專利名稱：含有至少兩種效價的疫苗組合物,其中一種效價是添加了助劑的,另一種效價是未添加助劑的的制作方法
技術領域：
本發(fā)明的主題具體地是一種穩(wěn)定化的甲型肝炎/傷寒(HA-Vi)雙效價疫苗組合物，其中Vi效價在至少約24小時期間保持其免疫能力。
甲型肝炎和傷寒是兩種已經有疫苗的疾病。世界上衛(wèi)生條件還遠未達到最理想的地區(qū)，都會發(fā)現有這兩種疾病。由于各自傳染物共同地具有同樣的傳播途徑(口-糞便途徑)，還由于這些疾病的流行地區(qū)覆蓋面非常寬闊，所以將這兩種效價合并在同一產品中似乎是很有意義的。特別地，很容易理解在旅行者用的疫苗范圍內，HA-Vi結合要比分開服用兩種單效價疫苗HA和Vi更具吸引力。
為了證明HA和Vi效價是相容的，特別在無毒、免疫能力和穩(wěn)定性方面是相容的，已經進行了許多研究工作。這些研究使用了由市場上已經有的單效價疫苗制備的HA-Vi組合，它們主要在于兩個方面一方面，將SmithKline Beecham Biological(Rixensart，比利時)生產的HavrixTM(HA)和(Vi)單效價疫苗組合進行了這些研究，另一方面，將Aventis Pasteur(里昂，法國)生產的AvaximTM(HA)和TyphimViTM(Vi)單效價疫苗組合進行了這些研究。
在這兩組研究中，HA單效價疫苗由失活的甲型肝炎病毒構成，并且吸附在氫氧化鋁上。同樣地，傷寒單效價疫苗由仍是未添加助劑的傷寒沙門氏菌莢膜的多糖構成。最后，以同樣方式，將這些相應的單效價疫苗(這些單效價疫苗是以液體形式銷售的)簡單混合生產出雙效價組合。因此，一定劑量的AvaximTM和一定劑量的Typhim ViTM混合在一起得到一定劑量的HA-Vi雙效價組合。
在沒有實施臨床試驗范圍內的注射之前，使用構建的組合曾進行了不到二十個月的兩組研究工作。這些研究工作表明，這些雙效價組合與相應的單效價是等效的，特別在免疫能力方面。于是，SmithKlineBeecham Biological的雙效價組合滿足了英國當局的要求，因此已經準許進入這個國家的市場。但是，這種準入有一個有效期確定為在生產后12個月的限制。
在疫苗領域內，特別考慮到在分配前控制分批所需要的時間時，有效期為12個月是不夠的。確定有效期為24個月或更好地為36個月大大有利于這些批疫苗推向市場。
然而，在HA-Vi組合的情況下，本申請人發(fā)現在生產日期過16-18個月后，Vi疫苗逐漸失去其免疫能力，并且提出一種有關這種不穩(wěn)定性根源的假設。事實上，具有Vi免疫原性特征的Vi多糖O-乙?；鶊F隨著時間推移會水解，特別在堿性條件下更是如此。這種水解被認為是造成Vi多糖免疫能力下降的原因，這種水解是由于組分Vi吸附在氫氧化鋁上所致，而氫氧化鋁是作為HA效價添加劑存在于雙效價組合中。單效價疫苗彼此一混合，Vi效價就立刻吸附在鋁凝膠上。這種吸附導致Vi多糖保持在堿性環(huán)境中。事實上，氫氧化鋁帶正電荷的吸引介質的OH-離子，這樣造成在鋁凝膠微環(huán)境中pH升高，在吸附后Vi就定位在鋁凝膠上。至于O-乙?；鶊F的水解，這種水解是一種非常緩慢的現象時，其作用是在約16-18個月后才真正覺察出來。
本申請人不僅證明了Vi效價隨著時間推移的不穩(wěn)定性問題，而且本申請人提出一種解決方法，該方法在于在雙效價組合中再添加一種化合物，它阻止鋁凝膠吸附Vi，同時保持以添加形式的HA效價。有利地，這種化合物可以是一種陰離子，例如磷酸根或檸檬酸根。
在其更一般的教導中，本發(fā)明因此涉及一種疫苗組合物，該組合物含有至少兩個效價(i)與氫氧化鋁一起添加的第一效價和(ii)含有細菌莢膜多糖的第個二效價，該多糖含有一個或多個O-乙?；鶊F，并且由于添加了第一效價，氫氧化鋁不吸附第二效價，這是由于附加化合物的存在將阻止氫氧化鋁吸附第二效價，不干擾第一效價的吸附。
根據一種有利的實施方式，因保護陰離子化合物的存在，可阻止吸附第二效價，其條件是它提供為最終疫苗使用所需要的所有安全保證。這種保護化合物可以是磷酸鹽、檸檬酸鹽或碳酸鹽。還可能使用不同陰離子的組合，例如磷酸根與檸檬酸根的組合。作為典型提示，明確指出特別地可以用含有磷酸一鉀、磷酸二鈉和氯化鈉的溶液提供磷酸根。
使用保護化合物尤其能夠長時間地(24個月或24個月以上)，優(yōu)選地在正常儲存溫度或更高(例如37℃)溫度下在保存過程中穩(wěn)定第二效價的抗原活性。采用不同的技術，在生產該組合物時測量這種活性，然后隨著時間推移或在生產日期過去至少24個月再進行同樣的測量，比較所得到的這些結果就可以估算出免疫活性的穩(wěn)定性。當不能確定數字化數據彼此間在統(tǒng)計上有不同時，則應該認為免疫活性是穩(wěn)定的。采用ELISA技術，使用在疫苗領域中通常使用的技術，可以實施抗原免疫活性的測定。
第一效價可以是任何疫苗效價，沒有類型或結構的限制，其條件當然是需要其添加。特別可以列舉甲型肝炎效價(HepA或HA)、乙型肝炎效價(HepB)和肺炎球菌效價。這種第一效價可以由失活病毒構成，失活病毒例如為失活的HA病毒或失活的脊髓灰質炎病毒；減弱的病毒；病毒或細菌亞單位抗原，例如乙型肝炎病毒的表面抗原，白喉或破傷風類毒素。
第二效價按照定義是由共軛或未共軛多糖構成，它們在其重復單元中含有一個或多個O-乙?；鶊F。傷寒沙門氏菌的莢膜多糖(還稱之Vi多糖)和腦膜炎奈瑟球菌群A的莢膜多糖滿足這個定義。在這些情況下，因此可以談到Vi效價，或傷寒效價和甲型腦膜炎(meningo A)效價。
關于“細菌莢膜多糖”，應該理解是由具有莢膜多糖特征的重復單元鏈構成的多糖，無論其大小，也與其輔助修飾無關。在本發(fā)明組合物中的多糖重復單元必須包括至少一個O-乙酰基團。
為了本發(fā)明的目的，根據完全常規(guī)的技術由源細菌出發(fā)可以得到純化形式的多糖。按照需要，該多糖可以是(i)片段的或非片段的和(ii)與載體多肽共軛或未共軛的，例如白喉或破傷風類毒素。
在更特定的范圍內，本發(fā)明的目的是一種疫苗組合物，它含有(i)與氫氧化鋁一起添加的HA效價和(ii)由Vi多糖構成的傷寒效價；其中Vi效價未被氫氧化鋁吸附的組合物。
為了本發(fā)明的目的，可以通過用氫氧化鋁進行沉淀，或者通過用氫氧化鋁吸附的方法來添加第一效價。
用于添加第一效價的氫氧化鋁可以是純氫氧化鋁(即只含有Al3+離子和氫氧根的鋁化合物)，或以這個名稱為人們所知的任何氫氧化鋁，即使從化學觀點來看，它們不是只由氫氧化鋁構成。因此還可能涉及混合的鋁化合物，例如以堿式磷酸鋁或堿式硫酸鋁名稱表示的鋁化合物。一般地，可能涉及特別地含有羥基基團的鋁化合物。作為典型說明，可列舉Superfos Biosector公司銷售的AlhydrogelTM氫氧化鋁。
為阻止吸附第二效價，同時保持呈添加形式的第一效價，應該添加足夠數量的磷酸根、檸檬酸根或碳酸根離子(保護化合物)。這個數量取決于各種因素，其中包括第一效價的數量與性質，其添加方式，氫氧化鋁的數量與性質，以及第二效價的數量。為了一旦確定了其它因素就可決定用于阻止第二效價吸附的化合物的適當量，疫苗領域里的技術人員可完全直接考慮這些制約因素，以便氫氧化鋁被磷酸根離子飽和，同時保持呈添加形式的第一效價。
但是，明確指出市售的疫苗通常含有0.6-1.5mg鋁/ml。在市售的Hep A疫苗中，只要氧化鋁凝膠的吸附位點遠未飽和，就會發(fā)現與HepA抗原相比，通常劑量(以鋁量表示)的氧化鋁凝膠大大過量。因此，實際上，只是鋁量似乎是確定應該存在的保護化合物數量的決定因素。
對于含有0.3mg呈氫氧化鋁形式和0.5ml體積的鋁的本發(fā)明組合物，再添加約20mM磷酸根是合適的。如果鋁為這同樣體積，而量加倍，再添加兩倍磷酸根，即40mM是合適的。但是對于1ml體積含有0.6mg鋁的本發(fā)明組合物，20mM磷酸根就足夠了。
作為說明，指出本發(fā)明的雙效價疫苗體積為0.5ml時可以含有(i)160抗原單位或1440 ELISA單位的失活的甲型肝炎病毒，該病毒吸附在(ii)含有0.3mg鋁的氫氧化鋁上；(iii)0.025mg Vi多糖；以及(iv)20mM磷酸根。
上述抗原單位和ELISA單位分別是Aventis Pasteur公司和SmithKline Beecham Biological公司(van Hoecke等人，J.Travel.Med.(1998)5116和André等人，inProg.Med.Virol.，Melnick JLEd，Basel，Karger(1990)3772)，借助專有標準的ELISA試驗所確定的單位。不可能是另外的，因為沒有Hep A疫苗的國際標準化標準。
本發(fā)明的組合物有利地呈液體形式，疫苗劑量有利地配制成0.5-1ml的體積，其中包括邊界。
本發(fā)明的組合物可以這樣制備(i)往含有除傷寒效價之外的通過氫氧化鋁添加的效價的制劑中添加磷酸根、檸檬酸根或碳酸根離子；(ii)把在步驟(i)得到的制劑與含有傷寒效價的制劑混合。
實施例制備本發(fā)明的HA-Vi組合物A-制備吸附的HA組分一批失活HA病毒的抗原效價是885U ELISA/ml，把99ml這種HA病毒與5.94ml 25％2-苯氧基-乙醇混合。然后均化15分鐘，然后用Millipak 40MPGL 04SH2過濾器過濾制劑。過濾后，得到95ml效價為835U ELISA/ml的制劑。
往這種制劑中添加47.5ml含有3.14mg鋁/ml的氧化鋁凝膠。用48m l40mM PBS(磷酸鹽緩沖液)補足。在5℃下攪拌一夜(18小時)，以便HA組分吸附在氧化鋁凝膠上。pH是7.28。
B-制備濃縮10倍的Vi多糖溶液根據Gotschlich等人，Prog.Immunobiol.Standard(1972)5485描述的方法制備Vi多糖粉末。在裝有16.64mg Vi(9.5g％殘留濕度，即15.06mg干重)的30ml瓶中，在連續(xù)攪拌下，逐步倒入25.1ml為注射制備的蒸餾水(ppi)。繼續(xù)在5℃下攪拌24小時，以便使多糖完全溶解。用0.22微米Millex GV SLGV 025過濾器過濾這種制劑。用5ml ppi蒸餾水洗滌該過濾器。最后體積因此是30.1ml。
C-制備HAVi雙效價疫苗往62ml在步驟A得到的制劑(HA)中添加10.6ml 94mM磷酸鹽溶液，然后添加8.1ml在步驟B中得到的制劑(Vi)。這樣得到疫苗的特征如下最后磷酸鹽的濃度20mMpH7.3摩爾滲透壓濃度578mosm/kg。
然后把這種稱之為P2制劑的制劑再分成劑量0.5ml的份。
同時還制備了兩種其它雙效價組合物P2′和P2″，它們不再含有20mM磷酸鹽，而分別含有10mM和40mM磷酸鹽。為此，根據種類添加了10.6ml 17.6mM或246mM的磷酸鹽溶液。
立刻研究P2、P2′和P2″組合物中的HA和Vi組分的性質或在離心后研究這些組合物中的HA和Vi組分性質，給出這些組分在這些組合物中的性質(采用ELISA方法檢測這些組分)。觀察到，在10mM磷酸鹽時，HA仍被吸附，但Vi吸附在氧化鋁凝膠上，而在40mM磷酸鹽時，Vi不再被吸附，但HA部分被解吸。在20mM磷酸鹽時，這些所尋求的條件都滿足HA仍被吸附同時Vi不被吸附。
接著，研究了在5℃±3℃下P2劑量在30個月期間的穩(wěn)定性。具體地采用ELISA方法評價了從其整體與離心后的上清液(吸附在與凝膠一起沉淀的氧化鋁凝膠上的組分)所取疫苗劑量中Vi多糖的抗原本領；這樣還能夠確定未吸附Vi的百分數。
ELISA是以間接方法方式實施的。待定劑量的Vi抗原是處在覆蓋板底部的抗-Vi抗體與小鼠的抗-Vi抗體之間的夾層中。添加生物素基化的抗鼠IgG的抗體，然后添加與辣根過氧化物酶偶合的生物素基化的鏈霉胍配合物。添加鄰亞苯基二胺二鹽酸鹽(OPD)使該反應顯色。OPD的降解表現出著橙褐色，這種著色與Vi抗原量成比例。其強度可用分光光度計測量。
在96-孔板中，分配100μl抗傷寒沙門氏菌血清。在37℃下培育5小時，然后排空該板，再用含有0.05％吐溫的PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌三次。添加200μl稀釋在PBS中的奶粉溶液，使空位點飽和。在37℃下培育1小時30分鐘，然后排空該板，再洗滌三次。制備以倍率2稀釋的標準疫苗的系列稀釋液，以便達到一定的標準范圍。以適當方式對待測定疫苗劑量以及參比劑量(能夠證實標準范圍)進行稀釋；將100μl每種稀釋液分配到孔中，再在37℃下培育一夜。排空該板，再進行洗滌。然后向孔中添加100μl適當稀釋抗Vi鼠血清。再在37℃下培育1小時，然后排空該板，再進行洗滌。這時固定生物素基化的鼠抗免疫球蛋白(向每個孔中加入100μl適當稀釋液)。再在37℃下培育1小時，然后排空該板，再進行洗滌。這時固定與過氧化物酶偶合的生物素基化鏈霉胍(向每個孔中加入100μl適當稀釋液)。再在37℃下培育1小時，然后排空該板，再進行洗滌。向每個孔中添加100μl 1mg/ml OPD在pH5檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液中的溶液，使該板顯色。在100μl 2N硫酸添加到孔中之前，在黑暗中在室溫下培育30分鐘。使用分光光度計在492nm處讀其板。確定了隨濃度變化的吸收標準曲線。與標準曲線相比，計算出每種試驗稀釋液的效價，以ng/ml表示。為了得到每個試驗疫苗劑量的平均效價，求出用全部稀釋液所得效價的平均值。該效價以μg/劑量給出。
還測量了離心后上清液中存在的Vi多糖的O-乙?；臄盗?。使用羥胺，采用比色方法測定了O-乙?；?Hestrin S.J.Biol.Chim.(1949)180249)。在堿性介質中羥胺與這些酯生成異羥肟酸，該酸在鐵鹽存在下給出栗色，可采用分光光度計在540nm處測定其強度。
同時，使用以與P2同樣方式制備的稱之為制劑P1的制劑進行同樣的研究，其唯一不同之處在于在制備雙效價疫苗時不添加磷酸鹽。在這種情況下，Vi組分沒有立刻吸附在氧化鋁凝膠上，為了在離心后進行測定，如P2一樣，合適的是預先解吸它。通過調節(jié)pH和介質的離子強度，可達到這種解吸。在離心后，讓氧化鋁凝膠與150mM檸檬酸三鈉溶液在37℃下接觸6小時。然后離心回收上清液，其中有Vi組分。
下表I中列出這些結果。
表I
還研究了在25℃±2℃6個月內與在37℃±3℃3個月內P2配方的穩(wěn)定性。這些結果列于下面表II和III。
表II
表III
權利要求
1.一種疫苗組合物，該組合物含有(i)與含有羥基基團的鋁化合物一起添加的第一效價，(ii)含有細菌莢膜多糖的第二效價，其多糖含有一個或多個O-乙酰基基團和(iii)磷酸根離子、檸檬酸根離子或碳酸根離子。
2.根據權利要求1所述的疫苗組合物，其中第一效價是甲型肝炎效價。
3.根據權利要求2所述的疫苗組合物，其中甲型肝炎效價由失活的甲型肝炎病毒構成。
4.根據權利要求1-3中任一權利要求所述的疫苗組合物，其中第二效價是傷寒效價，它由傷寒沙門氏菌莢膜的Vi多糖構成。
5.根據權利要求4所述的疫苗組合物，其中傷寒效價在至少24個月期間具有穩(wěn)定的抗原效價。
6.根據權利要求1-5中任一權利要求所述的疫苗組合物，其中通過氫氧化鋁或堿式磷酸鋁的鋁化合物添加第一效價。
7.根據權利要求1-6中任一權利要求所述的疫苗組合物，其中通過鋁化合物吸附來添加第一效價。
8.根據權利要求1-7中任一權利要求所述疫苗組合物的生產方法，其中(i)往一種制劑中添加磷酸根、檸檬酸根或碳酸根離子，該制劑含有通過含有羥基基團的鋁化合物添加的第一效價；和(ii)把在步驟(i)得到的制劑與含有第二效價的制劑混合，其中第二效價由含有一個或多個O-乙酰基基團的細菌莢膜的多糖構成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種疫苗組合物，該組合物含有兩種效價(i)第一效價，它與氫氧化鋁一起添加，(ii)含有細菌莢膜多糖的第二效價，其多糖含有一個或多個O－乙?；鶊F，并且由于保護化合物的存在它不吸附在氫氧化鋁上，該保護化合物可以是磷酸鹽、檸檬酸鹽或碳酸鹽，并且它阻止這種吸附。第一效價可以是任何疫苗效價。根據一種特別方式，疫苗組合物含有(i)氫氧化鋁吸附的甲型肝炎效價和(ii)由傷寒沙門氏菌莢膜的Vi多糖構成的傷寒效價。
文檔編號A61K39/295GK1541108SQ02815645
公開日2004年10月27日 申請日期2002年7月31日 優(yōu)先權日2001年8月8日
發(fā)明者A·弗朗松, A 弗朗松 申請人:艾文蒂斯巴斯德公司