenalty)為4，也可以測定兩個核苷酸序列或氨基酸序列之間的同一性百分率。另外，運用加入了GCG軟件包中的GAP程序(可以得自http//www.gcg.com)的Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.(48)444-453(1970))，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，并且空位加權為16、14、12、10、8、6或4，而長度加權為1、2、3、4、5或6，可以測定兩個氨基酸序列之間的同一性百分率。本發(fā)明的核酸序列和蛋白質序列可以進一步用作“查詢序列”，以對公共數(shù)據(jù)庫進行搜索，例如以鑒定相關的序列?？梢赃\用Altschul等((1990)J.Mol.Biol.215403-10)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)，進行這樣的搜索。可以運用NBLAST程序，分值(score)＝100、字長(wordlength)＝12，進行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明核酸分子同源的核苷酸序列?？梢赃\用XBLAST程序，分值＝50、字長＝3，進行BLAST蛋白質搜索，以獲得與本發(fā)明的蛋白質分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的、包括空位的序列比對，可以使用GappedBLAST，如Alschul等(1997)NucleicAcidRes.15(17)3389-3402中所描述的。當運用BLAST和GappedBLAST程序時，可以使用相應程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。所述核酸可以存在于全細胞、細胞裂解液中，或者以部分純化或基本純的形式存在。當通過標準技術，包括堿/SDS處理、CsCl分帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領域熟知的其它技術，當從其它細胞組分或其它污染物例如其它細胞核酸或蛋白質中純化出來時，核酸是“分離的”或“成為基本純的”。參見F.Ausubel等主編，CurrentProtocolinMolecularBiolory，GreenePublishingandWileyInterscience，紐約(1987)。本發(fā)明的核酸組成，盡管通常為來自cDNA、染色體或其混合物的天然序列(經修飾的限制位點等除外)，也可以根據(jù)提供基因序列的標準技術進行突變。對于編碼序列，這些突變可以按照需要影響氨基酸序列。特別是，考慮了本文描述的天然V序列、D序列、J序列、恒定區(qū)序列、轉換區(qū)序列或其它這類序列基本同源的或者來源于所述序列的DNA序列(其中“來源于”是指一種序列與另一種序列相同，或者由另一種序列經修飾而來)。核酸當將其置于與另一核酸序列的功能關系時則是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子如果其影響序列的轉錄則與編碼序列是有效連接的。就轉錄調節(jié)序列而論，有效連接是指所連接的DNA序列是相鄰的，并且必要時使兩個蛋白質編碼區(qū)相鄰并符合讀框地連接。對于轉換序列，有效連接是指所述序列能夠影響轉換重組。本文所用的術語“載體”意指能夠轉運與之連接的另一種核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質粒”，質粒是指可以將額外的DNA區(qū)段連接到其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA區(qū)段可以被連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其所導入的宿主細胞中自主復制(例如具有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)可以在被導入宿主細胞后可整合到宿主細胞的基因組中，從而隨宿主基因組一起復制。此外，某些載體能夠指導與其有效連接的基因的表達。這樣的載體在本文稱為“重組表達載體”(或簡稱為“表達載體”)。一般而言，重組DNA技術中所用的表達載體通常為質粒形式。在本說明書中，由于質粒是最常用的載體形式，因此“質?！焙汀拜d體”可互換使用。然而，本發(fā)明包括用于等同功能的這樣的其它形式的表達載體，例如病毒載體(例如復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。本文所用的術語“重組宿主細胞”(或簡稱為“宿主細胞”)意指其中導入了重組表達載體的細胞。不用說這樣的術語不僅指特定的題述細胞，而且指這類細胞的后代。因為在后續(xù)世代中可能由于突變或環(huán)境影響而發(fā)生某些修飾，所以這樣的后代可能實際上與親代細胞不完全相同，但仍包括在本文所用的術語“宿主細胞”的范疇之內。本文所用的術語“患者”包括任何人或非人類動物。例如，本發(fā)明的方法和組合物可以用于治療炎性疾病例如關節(jié)炎(例如類風濕性關節(jié)炎)患者。術語“非人類動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人類靈長類、羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。下面的各小節(jié)更詳細地描述本發(fā)明的各個方面。I.抗IL-15人抗體的產生可以采用各種各樣的已知技術，例如Koler和Milstein，Nature256495(1975)描述的標準體細胞雜交技術，產生本發(fā)明的人單克隆抗體。盡管優(yōu)選體細胞雜交法，但是原則上，也可以采用用于產生單克隆抗體的其它技術，例如，B淋巴細胞的病毒或癌基因轉化，采用人抗體基因文庫的噬菌體展示技術。用于產生生產本發(fā)明人單克隆抗體的雜交瘤的優(yōu)選動物系統(tǒng)是鼠類系統(tǒng)。小鼠中的雜交瘤生產是本領域眾所周知的，包括用于分離和融合免疫脾細胞的免疫方案和技術。在一個實施方案中，采用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而非小鼠免疫系統(tǒng)的轉基因或轉染色體小鼠，產生針對IL-15的人單克隆抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明使用含有編碼未經重排的人重鏈(μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)以及使內源μ和κ鏈基因座失活的中靶突變的轉基因小鼠，在本文稱為“HuMAb小鼠”(Lonberg，N.等(1994)，Nature368(6774)856-859)。因此，所述小鼠表現(xiàn)出小鼠IgM或κ表達減少，并且在免疫反應中，所導入的人重鏈和輕鏈轉基因經歷類別轉換和體細胞突變，產生高親和力的人IgGκ單克隆抗體(Lonberg，N.等(1994)，參見上文；綜述于Lonberg，N.(1994)，HandbookofExperimentalPharmacology11348-101；Lonberg，N.和Huszer，D.(1995)，Intern.Rev.Immunol.第13卷65-93，以及Harding，F(xiàn).和Lonberg，N.(1995)，Ann.N.Y.Acad.Sci764536-546)。HuMAb小鼠的產生在下面的第II小節(jié)有詳細描述，并且詳述于Taylor，L.等(1992)NucleicAcidsResearch206287-6295；Chen，J.等(1993)InternationalImmunology5647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.SciUSA903720-3724；Choi等(1993)NatureGenetics4117-123；Chen，J.等(1993)EMBOJ.12821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.1522912-2920；Lonberg等(1994)Nature368(6474)856-859；Lonberg，N.(1994)，HandbookofExperimentalPharmacology11349-101；Taylor，L.等(1994)InternationalImmunology6579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)，Intern.Rev.Immunol.第13卷65-93；Harding，F(xiàn).和Lonberg，N.(1995)，Ann.N.Y.Acad.Sci764536-546；Fishwild，D.等(1996)NatureBiotecnology14845-851。另見美國專利號5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429；全都屬于Lonberg和Kay以及GenPharmInternatinal；Surani等的美國專利第5,545,807號；于1998年6月11日公布的國際公布號WO98/24884；于1994年11月10日公布的WO94/25585；于1993年6月24日公布的WO93/1227；于1992年12月23日公布的WO92/22645；于1992年3月19日公布的WO92/03918。實施例2具體描述了HCO12轉基因HuMAb小鼠的產生。免疫為了產生抗IL-15的完全人單克隆抗體，可以用IL-15抗原的純化或富集制劑和/或表達IL-15的細胞，免疫含有人免疫球蛋白基因的轉基因或轉染色體小鼠(例如HCo12、HCo7或KM小鼠)，例如Lonberg等(1994)Nature368(6474)856-859；Fishwild等(1996)NatureBiotecnology14845-851和WO98/24884描述的?；蛘撸梢杂镁幋a人IL-15的DNA免疫小鼠。首次輸注時，所述小鼠最好為6-16周齡。例如，可以用IL-15抗原的純化或富集制劑(5-50μg)腹膜內免疫HuMAb小鼠。在用IL-15抗原的純化或富集制劑進行免疫不產生抗體的情況下，也可以用表達IL-15的細胞例如細胞系免疫小鼠，以促進免疫應答。使用各種抗原的累積的經驗已經表明，HuMAb轉基因小鼠當最初用完全弗氏佐劑中的抗原腹膜內(IP)或皮下(SC)免疫、隨后每隔一周用不完全弗氏佐劑中的抗原IP/SC免疫(直至總共10次)時，反應最佳。在所述免疫方案的過程中，可以通過眶后放血獲得的血漿樣品，監(jiān)測免疫應答?？梢酝ㄟ^ELISA(如下所述)對所述血漿進行篩選，而具有足夠效價的抗IL-15人免疫球蛋白的小鼠可以進行融合。小鼠可以在處死和取出脾臟前3天用抗原靜脈內加強免疫。生產抗IL-15人單克隆抗體的雜交瘤的產生為了制備產生抗IL-15人單克隆抗體的雜交瘤，可以從免疫小鼠分離脾細胞和淋巴結細胞，并將其與合適的無限增殖化細胞系如小鼠骨髓瘤細胞系融合。然后，所產生的雜交瘤可以根據(jù)抗原特異性抗體的產生進行篩選。例如，可能將來自免疫小鼠脾淋巴細胞的單細胞懸液與含有50％PEG(w/v)的SP2/0-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL1580)融合?？梢詫⒓毎约s1×105接種到平底微量滴定板中，隨后在還含有10％fetalCloneSerum(胎克隆血清)、5-10％origen雜交瘤克隆因子(IGEN)和1XHAT(Sigma)的選擇培養(yǎng)液中孵育兩周。約兩周后，細胞可以在HAT被HT取代的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。然后可以通過ELISA，根據(jù)抗IL-15人單克隆抗體IgM和單克隆抗體IgG對各孔進行篩選。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長時，則通?？梢栽?0-14天后觀察培養(yǎng)液。可以將分泌所述抗體的雜交瘤重新接種，再次進行篩選，并且如果人IgG仍呈陽性，則可以通過有限稀釋，將抗IL-15單克隆抗體亞克隆至少兩次。然后穩(wěn)定的亞克隆可以在體外進行培養(yǎng)，以便在組織培養(yǎng)液中產生抗體，供特征鑒定用。產生抗IL-15人單克隆抗體的轉染瘤的制備例如，采用本領域熟知的重組DNA技術和基因轉染方法的組合(Morrison，S.(1985)Science2291202)，也可以在宿主細胞轉染瘤中產生本發(fā)明的人抗體。例如，在一個實施方案中，可以將目標基因例如人抗體基因連接到表達載體例如真核表達質粒中，例如采用WO87/04462、WO89/01036和EP338841中公開的GS基因表達系統(tǒng)或本領域熟知的其它表達系統(tǒng)。可以將攜帶克隆抗體基因的純化質粒導入真核宿主細胞如CHO-細胞或NSO-細胞或其它真核細胞如植物源性細胞、真菌細胞或酵母細胞中。用于導入這些基因的方法可以是本領域描述的方法，例如電穿孔、脂質轉染、脂質轉染胺等等。在將這些抗體基因導入宿主細胞后，可以對表達所述抗體的細胞進行鑒定和選擇。這些細胞代表此后可以根據(jù)其表達水平進行擴增并且高標度產生抗體的轉染瘤?？梢詮倪@些培養(yǎng)上清液和/或細胞中分離和純化重組抗體。另一方面，可以在其它表達系統(tǒng)如大腸桿菌(E.coli)或完整的生物體中表達這些克隆抗體基因，或者可以合成表達所述抗體基因。應用部分抗體序列表達完整的抗體抗體主要通過位于6個重鏈和輕鏈互補性決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。為此，在各個抗體之間，CDR內的氨基酸序列比CDR之外的序列更多樣化。因為CDR序列負責大多數(shù)的抗體-抗原相互作用，所以有可能通過構建包括來自特定天然存在的抗體的CDR序列被移植到來自具有不同特性的不同抗體的構架序列上的表達載體，來表達模擬特定天然存在的抗體特性的重組抗體(參見例如Riechmann，L.等，1998，Nature332323-327；Jones，P.等，1986，Nature321522-525；和Queen，C.等，1989，Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.8610029-10033)。這樣的構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫中獲得。這些種系序列與成熟抗體基因序列不同，因為它們將不包括在B細胞成熟期間通過V(D)J連接而形成的完整裝配型可變基因。種系基因序列也將與高親和性次要組分抗體在所述可變區(qū)中并非均勻分布的序列有所不同。例如，體細胞突變在構架區(qū)的氨基端部分相對罕見。例如，體細胞突變在構架區(qū)1的氨基端部分以及構架區(qū)4的羧基端部分相對罕見。此外，許多體細胞突變并不顯著改變抗體的結合特性。為此，獲得特定抗體的完整DNA序列以再構建具有類似于原始抗體結合活性的完整重組抗體并不是必需的(參見于1999年3月12日申請的PCT/US99/05535)?？缭剿鯟DR區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列通常對于該目的是足夠的。用所述部分序列來確定哪些種系可變區(qū)基因區(qū)段和連接基因區(qū)段對所述重組的抗體可變基因有貢獻。然后用所述種系序列補上所述可變區(qū)的缺失部分。在蛋白質成熟期間，重鏈和輕鏈前導序列被切除，并不影響最終抗體的特性。為添加缺失的序列，可以通過連接或PCR擴增，將克隆化cDNA序列與合成寡核苷酸結合。或者，完整的可變區(qū)可以作為一組短的重疊寡核苷酸來合成，然后通過PCR擴增將其連接，以構建完整的合成可變區(qū)克隆。該方法有一些優(yōu)點，例如消除或包含或具體限定位點，或者最優(yōu)化特定密碼子。來自一個雜交瘤的重鏈和輕鏈轉錄物的核苷酸序列可以用來設計一組重疊的合成寡核苷酸，以構建具有與天然序列相同的氨基酸編碼能力的合成V序列。所述合成的重鏈和κ鏈序列可以在三個方面不同于天然序列間隔有重復核苷酸堿基序列段，以利于寡核苷酸合成和PCR擴增；根據(jù)Kozak法則(Kozak，1991，J.Biol.Chem.26619867-19870)，加入最適翻譯起始位點；以及在所述翻譯起始位點上游加入HindIII位點。對于重鏈和輕鏈可變區(qū)，優(yōu)化的編碼鏈序列和相應的非編碼鏈序列大約在相應的非編碼寡核苷酸的中點處被斷裂成30-50個核苷酸。因此，對于每條鏈，可以將所述寡核苷酸裝配成跨越150-400個核苷酸區(qū)段的重疊雙鏈組。然后用所述庫作為作為模板，產生150-400個核苷酸的PCR擴增產物。通常，一個可變區(qū)寡核苷酸組被分成兩個庫，分別擴增所述庫，產生兩種重疊PCR產物。然后通過PCR擴增連接這些重疊產物，形成完整的可變區(qū)。也可能需要在PCR擴增中包括重鏈或輕鏈恒定區(qū)的重疊片段(包括κ輕鏈的BbsI位點或γ重鏈的AgeI位點)，以產生可以容易被克隆到所述表達載體構建體中的片段。重構建的重鏈和輕鏈可變區(qū)然后與克隆啟動子序列、前導序列、翻譯起始序列、前導序列、恒定區(qū)序列、3’非翻譯序列、聚腺苷酸化序列和翻譯終止序列結合，構成表達載體構建體?？梢詫⑺鲋劓満洼p鏈表達構建體結合到一種載體中、共轉染、連續(xù)轉染或分別轉染到宿主細胞中，然后融合形成表達這兩種鏈的宿主細胞。下面描述用于構建人IgGκ表達載體的質粒(實施例1)。構建所述質粒，使得PCR擴增的V重鏈和Vκ輕鏈cDNA序列可以用來重構建完整的重鏈和輕鏈小基因。這些質粒可以用來表達完整的人IgG1κ或IgG4κ抗體。本發(fā)明的完全人抗體及嵌合抗體也包括IgG2、IgG3、IgE、IgA、IgM和IgD抗體?？梢詷嫿ㄏ嗨频馁|粒，用于表達其它重鏈同種型，或者用于表達包含λ輕鏈的抗體。因此，本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的人抗IL-15抗體146B7、147H5、404A8和404E4的結構特征用于構建結構上相關的、保留本發(fā)明抗體的至少一種功能特性(例如與IL-15結合)的人抗IL-15抗體。更準確地講，146B7、147H5、404A8和404E4的一個或多個CDR區(qū)可以與已知的人構架區(qū)和CDR重組結合，以構建本發(fā)明的其它重組工程的人抗IL-15抗體。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種用于制備抗IL-15抗體的方法，所述方法包括制備包含以下組分的抗體(1)人重鏈構架區(qū)和人重鏈CDR，其中至少一個人重鏈CDR包含一種選自圖2所示CDR的氨基酸序列(或SEQIDNO2中的相應氨基酸殘基)的氨基酸序列；和(2)人輕鏈構架區(qū)和人輕鏈CDR，其中至少一個人輕鏈CDR包含一種選自圖3所示CDR的氨基酸序列(或SEQIDNO4中的相應氨基酸殘基)的氨基酸序列；其中所述抗體保留與IL-15結合的能力?？梢圆捎脴藴式Y合測定，例如實施例中敘述的那些方法(例如ELISA)，來測定所述抗體與IL-15結合的能力。由于本領域熟知抗體重鏈和輕鏈CDR3結構域在抗體對抗原的結合特異性/親和性方面具有特別重要的作用，因此如上所述制備的本發(fā)明重組抗體優(yōu)選包含146B7、147H5、404A8和404E4的重鏈和輕鏈CDR3。所述抗體還可以包含146B7、147H5、404A8和404E4的CDR2。所述抗體還可以包含146B7、147H5、404A8和404E4的CDR1。所述抗體還可以包含CDR的任何組合。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供抗IL-15抗體，所述抗體包含(1)人重鏈構架區(qū)—人重鏈CDR1區(qū)、人重鏈CDR2區(qū)和人重鏈CDR3區(qū)，其中所述人重鏈CDR3區(qū)選自146B7、147H5、404A8和404E4的CDR3，例如圖2所示146B7的人重鏈CDR區(qū)(或SEQIDNO2中的相應氨基酸殘基)；和(2)人輕鏈構架區(qū)—人輕鏈CDR1區(qū)、人輕鏈CDR2區(qū)和人輕鏈CDR3區(qū)，其中所述人輕鏈CDR3區(qū)選自146B7、147H5、404A8和404E4的CDR3，例如圖3所示146B7的人輕鏈CDR區(qū)(或SEQIDNO4中的相應氨基酸殘基)；其中所述抗體與IL-15結合。所述抗體還可以包含146B7、147H5、404A8和404E4的重鏈CDR2和/或輕鏈CDR2。所述抗體還可以包含146B7、147H5、404A8和404E4的重鏈CDR1和/或輕鏈CDR1。上述工程抗體的CDR1區(qū)、CDR2區(qū)和/或CDR3區(qū)可以包含本文中公開的146B7、147H5、404A8和404E4的準確氨基酸序列。然而，普通技術人員將會認識到，某些偏離146B7、147H5、404A8和404E4的準確CDR序列的序列也是可行的，只要仍然保留所述抗體有效結合IL-15的能力(例如保守序列修飾)。因此，在另一個實施方案中，所述工程抗體可以由例如與146B7、147H5、404A8和404E4的一個或多個CDR有90％、95％、98％或99.5％相同的一個或多個CDR組成。除僅僅結合IL-15外，工程抗體例如上述的那些工程抗體可以根據(jù)其保留本發(fā)明抗體的其它功能特性進行選擇，所述功能特性例如(1)結合人IL-15并抑制IL-15誘導的促炎作用；(2)抑制IL-15誘導的TNFα產生或T細胞增殖；(3)如果在BIACORE3000儀器中，采用重組人IL-15作為被分析物而用所述抗體作為配體，根據(jù)表面胞質團共振(SPR)技術測定，與人IL-15結合的解離平衡常數(shù)(KD)小于約10-7M；(4)結合位于人IL-15的β-鏈和/或γ-鏈相互作用結構域上的表位；(5)干擾人IL-15的Asp8與人IL-15受體β-單位和/或人IL-15的Gln108與人IL-15受體γ-單位的結合；(6)結合受體結合的人IL-15；(7)結合人IL-15并抑制人IL-15誘導角化不全的能力；(8)結合人IL-15并抑制人IL-15誘導表皮增厚的能力；(9)結合人IL-15并抑制人IL-15誘導角質化細胞增殖的能力；和/或(10)結合人IL-15并抑制人IL-15誘導活化白細胞趨化性的能力。抗IL-15人單克隆抗體的表征可以采用各種已知技術，對本發(fā)明人單克隆抗體結合IL-15的特征進行鑒定。一般而言，所述抗體首先通過ELISA鑒定。簡而言之，微量滴定板可以先用PBS中的純化IL-15包被，然后用無關蛋白如PBS稀釋的牛血清白蛋白(BSA)封閉。向各孔中加入IL-15免疫小鼠血漿的稀釋液并于37℃孵育1-2小時。所述板用PBS/吐溫20洗滌，然后與堿性磷酸酶綴合的山羊抗人IgGFc特異性多克隆試劑一起于37℃孵育1小時。洗滌后，所述板用ABTS底物顯色，并于OD為405時進行分析。最好將產生最高效價的小鼠用于融合。上述ELISA測定可以用來篩選抗體，因而可以篩選出產生對IL-15免疫原呈陽性反應的抗體的雜交瘤。則可以將結合IL-15，最好是以高親和力與IL-15結合的雜交瘤進行亞克隆并進一步表征。然后可以從每個保留其親代細胞反應性(通過ELISA)的雜交瘤中選擇出一個克隆，用于制備細胞庫以及用于抗體純化。為了純化人抗IL-15抗體，可以讓所選的雜交瘤在滾瓶、兩升旋轉瓶或其它培養(yǎng)系統(tǒng)中生長?？梢赃^濾并濃縮上清液，然后用A蛋白瓊脂糖(Pharmacia，Piscataway，NJ)親和層析，以純化所述蛋白。在將緩沖液更換為PBS之后，可以用消光系數(shù)1.43通過OD280或最好通過濁度分析來測定濃度?？梢酝ㄟ^凝膠電泳和抗原特異性方法檢查IgG。為了確定所選抗IL-15人單克隆抗體是否與獨特表位結合，可以用市售的試劑(Pierce，Rockford，IL)將每種抗體生物素化?？梢杂面溍箍股锼氐鞍讟擞浀奶结槞z測生物素化MAb的結合。為了確定純化抗體的同種型，可以采用本領域公知的技術進行同種型ELISA。例如，微量滴定板的各孔可以用10μg/ml的抗人Ig于4℃包被過夜。用5％BSA封閉后，讓所述板與10μg/ml單克隆抗體或純化同種型對照在環(huán)境溫度下反應2小時。然后可以讓各孔與人IgG1或其它人同種型特異性綴合的探針反應。如上所述，使板顯色并進行分析。為了測試單克隆抗體與表達IL-15的活細胞的結合，可以使用流式細胞術。簡而言之，將表達膜結合的IL-15的細胞系和/或人PBMC(在標準生長條件下生長)與不同濃度的含有0.1％BSA和0.01％NaN3的PBS中的單克隆抗體于4℃混合1小時。洗滌后，讓細胞與熒光素標記的抗人IgG抗體在與第一抗體染色的相同條件下反應?？梢赃\用FACScan儀器，利用光散射和側向散射特性對單細胞進行門控來分析樣品，并測定標記抗體的結合。(除了或者替代)流式細胞術測定，可以使用利用熒光顯微鏡檢術的替代測定?？梢酝耆缟纤鰧⒓毎旧?，然后用熒光顯微鏡檢查。這一方法允許顯現(xiàn)出各個細胞，但基于抗原的密度，可能降低了靈敏度。通過蛋白質印跡法，可以進一步測試抗IL-15人IgG與IL-15抗原的反應性。簡而言之，可以制備來自表達IL-15的細胞的細胞提取物并進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的抗原轉移至硝化纖維素膜上，用20％小鼠血清封閉，并用待測單克隆抗體探測。人IgG結合可以采用抗人IgG堿性磷酸酶進行檢測，并且用BCIP/NBT底物片(tablets)(SigmaChem.Co.St.Louis，MO)來顯色。II.產生抗IL-15人單克隆抗體的轉基因和轉染色體非人類動物的產生另一方面，本發(fā)明提供能夠表達特異性結合IL-15的人單克隆抗體的轉基因和轉染色體非人類動物，例如轉基因或轉染色體小鼠。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供其基因組中包含人重鏈轉基因的轉基因或轉染色體小鼠，致使所述小鼠當用IL-15抗原和/或表達IL-15的細胞免疫時產生人抗IL-15抗體?？梢詫⑺鋈酥劓溵D基因整合到所述小鼠的染色體DNA中，轉基因小鼠例如本文詳細描述和舉例說明的HuMAb小鼠的情況正是如此?；蛘?，人重鏈轉基因可以在染色體外保持，如WO02/43478(2002年6月6日公布)中描述的轉染色體(例如KM)小鼠的情況正是如此。這樣的轉基因和轉染色體小鼠能夠通過經歷V-D-J重組和同種型轉換而產生抗IL-15人單克隆抗體的多種同種型(例如IgG、IgA和/或IgE)。同種型轉換可以通過例如經典或非經典同種型轉換而發(fā)生。設計對外源抗原刺激應答、具有異源抗體庫的轉基因或轉染色體非人類動物，需要在所述轉基因動物中所含有的異源免疫球蛋白轉基因準確地通過B-細胞發(fā)育途徑起作用。這包括例如異源重鏈轉基因的同種型轉換。因此，構建轉基因以便產生同種型轉換以及抗體下述功能的一種或多種(1)高水平和細胞類型特異性表達，(2)功能性基因重排，(3)對等位基因排斥的激活和應答，(4)表達足夠的初級庫，(5)信號轉導，(6)體細胞超變，以及(7)在免疫應答期間轉基因抗體基因座的顯性化。并非所有上述標準都需要符合。例如，在其中所述轉基因動物的內源免疫球蛋白基因座被功能性破壞的那些實施方案中，所述轉基因無需激活等位基因排斥。此外，在其中所述轉基因包含功能性重排的重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白基因的那些實施方案中，功能性基因重排的第二條標準是不必要的，至少對于已經重排的轉基因是不必要的。有關分子免疫學的背景，參見FundamentalImmunology，第二版(1989)，PaulWilliamE.主編，RavenPress，紐約。在某些實施方案中，用來產生本發(fā)明人單克隆抗體的轉基因或轉染色體非人類動物在所述轉基因動物的種系中含有經重排的、未經重排的或者經重排或未經重排組合的異源免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉基因。各重鏈轉基因包含至少一個CH基因。另外，所述重鏈轉基因可以含有功能性同種型轉換序列，所述轉換序列在所述轉基因動物的B細胞中能夠支持編碼多種CH基因的異源轉基因的同種型轉換。這樣的轉換序列可以是在來自用作轉基因CH基因源的物種的種系免疫球蛋白基因座中天然存在的那些序列，或者這樣的轉換序列可以來源于接受所述轉基因構建體的物種(所述轉基因動物)中存在的那些序列。例如，用于產生轉基因小鼠的人轉基因構建體可以產生更高頻率的同種型轉換事件，如果其摻入了與小鼠重鏈基因座中天然存在的轉換序列相似的轉換序列，由于推測所述小鼠轉換序列最適合與小鼠轉換重組酶的酶系統(tǒng)一起發(fā)揮作用，而人轉換序列則不是這樣的?？梢苑蛛x轉換序列并通過常規(guī)克隆方法克隆，或者可以由根據(jù)與免疫球蛋白轉換區(qū)序列相關的公開序列資料設計的重疊合成寡核苷酸從頭合成所述轉換序列(Mills等，Nucl.AcidsRes.157305-7316(1991)；Sideras等，Intl.Immunol.1631-642(1989))。對于每種上述轉基因動物，功能性重排的異源重鏈和輕鏈免疫球蛋白轉基因存在于相當大比例的所述轉基因動物的B細胞中(至少10％)。用于產生本發(fā)明轉基因動物的轉基因包括含有編碼以下的DNA的重鏈轉基因至少一個可變區(qū)基因區(qū)段、一個多樣性基因區(qū)段、一個連接基因區(qū)段和至少一個恒定區(qū)基因區(qū)段。所述免疫球蛋白輕鏈轉基因包含編碼以下的DNA至少一個可變區(qū)基因區(qū)段、一個連接基因區(qū)段和至少一個恒定區(qū)基因區(qū)段。編碼所述輕鏈和重鏈基因區(qū)段的基因區(qū)段對于所述轉基因非人類動物是異源的，因為它們來源于或對應于編碼來自不包括所述轉基因非人類動物的物種的免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因區(qū)段的DNA。在本發(fā)明的一個方面，構建所述轉基因，致使各基因區(qū)段是未經重排的，即沒有重排，以便編碼功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈。這樣的未重排轉基因支持所述V、D和J基因區(qū)段的重組(功能性重排)，并且最好支持將整個D區(qū)基因區(qū)段或其一部分摻入到接觸IL-15抗原的轉基因非人類動物體內所產生的重排免疫球蛋白重鏈中。在一個替代的實施方案中，所述轉基因包括未經重排的“小基因座(mini-locus)”。這樣的轉基因通常包含C、D和J區(qū)段的相當大部分以及V基因區(qū)段的亞組。在這樣的轉基因構建體中，各種調節(jié)序列例如啟動子、增強子、類別轉換區(qū)、用于RNA加工的剪接供體序列和剪接受體序列、重組信號等，包含來源于所述異源DNA的相應序列。可以將這樣的調節(jié)序列摻入到來自本發(fā)明所用的非人類動物的相同或相關物種的轉基因中。例如，可以將人免疫球蛋白基因區(qū)段與用于轉基因小鼠的嚙齒動物免疫球蛋白增強子序列在轉基因中結合?；蛘?，可以將合成的調節(jié)序列摻入到所述轉基因中，其中這樣的合成調節(jié)序列與已知在哺乳動物基因組中天然存在的功能性DNA序列并不同源。依照共有序列原則(consensusrules)，例如那些限定剪接-受體位點或啟動子/增強子基序的允許序列(permissiblesequence)的共有序列原則，設計合成調節(jié)序列。例如，與天然存在的種系Ig基因座相比，小基因座包含所述基因組免疫球蛋白基因座的一部分，所述部分具有非必需DNA部分(例如間插序列；內含子或其部分)的至少一個內部(即不在該部分的末端)缺失。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，用于產生抗IL-15人抗體的轉基因或轉染色體動物含有WO98/24884的實施例12中描述的轉基因(例如pHC1或pHC2)的至少1個，通常2-10個且有時25-50個或更多個拷貝，讓所述動物與含有WO98/24884的實施例5、6、8或14中描述的單拷貝輕鏈轉基因的動物配種，而讓其后代與WO98/24884的實施例10中描述的JH缺失動物配種。讓動物繁育至這三個性狀中每個性狀達到純合性。這樣的動物具有下述基因型單拷貝(每單套染色體)的人重鏈未重排小基因座(WO98/24884的實施例12中描述的)、單拷貝(每單套染色體)的重排人K輕鏈構建體(WO98/24884的實施例14中描述的)以及在去除全部功能性JH區(qū)段的每個內源小鼠重鏈基因座上的一個缺失(WO98/24884的實施例10中描述的)。讓這樣的動物與對于JH區(qū)段缺失為純合的小鼠(WO98/24884的實施例10中描述的)配種，產生對于所述JH缺失為純合的而對于所述人重鏈和輕鏈構建體為半合的后代。給所產生的動物注射抗原并用來產生針對這些抗原的人單克隆抗體。從這樣的動物中分離的B細胞對于人重鏈和輕鏈是單特異性的，因為它們僅含單拷貝的每個基因。此外，它們對于人或小鼠重鏈將是單特異性的，因為兩個內源小鼠重鏈基因拷貝由于跨越所引入的JH區(qū)的缺失而均無功能，如WO98/24884的實施例9和12中所描述的。此外，相當大比例的B細胞對于人或小鼠輕鏈將是單特異性的，因為在相當大比例的B細胞中，單拷貝的所述重排人κ輕鏈基因的表達將等位基因和同種型地排斥內源小鼠κ鏈和λ鏈基因的重排。本發(fā)明所用的轉基因和轉染色體小鼠表現(xiàn)出產生大部分種系庫免疫球蛋白，理想條件下基本類似于天然小鼠。因此，例如在其中已使內源Ig基因失活的實施方案中，血清的總免疫球蛋白水平范圍為約0.1-10mg/ml，最好為0.5-5mg/ml，理想條件下至少約1.0mg/ml。當已經將能夠實現(xiàn)從IgM轉換成IgG的轉基因導入轉基因小鼠中時，成年小鼠血清IgG與IgM之比最好是約10∶1。所述IgG與IgM之比遠小于未成年小鼠。一般而言，大于約10％、優(yōu)選40-80％的脾和淋巴結B細胞只表達人IgG蛋白。所述庫最好近似于天然小鼠，通常高至少約10％，優(yōu)選25-50％或更高。一般而言，將產生至少約1000個不同的免疫球蛋白(最好是IgG)，優(yōu)選104至106或更多，主要取決于小鼠基因組中所引入的不同V、J和D區(qū)的數(shù)目。這些免疫球蛋白將通常識別約二分之一或更高的高抗原性蛋白，例如葡萄球菌A蛋白。通常，所述免疫球蛋白對預選抗原表現(xiàn)出的親和力(KD)小于10-7M，例如小于10-8M，10-9M或10-10M或甚至更低。在某些實施方案中，可能最好產生具有預定庫的小鼠，以限制對預定抗原類型應答的抗體中代表的V基因的選擇。具有預定庫的重鏈轉基因可以包含例如對預定人抗原類型應答的抗體中優(yōu)先使用的人VH基因。另一方面，由于各種原因，某些VH基因可能被排除在已知庫之外(例如與編碼針對預定抗原的高親和性V區(qū)的可能性低；經歷體細胞突變和親和力增強的傾向性低；或對某些人有免疫原性)。因此，在含有各種重鏈和輕鏈基因區(qū)段的轉基因重排之前，這樣的基因區(qū)段可以容易地例如通過雜交或DNA測序從非轉基因動物的生物體種中鑒定出來。可以用例如IL-15抗原的純化或富集制劑和/或表達IL-15的細胞免疫上述轉基因和轉染色體小鼠。或者，可以用編碼人IL-15的DNA免疫所述轉基因小鼠。然后所述小鼠將產生通過轉基因內轉換重組(順式轉換)經歷類別轉換并表達與IL-15反應的免疫球蛋白的B細胞。所述免疫球蛋白可以是人抗體(也稱為“人序列抗體”)，其中重鏈和輕鏈多肽由人轉基因序列編碼，所述序列可以包括由體細胞突變產生的序列和V區(qū)重組連接序列以及種系編碼序列；這些人抗體可以被稱為與由人VL或VH基因區(qū)段以及人JL或DH和JH區(qū)段編碼的多肽序列基本相同的，即使由于體細胞突變和不同V-J和V-D-J重組連接而可能存在其它非種系序列。每種抗體鏈的可變區(qū)通常至少80％由人種系V基因區(qū)段、J基因區(qū)段編碼以及當其為重鏈時由D基因區(qū)段編碼；經常至少85％的可變區(qū)由轉基因中存在的人種系序列編碼；常常90％或95％或更高的可變區(qū)序列由轉基因中存在的人種系序列編碼。然而，由于體細胞突變以及VJ與VDJ連接而引入了非種系序列，因此人序列抗體通常具有一些不是由人V、D或J基因區(qū)段編碼的可變區(qū)序列(并且罕見恒定區(qū)序列)，正如在所述小鼠的種系中的人轉基因中所發(fā)現(xiàn)的。通常，這樣的非種系序列(或單個核苷酸位置)在CDR中或附近成簇，或者在已知細胞突變集中的區(qū)成簇。與預定抗原結合的人抗體可以由同種型轉換產生，致使產生包含人序列γ鏈(如γ1、γ2a、γ2B或γ3)和人序列輕鏈(例如κ)的人抗體。由于親和性成熟和B細胞經抗原選擇、尤其是隨后第二次(或后續(xù))抗原攻擊，這樣的同種型轉換人抗體通常在可變區(qū)且經常在CDR約10個殘基中或以內常常含有一個或多個體細胞突變。這些高親和性人抗體的結合親和力(KD)可小于10-7M、例如小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低。本發(fā)明的另一方面包括來源于本文所述轉基因或轉染色體小鼠的B細胞。所述B細胞可以用于產生表達以高親和力(例如小于10-7M)與人IL-15結合的人單克隆抗體的雜交瘤。因此，在另一個實施方案中，如果在BIACORE3000儀器中，采用重組人IL-15作為被分析物而用所述抗體作為用于結合人IL-15的配體，根據(jù)表面胞質團共振(SPR)技術測定，本發(fā)明提供一種產生人抗體的親和力(KD)小于約10-7M、例如小于約10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的雜交瘤，其中所述抗體包含一條人序列輕鏈，所述人序列輕鏈包含(1)一個輕鏈可變區(qū)，具有與由人VL基因區(qū)段和人JL區(qū)段編碼的多肽序列基本相同的多肽序列，和(2)一個輕鏈恒定區(qū)，具有與由人CL基因區(qū)段編碼的多肽序列基本相同的多肽序列；和一條人序列重鏈，所述人序列重鏈包含(1)一個重鏈可變區(qū)，具有與由人VH基因區(qū)段、任選D區(qū)和人JH區(qū)段編碼的多肽序列基本相同的多肽序列，和(2)一個重鏈恒定區(qū)，具有與由人CH基因區(qū)段編碼的多肽序列基本相同的多肽序列?？梢酝ㄟ^在其基因組中包含整合的人免疫球蛋白轉基因的轉基因小鼠中，擴充人可變區(qū)基因區(qū)段庫的方法，促進產生抗IL-15的高親和性人單克隆抗體，所述方法包括將包含在所述整合的人免疫球蛋白轉基因中不存在的V區(qū)基因區(qū)段的V基因轉基因引入所述基因組中。通常，所述V區(qū)轉基因是包含一部分人VH或VL(VK)基因區(qū)段陣列的酵母人工染色體，其可能在人基因組中天然存在或者通過重組方法分別將其剪接到一起，其可能包括無序或缺失的V基因區(qū)段。所述YAC中通常含有至少五個或更多個功能性V基因區(qū)段。在這種變異中，產生通過V庫擴充方法產生的轉基因小鼠是可行的，其中所述小鼠表達包含由V區(qū)轉基因上存在的V區(qū)基因區(qū)段編碼的可變區(qū)序列和根據(jù)人Ig轉基因編碼的C區(qū)的免疫球蛋白鏈。通過V庫擴充方法，可以產生具有至少5種不同V基因的轉基因小鼠；小鼠同樣可以含有至少約24種V基因或更多。某些V基因區(qū)段可能是非功能性的(例如假基因(pseudogene)等)；這些區(qū)段可以被保留，或者必要時，通過技術人員可以掌握的重組方法選擇性缺失。一旦所述小鼠種系已進行工程改造以含有具有經擴充的V區(qū)段庫、在含有所述J和C基因區(qū)段的人Ig轉基因中基本不存在的功能性YAC，則所述性狀可以遺傳或培育到其它遺傳背景中，所述背景包括其中將具有擴充V區(qū)段庫的功能性YAC培育到具有不同人Ig轉基因的小鼠種系中的背景。具擴充V區(qū)段庫的多種功能性YAC可以培育到與人Ig轉基因(或多種人Ig轉基因)一起起作用的種系中。盡管本文稱之為YAC轉基因，但是這樣的轉基因當整合到基因組中時可能已基本上不含酵母序列，例如在酵母中自主復制所需的序列；當不再需要在酵母中復制后(例如在導入小鼠ES細胞或小鼠原合子(prozygote)之前)，這樣的序列可以任選通過基因工程除去(例如限制性消化以及脈沖場凝膠電泳或其它合適的方法)。人序列免疫球蛋白表達的性狀的遺傳方法，包括培育具有人Ig轉基因且也任選具有含擴充V區(qū)段庫的功能性YAC的轉基因小鼠。VH和VL基因區(qū)段均可以存在于YAC中。所述轉基因小鼠可以培育到專業(yè)人員希望的任何背景中，包括帶有其它人轉基因的背景，包括人Ig轉基因和/或編碼其它人淋巴細胞蛋白的轉基因。本發(fā)明也提供一種由具有擴充V區(qū)庫YAC轉基因的轉基因小鼠產生的高親和性人序列免疫球蛋白。盡管上文描述了本發(fā)明轉基因動物的優(yōu)選實施方案，但是考慮了分為以下的四個類別的其它實施方案I.含有未重排重鏈和重排輕鏈免疫球蛋白轉基因的轉基因動物；II.含有未重排重鏈和未重排輕鏈免疫球蛋白轉基因的轉基因動物；III.含有重排重鏈和未重排輕鏈免疫球蛋白轉基因的轉基因動物；IV.含有重排重鏈和重排輕鏈免疫球蛋白轉基因的轉基因動物。在這些類別的轉基因小鼠中，優(yōu)選的優(yōu)先順序如下當內源輕鏈基因(或至少K基因)通過同源重組(或其它方法)而被剔除時為II＞I＞III＞IV，而當內源輕鏈基因未被剔除并且必須通過等位基因排斥而顯性化時為I＞II＞III＞IV。III.抗體綴合物/免疫毒素另一方面，本發(fā)明的特征在于一種與治療部分例如細胞毒素、藥物(例如免疫抑制劑)或放射性同位素綴合的抗IL-15人單克隆抗體。當與細胞毒素綴合時，這些抗體綴合物被稱為“免疫毒素”。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害(例如殺傷)的任何藥劑。實例包括紫杉醇、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春花堿、秋水仙素、多柔比星、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、普卡霉素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及其類似物或同系物。治療藥包括但不限于抗代謝藥(例如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、降卡巴嗪(decarbazine))、烷化劑(例如氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈佐星、絲裂霉素C和順式二胺二氯鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環(huán)類抗生素(例如柔紅霉素(舊稱道諾霉素)和多柔比星)、抗生素類(例如放線菌素D(舊稱放線菌素)、博來霉素、普卡霉素和安曲霉素(AMC))以及抗有絲分裂藥(例如長春新堿和長春花堿)。本發(fā)明的抗體可以與放射性同位素例如放射性碘綴合，產生用于治療IL-15相關疾病如癌癥的細胞毒性放射性藥物。本發(fā)明的抗體綴合物可以用來調節(jié)給定的生物反應。所述治療部分不應解釋為限于經典的化療藥。例如，所述藥物部分可以是具有所需生物活性的蛋白質或多肽。這樣的蛋白質可包括例如酶活性毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質，如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或生物反應調節(jié)劑，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它細胞因子或生長因子。用于將這樣的治療部分與抗體綴合的技術是眾所周知的，參見例如Arnon等，“MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugInCancerTherapy(癌癥治療中用于藥物免疫靶向的單克隆抗體)”，載于MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy，Reisfeld等(主編)，第243-56頁(AlanR.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“AntibodiesForDrugDelivery(用于藥物傳遞的抗體)”，載于ControllDrugDelivery(第2版)，Robison等(主編)，第623-53頁(MarcelDekker，Inc.1987)；Thorpe，“AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapyAReview(綜述癌癥治療中細胞毒性藥物的抗體載體)”，載于MonoclonalAntibodies’84BiologicalAndChnicalApplication，Pinchera等(主編)，第475-506頁(1985)；“Analysis，Results，AndFutureProsprectiveOfTheUseOfTherapeuticRadiolabledAntibodyInCancerTherapy(癌癥治療中放射性標記抗體治療應用的分析、結果和前景)”，載于MonoclonalAntibodiesForCancerDetecionAndTherapy，Baldwin等(主編)，第303-16頁(AcademicPress1985)，以及Thorpe等，“ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibodies-ToxinConjugate(抗體-毒素綴合物的制備和細胞毒特性)”，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。IV.藥用組合物另一方面，本發(fā)明提供一種組合物例如藥用組合物，所述組合物含有與藥學上可接受的載體一起配制的一種或一種組合的本發(fā)明的人單克隆抗體或其抗原結合部分。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包括多種(例如兩種或更多種)分離的本發(fā)明人抗體的組合。所述組合物中每種抗體最好與IL-15的不同預選表位結合。本發(fā)明的藥用組合物也可以在聯(lián)合療法中給予，即與其它藥物聯(lián)合給予。例如，所述聯(lián)合療法可以包括本發(fā)明組合物與至少一種或多種其它治療藥，如抗炎藥、DMARD(疾病調修抗風濕藥)、免疫抑制劑、化療藥和銀屑病藥。本發(fā)明的藥用組合物也可以結合放射療法給予。本發(fā)明也包括與其它抗體例如CD4特異性抗體和IL-2特異性抗體共同給予。這種與CD4特異性抗體或IL-2特異性抗體的組合被認為對于治療自身免疫病和移植排斥特別有用。本文所用的“藥學上可接受的載體”包括任何和所有生理上相容的溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。所述載體最好適合于靜脈內、肌內、皮下、胃腸外、脊髓或表皮給藥(例如通過注射或輸注)。根據(jù)給藥途徑，所述活性化合物即抗體、雙特異性或多特異性分子，可以用保護所述化合物免遭酸和可以使所述化合物失活的其它天然條件的作用的材料來包衣?！八帉W上可接受的鹽”是指保留母體化合物的所需生物活性并且不引起任何不想要的毒理學效應的鹽(參見例如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。這樣的鹽的實例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括由無毒無機酸以及無毒有機酸衍生的鹽，無毒無機酸例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等，無毒有機酸例如脂族一和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等。堿加成鹽包括由堿土金屬以及無毒有機胺衍生的鹽，堿土金屬例如鈉、鉀、鎂、鈣等，無毒有機胺例如N，N’-二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等。本發(fā)明的組合物可以通過本領域已知的多種方法來給予。正如本領域技術人員將會認識到的，給藥途徑和/或方式將視所需結果而變。所述活性化合物可以與保護所述化合物抵抗快速釋放的載體一起配制，例如控釋制劑，包括植入劑、透皮貼劑和微囊化遞藥系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾纳锵嗳菪跃酆衔?，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙二醇酸、膠原、多聚原酸酯和聚乳酸。用于制備這類制劑的許多方法是專利方法或者是本領域技術人員普遍已知的。參見例如SustainenandControlledReleaseDrugDeliverySystem(緩釋和控遞藥物遞藥系統(tǒng))，J.R.Robinson主編，MarcelDekker，Inc.紐約，1978。為了通過某些給藥途徑給予本發(fā)明的化合物，所述化合物可能必需用防止其失活的材料來包衣，或者將所述化合物與所述材料共同給予。例如，所述化合物可以在合適的載體例如脂質體或稀釋劑中給予受治療者。藥學上可接受的稀釋劑包括鹽水和水性緩沖液。脂質體包括水包油包水型CGF乳劑以及常規(guī)的脂質體(Strejan等(1984)J.Neuroimmunol.727)。藥學上可接受的載體包括無菌水性溶液或分散體以及用于臨時配制無菌注射液或分散劑的無菌粉末。將這樣的介質和試劑用于藥用活性物質是本領域已知的。除非任何常規(guī)介質或試劑與所述活性化合物不相容，考慮了其在本發(fā)明藥用組合物中的應用。也可將補充的活性化合物摻入到所述組合物中。治療組合物通常必須是無菌的，并且在生產和貯藏條件下穩(wěn)定。所述組合物可以配制成溶液劑、微乳劑、脂質體或適合于高藥物濃度的其它有序結構。所述載體可以是溶劑或分散介質，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物。例如通過應用包衣劑如卵磷脂、在分散體的情況下通過維持所需的粒徑，以及通過利用表面活性劑，可以維持適當?shù)牧鲃有?。在許多情況下，所述組合物中最好包括等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。通過在所述組合物中包括延長吸收的藥劑例如單硬脂酸鹽和明膠，可以引起注射用組合物的延長吸收。通過將所需量的所述活性化合物與根據(jù)需要的一種或一種組合的上述組分摻入到合適的溶劑中，然后微量過濾除菌，可以制備無菌注射液。一般而言，通過將所述活性化合物摻入到含有基本分散介質和上述的所需其它組分的無菌載體中，制備分散劑。就供制備無菌注射液的無菌粉針劑而言，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，得到由預先過濾除菌的其溶液的有效成分的粉末加上任何其它的所需成分。調整給藥方案，以提供最佳的所需反應(例如治療反應)。例如，可以給予一次大劑量，可以在規(guī)定時間內給予幾個分次劑量，或者根據(jù)治療情況的需要所指示的，所述劑量可以按比例減少或增加。例如，本發(fā)明的人抗體可以通過皮下注射每周給予一次或兩次，或者通過皮下注射每月給予一次或兩次。尤其有利的是配制單位劑型的胃腸外組合物，以便于給藥和劑量的均一性。本文所用的單位劑型是指對于待治療患者適合作為單位劑量的物理上分離的單位；每個單位含有計算用以與所需藥用載體結合產生所需療效的預定量的活性化合物。對于本發(fā)明的單位劑型的規(guī)定由以下因素決定或者直接取決于以下因素(a)所述活性化合物的獨特特性和待達到的特定療效，和(b)用于治療個體的敏感性的這樣一種活性化合物的配制領域中固有的限制。藥學上可接受的抗氧化劑的實例包括(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)脂溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。對于所述治療組合物，本發(fā)明的制劑包括適合于經口、經鼻、局部(包括口腔含化和舌下)、直腸、陰道和/或胃腸外給藥的制劑。所述制劑通常可以以單位劑型存在，并且可以通過藥學領域已知的任何方法來制備?？梢耘c載體材料聯(lián)合產生一種劑型的有效成分的量將隨待治療患者以及特定給藥方式而變?？梢耘c載體材料聯(lián)合產生一種劑型的有效成分的量一般是所述組合物產生療效的量。一般而言，按百分比計，該量的范圍將為約0.001％至約90％的有效成分，優(yōu)選約0.005％至約70％，最優(yōu)選約0.01％至約30％。適合于陰道給藥的本發(fā)明制劑也包括含有本領域已知的合適的這類載體的子宮托、陰道塞、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫制劑或噴霧制劑。用于本發(fā)明組合物的局部給藥或透皮給藥的劑型包括散劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、溶液劑、貼劑和吸入劑。所述活性化合物可以在無菌條件下與藥學上可接受的載體以及可能需要的任何防腐劑、緩沖劑或拋射劑混合。本文所用的短語“胃腸外給藥”和“在胃腸外給藥”是指腸道給藥和局部給藥之外的給藥方式，通常為注射，包括但不限于靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節(jié)內、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射和輸注?？梢杂糜诒景l(fā)明藥用組合物中的合適水性和非水性載體的實例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它們的合適混合物、植物油如橄欖油以及注射用有機酯如油酸乙酯。例如通過應用包衣材料如卵磷脂，在分散體的情況下通過維持所需的粒徑，以及利用表面活性劑，可以維持適當?shù)牧鲃有?。這些組合物也可以含有輔料，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。通過上述滅菌方法，以及通過包含各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等，可以確保防止微生物的存在。也可能需要在所述組合物中包括等滲劑，例如糖、氯化鈉等。另外，通過包含延長吸收的藥劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可以引起注射用藥物形式的延長吸收。當本發(fā)明的化合物作為藥物給予人和動物時，它們可以單獨給予，或者作為含有例如0.001-90％(更優(yōu)選0.005-70％，例如0.01-30％)的有效成分以及藥學上可接受的載體的藥用組合物給予。無論選擇何種給藥途徑，可以將以合適的水合形式應用的本發(fā)明化合物和/或本發(fā)明的藥用組合物，通過本領域技術人員已知的常規(guī)方法，配制成藥學上可接受的劑型。本發(fā)明藥用組合物中的所述有效成分的實際劑量水平可以變化，以便對于特定患者、組合物和給藥方式而言獲得有效達到所需治療反應且對所述患者無毒的所述有效成分的量。所選的劑量水平將取決于各種各樣的藥代動力學因素，包括所用的本發(fā)明的特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性、給藥途徑、給藥時間、所用特定化合物的排泄速率、療程、與所述特定組合物聯(lián)合使用的其它藥物、化合物和/或材料、待治療患者的年齡、性別、體重、病癥、一般健康狀況和此前的用藥史和藥物領域熟知的類似因素。具有本領域普通技術的醫(yī)師或獸醫(yī)可以容易地確定所需的藥用組合物的有效量并開出處方。例如，所述醫(yī)師或獸醫(yī)可以開始給予水平低于達到所需療效的所需水平的所述藥用組合物中所用的本發(fā)明化合物，然后逐漸增加劑量，直至達到所需的療效。一般而言，本發(fā)明的組合物的合適日劑量將是所述化合物有效產生療效的最低劑量的量。這樣的有效劑量一般取決于上述因素。優(yōu)選靜脈內、肌內、腹膜內或皮下給藥，優(yōu)選接近靶部位給藥。如有需要，治療組合物的有效日劑量可以以2個、3個、4個、5個、6個或更多分劑量，在一天內以合適的間隔分別給予，任選以單位劑型給予。當有可能單獨給予本發(fā)明的化合物時，優(yōu)選所述化合物作為藥用制劑(組合物)給予。治療組合物可以用本領域已知的藥物裝置給予。例如，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的治療組合物可以用無針皮下注射裝置給予，所述裝置例如公開于美國專利號5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中。可用于本發(fā)明的眾所周知的植入物和組件的實例包括美國專利第4,487,603號，它公開了一種用于以控制速率分配藥物的可植入微型輸注泵；美國專利第4,486,194號，它公開了一種用于透過皮膚給予藥物的治療裝置；美國專利第4,447,233號，它公開了一種用于以精確的輸注速度遞藥的藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，它公開了一種用于連續(xù)遞藥的可變流速的可植入輸注裝置；美國專利第4,439,196號，它公開了一種具有多室區(qū)室的滲透性遞藥系統(tǒng)；以及美國專利第4,475,196號，它公開了一種滲透性遞藥系統(tǒng)。許多其它這樣的植入物、遞藥系統(tǒng)和組件是本領域技術人員已知的。在某些實施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體可以配制成確保在體內的適當分布。例如，血腦屏障(BBB)排除了許多高親水性化合物。為了確保本發(fā)明的治療化合物穿過BBB(如有需要)，可以將它們配制在例如脂質體中。有關生產脂質體的方法，參見例如美國專利4,522,811、5,374,548和5,399,331。所述脂質體可以包含被選擇性地轉運到特定細胞或器官、從而增強靶藥物傳遞的一個或多個部分(參見例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。示例性的靶向部分包括葉酸或生物素(參見例如Low等的美國專利5,416,016)、甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.1531038)；抗體(P.G.Bloeman等(1995)FEBSLett.357140；M.Owais等(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39180)；表面活性劑A蛋白受體(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233134)，其不同種類的可包含本發(fā)明制劑以及本發(fā)明分子的組分；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.2699090)；另見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods4273。在本發(fā)明的一個實施方案中，在脂質體中配制本發(fā)明的治療化合物；在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述脂質體包括一個靶向部分。在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述脂質體中的治療化合物通過大劑量注射傳遞到緊靠腫瘤或感染的部位。所述組合物必須是流動的，使得存在易于注射性。它必須在生產和貯藏條件下穩(wěn)定，并且必須防腐以抵抗微生物如細菌和真菌的污染作用。對于類風濕性關節(jié)炎的“治療有效劑量”優(yōu)選在患者中產生改善率的ACR20預先定義(ACR20PreliminaryDefinitionofImprovement)，更優(yōu)選產生改善率的ACR50預先定義(ACR50PreliminaryDefinitionofImprovement)，并且甚至更優(yōu)選產生改善率的ACR70預先定義(ACR70PreliminaryDefinitionofImprovement)。改善率的ACR20預先定義的定義是在觸痛關節(jié)計數(shù)(TCJ)和腫脹關節(jié)計數(shù)(SWJ)中，改善率≥20％；并且在下列五項評價中有3項的改善率≥20％患者疼痛評價(VAS)、患者綜合評價(VAS)、醫(yī)生綜合評價(VAS)、患者殘疾自我評價(HAQ)、急性期反應物(CRP或ESR)。ACR50和ACR70以同樣方式定義，而改善率分別為≥50％和≥70％。有關進一步細節(jié)參見Felson等，載于AmericanCollegeofRheumatologyPreliminaryDefinitionofImprovementinRheumatoidArthritis(美國風濕病學會關于類風濕性關節(jié)炎改善率的預先定義)；ArthritisRheumatism(1995)38727-735?；衔镆种颇[瘤的能力可以用預測在人類腫瘤中的功效的動物模型系統(tǒng)中來評價。或者，組合物的這種特性可以通過檢查所述化合物的抑制能力來評價，這類抑制用技術人員已知的測定在體外來檢查。治療化合物的治療有效量可以縮小腫瘤大小，或者緩解患者的癥狀。本領域普通技術人員可以根據(jù)如患者的體重、患者癥狀的嚴重程度以及所選的特定組合物或給藥途徑等因素來確定這樣的量。所述抗體治療或預防銀屑病的能力也可以按照本領域熟知的方法來評價。所述組合物必須是無菌的，且是流動的，使得所述組合物可通過注射器給予。除水之外，所述載體可以是等滲緩沖鹽溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)和它們的合適混合物。例如通過應用包衣劑例如卵磷脂、在分散體的情況下通過維持所需的粒徑，以及通過應用表面活性劑，可以維持適當?shù)牧鲃有浴Ｔ谠S多情況下，優(yōu)選在所述組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇例如甘露醇或山梨醇以及氯化鈉。通過在所述組合物中包括延長吸收的藥劑，例如單硬脂酸鋁或明膠，可以引起所述注射用組合物的長期吸收。當所述活性化合物如上所述被適當保護時，所述化合物可以例如與惰性稀釋劑或可吸收的食用載體一起口服給予。V.本發(fā)明的應用和方法本發(fā)明的抗IL-15的人抗IL-15抗體(包括所述抗體的衍生物和綴合物)以及含有所述抗體的組合物可以用于多種體外和體內診斷和治療應用。在一個實施方案中，本發(fā)明的人抗體用來抑制IL-15誘導的T細胞和/或單核細胞/巨噬細胞的TNFα產生，優(yōu)選不抑制由其它細胞因子如IL-2誘導的TNFα產生。通過使所述抗體與IL-15接觸(例如通過將所述抗體給予患者)，IL-15通過IL-15受體傳導信號的能力被抑制，因而也抑制了T細胞和/或單核細胞/巨噬細胞產生TNFα。優(yōu)選的抗體與IL-15特異性表位(例如特定亞基如γ亞基)結合，因而有利地抑制了IL-15誘導的TNFα產生，但不干擾結構上相關的細胞因子如IL-2誘導的TNFα產生。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人抗體用來抑制IL-15誘導的T細胞募集和/或增殖，優(yōu)選不抑制其它結構上相關的細胞因子如IL-2誘導的T細胞增殖。如同TNFα產生一樣，通過使所述抗體與IL-15接觸(例如通過將所述抗體給予患者)，IL-15通過IL-15受體傳導信號的能力被抑制，因而也抑制了IL-15對T細胞的刺激作用。因此，在又一個實施方案中，本發(fā)明提供一種用于治療或預防由IL-15介導的疾病(例如自身免疫病如銀屑病、類風濕性關節(jié)炎或炎性腸病，或感染性疾病如HIV)的方法，即將有效量的本發(fā)明人抗體給予患者，以治療或預防所述疾病。所述抗體可以單獨給予，或者與其它治療藥一起給予，所述治療藥例如抗炎藥如甾體或非甾體抗炎藥，或者與抗體聯(lián)合或協(xié)同作用的細胞毒素一起給予，以治療或預防所述IL-15介導的疾病。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的人抗體用來治療或預防類風濕性關節(jié)炎(RA)。所述抗體限制了IL-15在疾病相關性炎癥如RA的進程中所起的作用。T細胞、尤其是CD4+T-輔助細胞參與RA炎癥過程的觸發(fā)和維持。另一種細胞因子TNF-α也參與最終導致RA患者關節(jié)損傷和功能喪失的炎癥途徑。局部合成的IL-15在激活和募集T細胞以及誘導TNF-α和其它炎性細胞因子中起關鍵性的作用。IL-15在RA進程中的作用涉及由巨噬細胞合成的IL-15誘導T細胞募集的過程。然后，所述活化T細胞(1)維持巨噬細胞激活；并且(2)誘導TNF-α產生。受刺激的巨噬細胞促進合成更多的IL-15以及T細胞激活，因而持續(xù)進行所述循環(huán)。除了其對TNF-α和巨噬細胞的作用外，IL-15還激活嗜中性粒細胞，并影響局部B細胞的免疫球蛋白分泌，尤其是類風濕因子的合成。因此，本發(fā)明的抗IL-15抗體可以用于預防或阻斷引起RA的IL-15的上述作用，因而可以用于預防或治療該疾病。例如，本發(fā)明的抗IL-15抗體可以用于抑制與RA相關的炎癥和/或預防活化白細胞的趨化性。本發(fā)明的人抗體可以用于抑制對甲氨蝶呤有不適當反應的類風濕性關節(jié)炎患者的結構性損傷的發(fā)展，或用于減少一般至嚴重的活動性類風濕性關節(jié)炎患者的體征和癥狀以及延緩結構性損傷，包括并沒有經歷過DMARD治療無效的患者。本發(fā)明的人抗體還可以用于阻斷或抑制IL-15的其它作用。IL-15在各種細胞和組織中表達，包括單核細胞和巨噬細胞、成纖維細胞、樹突細胞以及角質化細胞。角質化細胞是表皮和粘膜組織上皮層的主要組分。角質化細胞生長的控制由細胞因子和生長因子的復雜網(wǎng)絡介導，其中部分因子由角質化細胞自身產生。來自角質化細胞的IL-15促使T細胞聚集、增殖及在銀屑病斑中存活。已知多種其中角質化細胞數(shù)目增加所導致的表皮增生的疾病，所述表皮增生引起至少某些相關的疾病癥狀。這些疾病包括慢性疾病如銀屑病和特應性皮炎，以及慢性病癥如慢性手部濕疹、接觸性皮炎、病毒疣(HPV有關的)、皮膚T細胞淋巴瘤、傷口愈合困難如糖尿病引起的傷口愈合困難。因此，本發(fā)明提供治療或預防這類疾病的方法，即通過將有效量的本發(fā)明人抗IL-15抗體給予患者，以治療或預防所述疾病。例如，本發(fā)明的抗IL-15抗體可以用于阻斷或抑制銀屑病中的角化不全，減少銀屑病中的表皮厚度，以及減少銀屑病中的角質化細胞增殖。IL-15也調節(jié)腸上皮細胞的功能(Reinecker等，(1996)Gastro-enterology1111706-13)。準確地講，IL-15可以導致對粘膜上皮細胞和腸上皮細胞系的調整，因此與炎性腸病如腹腔疾病的發(fā)病機理有關。IL-15在這些疾病中的作用表現(xiàn)在未治療的腹腔疾病患者的小腸中的IL-15+細胞的選擇性過度出現(xiàn)(WO00/02582)。因此，已經表明，IL-15直接參與腹腔疾病的觸發(fā)和維持。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗IL-15人抗體(即抑制IL-15促炎作用的抗體)可以用于治療和/或預防腹腔疾病，即將有效量的所述抗體給予患者，以治療或預防所述疾病。此外，本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)IL-15還促進新血管的形成，一種被稱為新血管形成或血管生成的過程。因此，本發(fā)明抗體的又一用途包括預防或治療包括新血管形成在內的疾病。除炎性疾病之外，這些疾病還包括各種依賴于或其特征在于新血管形成的癌癥。本發(fā)明的人抗體還可以用于阻斷或抑制與感染性疾病如HIV相關的IL-15的作用。因此，本發(fā)明抗體的另一用途包括預防或治療感染性疾病如HIV-1。例如，所述抗體可以用于在體外或體內診斷由IL-15介導的各種疾病。準確地講，所述抗體可以用于檢測IL-15的水平或在其膜表面含有IL-15或與其受體(受體結合的人IL-15)相關的細胞水平。然后可找出這種IL-15水平檢測與某些疾病癥狀之間的聯(lián)系?；蛘?，所述抗體可以用于抑制或阻斷IL-15的功能，進而可以預防或緩解由IL-15作用引起的疾病癥狀。如上文所述，本發(fā)明的人抗IL-15抗體可以與一種或多種治療藥如免疫抑制劑或抗炎藥共同給予，以提高整體抗炎效應。所述抗體可以連接于所述藥物(作為免疫復合物)，或者可與所述藥物分開給予。在后一種情況下(分開給藥)，可以在給予所述藥物之前、之后或同時，給予所述抗體。合適的治療藥其中包括抗炎藥、DMARD(疾病調修抗風濕藥)、免疫抑制劑、化療藥和銀屑病藥。根據(jù)本發(fā)明的人抗體也可以結合放療給予。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人抗體可以與其它抗體例如CD4特異性抗體和IL-2特異性抗體聯(lián)合給予。本發(fā)明的人抗體與CD4特異性抗體或IL-2特異性抗體的組合被認為對治療自身免疫病和移植排斥特別有用。包含本發(fā)明的人抗IL-15抗體的試劑盒以及任選使用說明也在本發(fā)明的范圍內。所述試劑盒還可以含有一種或多種其它試劑如免疫抑制劑或一種或多種本發(fā)明的其它人抗體(例如不同于第一種人抗體、具有補體活性、結合IL-15抗原的表位的人抗體)。因此，用本發(fā)明抗體治療的患者可以另外給予(在給予本發(fā)明的人抗體之前、同時或之后)另一治療藥，例如增強或提高所述人抗體療效的抗炎藥。在另一個實施方案中，通過使這樣的化合物與所述抗體結合，本發(fā)明的人抗體可以用于將化合物(例如治療藥、標記、細胞毒素、免疫抑制劑等)靶向含有與其表面(例如結合IL-15受體或與其結合的膜)結合的IL-15的細胞。因此，本發(fā)明也提供用于使離體、體內或體外表達IL-15和IL-15受體的細胞定位的方法(例如用可檢測標記如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)。在下面的實施例中描述了本發(fā)明的其它實施方案。通過以下實施例進一步說明本發(fā)明，不應解釋為以下實施例進一步限制本發(fā)明。序列表、附圖和在本申請中所引用的所有參考文獻、專利和公布的專利申請的內容通過引用結合到本文中。實施例實施例1Cμ中靶小鼠的產生CMD打靶載體的構建質粒pICEμ含有一個跨越μ基因的鼠Ig重鏈基因座的EcoRI/XhoI片段，得自Balb/C基因組λ噬菌體文庫(Marcu等，Cell22187，1980)。將該基因組片段亞克隆到質粒pICEMI9H(Marsh等；Gene32，481-485，1984)的XhoI/EcoRI位點中。pICEμ中包括的重鏈序列從恰好位于μ內含子增強子3’的EcoRI位點下游延伸至位于μ基因最后一個跨膜外顯子下游約1kb的XhoI位點；然而，μ轉換重復區(qū)中的大部分已經由于在大腸桿菌(E.coli)中傳代而缺失。如下構建所述打靶載體。從pICEμ中切下一個1.3kbHindIII/SmaI片段，并將其亞克隆到HindIII/SmaI消化的pBluescript(Stratagene，LaJolla，CA)中。該pICEμ片段從位于Cμl5’約1kb的HindIII位點延伸至位于Cμl內的SmaI位點。所得的質粒用SmaI/SpeI消化，插入來自pICEμ、從Cμl3’中的SmaI位點延伸至恰好位于最后一個Cμ外顯子下游的XbaI位點的約4kbSmaI/XbaI片段。所得質粒pTAR1在SmaI位點線性化，并插入一個neo表達盒。該盒由處于小鼠磷酸甘油酸激酶(pgk)啟動子(XbaI/TaqI片段；Adra等(1987)，Gene6065-74)的轉錄控制下并且含有pgk聚腺苷酸化位點(PvuII/HindIII片段；Boer等(1990)BiochemicalGenetics28299-308)的neo基因組成。該盒得自質粒pKJ1(如Tybulewicz等(1991)Cell651153-1163所述)，從所述質粒中切取neo盒作為EcoRI/HindIII片段，并將其亞克隆到EcoRI/HindIII消化的pGEM-7Zf(+)中，產生pGEM-7(KJ1)。通過EcoRI/SaII消化，從pGEM-7(KJ1)中切取該neo盒，將其平端化，并以與基因組Cμ序列相反的方向亞克隆到質粒pTAR1中的SmaI位點。所得的質粒用NotI線性化，并插入單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)盒，以便富集帶有同源重組體的ES克隆，如Mansour等(1988)Natrue336348-352所述。該盒由以小鼠pgk啟動子和聚腺苷酸化位點作支架的tk基因的編碼序列組成，如Tybulewicz等(1991)Cell651153-1163所述。所得的CMD打靶載體與所述重鏈基因座有總共大約5.3kb同源性，設計用以產生其中neo表達盒插入第一個Cμ外顯子的唯一SmaI位點中的突變型μ基因。所述打靶載體在通過電穿孔進入ES細胞中之前，用在質粒序列內切割的PvuI線性化。中靶ES細胞的產生及分析基本上按照已描述的方法(Robertson，E.J.(1978)載于TeratocarcinomasandEmbryonicStemCellsaPracticalApproach(E.J.Robertson主編)牛津IRLPress，第71-112頁)，讓AB-1ES細胞(McMahon，A.P.和Bradley，A.(1990)Cell621073-1085)在無有絲分裂活性的SNL76/7細胞飼養(yǎng)層(出處同前)上生長。采用Hasty等所述的方法(Hasty，P.R.等(1991)Nature350243-246)，通過電穿孔，將線性化CMD打靶載體導入AB-1細胞中。將電穿孔細胞以1-2×106細胞/皿的密度接種到100mm培養(yǎng)皿中。24小時后，向培養(yǎng)基中加入G418(200微克/毫升有效成分)和FIAU(5×10-7M)，讓抗藥物克隆在8-9天內產生。挑出克隆，用胰酶消化，將其分為兩份，進一步擴大培養(yǎng)。將得自每個克隆的一半細胞冷凍，而另一半細胞用于分析載體和靶序列之間的同源重組。通過DNA印跡雜交，進行DNA分析。如Laird等所述(Laird，P.W.等，(1991)NucleicAcidsRes.194293)，從克隆中分離DNA。分離的基因組DNA用SpeI消化，用915bpSacI片段即探針A(參見圖1)探測，探針A與μ內含子增強子和μ轉換區(qū)序列之間的序列雜交。探針A從野生型基因座中檢測到一個9.9kbSpeI片段，而從μ基因座中檢測到一個已經與CMD打靶載體(neo表達盒含有一個SpeI位點)同源重組的7.6kb鑒別性條帶。在通過DNA印跡分析篩選出的1132個G418和FIAU抗性克隆中，3個克隆顯示出在μ基因座同源重組的所述7.6kbSpeI條帶。這3個克隆進一步用酶BglI、BstXI和EcoRI消化，以證實所述載體同源整合到所述μ基因中。當與探針A雜交時，經BglI、BstXI或EcoRI消化的野生型DNA的DNA印跡分別產生15.7kb片段、7.3kb片段和12.5kb片段，而7.7kb片段、6.6kb片段和14.3kb片段分別指示存在中靶μ等位基因。所有3個通過SpeI消化所檢測的陽性克隆顯示出預期的鑒別所述neo盒插入Cμl外顯子中的BglI、BstXI和EcoRI限制性片段。帶有突變型μ基因的小鼠的產生將指定編號為264、272和408的所述3個中靶ES克隆解凍復蘇，如Bradley所述(Bradley，A.(1987)載于TeratocarcinomasandEmbryonicStemCellsaPracticalApproach(E.J.Robertson主編)牛津IRLPress，第113-151頁)，注射到C57BL/6J胚泡中。將經注射的胚泡轉移到假孕雌性小鼠的子宮中，產生代表來源于植入ES細胞和宿主胚泡的細胞混合物的嵌合小鼠。根據(jù)刺豚鼠毛色中C57BL/6J黑色背景上來源于所述ES細胞系的量，可以肉眼估計ES細胞對所述嵌合體的貢獻程度。克隆272和408僅產生低百分比的嵌合體(即刺豚鼠著色的百分比低)，而克隆264則產生高百分比的雄性嵌合體。讓這些嵌合體與C57BL/6J雌鼠配種，產生ES細胞基因組種系遺傳的刺豚鼠后代。通過對經BglI消化的尾部活檢樣品的DNA的DNA印跡分析(如上文關于ES細胞DNA分析的所述方法)，篩選所述被打中的μ基因。大約50％的所述刺豚鼠后代除顯示出15.7kb的野生型條帶之外，還顯示出一個7.7kb的BglI的雜交條帶，證明中靶μ基因的種系遺傳。對轉基因小鼠μ基因的功能性失活的分析為了確定neo盒插入到Cμl中是否使所述Ig重鏈基因失活，讓克隆264嵌合體與JHD突變純合型小鼠配種，JHD突變由于JH基因區(qū)段的缺失而使重鏈表達失活(Chen等，(1993)Immunol.5647-656)。產生了4個刺豚鼠后代。從1月齡這些動物中獲得血清，通過ELISA分析鼠IgM的存在。所述4個后代中的2個完全缺乏IgM(參見表1)。尾部活檢樣品DNA通過BglI消化并使其與探針A(參見圖1)雜交、以及通過StuI消化并與475bpEcoRI/StuI片段(出處同前)雜交進行DNA印跡分析，分析所述4只動物的基因型，證明不能表達血清IgM的動物是其中所述重鏈基因座中的一個等位基因帶有所述JHD突變、而另一個等位基因帶有所述Cμl突變的動物。JHD突變雜合型小鼠顯示出血清Ig的野生型水平。這些數(shù)據(jù)證明，所述Cμl突變使μ基因的表達失活。表1表1顯示了通過ELISA檢測的攜帶CMD突變和JHD突變的小鼠(CMD/JHD)、JHD突變雜合型小鼠(+/JHD)、野生型小鼠(129Sv×C57BL/6J)F1小鼠(+/+)以及B細胞缺陷型JHD突變純合型小鼠(JHD/JHD)的血清IgM水平。實施例2HCO12轉基因小鼠的產生HCO12人重鏈轉其因通過將pHC2(Taylor等，1994，Iht.Immunol.，6579-591)的80kb插入片段和pVx6的25kb插入片段共同注射，產生HCO12轉基因。質粒pVx6如下所述構建。將包含人種系VH1-18(DP-14)基因與約2.5kb5′側翼基因組序列和5kb3′側翼基因組序列的8.5kbHindIII/SalIDNA片段，亞克隆到質粒載體pSP72(Promega，Madison，WI)中，產生質粒p343.7.16。將包含人種系VH5-51(DP-73)基因與約5kb5′側翼基因組序列和1kb3′側翼基因組序列的7kbBamHI/HindIIIDNA片段，克隆到基于pBR322的質?？寺≥d體pGP1f(Taylor等1992，NucleicAcidsRes.206287-6295)中，產生質粒p251f。由pGP1f衍生的一種新克隆載體pGP1k(SEQIDNO13)用EcoRV/BamHI消化，與包含人種系VH3-23(DP47)基因以及約4kb5′側翼基因組序列和5kb3′側翼基因組序列的10kbEcoRV/BamHIDNA片段連接。所得的質粒p112.2RR.7用BamHI/SalI消化，與p251f的7kb純化BamHI/SalI插入片段連接。所得的質粒pVx4用XhoI消化，與p343.7.16的8.5kbXhoI/SalI插入片段連接。獲得一個具有與另外兩個V基因方向相同的VH1-18基因的克隆。命名為pVx6的該克隆然后用NotI消化，如Hogan等所述(B.Hogan等，ManipulatingtheMouseEmbryo，ALaboratoryManual，第二版，1994，ColdSpringHarborLaboratoryPress，PlainviewNY)，將經純化的26kb插入片段與純化的pHC2的80kbNotI括入片段以1∶1的摩爾比共同注射到半日齡(C57BL/6J×DBA/2J)F2胚胎的原核中。從由經注射胚胎發(fā)育而成的小鼠，建立了三個獨立的包含得自Vx6以及HC2的序列的轉基因小鼠系。這些系命名為(HCO12)14881、(HCO12)15083和(HCO12)15087。然后，這三個系中的每個系與包含實施例1中所述的CMD突變、JKD突變(Chen等1993，EMBOJ.12811-820)和(KCo5)9272轉基因(Fishwild等1996，NatureBiotechnology14845-851)的小鼠配種。所產生的小鼠在內源小鼠重鏈和κ輕鏈基因座被破壞純合型的背景中表達人重鏈和κ輕鏈轉基因。實施例3抗IL-15人單克隆抗體的產生如上所述產生的以及由Medex(SanJosé，CA，美國)提供的HCo12和HCo17轉基因小鼠，用補充完全弗氏佐劑(CFA，批號121024LA，DifcoLaboratories，Detroit，Michigan，美國)或不完全弗氏佐劑(ICFA，批號121195LA，Difco)的人重組IL-15(hIL-15，Immunexcorp.，Seattle，美國)皮下(SC)、腹膜內(IP)或靜脈內(IV)注射免疫。在幾種情況下，用與KLH偶聯(lián)的hIL-15進行免疫。在用補充完全或不完全弗氏佐劑的hIL-15加強免疫數(shù)次后，測試小鼠血清針對IL-15的人抗體的存在情況。產生最終克隆146B7、146H5、404E4和404A8的轉基因小鼠的免疫方案小鼠編號146(HCo12)、ID995-146，雌性170699SC12μghIL-15+CFA(Difco，批號121024LA)010799SC12μghIL-15+CFA(Difco，批號121195LA)150799SC12μghIL-15+ICFA020899SC12μghIL-15-KLH+ICFA070999SC12μghIL-15-KLH+ICFA280999SC12μghIL-15-KLH+CFA111099IV30μghIL-15+PBS121099IV30μghIL-15+PBS151099該小鼠的淋巴結細胞和脾細胞與SP2/0的融合體小鼠編號404(HCo7)、ID997-404，雌性201099IP25μghIL-15-KLH+CFA(Difco，批號121024LA)031199IP12.5μghIL-15、12.5μghIL-15-KLH、25μg+ICFA(Difco，批號121195LA)101199IV12.5μghIL、12.5μghIL-15-KLH121199IV12.5μghIL、12.5μghIL-15-KLH191199該小鼠的淋巴結細胞和脾細胞與SP2/0的融合體培養(yǎng)基融合配偶體培養(yǎng)基(FPM)Iscoves改良Dulbecco氏培養(yǎng)基補充100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、1mM丙酮酸鈉、0.5mMβ-巰基乙醇(LifeTechnologies，Paisley，蘇格蘭)和10％熱滅活胎牛血清(HyClone，Utah，美國)。融合選擇培養(yǎng)基(FSM)FPM補充30mlOrigenHybridomaCloningFactor(雜交瘤克隆因子)(IGEN，Gaithersburg，MD，美國)、HAT(1支管形瓶，生產商推薦的濃度，SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO，美國)和0.5mg/ml卡那霉素(LifeTechnologies，Paisley，蘇格蘭)。融合克隆培養(yǎng)基(FCM)FPM補充20mlOrigenHybridomaCloningFactor(雜交瘤克隆因子)(IGEN，Gaithersburg，MD，美國)、HT(1支管形瓶，生產商推薦的濃度，SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO，美國)和0.5mg/ml卡那霉素(LifeTechnologies，Paisley，蘇格蘭)。雜交瘤制備脾細胞和淋巴結細胞與SP2/0骨髓瘤細胞的融合為了獲得雜交瘤，取出所述小鼠的脾臟、腹股溝淋巴結和副主動脈淋巴結。將脾細胞和淋巴結細胞的單細胞懸液與SP2/0骨髓瘤細胞以1∶2的細胞比率混合。離心沉淀細胞，并將沉淀于37℃小心地重懸于1ml聚乙二醇(50％w/v的PBS溶液中，Sigma-Aldrich，Irvin，英國)中。渦旋細胞60秒后，加入25mlFPM-2，然后將細胞于37℃孵育30-60分鐘。孵育后，將細胞以0.75×105細胞/孔(100μl)的細胞濃度在裝有FSM的96孔板中進行培養(yǎng)。3天后，向各孔中加入100μlFSM。用hIL-15免疫的HCo7和HCo12小鼠的脾細胞和淋巴結細胞的融合，導致產生幾種產生抗IL-15抗體的雜交瘤。分離出以下4個產生完全人抗IL-15抗體的穩(wěn)定克隆(1)146LyD7F7B7，重命名為146B7；(2)146DE2E12A3H5，重命名為146H5；(3)404CG11B7E4，重命名為404E4；和(4)404FB12E7A8，重命名為404A8。這些克隆全都是人IgG1/k亞類。雜交瘤的篩選融合后第7天和第11天之間，采用以下ELISA，篩選各孔中人抗體的存在用ELISA篩選培養(yǎng)上清液中存在的人IgG為了進行ELISA以檢測人IgG抗體的存在，將磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的0.9μg/ml兔-α-κ-輕鏈抗體(DAKO，Glostrup，丹麥)以100μl/孔加入到NuncMaxisoroELISA板中(室溫下孵育過夜)。所述板用補充雞血清(2％；LifeTechnologies，Paisley，蘇格蘭)和吐溫-20(0.05％；PBSTC)的PBS封閉后，加入培養(yǎng)上清液。孵育1.5小時后，洗滌所述板，然后加入在PBSTC中稀釋的0.5μg/ml的與辣根過氧化物酶綴合的兔-α-人IgG(Fab-2片段)(DAKO，Glostrup，丹麥)。孵育1小時后，洗滌各孔，按照生產商的方案，加入底物ABTS(2，2’-連氮雙-3-乙基苯并噻唑啉-磺酸，RocheDiagnostics，Mannheim，德國)，然后用EL808ELISA-讀出儀(Bio-tekInstruments，Winooski，VT，美國)在405nm下評價抗體結合。用ELISA篩選存在的IL-15特異性抗體含有人IgG/k抗體的各孔進一步用IL-15-特異性ELISA測試人抗IL-15抗體的存在。為了進行所述ELISA，將1μg/mlIL-15的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)以100μl/孔加入到NuncMaxisorpELISA板中(室溫下孵育過夜)。所述板用補充雞血清(2％；LifeTechnologies，Paisley，蘇格蘭)和吐溫-20(0.05％；PBSTC)的PBS封閉后，加入培養(yǎng)上清液。孵育1.5小時后，洗滌所述板，然后加入在PBSTC中以1/5000稀釋的與辣根過氧化物酶綴合的α-人IgGFc(JacksonImnunoresearch，WestGrove，Pennsylvania，美國)。孵育1小時后，洗滌各孔，然后按照生產商的方案，加入底物ABTS(2，2’-連氮雙-3-乙基苯并噻唑啉-磺酸，RocheDiagnostics，Mannheim，德國)，然后用EL808ELISA-讀出儀(Bio-tekInstruments，Winooski，VT，美國)在405nm下評價抗體結合。雜交瘤的亞克隆為了獲得穩(wěn)定的抗IL-15細胞系，通過有限稀釋96孔板中的細胞(至0.5個細胞/孔)，亞克隆所述雜交瘤。約10天后，用上述IL-15ELISA測試所述亞克隆。在幾個亞克隆程序期間，將FSM分階段通過FCM替換成FPM。用下述ELISA確定所述亞克隆的同種型。通過ELISA同種型測定抗IL-15抗體為了進行同種型ELISA，將1μg/ml抗人Fc(JacksonImmunoresearch)的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)以100μl/孔加入到NuncMaxisorpELISA板中(室溫下孵育過夜)。所述板用補充雞血清(2％；LifeTechnologies，Paisley，蘇格蘭)和吐溫-20(0.05％；PBSTC)的PBS封閉后，加入培養(yǎng)上清液。孵育1.5小時后，洗滌各板，然后加入與堿性磷酸酶綴合的小鼠-α-HuIgG1(Zymed，plaats，land)或與辣根過氧化物酶綴合的小鼠-α-HuIgG3(Zymed)。孵育1小時后，洗滌各孔，然后按照生產商的方案，加入底物ABTS(2，2’-連氮雙-3-乙基苯并噻唑啉-磺酸，RocheDiagnostics，Mannheim，德國)，然后用EL808ELISA-讀出儀(Bio-tekInstruments，Winooski，VT，美國)在405nm下評價抗體結合。實施例4完全人抗IL-15抗體的表位特異性為了發(fā)揮治療作用并抑制IL-15誘導的促炎作用，IL-15特異性抗體需要識別參與IL-15受體的IL-2Rβ-鏈和/或γ-鏈相互作用的IL-15表位。用突變蛋白(Pettit等所述)評價完全人抗IL-15抗體—146B7、146H5、404A8和404E4的表位特異性。所用的IL-15突變體包括IL-15突變體Q108S(殘基108上的Gln被Ser取代；γ-鏈相互作用位點中的突變)和突變體D8SQ108S(殘基108上的Gln被Ser取代，而8位上的Asp被Ser取代，IL-15的β-鏈和γ-鏈相互作用位點中的突變)。用ELISA測定hIL-15特異性抗體—146B7、146H5、404A8和404F4與hIL-15和突變型IL-15蛋白的結合為了進行所述ELISA，將100μl的1μg/mlIL-15或hIL-15突變蛋白的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)加入到NuncMaxisorpELISA板中，供包被用。所述板用補充雞血清(2％；LifeTechnologies，Paisley，蘇格蘭)和吐溫-20(0.05％；PBSTC)的PBS封閉后，孵育hIL-15特異性抗體的連續(xù)稀釋液。洗滌后，加入在PBSTC中以1/5000稀釋的與過氧化物酶綴合的α-人IgGFc(JacksonImmunoresearch，WestGrove，Pennsylvania，美國)。洗滌后，按照生產商的方案，加入底物ABTS(2，2’-連氮雙-3-乙基苯并噻唑啉-磺酸，RocheDiagnostics，Mannheim，德國)，然后用EL808ELISA-讀出儀(Bio-tekInstruments，Winooski，VT，美國)在405nm下評價抗體結合。完全人IL-15特異性抗體—146B7、146H5、404A8和404E4與hIL-15和IL-15突變蛋白Q108S和D8SQ108S的結合示于圖1中。146B7和146H5均不能與這些突變型IL-15蛋白結合。由于這兩種突變體都帶有Q108S突變，因此146B7和146H5所識別的表位位于IL-15與IL-15受體γ-鏈相互作用的關鍵性結構域內。404A8和404E4都能結合所述突變蛋白，因此，這些抗體識別IL-15的β-鏈和γ-鏈相互作用結構域以外的表位。146B7和146H5都在與IL-15受體γ-鏈相互作用的區(qū)結合IL-15。這與采用本發(fā)明完全人抗IL-15抗體根據(jù)增殖測定所得的數(shù)據(jù)一致。如下文詳述，404A8和404E4都不能抑制IL-15誘導的CTLL-2細胞和人PBMC的增殖。146B7和146H5都能夠抑制IL-15誘導的增殖。此外，通過阻斷IL-15與IL-15受體γ亞基的相互作用能夠實現(xiàn)對增殖的抑制。實施例5146B7的VH區(qū)序列和VL區(qū)序列采用下列步驟，測定146B7的重排VH區(qū)和VL區(qū)的核苷酸序列和導出的氨基酸序列。這些序列給出了關于所用VH和VL種系家族的信息；這些種系序列中的點突變是由于在所述動物的免疫期間B細胞的親和力成熟所致。RNA制備按照生產商的方案，用RNAzol(Biogenesis，Poole，英國)，從5×106146B7雜交瘤細胞制備總RNA。cDNA制備按照生產商的方案，用AMV反轉錄酶加上緩沖液(RocheDiagnosticsGmbH，Mannheim，德國)、寡聚d(T)15(Promega，Madison，WI，美國)、dNTP(BoehringerMannheimCorp，美國)和RNAsin(Promega)，從3μgRNA制備146B7RNA的cDNA。用于擴增克隆用VH區(qū)和VL區(qū)的PCR引物所用的引物對VHFR15’引物(1)AB62CAggTKCAgCTggTgCAgTC(2)AB63SAggTgCAgCTgKTggAgTC(3)AB65gAggTgCAgCTggTgCAgTCVH前導5’引物(4)AB85ATggACTggACCTggAgCATC(5)AB86ATggAATTggggCTgAgCTg(6)AB87ATggAgTTTggRCTgAgCTg(7)AB88ATgAAACACCTgTggTTCTTC(8)AB89ATggggTCAACCgCCATCCTVH3’引物(9)AB90TgCCAgggggAAgACCgATggVKFR15’引物(1)AB8RACATCCAgATgAYCCAgTC(2)AB9gYCATCYRgATgACCCAgTC(3)AB10gATATTgTgATgACCCAgAC(4)AB11gAAATTgTgTTgACRCAgTC(5)AB12gAAATWgTRATgACACAgTC(6)AB13gATgTTgTgATgACACAGTC(7)AB14gAAATTgTgCTgACTCAgTCVK前導5’引物(8)AB123CCCgCTCagCTCCTggggCTCCTg(9)AB124CCCTgCTCAgCTCCTggggCTgC(10)AB125CCCAgCgCAgCTTCTCTTCCTCCTgC(11)AB126ATggAACCATggAAgCCCCAgCACAgCVK3’引物(12)AB16CgggAAgATgAAgACAgATg用于擴增克隆用VH區(qū)和VL區(qū)的PCR條件在GeneAmpPCRSystem9700(PerkinElmerAppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA，美國)上，用AmpliTaq聚合酶(PerkinElmer)進行PCR反應。PCR循環(huán)方案94°2’11個循環(huán)94°30”65°30”，每個循環(huán)減1°72°30”30個循環(huán)94°30”55°30”72°30”72°10’冷卻至4°在pGFMT-載體系統(tǒng)I中克隆VH和VL在瓊脂糖凝膠上分析PCR產物之后，用S-400或S300microspin柱(AmershamPharmaciaBiotechInc.，piscataway，NJ，美國)或QIAEXIIGelExtractionKit(凝膠提取試劑盒)(QiagenGmbH，Hilden，德國)純化所述產物。對于每個實驗，按照生產商的方案，在pGEMT載體系統(tǒng)I(Promega)中克隆用每個VH區(qū)和VL區(qū)的FR1或前導引物的兩個獨立的PCR擴增產物。轉化到大腸桿菌DH5α后，各克隆用T7和SP6引物、通過55℃下30個循環(huán)的菌落PCR進行篩選。來自各單菌落的質粒DNA用QiaprepSpin微量制備試劑盒(Qiagen)純化。為了進一步分析Ncol/Notl(NEBiolabs，UnitedKingdomandRocheDiagnostics)，進行消化并在瓊脂糖凝膠上進行分析。測序克隆后，在pGEMT-載體系統(tǒng)I中對V區(qū)進行測序。按照方案，聯(lián)合使用T7和Sp6引物(Eurogentec，Luik，Belgium)和測序試劑盒ABIPrismBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit(AppliedBiosystems，Warrington，英國)。該反應在ABIPRISM377測序儀(PEAppliedBiosystems)中進行，并用程序DNAStar，SeqmanII分析序列。然后將所述序列與VBASE中的種系V-基因序列(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/intro.htm)進行序列比對。146B7VH區(qū)和VL區(qū)的克隆和測序通過PCR擴增雜交瘤146B7的VH區(qū)和VL區(qū)，并將其克隆到pGEMT-載體系統(tǒng)I中，以測定cDNA序列。所述核苷酸序列和相應的氨基酸序列分別示于圖2(SEQIDNO1和2)和圖3(SEQIDNO3和4)中。也標出了構架區(qū)(FR)和互補性決定區(qū)(CDR)。依照序列比對，146B7VH區(qū)的種系家族在Vbase中為VH5-51(VH5-亞組)、D2-15/D2(DH-區(qū)段)、JH4b(JH-區(qū)段)。依照序列比對，146B7VL區(qū)的種系家族在Vbase中為A27(VKIII-亞組)和JK2(JK-區(qū)段)。有關VH區(qū)和VL區(qū)的更多資料示于Kabat數(shù)據(jù)庫http//immuno.bme.nwu.edu/或http//www.Vbase.com。實施例6146B7的親和性結合特征按照下列程序，用BIACORE3000儀器，通過表面胞質團共振(SPR)技術，分析146B7的親和性，以測定生物分子蛋白質的相互作用。檢測出生物分子結合所致的表層SPR信號的變化，并且表示表層質量濃度的變化。親和力用下列定義表示ka＝締合速率常數(shù)(M-1sec-1)；kd＝解離速率常數(shù)(sec-1)；KA＝締合平衡常數(shù)＝ka/kd(M-1)；而KD＝解離平衡常數(shù)＝kd/ka(M)。進行不同的程序，以獲得146B7對人IL-15(hIL-15)的親和力。將來自兩個不同供應商(Immunex，corp.，Seattle，美國和Peprotech，RockyHill，NJ，美國)的重組人IL-15與CM5傳感器芯片偶聯(lián)。將與傳感器芯片偶聯(lián)的化合物定義為配體。在其它實驗中，用146B7作為配體。在各種動力學分析中，將所用的被分析物146B7或hIL-15與所述傳感器芯片所偶聯(lián)的配體的結合，跟與參比對照CM5傳感器芯片的結合進行比較。測試連續(xù)稀釋的被分析物(0μg/ml、3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)。在模型Langmuir1:1中，擬合締合曲線和解離曲線的單體相互作用，以測定ka和kd并計算KA和KD。所有數(shù)據(jù)全都運用BIA-EvaluationVersion3.1進行分析。對于二價相互作用，使用模型“二價被分析物”。所有分析均根據(jù)漂移基線進行校正。為了測定146B7的抗體親和力，在BIACORE3000上測量抗體146B7對得自兩個不同供應商Immunex和Peprotech的重組人IL-15的親和力。用146B7作為配體，而用hIL-15作為被分析物，測定單價相互作用(曲線擬合Langmuir1:1)。146B7對IL-15(ImmunexCorp.)的親和力如下測量締合速率常數(shù)ka1.07(±0.17)×105M-1sec-1解離速率常數(shù)kd6.56(±0.09)×10-3sec-1締合平衡常數(shù)KA1.55(±0.21)×107M-1解離平衡常數(shù)KD6.56(±0.88)×10-8M為了測定146B7的親合力，用IL-15(ImmunexCorp.)作為配體，而用146B7作為被分析物。如果所得數(shù)據(jù)運用Langmuir(1:1)曲線擬合進行分析，則表示所述抗體的二價相互作用，從而測定出所述抗體的親合力。146B7對IL-15(ImmunexCorp.)的親合力如下測量締合速率常數(shù)ka7.30(±0.81)×105M-1sec-1解離速率常數(shù)kd1.45(±2.05)×10-3sec-1締合平衡常數(shù)KA5.03(±3.40)×108M-1解離平衡常數(shù)KD1.55(±1.24)×10-9M也測定了146B7對得自Peprotech的IL-15的親和力和親合力。未見對兩種不同來源的IL-15的親和力或親合力方面的顯著差異。正如以下實施例關于完全人抗IL-15抗體對人白介素-15(hIL-15)誘導的CTLL-2細胞和PBMC增殖的抑制的描述，根據(jù)[3H]-胸苷摻入測定，146B7以劑量依賴性方式抑制IL-15誘導的增殖。計算50％抑制時的IC50濃度為3.1±0.91nM，這是一種根據(jù)這些增殖抑制實驗測定親和力的更加有效的方法。該IC50與用146B7作為配體而用重組人IL-15作為被分析物通過BIACORE3000測得的親合力(KD1.5nM)一致，因而證實了本文所得的親和力和親合力測量結果。實施例7抗IL-15完全人抗體抑制hIL-15誘導的TNF-α產生采用下列程序，用來自健康志愿者的外周血單核細胞(PBMC)，研究抗IL-15完全人抗體—146B7、146H5、404E4和404A8對IL-15誘導的TNF-α產生的影響。為了評價對IL-15的特異性，也檢查了這些抗體對IL-2介導的TNF-α產生的影響。細胞培養(yǎng)將細胞保持在含有2mML-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素(均得自LifeTechnologies，Paisley，蘇格蘭)和10％熱滅活胎牛血清(HyClone，Utah，美國)的RPMI-1640中。外周血單核細胞(PBMC)的純化征得同意后，從健康志愿者采集新鮮人血，加肝素抗凝。采用Ficoll(Pharmacia，Uppsala，瑞典)，通過密度梯度離心，進行PBMC的純化。試驗化合物hIL-15，批號6870-011，Immunexcorp.，Seattle，Washington，美國。hIL-2，ChironBeneluxBV，Amsterdam，荷蘭。所用的完全人抗體146B7(批號070101)和146B7RDJW07，404A8(批號030101)和404E4(批號080101)及作為同種型對照的抗體T1(97-2B11-2B12，批號190900)?？笽L-15抗體抑制對PBMC的人IL-15(hIL-15)或hIL-2誘導的TNF-α產生在存在或不存在hIL-2或hIL-15以及含有或不含抗IL-15抗體的情況下，PBMC按三個復份或四個復份以1.5×105細胞/孔在96孔平底板中進行培養(yǎng)。包括作為陰性對照的同種型對照抗體(T1)。加入伴刀豆球蛋白A(2.5μg/ml，Calbiochem)作為用于增殖的陽性對照。細胞在37℃和5％CO2下孵育72小時。收獲上清液，以通過ELISA(U-CyTech，Utrecht，荷蘭)定量測定人TNF-α的含量。測試146B7和同種型對照抗體對PMBC的IL-15介導的TNF-α產生的影響。146B7以劑量依賴性方式抑制hIL-15介導的TNF-α產生，而同種型對照抗體不抑制hIL-15誘導的TNF-α產生(圖6)。顯示了兩名健康志愿者的數(shù)據(jù)。404E4和404A8不能抑制hIL-15誘導的TNF-α產生。為了確證抗IL-15抗體的特異性，評價它們對hIL-2介導的TNF-α產生的影響。146B7不誘導對IL-2介導的TNF-α產生的抑制(圖7)。未見404E4或404A8之一對hIL-2介導的TNF-α產生的劑量依賴性抑制。對hIL-15介導的TNF-α產生的劑量依賴性抑制僅見于146B7而非404E4和404A8。所述抑制作用對hIL-15是特異性的；IL-2介導的TNF-α產生未被抑制。實施例8抗IL-15完全人抗體對人白介素15(hIL-15)誘導的CTLL-2細胞增殖和PBMC增殖的抑制采用下列程序，使用CTLL-2細胞(Gillis等，1978)和外周血單核細胞(PBMC)，測試抗體146B7、146H5、404E4和404A8抑制T細胞增殖的能力。細胞培養(yǎng)將培養(yǎng)物保持在含有2mML-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素(得自LifeTechnologies，Paisley，蘇格蘭)和10％熱滅活胎牛血清(HyClone，Utah，美國)的RPMI-1640中。將CTLL-2細胞(Gillis等，1978)保持在補充36單位hIL-2/ml(ChironBeneluxBV，Amsterdam，荷蘭)的上述培養(yǎng)基中并饑餓hIL-2達3-4天，然后開始進行所述實驗。臨用前將CTLL-2細胞洗滌3次。外周血單核細胞(PBMC)的純化征得同意后，從健康志愿者采集新鮮人血，加肝素抗凝。采用Ficoll(Pharmacia，Uppsala，瑞典)，通過密度梯度離心，進行PBMC的純化。試驗化合物hIL-15，批號6870-011，Immunexcorp.，Seattle，Washington，美國。hIL-2，ChironBeneluxBV，Amsterdam，荷蘭。本報告中示于圖8、供CTLL-2分析用的抗IL-15抗體146B7、146H5、404A8、404E4。進行PMBC分析所用的抗IL-15抗體146B7(批號070101)，404A8(批號030101)和404E4(批號080101)?？笽L-15抗體對人IL-15(hIL-15)或hIL-2誘導的CTLL-2增殖的抑制在每個試驗中，細胞按3個復份以5×103細胞/孔接種于含或不含hIL-2或ML-15的96孔板中。為了評價對增殖的作用，分別加入這四種抗IL-15抗體。細胞在37℃和5％CO2下孵育16小時。收獲(Harvester96MachIIM，Tomtec，Orange，CT，美國)前4小時，加入[3H]胸苷(1μCi/孔，AmershamLifeSciences，LittleChalfont，Buckinhamshire，英國)。如圖8所示，根據(jù)[3H]胸苷摻入減少表明，146B7和146H5以劑量依賴性方式降低IL-15誘導的CTLL-2細胞增殖。404E4和404A8均不能阻斷IL-15誘導的CTLL-2細胞增殖?？笽L-15抗體對hIL-15(hIL-15)或hIL-2誘導PBMC增殖的抑制在存在或不存在hIL-2或hIL-15及抗IL-15抗體的情況下，將PBMC按3個復份以5×104細胞/孔在96孔U底板(Nunc，NalgeNuncInternational，丹麥)中進行培養(yǎng)。加入伴刀豆球蛋白A(2.5μg/ml，Calbiochem)作為用于增殖的陽性對照。將細胞在37℃和5％CO2下孵育72小時。在收獲(Harvester96，Tomtec，Orange，CT，美國)前16小時，加入[3H]胸苷(1μCi/孔，AmershamLifeSciences，LittleChalfont，Buckinhamshire，英國)。146B7能夠以劑量依賴性方式抑制IL-15誘導的[3H]胸苷摻入，因此抑制增殖(IC50＝3.1±0.91nM)。404E4和404A8均不能阻斷hIL-15誘導的PBMC增殖。根據(jù)先前進行的實驗所獲得的數(shù)據(jù)，沒有對146H5進行測試。為了確證146B7、404E4和404A8對IL-15的特異性，還評價了這些抗體對IL-2介導的增殖的影響。所測試的抗IL-15抗體中沒有一個表現(xiàn)出對IL-2誘導的增殖的影響(圖9)。實施例9抗IL-15人抗體146B7與人PBMC上存在的人IL-15結合試驗化合物人PBMC得自征得同意后的健康志愿者?？贵w146B7(批號MDX015)，MedarexInc.，Milpitas，CA，美國。146B7和人IgG的生物素化N-羥基琥珀酰亞胺基-生物素(Sigma)首先在DMSO中稀釋(終稀釋度100mg/ml)，然后在0.1MNaHCO3中稀釋(終稀釋度1mg/ml，Sigma)。每1mg抗體(在1ml中稀釋)中加入600μl生物素溶液(避光，2小時，室溫)。將抗體-生物素溶液在slide-a-lyzerTM透析盒(10,000MWCO，Pierce，PerbioScience，荷蘭)中透析(4℃過夜)，以除去未標記的生物素。次日，通過分光光度法(Ultrospec2100pro)在OD280nm下測定生物素化抗體的濃度。外周血的刺激為了誘導IL-15，通過靜脈穿刺獲得健康志愿者的血液。將PBMC在補充青霉素(5U/ml)、鏈霉素(50μg/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)(BiowhittakerEurope)和10％胎牛血清(OptimumC241，Multicell，WisentInc.)的RPMI1640(BiowhittakerEurope)中最多培養(yǎng)2天(37℃)，并且用500U/mlIFNγ(BoehringerIngelheim)刺激。流式細胞術將細胞與10％人AB血清(CLB，Amsterdam，荷蘭)一起在補充青霉素(5U/ml)、鏈霉素(50μg/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)(BiowhittakerEurope)和10％胎牛血清(OptimumC241，Multicell，WisentInc.)的RPMI1640(BiowhittakerEurope)中進行預培養(yǎng)。透化處理(20min，4℃，Cytofix/CytopermTMKit，BectonDickinson，SanDiago，CA)并用Perm/WashTM緩沖液(Cytofix/CytopermTMKit)洗滌后，通過流式細胞術，對PBMC進行對IL-15的染色。在整個染色程序中，使用Perm/WashTM緩沖液(Cytofix/CytopermTMKit)，實現(xiàn)連續(xù)滲透力。將細胞與生物素化146B7或生物素化hIgG1(20μg/ml，30min，4℃)一起孵育并用Perm/WashTM緩沖液洗滌后，隨后將細胞與鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白(DAKO)一起孵育30分鐘(4℃)。通過流式細胞術(FACSCalibur，BectonDickison)分析并門控單核細胞后，運用CellQuestPro軟件，測定每個樣品至少5000個細胞的熒光強度。數(shù)據(jù)表示剌激指數(shù)(S.I.)，如下計算S.I.＝(平均熒光正染色)/(平均熒光背景染色)。免疫細胞化學為了檢測人單核細胞中存在的IL-15，制備全血樣品的細胞抹片(cytospin)制備物。當5×104個細胞(200μl)沉降在Superfrost-Plus顯微鏡載玻片(Menzel)后，風干載玻片(＜60min)，在20％低聚甲醛/PBS中固定(8min，4℃)，用PBS洗滌后再次風干。染色前，細胞抹片制備物在PBS(+0.1％皂苷；PBSS)中透化處理，隨后用于整個染色程序。為了阻斷內源過氧化物酶的活性，將細胞抹片制備物與在檸檬酸/磷酸緩沖液中稀釋的0.05％(v/v)過氧化氫(H2O2)一起孵育(pH8.5，20min，室溫)。用PBSS洗滌后，按照生產商的說明(BiotinBlockingKit，VectorLab.，DAKO)，阻斷內源生物素的活性。用PBSS洗滌后，細胞抹片制備物在PBSS中與10％(v/v)合并的人AB-血清(CLB，Amsterdam，荷蘭)一起孵育(30min)，阻斷非特異性結合位點。此后，將細胞抹片制備物與生物素化第一抗體一起孵育(60min，室溫)，用PBSS洗滌后，跟與生物素化辣根過氧化物酶復合的鏈霉抗生物素蛋白(streptABComplex/HRP，DAKO)一起孵育(1∶100的含2％人AB-血清的PBSS，30分鐘，室溫)。用PBSS洗滌后，將細胞抹片制備物在醋酸鈉緩沖液(50mM，pH4.9)中與3-氨基-9-乙基咔唑(0.5mg/ml)和H2O2(0.01％)一起孵育10分鐘(室溫)，以檢測HRP活性。細胞抹片用水龍頭流水洗滌5分鐘，用蘇木精(DAKO)復染色1分鐘，再用水龍頭流水洗滌5分鐘，在faramount或glycergel(DAKO)中包埋。流式細胞術146B7與IFNγ-刺激的人單核細胞的結合示于圖12。生物素化146B7與未刺激的單核細胞結合，表明在未刺激的細胞中存在IL-15。用IFNγ刺激單核細胞，導致146B7與所述細胞的結合增加，在培養(yǎng)的第一天達到最高值。對照抗體hIgG1顯示幾乎不結合未刺激的單核細胞。用IFNγ刺激通過增加單核細胞上Fcγ受體的表達而增加hIgG1的結合。免疫細胞化學圖13顯示146B7或對照抗體hIgG1對人單核細胞的染色。所述細胞與146B7一起孵育后，觀察到細胞質被清楚地染成紅色，而對照抗體則不會。因此，146B7結合單核細胞中的hIL-15，而這種結合在用IFNγ刺激后受到正調節(jié)。圖13也顯示IL-15染色主要在細胞內。實施例10抗IL-15人抗體146B7通過免疫組織化學結合組織中的IL-15試驗化合物人銀屑病皮膚—組織樣品在征得同意后取得。LouiseVilladsen，DepartmentofDermatology，GentofteUniversityHospital，Copenhagen，丹麥?？贵w146B7(批號MDX015)，Medarex，Milpitas，CA，美國。146B7和人IgG的生物素化N-羥基琥珀酰亞胺基-生物素(Sigma)首先在DMSO中稀釋(終稀釋度100mg/ml)，然后在0.1MNaHCO3中稀釋(終稀釋度1mg/ml，Sigma)。每1mg抗體(在1ml中稀釋)中加入600μl生物素溶液(避光，2hrs，室溫)。將抗體-生物素溶液在slide-a-lyzerTM透析盒(10,000MWCO，Pierce，PerbioScience，荷蘭)中透析(ON，4℃)，以除去未標記的生物素。次日，通過分光光度法(Ultrospec2100pro)在OD280nm.下測定生物素化抗體的濃度。免疫組織化學將組織貯存于-80℃直至分析。解凍后，將組織切片在丙酮中固定(10min，室溫)并風干。為了阻斷內源過氧化物酶的活性，將切片與在檸檬酸/磷酸緩沖液中稀釋的0.05％(v/v)過氧化氫(H2O2)一起孵育(pH5.8，20分鐘，室溫)。用PBS-吐溫20(PBST，0.05％，v/v)洗滌后，按照生產商的說明(BiotnBlockingKit，VectorLab.，DAKO)，阻斷內源生物素活性。用PBST洗滌后，將組織切片與10％(v/v)合并的人AB-血清(CLB，Amsterdam，荷蘭)在PBST中孵育(30分鐘)，以阻斷非特異性結合位點。吸印血清后，隨后將切片與在含2％人AB血清的PBS中稀釋的生物素化第一抗體(146B7或hIgG1)一起孵育60分鐘(室溫)。用PBST洗滌切片。用PBST洗滌后，將所有組織切片均與在含2％人AB血清的PBS中稀釋的streptABComplex/HRP一起孵育(DAKO，1∶100稀釋于含2％人AB-血清的PBS中，30分鐘，室溫)。用PBST洗滌后，將切片與3-氨基-9-乙基咔唑(0.5mg/ml)和H2O2(0.01％)一起在醋酸鈉緩沖液(50mM，pH4.9)中孵育10分鐘(室溫)，用于檢測HRP活性。切片用水龍頭流水洗滌5分鐘，用蘇木精(DAKO)復染色1分鐘，再用水龍頭流水洗滌5分鐘，最后在faramount或glycergel(DAKO)中包埋。結果組織切片用146B7染色后，觀察到銀屑病皮膚中的角質化細胞的細胞質被清楚地染色，而對照抗體則不會(圖14；146B7染色得自銀屑病斑的IL-15陽性角質化細胞)。實施例11抗IL-15人抗體146B7阻斷SCID小鼠-人組織嵌合體中的IL-15顯著抑制關節(jié)炎組織和銀屑病組織中的炎癥試驗化合物滑膜組織—得自征得同意后的青少年類風濕性關節(jié)炎患者；AlexeiGrom，divisionofpediatricrheumatology，Children’sHospitalMedicalCenter，Cincinnati，Ohio，美國。角化瘤活檢組織—組織樣品在征得同意后取得。LouiseVilladsen，DepartmentofDermatology，GentofteUniversityHospital，Copenhagen，丹麥?？贵w146B7(批號MDX015)，MedarexInc.，Milpitas，CA，美國，供銀屑病實驗用?？贵w146B7(批號15-00RDJW07)，MedarexInc.，Milpitas，CA，美國，供類風濕性關節(jié)炎實驗用。阻斷SCID小鼠-人滑膜組織嵌合體中的IL-15新鮮滑膜組織樣品取自關節(jié)置換手術后的青少年類風濕性關節(jié)炎患者。樣品無菌條件下收集。將來自整個滑膜組織的切碎組織塊充分混合，以保證各制備物的均一性。將切碎組織皮下植入SCID/NOD小鼠(JacksonLaboratories)的背部(每只小鼠2-4移植點，每點100mg)。各小鼠在移植物植入當天以及植入后第7天、第14天和第21天接受146B7(500μg，i.p.)或PBS。植入后第28天處死小鼠。切取滑膜移植物并置入福爾馬林中，供H&E染色用。SCID小鼠-人滑膜組織嵌合體組織H&E染色的定量測定(根據(jù)Lehr等，J.Histochem.Cytochem.1997，45，1559改進的)采用×10物鏡(Zeiss顯微鏡；Axiovision軟件)獲得從SCID小鼠-人滑膜組織嵌合體獲得的切片的數(shù)字圖象(2600×2060，jpg)后，運用6.0版Photoshop(AdobeSystems，Mountainview，CA)并減少至1300×1300像素，對數(shù)據(jù)作計算機分析。在每個切片中選6個×10視野，以便最佳反映完整載玻片上的組織染色全貌。選擇全部染色核后(幻棒對深色核的誤差為10)，產生所選區(qū)的光密度圖，并記錄平均染色強度(選擇相似/圖象幀命令之后)。隨后，選擇背景并對染色進行定量(幻棒對背景的誤差為10)。以核染色和背景染色之差計算染色強度。此以任意單位下的細胞化學指數(shù)表示。數(shù)據(jù)以平均值和s.e.m表示。通過Student氏t-檢驗，對數(shù)據(jù)進行分析。阻斷SCID小鼠-人銀屑病組織嵌合體中的IL-15角質刀活檢組織取自兩名患者的銀屑病斑，分開后移植到C.B-17SCID小鼠(JacksonLaboratories)。移植3周后，小鼠接受PBS(安慰劑)、每隔2天接受10mg/kg劑量的CsA(環(huán)孢菌素A)(Sandoz)達15天，或者在第1天接受20mg/kg而在第8天和第15天接受10mg/kg劑量的146B7。最后一次注射后1周，處死小鼠，并從每種異種移植物中取出4mm穿刺活檢組織。將活檢組織在福爾馬林中固定，供石蠟包埋用，并用H&E和Ki-67核抗原染色。SCID小鼠-人銀屑病組織嵌合體組織的免疫組織化學染色的定量測定評價H&E染色切片的表皮厚度(μm)、角化不全等級(0-3級)以及上皮中炎性單核細胞的數(shù)目。評價Ki-67染色切片的每平方毫米切片循環(huán)角質化細胞的數(shù)目。計算各處理組中4只小鼠的平均值，而將來自每個患者的數(shù)據(jù)總結為平均值和s.e.m。SCID/RA模型對切片的顯微鏡觀察表明，染色最深的核屬于浸潤細胞。因此，核數(shù)目(根據(jù)相對表面積測定)被認為是對浸潤的度量。與溶媒處理相比，注射146B7減少了進入發(fā)炎滑膜組織中浸潤細胞的數(shù)目(圖15a，p＜0.05)。圖15b說明146B7對異種移植的滑膜組織中細胞浸潤的影響，并且顯示與溶媒處理比較，著色核的細胞數(shù)目減少。SCID/銀屑病模型圖16顯示用146B7或對照處理的SCID/銀屑病小鼠。與溶媒PBS相比，注射146B7減輕了銀屑病根據(jù)角質層至表皮突起始點測量的表皮厚度評價的嚴重程度(圖16A))PBS(177.8±42.2μm)、CsA(91.0±15.2μm)、146B7(62.5±9.1μm)。從角質層至表皮突最深處測量時也觀察到厚度減小(圖16B)PBS(433.8±32.1μm)、CsA(303.8±62.9μm)和146B7(208.0±33.8μm)。另外，146B7處理降低了角化不全的等級(圖16C)PBS(1.6±0.4)、CsA(1.3±0.3)、146B7(0.5±0.3)。此外，146B7減少了上皮中炎性單核細胞的數(shù)目(圖16D)PBS(33.3±1.9個單核細胞)、CsA(19.4±8.5)、146B7(16.4±0.1)。人Ki-67蛋白的表達與細胞增殖緊密相關。在分裂間期間期，僅在細胞核內檢測到所述抗原，而在有絲分裂中，所述蛋白的大多數(shù)重新定位于染色體表面。Ki-67蛋白在細胞周期的所有活動期(G(1)，S，D(2)及有絲分裂)期間存在，但在靜息細胞(G(0))中不存在的事實，使之成為用于測定特定細胞群體的所謂生長部分的極好標志。146B7減少Ki-67+循環(huán)角質化細胞的數(shù)目(圖16E)PBS(247.9±77.0)、CsA(116.0±24.1)、146B7(73.8±9.9)。在類風濕性關節(jié)炎的人SCID模型中，用146B7處理抑制了炎性細胞浸潤到發(fā)炎組織。此外，在移植人銀屑病斑的SCID小鼠中，與用CsA處理相比，用146B7處理減輕了銀屑病的嚴重程度。事實上，在人/SCID小鼠中，用146B7處理導致銀屑病的炎癥、表皮厚度、分裂中的角質化細胞數(shù)目和角化不全的嚴重程度顯著減輕。實施例12抗IL-15人抗體146B7識別受體結合的IL-15試驗化合物hIgG1-對照人抗體(Sigma)?？贵w146B7-MedarexInc.，MDX015。組成型表達IL-15Rα的Raji細胞(MartinGlennie，TenovusResearchLaboratory，SouthamptonGeneralHospital，Southampton，英國)146B7和人IgG的生物素化N-羥基琥珀酰亞胺基-生物素(Sigma)首先在DMSO中稀釋(終稀釋度100mg/ml)，然后在0.1MNaHCO3中稀釋(終稀釋度1mg/ml，Sigma)。每1mg抗體(在1ml中稀釋)中加入600μl生物素溶液(避光，2小時，室溫)。將抗體-生物素溶液在slide-a-lyzerTM透析盒(10,000MWCO，Pierce，PerbioScience，荷蘭)中透析(4℃過夜)，以除去未標記的生物素。次日，通過分光光度法(Ultrospec2100pro)在OD280nm下測定生物素化抗體的濃度。通過ELISA檢測146B7與IL-15-IL-15Rα復合物的結合在用IL-15Rα(R&Dsystems，Minneapolis，MN，美國)包被(室溫下過夜)平底微量滴定板(Greiner)后，將各板與PBS和雞血清一起孵育(2％，RT，60min)。用PBS(+0.02％吐溫20PBST)洗滌后，隨后，所述板與幾種稀釋度的未標記IL-15(50μl，RT，Immunex，Seattle，美國)一起孵育。10分鐘后，向各孔中加入不同濃度的生物素化抗體(50μl)(室溫下90分鐘)。用PBST洗滌后，各板與在PBST-C(PBST加2％雞血清)中以1∶10,000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白-多聚辣根過氧化物酶(CLB，Amsterdam，荷蘭)一起孵育(室溫下60分鐘)。最后，洗滌板后隨即按照生產商的方案，與ABTS(連氮雙-3-乙基苯并噻唑啉-磺酸，RocheDiagnostics，Mannheim，德國)的ABTS緩沖液一起孵育。用2％草酸(50μl)終止顯色反應。用EL808ELISA-讀出儀(Bio-TekInstruments，Winooski，VT，美國)在405nm下評價結合。146B7與Raji細胞上的IL-15-IL-15R復合物的結合將Raji細胞與10％合并的人AB血清(CLB，Amsterdam，荷蘭)在FACS緩沖液(PBS，0.05％BSA，0.02％NaNO3)中預孵育。將Raji細胞(1-2*105細胞/孔)接種于各孔中，然后加入幾種濃度的50μl未標記的IL-15(在含10％人AB血清的FACS中稀釋)。將細胞孵育30分鐘(4℃)并用FACS緩沖液洗滌兩次后，向各孔中加入50μl生物素化抗體(146B7或hIgG1)(4℃下30分鐘)。用FACS緩沖液洗滌兩次后，向各孔中加入50μl鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白(4℃下30分鐘)。用FACS緩沖液洗滌兩次后，吸取細胞于200μlFACS緩沖液中，通過流式細胞術(FACSCalibur，BectonDickison)，運用CellQuest軟件分析后，測定每樣品至少5000個細胞的熒光強度。數(shù)據(jù)以如下計算的刺激指數(shù)(S.I.)表示S.I.＝(平均熒光正染色)/(平均熒光背景染色)。ELISA通過ELSIA，146B7與IL-15/IL-15R復合物的結合示于圖19。146B7的結合隨與其受體結合的IL-15濃度的增加而增加。沒有觀察到對照抗體與IL-15或IL-15R的結合作用。與表達IL-15R的Raji細胞的結合146B7與Raji細胞上的IL-15/IL-15R復合物的結合示于圖20。146B7以劑量依賴性方式與IL-15/IL-15R復合物結合。沒有觀察到hIgG1與Raji細胞上的IL-15/IL-15R復合物的結合(圖20)。146B7能夠在該細胞因子與其受體結合后結合IL-15。146B7結合不參與結合所述受體的IL-15上的表位。參考文獻BathonJ.M.，MartinR.W.，F(xiàn)leischmannR.M.，TesserJ.R.，SchiffM.H.，KeystoneE.C.，GenoveseM.C.，WaskoM.C.，MorelandL.W.，WeaverA.L.，MarkensonJ.和FinckB.K.(2000)Acomparisonofetanerceptandmethotrexateinpatientswithearlyrheumatoidarthritis(依那西普和甲氨蝶呤在早期類風濕性關節(jié)炎患者中的比較).NEnglJMed343，1586-93.FehnigerT.A.和CaligiuriM.A.(2001)Interleukin15biologyandrelevancetohumandisease(白介素15生物學及與人類疾病的關系).Blood9714-28.FishwildD.M.，O’DonnellS.L.，BengoecheaT.，HudsonD.V.，HardingF.，BernhardS.L.，JonesD.，KayR.M.，HigginsK.M.，SchrammS.R.和LonbergN.(1996)High-avidityhumanIgGkmonoclonalantibodiesfromanovelstrainofminilocustransgenicmice(來自小基因座轉基因小鼠的一個新品系的高親合力人IgGk單克隆抗體).Naturebiotechn.14845-51.GillisS.，F(xiàn)ermM.M.，OuW.和SmithK.A.(1978)Tcellgrowthfactorparametersofproductionandaquantitativemicroassayforactivity(T細胞生長因子對活性的產生和定量微量測定的參數(shù)).J.Immunol120，2027-32.KennedyM.K.等(2000)ReversibledefectsinnaturalkillerandmemoryCD8TcelllineagesinIL-15deficientmice(IL-15缺陷型小鼠中天然殺傷T細胞和記憶CD8T細胞譜系的可逆性缺陷).JExp.Med.191771-80KirmanI.，VainerB.和NielsenO.H.(1998)Interleukin-15anditsroleinchronicinflammatorydiseases(白介素-15及其在慢性炎性疾病中的作用).InflammRes47，285-9.KlippelJ.H.(2000)Biologictherapyforrheumatoidarthritis(類風濕性關節(jié)炎的生物療法).NEnglJMed343，1640-1.KhlerG.和MilsteinC.(1975)Continuousculturesoffhsedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity(分泌預定特異性抗體的融合細胞的連續(xù)培養(yǎng)物).Nature256495-7.LiuC.C.，PerussiaB.和YoungJ.D.(2000)TheemergingroleofIL-15inNK-celldevelopment(IL-15在NK細胞發(fā)育中的應急作用).ImmunolToday21，113-6.LovellD.J.，GianniniE.H.，ReiffA.，CawkwellG.D.，SilvermanE.D.，NoctonJ.J.，SteinL.D.，GedaliaA.，IlowiteN.T.，WallaceC.A.，WhitmoreJ.和FinckB.K.(2000)Etanerceptinchildrenwithpolyarticularjuvenilerheumatoidarthritis.PediatricRheumatologyCollaborativeStudyGroup(多關節(jié)性青少年類風濕性關節(jié)炎兒童中的依那西普。兒科風濕病學合作研究小組).NEnglJMed342，763-9.MainiR.N.和TaylorP.C.(2000)Anti-cytokinetherapyforrheumatoidarthritis(針對類風濕性關節(jié)炎的抗細胞因子療法).AnnuRevMed51.207-29.McInnesI.B.，al-MughalesJ.，F(xiàn)ieldM.，LeungB.P.，HuangF.P.，DixonR.，SturrockR.D.，WilkinsonP.C.和LiewF.Y.(1996)Theroleofinterleukin-15inT-cellmigrationandactivationinrheumatoidarthritis(白介素-15在類風濕性關節(jié)炎T細胞遷移和激活中的作用).NatMed2，175-82.McInnesI.B.，LeungB.P.，SturrockR.D.，F(xiàn)ieldM.和LiewF.Y.(1997)Interleukin-15mediatesTcell-dependentregulationoftumornecrosisfactor-alphaproductioninrheumatoidarthritis(白介素-15介導類風濕性關節(jié)炎中腫瘤壞死因子-α產生的T細胞依賴性調節(jié)).NatMed3，189-95.McInnesI.B.和LiewF.Y.(1998)Interleukin15aproinflammatoryroleinrheumatoidarthritissynovitis(類風濕性關節(jié)炎性滑膜炎的促炎作用).ImmunolToday19，75-9.Oppenheimer-Marks等(1997)J.Clin.Investig.1011261-72.PettitD.K.，BonnertT.P.，EisenmanJ.，SrinivasanS.，PaxtonR.，BeersC.，LynchD.，MillerB.，YostJ.，GrabsteinK.H.和GombotzW.R.(1997)Structure-functionstudiesofinterleukin15usingsite-specificmutagenesis，polyethyleneglycolconjugation，andhomologymodeling(用定點誘變、聚乙二醇綴合和同源性建模對白介素15的結構功能研究).JBiolChem272，2312-8.Ruchatz等(1998)J.Immunol.1605654-60.WaldmannT.，TagayaY.和BamfordR.(1998)Interleukin-2，interleukin-15，andtheirreceptors(白介素-2、白介素-15及其受體).IntRevImmunol16，205-26.WaldmannT.A.，DuboisS.和TagayaY.(2001)ContrastingRolesofIL-2andIL-15intheLifeandDeathofLymphocytes.ImplicationsforImmunotherapy(IL-2和IL-15在淋巴細胞的存活和死亡中的相反作用。免疫療法的意義).Immunity14，105-110.WaldmannT.A.和TagayaY.(1999)Themultifacetedregulationofinterleukin-15expressionandtheroleofthiscytokineinNKcelldifferentiationandhostresponsetointracellularpathogens(白介素-15表達的多方面調節(jié)及該細胞因子在NK細胞分化和宿主對胞內病原體反應中的作用).AnnuRevImmunol17，19-49.等同實施方案本領域技術人員會認識到或者能夠僅用常規(guī)實驗就確定本文所述的本發(fā)明具體實施方案的許多等同方案。這類等同方案將包括在以下權利要求書中。在獨立權利要求書中公開的實施方案的任何組合考慮在本發(fā)明的范圍內。文獻引用本文所引用的所有出版物、專利和待審的專利申請都通過引用全部結合到本文中。序列表<110>GenMab，Inc.etal.<120>白介素15(IL-15)特異性人抗體<130>GMI-024PC<150>US60/314,731<151>2001-08-23<160>4<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>390<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(1)...(390)<400>1gaggtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggag48GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyGlu151015tctctgaagatctcctgtaaggtttctggatacttctttaccacctac96SerLeuLysIleSerCysLysValSerGlyTyrPhePheThrThrTyr202530tggatcggctgggtgcgccagatgcccgggaaaggcctggagtatatg144TrpIleGlyTrpValArgGlnMetProGlyLysGlyLeuGluTyrMet354045gggatcatctatcctggtgactctgataccagatacagcccgtccttc192GlyIleIleTyrProGlyAspSerAspThrArgTyrSerProSerPhe505560caaggccaggtcaccatctcagccgacaagtccatcagcaccgcctac240GlnGlyGlnValThrIleSerAlaAspLysSerIleSerThrAlaTyr65707580ctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgt288LeuGlnTrpSerSerLeuLysAlaSerAspThrAlaMetTyrTyrCys859095gcgagagggggtaactggaactgctttgactactggggccagggaacc336AlaArgGlyGlyAsnTrpAsnCysPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThr100105110ctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttcccc384LeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPhePro115120125ctggca390LeuAla130<210>2<211>130<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>2GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyGlu151015SerLeuLysIleSerCysLysValSerGlyTyrPhePheThrThrTyr202530TrpIleGlyTrpValArgGlnMetProGlyLysGlyLeuGluTyrMet354045GlyIleIleTyrProGlyAspSerAspThrArgTyrSerProSerPhe505560GlnGlyGlnValThrIleSerAlaAspLysSerIleSerThrAlaTyr65707580LeuGlnTrpSerSerLeuLysAlaSerAspThrAlaMetTyrTyrCys859095AlaArgGlyGlyAsnTrpAsnCysPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThr100105110LeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPhePro115120125LeuAla130<210>3<211>357<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(1)...(357)<400>3gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggg48GluIleValLeuThrGlnSerProGlyThrLeuSerLeuSerProGly151015gaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagc96GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerValSerSerSer202530tacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctc144TyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeu354045atctatggtgcatcccgcagggccactggcatcccagacaggttcagt192IleTyrGlyAlaSerArgArgAlaThrGlyIleProAspArgPheSer505560ggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggag240GlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerArgLeuGlu65707580cctgaagattttgcagtgtattactgtcagcggtatggtagctcacac288ProGluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnArgTyrGlySerSerHis859095acttttggccaggggaccaagctggagatcagccgaactgtggctgca336ThrPheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleSerArgThrValAlaAla100105110ccatctgtcttcatcttcccg357ProSerValPheIlePhePro115<210>4<211>119<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>4GluIleValLeuThrGlnSerProGlyThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerValSerSerSer202530TyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeu354045IleTyrGlyAlaSerArgArgAlaThrGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerArgLeuGlu65707580ProGluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnArgTyrGlySerSerHis859095ThrPheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleSerArgThrValAlaAla100105110ProSerValPheIlePhePro11權利要求1.一種分離的人單克隆抗體，所述抗體特異性結合人IL-15并抑制IL-15誘導的促炎作用。2.權利要求1的抗體，所述抗體抑制IL-15誘導的TNFα產生或T細胞增殖。3.權利要求2的抗體，根據(jù)增殖抑制分析測定，所述抗體抑制IL-15誘導的T細胞增殖的IC50值小于約100nM。4.權利要求2的抗體，根據(jù)增殖抑制分析測定，所述抗體抑制IL-15誘導的T細胞增殖的IC50值小于約10nM。5.權利要求1的抗體，采用重組人IL-15作為被分析物而用所述抗體作為配體，根據(jù)表面胞質團共振(SPR)技術測定，所述抗體結合人IL-15的解離平衡常數(shù)(KD)小于10-7M。6.權利要求1的抗體，其中所述抗體特異性結合位于人IL-15的β-鏈或γ-鏈相互作用結構域上的表位。7.權利要求6的抗體，其中所述抗體特異性結合位于人IL-15的γ-鏈相互作用結構域上的表位。8.權利要求1的抗體，其中所述抗體干擾人IL-15的Asp8與人IL-15受體的β-單位的結合或者人IL-15的Gln108與人IL-15受體的γ-單位的結合。9.權利要求1的抗體，其中所述抗體與受體結合的人IL-15特異性結合。10.一種分離的人單克隆抗體，所述抗體特異性結合由人IgG重鏈和人κ輕鏈核酸編碼的人IL-15，所述核酸在其可變區(qū)中分別包含圖2(SEQIDNO1)和圖3(SEQIDNO3)所示的核苷酸序列及其保守序列修飾。11.一種分離的人單克隆抗體，所述抗體特異性結合具有IgG重鏈和κ輕鏈可變區(qū)的人IL-15，所述可變區(qū)分別包含圖2(SEQIDNO2)和圖3(SEQIDNO4)所示的氨基酸序列及其保守序列修飾。12.一種分離的人單克隆抗體，所述抗體特異性結合包含選自以下的CDR區(qū)的人IL-15(a)CDR1區(qū)，所述CDR1區(qū)分別包含圖2(SEQIDNO2)和圖3(SEQIDNO4)所示的氨基酸序列CDR1及其保守序列修飾，(b)CDR2區(qū)，所述CDR2區(qū)分別包含圖2(SEQIDNO2)和圖3(SEQIDNO4)所示的氨基酸序列CDR2及其保守序列修飾，和(c)CDR3區(qū)，所述CDR3區(qū)分別包含圖2(SEQIDNO2)和圖3(SEQIDNO4)所示的氨基酸序列CDR3及其保守序列修飾，其中所述CDR區(qū)插入到抗體構架區(qū)中或者通過合成接頭連接。13.權利要求1的抗體，其中所述抗體選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE抗體。14.權利要求1的抗體，所述抗體包含IgG1重鏈。15.權利要求1的抗體，所述抗體是抗體片段或單鏈抗體。16.權利要求1的抗體，所述抗體是完全抗體。17.權利要求1的抗體，所述抗體由雜交瘤生產，所述雜交瘤包括得自其基因組中包含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的轉基因非人類動物的、與無限增殖化細胞融合的B-細胞。18.一種分離的人單克隆抗體，所述抗體特異性結合人IL-15并抑制IL-15在與其受體結合時誘導促炎作用的能力。19.一種抑制IL-15誘導的但不抑制IL-2誘導的T細胞或單核細胞中TNFα產生的方法，所述方法包括使IL-15與特異性結合人IL-15的分離的人單克隆抗體接觸。20.一種抑制IL-15誘導的但不抑制IL-2誘導的T細胞增殖的方法，所述方法包括在所述T細胞存在下，使IL-15與特異性結合人IL-15的分離的人單克隆抗體接觸。21.權利要求20的方法，其中所述T細胞是外周血單核細胞(PBMC)或CTLL-2細胞。22.一種雜交瘤，所述雜交瘤包含得自其基因組中包含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的轉基因非人類動物的、與無限增殖化細胞融合的B-細胞，其中所述雜交瘤產生一種特異性結合人IL-15的人單克隆抗體。23.權利要求22的雜交瘤，所述雜交瘤產生由人IgG重鏈和人κ輕鏈核酸編碼的人單克隆抗體。24.一種雜交瘤，所述雜交瘤產生一種由人IgG重鏈和人κ輕鏈核酸編碼的人單克隆抗體，所述核酸在其可變區(qū)中分別包含如圖2(SEQIDNO1)和圖3(SEQIDNO3)所示的核苷酸序列及其保守序列修飾。25.一種雜交瘤，所述雜交瘤產生一種具有IgG重鏈和κ輕鏈可變區(qū)的人單克隆抗體，所述可變區(qū)分別包含如圖2(SEQIDNO2)和圖3(SEQIDNO4)所示的氨基酸序列及其保守序列修飾。26.權利要求1的分離的人抗體，所述人抗體由包含編碼人重鏈和人輕鏈的核酸的轉染瘤產生。27.一種轉染瘤，所述轉染瘤包含編碼人重鏈和人輕鏈的核酸，其中所述轉染瘤產生可檢測量的權利要求1的單克隆抗體。28.權利要求27的轉染瘤，所述轉染瘤包含編碼人重鏈和人輕鏈的核酸，所述核酸在其可變區(qū)中分別包含如SEQIDNO1和SEQIDNO3所示的核苷酸序列或其保守序列修飾。29.一種轉基因非人類動物，所述轉基因非人類動物表達特異性結合人IL-15的人單克隆抗體，其中所述轉基因非人類動物的基因組包含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因。30.一種產生特異性結合人IL-15的人單克隆抗體的方法，所述方法包括用人IL-15或表達人IL-15的細胞免疫其基因組中包含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的轉基因非人類動物，使得所述動物的B-細胞產生抗體；分離所述動物的B細胞；使所述B細胞與骨髓瘤細胞融合，形成分泌IL-15特異性人單克隆抗體的無限增殖雜交瘤細胞；和從所述雜交瘤的培養(yǎng)上清液中分離出IL-15特異性人單克隆抗體。31.一種免疫綴合物，所述免疫綴合物包含權利要求1的抗體和一種治療藥物。32.權利要求31的免疫綴合物，其中所述治療藥物為免疫抑制劑。33.權利要求31的免疫綴合物，其中所述治療藥物是選自甾體抗炎藥、非甾體抗炎藥和DMARD的抗炎藥。34.權利要求31的免疫綴合物，其中所述治療藥物為細胞毒性劑。35.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含權利要求1的抗體和藥學上可接受的載體。36.權利要求35的組合物，所述組合物還包含治療藥物。37.權利要求36的組合物，其中所述藥物為免疫抑制劑。38.權利要求37的組合物，其中所述免疫抑制劑為環(huán)孢菌素。39.權利要求36的組合物，其中所述藥物是選自甾體抗炎藥和非甾體抗炎藥的抗炎藥。40.權利要求36的組合物，其中所述藥物是選自甲氨蝶呤、依那西普和英夫利昔單抗的DMARD。41.權利要求36的組合物，其中所述藥物是選自多柔比星、順鉑、博來霉素、卡莫司汀、環(huán)磷酰胺和苯丁酸氮芥的化療藥。42.權利要求36的組合物，其中所述藥物是用于治療銀屑病的藥物。43.權利要求36的組合物，其中所述藥物是抗體。44.權利要求43的組合物，其中所述抗體選自CD4特異性抗體和IL-2特異性抗體。45.一種治療或預防由人IL-15介導的疾病的方法，所述方法包括將有效量的權利要求1的抗體給予患者，以治療或預防所述疾病。46.權利要求45的方法，其中所述疾病選自銀屑病、關節(jié)炎、炎性腸病、癌癥、移植排斥和感染性疾病。47.權利要求46的方法，其中所述關節(jié)炎是類風濕性關節(jié)炎。48.權利要求45的方法，所述方法還包括與共同給予治療藥物。49.權利要求48的方法，其中所述藥物是免疫抑制劑。環(huán)孢菌素。50.權利要求49的方法，其中所述免疫抑制劑是環(huán)孢菌素。51.權利要求48的方法，其中所述藥物是選自甾體抗炎藥和非甾體抗炎藥的抗炎藥。52.權利要求48的方法，其中所述藥物是選自甲氨蝶呤、依那西普和英夫利昔單抗的DMARD。53.權利要求48的方法，其中所述藥物是選自多柔比星、順鉑、博來霉素、卡莫司汀、環(huán)磷酰胺和苯丁酸氮芥的化療藥。54.權利要求48的方法，其中所述藥物是用于治療銀屑病的藥物。55.權利要求48的方法，其中所述藥物是抗體。56.權利要求55的方法，其中所述抗體選自CD4特異性抗體和IL-2特異性抗體。57.一種治療或預防銀屑病的方法，所述方法包括給予患者一種特異性結合人IL-15并抑制IL-15與其受體結合時誘導促炎作用的能力的分離的人單克隆抗體。58.權利要求57的方法，其中所述抗體抑制IL-15誘導角化不全的能力。59.權利要求57的方法，其中所述抗體抑制IL-15誘導表皮增厚的能力。60.權利要求57的方法，其中所述抗體抑制IL-15誘導角質化細胞增殖的能力。61.一種治療或預防類風濕性關節(jié)炎的方法，所述方法包括給予患者一種特異性結合人IL-15并抑制IL-15與其受體結合時誘導促炎作用的能力的分離的人單克隆抗體。62.權利要求61的方法，其中所述抗體抑制IL-15誘導活化白細胞趨化性的能力。63.一種通過檢測樣品中存在IL-15抗原或表達IL-15的細胞而診斷IL-15介導的疾病的方法，所述方法包括在允許所述抗體或其部分和IL-15之間形成復合物的條件下，使所述樣品和對照樣品與權利要求1的人抗體接觸；和檢測所述復合物的形成，其中與對照樣品相比，所述樣品之間復合物形成的差異說明所述樣品中存在IL-15。64.一種核酸，所述核酸包含編碼抑制IL-15的促炎作用的人單克隆抗體可變區(qū)的核苷酸序列。65.一種核酸，所述核酸包含編碼特異性結合人IL-15的人單克隆抗體可變區(qū)的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自SEQIDNO1和SEQIDNO3及其保守序列修飾。66.一種表達載體，所述表達載體包含編碼結合人IL-15的人抗體的輕鏈、重鏈或者輕鏈和重鏈兩者的可變區(qū)的核苷酸序列。67.權利要求66的表達載體，所述表達載體還包含編碼結合IL-15的人抗體的輕鏈、重鏈或者輕鏈和重鏈兩者的CDR區(qū)的核苷酸序列。68.一種表達載體，所述表達載體包含編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，所述可變區(qū)分別包含在SEQIDNO2和SEQIDNO4中所示的氨基酸序列及其保守序列修飾。69.一種表達載體，所述表達載體包含編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，所述可變區(qū)分別包含在SEQIDNO2和SEQIDNO4中所示的氨基酸序列及其保守修飾。70.一種轉染瘤，所述轉染瘤包含權利要求66的表達載體。全文摘要公開了特異性結合IL－15(例如人IL－15)的分離的人單克隆抗體及基于相關抗體的組合物和分子?？梢栽谀軌蛲ㄟ^經歷V－D－J重組和同種型轉換而產生人單克隆抗體的多種同種型的轉染瘤或非人類轉基因動物例如轉基因小鼠中產生所述人抗體。也公開了包含所述人抗體的藥用組合物、產生所述人抗體的非人類轉基因動物和雜交瘤以及應用所述人抗體的治療方法和診斷方法。文檔編號A61P1/04GK1571836SQ02820778公開日2005年1月26日申請日期2002年8月23日優(yōu)先權日2001年8月23日發(fā)明者J·G·J·范德溫克爾,M·A·范迪克,J·舒爾曼,A·F·格里特森,O·巴爾德斯加爾德申請人:根馬布股份公司