專利名稱：柯薩奇病毒b組1型基因疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防柯薩奇病毒感染的疫苗。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)用于預(yù)防柯薩奇病毒B(CVB)感染的疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗。滅活疫苗在其滅活過程中出現(xiàn)抗原性減弱及重要表位丟失，使機(jī)體不能產(chǎn)生足夠的保護(hù)性免疫。減毒活疫苗接種后常常引起免疫抑制，減毒不充分可致臨床病毒感染，且活病毒疫苗有回復(fù)突變產(chǎn)生致病表型的可能，而過分減毒又造成疫苗效價(jià)的降低，削弱其激發(fā)機(jī)體免疫的能力。新型CVB疫苗有亞單位疫苗和合成肽疫苗。亞單位疫苗安全、無毒、副作用小，但免疫原性差。近年來把病毒的亞單位成分通過DNA重組技術(shù)加以表達(dá)的疫苗，稱為基因工程重組亞單位疫苗?；蚬こ桃呙缫驯粦?yīng)用于臨床。該疫苗的制備包括基因的分子克隆、表達(dá)和蛋白純化過程，其研制費(fèi)用較高，技術(shù)難度較大且成功率低。常因誘發(fā)對(duì)載體自身的免疫反應(yīng)而不能重復(fù)使用；活重組疫苗亦有回復(fù)突變、造成免疫低下、宿主患病甚至死亡的潛在危險(xiǎn)。合成肽疫苗是根據(jù)需要有目的地方設(shè)計(jì)具有中和或保護(hù)性抗原的短肽作為疫苗。但由于合成肽是一種直鏈結(jié)構(gòu)，缺乏天然的三維空間結(jié)構(gòu)，功能不同于天然蛋白。另外合成的短肽分子很小，免疫原性較差。因此人們迫切希望找到新的安全有效的疫苗。90年代人們開展了針對(duì)CVB特異性免疫防治的研究工作，包括滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗及合成肽疫苗，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)接種，顯示了一定的免疫保護(hù)作用。但由于CVB有6個(gè)血清型，核酸具有感染性，因此研制滅活疫苗、減毒活疫苗及亞單位疫苗十分困難。上述疫苗本身又有一定的缺陷，故一直未有CVB的疫苗上市，人們迫切希望找到一種安全有效的新疫苗。近幾年發(fā)展起來的基因免疫(genetic immunization)技術(shù)為CVB疫苗的研制開辟了一條新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有疫苗存在免疫原性差、安全性差的不足，提供一種柯薩奇病毒B組1型基因疫苗，即防治柯薩奇病毒B組1型心肌炎的基因疫苗。本發(fā)明的柯薩奇B1病毒(CVB1)基因疫苗是由CVB1編碼主要中和抗原的VP1基因和作為真核表達(dá)載體的質(zhì)粒pCEP4組成的pCEP4-CVB1VP1質(zhì)粒。其主要優(yōu)點(diǎn)為免疫應(yīng)答完整、持久，同種異株交叉保護(hù)，聯(lián)合免疫，制備簡便，安全穩(wěn)定，可重復(fù)使用。
基因免疫通過直接給動(dòng)物接種抗原蛋白編碼基因使動(dòng)物獲得對(duì)該抗原的免疫力，這種編碼抗原蛋白的外源基因既是載體又是抗原的來源，并具有疫苗的功能，因此被稱為基因疫苗或核酸疫苗(nucleic acid vaccine)?；蛞呙绲某霈F(xiàn)為CVB感染的防治開辟了新的途徑。基因疫苗又稱核酸疫苗或DNA疫苗，由病原體抗原編碼基因和作為真核表達(dá)載體的質(zhì)粒組成?？乖幋a基因的表達(dá)產(chǎn)物必須是病原體的有效成分，才可引發(fā)保護(hù)性免疫。與傳統(tǒng)疫苗相比，本發(fā)明的基因疫苗有下列優(yōu)點(diǎn)(1)直接DNA接種，避免了傳統(tǒng)疫苗抗原制備純化等繁瑣過程；(2)免疫應(yīng)答完整持久，基因免疫時(shí)抗原多肽的遞呈和自然感染時(shí)相似，以天然構(gòu)象被免疫系統(tǒng)識(shí)別，克服了其它疫苗抗原表位改變的缺點(diǎn)；(3)基因疫苗具有共同的理化特征，可在同一質(zhì)粒嵌合多種目的基因，形成聯(lián)合免疫；(4)基因疫苗制備簡便，成本低，安全穩(wěn)定，便于貯存和運(yùn)輸。


圖1為pMD18-T質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖譜；圖2為pCEP4質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖譜；圖3為真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCEP4-VP1的構(gòu)建圖；圖4為CVB1VP1基因逆轉(zhuǎn)錄PCR電泳結(jié)果圖，其中AΦX174/Hae III，BCVB1VP1(0.83kb)；圖5為pMD18-T-VP1的酶切鑒定結(jié)果圖，其中ALamdaDNA/Ecor I+HindIII，BΦX174/Hae III，CpMD18-T-VP1/EcoRI，DpMD18-T-VP1/XbaI，EpMD18-T-VP1/XbaI+Kpn I；圖6為PCR擴(kuò)增鑒定pMD18-T-VP1，ALamda DNA/Ecor I+Hind III，BAmplification of CVB1VP1；圖7為pMD18-T-VP1測(cè)序圖譜；圖8為pCEP4-VP1質(zhì)粒PCR及酶切鑒定結(jié)果圖，其中ALamda DNA/Ecor I+Hind III，BAmplification of VP1 from pCEP4-VP1，CpCEP4-VP1/Nhe I，DpCEP4-VP1/Nhe I+BamH I；圖9為pCEP4-VP1測(cè)序圖譜；圖10為pCEP4-VP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后免疫熒光檢測(cè)結(jié)果圖；圖11為pCEP4轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后免疫熒光檢測(cè)結(jié)果圖；圖12為Western blot檢測(cè)分析pCEP4-VP1在HeLa細(xì)胞的表達(dá)結(jié)果圖，其中ApCEP4轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，BpCEP4-VP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞；圖13為小鼠免疫后CTL反應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式的CVB1基因疫苗是由CVB1編碼主要中和抗原的VP1基因和作為真核表達(dá)載體的質(zhì)粒pCEP4組成的pCEP4-CVB 1VP1質(zhì)粒，CVB1VP1的基因序列參見基因序列表。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式對(duì)CVB1基因疫苗進(jìn)行詳細(xì)介紹。
一、材料1.1病毒、細(xì)胞CVB1病毒株、Vero細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和P815細(xì)胞由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所診斷二室提供，CVB1在Vero細(xì)胞傳代，Vero細(xì)胞和HeLa細(xì)胞在含10％胎牛血清的Eagle′s MEM傳代培養(yǎng)，P815細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。
1.2載體、菌株實(shí)驗(yàn)采用的載體包括pMD18-T、pCEP4，pMD18-T和pCEP4的宿主菌株為JM109。pMD18-T為TaKaRa生物技術(shù)公司產(chǎn)品，大小為2.7kb，是一個(gè)高效TA克隆載體，適合PCR產(chǎn)物克隆，該載體含有LacZ基因，多克隆位點(diǎn)處于該基因中間，因此可以通過藍(lán)白選擇來初步篩選重組子。另外pMD18-T在多克隆位點(diǎn)兩端具有M13forward Primer和M13reverse primer，便于對(duì)克隆片段進(jìn)行測(cè)序(見圖1)。pCEP4為Invitrogen公司產(chǎn)品，大小10.4kb，是真核表達(dá)載體，所含的CMV啟動(dòng)子是重組真核表達(dá)載體中最強(qiáng)的啟動(dòng)子，可高效表達(dá)外源基因。該質(zhì)粒圖譜見圖2。
1.3引物、酶和試劑擴(kuò)增CVB1VP1的引物是應(yīng)用Oligo5.0軟件自行設(shè)計(jì)的兩段寡核苷酸，序列為Upperprimer5’-AGA TGC CAG TGG AAG AAT CG-3′，Lower primer5’-CGT CTA GAT TGT GGT AAT GTT TGA G-3′。上、下游引物的堿基組成分別為A＝7、G＝7、C＝3、T＝3和A＝5、G＝8、C＝2、T＝10，上游引物5’端加了一個(gè)起使密碼子ATG，下游引物5’端加了一個(gè)Xba I位點(diǎn)，以備克隆和鑒定之用，終止密碼子U(T)AG包含在XhaI識(shí)別位點(diǎn)的序列中。實(shí)驗(yàn)中使用的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)λ/EcoR I+Hind III、ΦX174/Hae III及蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)為Promega公司和TaKaRa公司產(chǎn)品。RNA提取試劑TRIzol Reagent為GIBCO/BRL公司產(chǎn)品。DNA片段凝膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction kit為QIAGEN公司產(chǎn)品。質(zhì)粒大量提純?cè)噭镼IAGEN公司的QIAGEN PlasmidMaxi Kit。DNA轉(zhuǎn)染試劑CLONfectin為CLONTECH公司產(chǎn)品。羊抗鼠IgG熒光標(biāo)記抗體和羊抗鼠IgG酶標(biāo)抗體購自QIAGEN公司。CVB1 IgM、IgG的ELISA檢測(cè)試劑購自瀛天名生物技術(shù)公司。
1.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物為純系BALB/C小鼠，實(shí)驗(yàn)時(shí)鼠齡為6～7W，重量18士2g，雌雄各半。
二、方法2.1CVB1 RNA的提取將TCID50為10-8的CVB1病毒接種Vero細(xì)胞，37℃培養(yǎng)，待病變?yōu)?++～++++時(shí)收獲。將細(xì)胞反復(fù)凍融三次，取0.3ml置于1.5ml微量離心管中，加入1mlTPIzol Reagent，混勻，15～30℃放置5min。加入0.2ml氯仿，劇烈振搖15sec，室溫放置3min。4℃℃12,000xg離心15min。取上層水相，加入0.5ml異丙醇，15～30℃10min。4℃12,000xg離心15min，去上清，加入1m175％乙醇清洗沉淀，4℃7,500xg離心5min，干燥沉淀，加ddH2O20μl重懸沉淀，-70℃保存。
2.2CVBIVPI的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增2.2.1CVBlVPl逆轉(zhuǎn)錄取0.5ml微量離心管加入10×AMV RT buffer2μl、10mM dNTP 2μl、rRNasin 1μl、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1μl、50pM下游引物0.5μl、RNA模板10μl，無RNAase的去離子水3.5μl。42℃作用60min進(jìn)行cDNA第一鏈合成，產(chǎn)物部分用于PCR，其余-20℃保存。
2.2.2CVBIVPl的PCR擴(kuò)增取0.2ml微量離心管加入CVB1 RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μl、10×Taq DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5μl、25mMMgCl26μl、10mM dNTP3μl、20pM上游引物1μl、20pM下游引物1μl、Taq DNA聚合酶0.5μl、ddH2O28.5μl。94℃預(yù)處理5min，然后進(jìn)行PCR循環(huán)(BIOMETRA PCR擴(kuò)增儀)94℃30sec、55℃45sec、72℃1min，共30個(gè)循環(huán)，最后一次延伸時(shí)間延長8min。取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物上1％瓊脂糖凝膠電泳，照相。其余-20C保存。
2.3pMD18-T-VP1的構(gòu)建與鑒定2.3.1分離純化VP1基因的PCR產(chǎn)物將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物40μl加至1％瓊脂糖凝膠中，5V/cm電泳40min。純化方法按照QIAquick Gel Extraction kit說明書進(jìn)行在UV照射下將0.83kb片段用清潔刀片切下，稱重，加入3倍體積的Buffer QG，50℃溫育10min至凝膠完全融化，將QIAquick柱放在配套的2ml收集管上，將融化的凝膠加入柱內(nèi).10,000xg離心1min，加0.75mlBuffer PE至柱內(nèi)，10,000xg離心1min。棄去殘液，將柱放在套管上再離心1min，棄去殘液，將柱放于1.5ml離心管上，加50μl ddH2O于柱中心，靜置lmin，10,000xg離心1min，管內(nèi)即為回收的PCR產(chǎn)物。
2.3.2連接pMD18-T和CVB1VP1在0.2ml離心管中加入純化的CVBl VPlPCR產(chǎn)物4μl、pMD18-T 1μl、Ligationsolution 5μl。設(shè)立對(duì)照DNA連接實(shí)驗(yàn)于0.2ml離心管中加入Control DNA 1μl、pMD18-T 1μl、Ligation solution 5μl、ddH2O 3μl。兩管于16℃反應(yīng)2h。
2.3.3感受態(tài)細(xì)菌的制備和轉(zhuǎn)化用滅菌的接種針刮拭甘油凍存的JM109細(xì)菌，快速劃于Amp-的LB瓊脂平板上37℃培養(yǎng)過夜。挑單菌落接種于100ml新鮮的Amp-LB培養(yǎng)基，37℃振搖至OD600為0.5時(shí)將培養(yǎng)液置于冰上預(yù)冷10min，于4℃1,600xg離心10min。細(xì)胞沉淀用10ml冰預(yù)冷的CaCl2溶液重懸，于4℃1,100xg離心5min。細(xì)胞沉淀用10ml冰預(yù)冷的CaCl2溶液重懸，冰上放置30min，于4℃1,100xg離心5min。用2ml冰預(yù)冷的CaCl2溶液重懸細(xì)胞，分裝凍存。取5μl連接產(chǎn)物加至100μl感受態(tài)JM109，冰浴30min，42℃50sec，冰浴2min，加入400μl LB培養(yǎng)基，37℃振搖45min。涂100μl IPTG(100μlM)和20μlX-gal(50mg/ml)于含氯芐青霉素(100μl/ml)的LB瓊脂平板，37℃吸附30min。將菌液接種至平板，37℃培養(yǎng)18h～24h。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)JM109感受態(tài)菌和線狀pMD18-T轉(zhuǎn)化對(duì)照。
2.3.4目的菌落的篩選從轉(zhuǎn)化菌平板中任選20個(gè)白菌落，接種于5ml Amp-的LB培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)6h，取1ml菌粗提質(zhì)粒，1％瓊脂糖電泳檢查重組子的大小，初步篩選符合大小的質(zhì)粒。
2.3.5小量提取質(zhì)粒取1.5ml經(jīng)初步篩選認(rèn)為含重組質(zhì)粒的細(xì)菌菌液，4℃12000xg離心1min收集細(xì)胞，加入100μl冰浴預(yù)冷的溶液I(25mM Tris-HCl，pH＝8.0、10mM EDTA，pH＝8.0、50mM葡萄糖)重懸細(xì)胞，然后加入200μl新配制的溶液II(0.2M NaOH、1％SDS)，顛倒數(shù)次，再加150μl冰預(yù)冷的溶液III(5mol/l KAc60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)，顛倒混勻，冰浴5min。4℃12000xg5min，將上清移至另一個(gè)微量離心管，加入2倍體積無水乙醇，混勻，室溫放置10min。4℃12000xg離心，去上清，75％乙醇洗滌三次，干燥后加50μl含20μg/μl RNase A的ddH2O重懸DNA。取10μl上樣測(cè)定波長260nm和280nm時(shí)的吸光度，獲得純度和濃度。
2.3.6酶切鑒定在3個(gè)0.5ml離心管中各加入5μl提取的質(zhì)粒，用XbaI、EcoRI、XbaI+KpnI消化4h，若質(zhì)粒可被XbaI酶切成為3.5kb一個(gè)片段，被EcoR I酶切成為2.7kb和0.8kb兩個(gè)片段，被XbaI+KpnI酶切成為3.1kb和0.4kb兩個(gè)片段則可初步認(rèn)為VP1基因是反向插入pMD 18-T。如果被XbaI酶切后成為2.7kb和0.8kb兩個(gè)片段，被EcoR I酶切成為3.4kb和0.1kb兩個(gè)片段則可初步認(rèn)為CVB1VP1基因插入方向?yàn)檎颉?br> 2.3.7PCR鑒定取0.2ml微量離心管加入下述成份小量質(zhì)粒提取物0.5μl、10×Tap DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5μl、25mM MgCl26μl、10mMdNTP3μl、20pM上游引物1μl、20pM下游引物1μl、Taq DNA聚合酶0.5μl、ddH2O 33μl。PCR反應(yīng)條件同“2.2CVB1VP1的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增”。
2.3.8測(cè)序?qū)⒚盖泻蚉CR初步驗(yàn)證為CVB1 VP1反向插入的重組質(zhì)粒pMD18-T-VP1小量精提，使其A260/A280值介于1.8至1.9間，測(cè)序由兩端進(jìn)行，測(cè)序儀為ABI PRISM 377XL DNA Sequencer。測(cè)序引物為通用引物M13forward primer和M13reverseprimer。測(cè)序號(hào)為LHB1446。
2.4pCEP4-VP1的構(gòu)建與鑒定2.4.1連接取2μg pMD18-T-VP1和2μg pCEP4分別同時(shí)用BamH I和HindIII兩個(gè)酶切消化，體系如下2μg PMD18-T-VP1/2μg pCEP4，5μl TaKaRa內(nèi)切酶緩沖液K，20U BamH I，20U Hind III，加ddH2O至50μl，37℃過夜。將酶切產(chǎn)物上1％瓊脂糖凝膠電泳，用QIAquick Gel Extraction kit回收酶切后0.83kb的pMD18-T-VP1/BamH I+Hind III和10.4kb的pCEP4/BanmH I+Hind III。取pMD18-T-VP1/BamH I+Hind III3μl和pCEP4/BamH I+Hind III2μl加至0.2ml微量離心管中，加入10xT4連接酶反應(yīng)緩沖液1μl、T4DNA連接酶1.5U、ddH2O2.5μl。4℃反應(yīng)16h。
2.4.2轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物取5μl加至100μl感受態(tài)JM109，冰浴30min，42℃50sec，冰浴2min，加入400μlLB培養(yǎng)基，37℃振搖45min，接種至含氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18h～24h。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)pCEP4未切質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、pCEP4/BamHI+HindIII轉(zhuǎn)化和JM109感受態(tài)菌對(duì)照。
2.4.3篩選挑選菌落接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖振培養(yǎng)6h，取1ml菌粗提質(zhì)粒，1％瓊脂糖電泳檢查重組子大小，選擇可能的菌落提純質(zhì)粒。
2.4.5鑒定分別取5μl提取的質(zhì)粒，用Nhe I、Nhe I+BamH I酶切，判斷重組子大小及目的基因插入的正確性。取0.5μl質(zhì)粒，按“2.3pMD18-T-VP1的構(gòu)建與鑒定”中的方法和條件進(jìn)行PCR，檢測(cè)目的基因插入與否。精提初步驗(yàn)證正確的質(zhì)粒，使其A260/A280值介于1.8至1.9間，測(cè)序號(hào)為TaKaRaLHB 1772。由于pCEP4本身沒有測(cè)序可用的通用引物，因此用軟件Oligo5.0分析并自行設(shè)計(jì)一對(duì)測(cè)序引物。引物序列為F5-AGAGCTCGTTTAGTGAACCG-3’和R5’-GTG GTT TGT CCA AAC TCA TC-3’。
2.5CVB1VP1基因在HeLa細(xì)胞的表達(dá)2.5.1大量提純制備pCEP4-CVP1和pCEP4QIAGEN Plasmid Maxi Kit大量提取純化pCEP4-vPI和pCEP4。挑含有目的質(zhì)粒的單菌落接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖振培養(yǎng)8h。將上述培養(yǎng)液1/500稀釋，接種于100ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖振培養(yǎng)12～16h。收獲菌液于4℃6,000xg離心15min。用10ml Buffer P1(50mM Tris-HCl，pH＝8.0、10mMEDTA、100μg/ml RNase A)重懸細(xì)胞。加入10ml Buffer P2(0.2N NaOH、1％SDS)，輕柔而充分地顛倒混勻4～6次，室溫放置5min。加10ml冰預(yù)冷的Buffer P3(3.0mol/lKAc 60ml，pH＝5.5)，輕柔而充分地顛倒混勻4～6次，冰浴20min。于4℃20,000xg離心30min，取上清，于4℃20,000xg再離心15min。將上清加入到被Buffer QBT(750mMNaCl、50mM MOPS，pH＝7.0、15％Isopronanol、0.15％Triton X-100)平衡好的QIAGEN-tip500柱內(nèi)，在重力作用下上清液進(jìn)入到樹脂內(nèi)。用30mlBuffer Qc(1.OM NaCl、50mM MOPS，pH＝7.0、15％Isopropanol)洗柱兩次。用15mlBuffer QF(1.25M NaCl、50mM Tris-Cl，pH＝8.5、15％lsopropanol)洗脫DNA。加10.5ml室溫異丙醇至洗脫的DNA中，混勻于4℃15,000xg離心30min，小心去除上清。用5ml70％乙醇洗沉淀，于4℃15,000xg離心10min，小心去除上清。干操沉淀，以0.5ml pH＝8.0的TE溶解DNA，保存于-20C，用于側(cè)序、細(xì)胞轉(zhuǎn)染或動(dòng)物接種。
2.5.2pCEP4-VP1和pCEP4轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞在六孔培養(yǎng)板培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前一天將每孔加1-4×105細(xì)胞，5％CO237℃培養(yǎng)過夜18h～24h，待細(xì)胞長至60％～90％成層時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。溫育Hepes Buffer Saline(HBS，20mMHepes、150mMNaCl，pH＝7.4)至45-55℃，用HBS稀釋Clonfection至終濃度為1μg/μl，立即混勻置于冰上。將pCEP4和pCEP4-VP1各取3μg分別加100μl無血清培養(yǎng)基，取3μg Clonfectin分別溶于兩管100μl無血清培養(yǎng)基，將質(zhì)粒加到Clonfectin管中，混合，室溫放置20min，使DNA/Clonfectin復(fù)合物形成。兩管內(nèi)各加1.8ml無血清培養(yǎng)基。除去待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)液，加入2ml含DNA/Clonfectin復(fù)合物的培養(yǎng)基，輕微晃動(dòng)細(xì)胞板使DNA/Clonfectin復(fù)合物均勻混在細(xì)胞上。5％CO237℃培養(yǎng)4h。去除含轉(zhuǎn)染液的培養(yǎng)液，加入1×PBS 1ml洗一次。加2ml新鮮的含10％胎牛血清(FCS)的Eagle’s MEM，5％CO237℃培養(yǎng)細(xì)胞48h。
2.5.3免疫熒光檢測(cè)用冷丙酮固定玻片上的細(xì)胞，包括pCEP4轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞、pCEP4-VP1轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞對(duì)照。固定30min，干燥。用0.05M PBS(pH＝7.2)1∶5稀釋的含CVB1-IgG血清0.05ml滴加至細(xì)胞上，37℃30min，水洗10min。加經(jīng)0.05M PBS 1∶5稀釋的0.05ml羊抗小鼠IgG熒光標(biāo)記抗體，37℃作用30min，水洗10min，PBS洗5min。涼干。熒光顯微鏡下觀察。
2.5.4Western blot檢側(cè)收獲轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞，4℃12,000oxg離心1min，棄去上清。將適量沉淀重懸于5μl水中，加入5μl 2xSDS凝膠上樣緩沖液(50imM Tris-HCl，pH＝6.8、100mMDTT、2％SDS、0.1％溴酚藍(lán)、10％甘油)，混勻于100℃加熱10min。各樣品取20μl加樣于12％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。一份用考馬斯亮藍(lán)R-250對(duì)凝膠染色。另一份將SDS聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白泳帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Bio Rad)上，200mA轉(zhuǎn)移1小時(shí)。以0.2％的麗春紅染色確定蛋白己轉(zhuǎn)到膜上，并根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)(Sigma中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn))用圓珠筆標(biāo)記目的條帶的位置。用TTBS(TBS/0.4％Tween-20)洗滌二次，加5％脫脂奶室溫封閉2小時(shí)。TTBS洗三次，加入抗CVB 1抗體于室溫?fù)u動(dòng)孵育3小時(shí)。TTBS洗三次，加入酶標(biāo)抗小鼠1gG抗體，于室溫?fù)u動(dòng)孵育2小時(shí)。TTBS洗三次，加入顯色液(30mg二氨基聯(lián)苯胺，2.5ml Tris-HCl，pH＝7.4，加水定容至50ml，使用前加30μl 30％H2O2)至出現(xiàn)清晰的條帶為止，棄去顯色液，用水洗膜二次。
2.6動(dòng)物接種將鼠齡為6～7W、18±2g、雌雄各半的BALB/C小鼠隨機(jī)分成pCEP4-VP1接種組、pCEP4接種組、滅活的CVB1病毒接種組和生理鹽水對(duì)照組，每組10只動(dòng)物。將純度為1.85(A260/A280)的DNA樣品用水稀釋至1mg/ml，每毫升DNA樣品加入30.8μl5M NaCl使NaCl終濃度為0.9％。每只鼠腹腔注射鹽酸路氯胺酮2mg，待數(shù)分鐘后小鼠四肢松弛開始接種。對(duì)pCEP4-VP1接種組和pCEP4接種組小鼠，于雙側(cè)大腿內(nèi)側(cè)股四頭肌處各注射0.1mlDNA樣品。正常對(duì)照組在股四頭肌處接種等量的生理鹽水。CVB1病毒接種組小鼠用56℃30min滅活的CVB1病毒(10-8TCID50)腹腔接種，每只0.2ml。四周后進(jìn)行第二次接種，作為加強(qiáng)免疫，接種量和接種方法同前。第一次接種前、第一次接種后一周、加強(qiáng)免疫前、加強(qiáng)免疫后三周斷尾采血，分離血清，-70℃保存用于IgM、lgG檢測(cè)。
2.7體液免疫檢測(cè)2.7.1CVB1-IgM ELIsA試驗(yàn)將2滴標(biāo)本稀釋液滴到包被孔中(陰陽對(duì)照孔不加)。將被檢血清用生理鹽水20倍稀釋，取10μl稀釋后血清加至包被孔，混勻，設(shè)立陰、陽性對(duì)照孔，37℃作用40min。洗滌液洗3次，甩干。加入1∶50稀釋的酶標(biāo)抗體0.1ml，37℃作用20min。洗滌液洗5次，甩干。加入底物A和底物B各0.05ml。室溫放置顯色。待陽性對(duì)照顯蘭色后加入終止液，觀察被檢孔結(jié)果，然后用酶標(biāo)儀于波長45Onm處測(cè)定OD值，與空白對(duì)照孔校正。計(jì)算P/N值，P/N＝被檢血清OD值/陰性對(duì)照孔OD值，P/N≥2.1時(shí)為陽性，P/N＜2.1為陰性。
2.7.2CVB1-IgGELISA試驗(yàn)將包被板條用洗滌液洗三次，甩干，將被檢標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1∶100稀釋后每孔加100μl，陰陽性對(duì)照液100μl各加一孔。混勻，37℃作用40min。洗滌液洗3次，甩干。加入1∶50稀釋的酶標(biāo)抗體0.1ml，37℃作用20min。洗滌液洗三次，甩干。加入底物A和底物B各0.05ml。室溫放置顯色。待陽性對(duì)照顯藍(lán)色后加入終止液，觀察結(jié)果。用酶標(biāo)儀于波長450nm處測(cè)定OD值，與空白對(duì)照孔校正。計(jì)算P/N值，P/N＝被檢血清OD值/陰性對(duì)照孔OD值，P≥2.1時(shí)為陽性，P/N＜2.1為陰性。
2.8細(xì)胞免疫檢測(cè)效應(yīng)毒性T淋巴細(xì)施(CTL)反應(yīng)的檢側(cè)效應(yīng)細(xì)胞的制備第二次加強(qiáng)免疫后三周處死小鼠，于無菌條件下取脾，常規(guī)分離脾細(xì)胞。簡言之，在200目不銹鋼網(wǎng)篩上研碎鼠脾，將脾細(xì)胞置于無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，收集至試管中，2,000xg離心10min，棄去上清。加5ml0.83％NH4Cl低滲液破壞紅細(xì)胞，離心去上清，加5ml含10％胎牛血清的RPMI 1640重懸后吸至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃貼壁1.5小時(shí)，去除貼壁細(xì)胞。小心吸取上清過無菌尼龍毛柱，分離得到T細(xì)胞。將T細(xì)胞重懸于T細(xì)胞培養(yǎng)基(TCM，含RPMI 1640，2mM谷胺酰胺，1％青霉素，1％鏈霉素，20mM HEPES，5×10-5M β-疏基乙醇)。用TCM調(diào)T細(xì)胞數(shù)為1×107/ml。取1ml加入加孔培養(yǎng)板，每孔加0.3ml滅活的CVB1(10-8TCID50)病毒再刺激。于37℃5％CO2培養(yǎng)5天制備效應(yīng)細(xì)胞。
靶細(xì)胞的制備用10moi CVB1病毒感染P815細(xì)胞過夜，無血清RPMI 1640洗三次，加入100μCiNa251CrO4，于37℃5％CO2培養(yǎng)1.5小時(shí)，再用無血清RPMI1640洗三次，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×105/ml，作為靶細(xì)胞。將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞分別以100∶1、50∶1、25∶1共同37℃5％CO2培養(yǎng)6小時(shí)，同時(shí)做自然釋放和最大釋放對(duì)照。離心后吸取上清100μl，裝入小塑料管，于γ計(jì)數(shù)儀讀取CPM值。
按以下公式計(jì)算殺傷率 三、結(jié)果3.1CVB1 VP1的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增取10μl RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣至1％瓊脂糖凝膠，5V/cm，電泳45min。結(jié)果見圖4。在0.83kb處可見條明亮的核酸區(qū)帶，與理論預(yù)期值教。在泳道中無其他非特異闊增區(qū)帶可見。
3.2pMD18-T-VP1的構(gòu)建與鑒定3.2.1連接與轉(zhuǎn)化CVB 1VP1片段與pMD18-T連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109后獲得約100個(gè)菌落，其中藍(lán)菌落約40個(gè)，白菌落約60個(gè)。Control DNA和pMD18-T連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109后獲得約120個(gè)菌落，其中藍(lán)菌落約40個(gè)，白菌落約80個(gè)，表明感受態(tài)細(xì)菌的效率和連接條件的控制較好。JM109菌平板和線狀pMD18-T轉(zhuǎn)化平板均無細(xì)菌生長，說明pMD18-T-VP1轉(zhuǎn)化子帶有重組質(zhì)粒。
3.2.2篩選菌落與酶切從轉(zhuǎn)化菌平板中任選20個(gè)白菌落，接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后粗提質(zhì)粒，進(jìn)行1％瓊脂糖電泳篩選，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒大小均在3.5kb左右。提純其中第4號(hào)菌落質(zhì)粒，用EcoRI、XbaI、Xba I+Kpn I消化發(fā)現(xiàn)該質(zhì)?？杀籈coR I酶切成為2.7kb和0.8kb兩個(gè)片段，被Xba I酶切成為3.5kb一個(gè)片段，被Xba I+Kpn I酶切成為3.1kb和0.4kb兩個(gè)片段，初步說明VP1基因是反向插入pMD18-T，見圖5。
3.2.3PCR以4號(hào)菌落提取的質(zhì)粒為模板，按照上述方法進(jìn)行PCR，pMD18-T-VP1可擴(kuò)增出一條明亮的0.83kb片段，結(jié)果正確，見圖6。
3.2.4測(cè)序?qū)?號(hào)菌落提純的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序報(bào)告顯示，每個(gè)反應(yīng)至少可以清晰地讀出550個(gè)以上的堿基峰值(近600個(gè))，說明小量提純獲得的pMD18-T-VP1在純度上能滿足測(cè)序的要求。從兩端測(cè)序，中間有約250個(gè)堿基重疊。將所測(cè)序列(下排)與Genbank中l(wèi)izuka，N報(bào)告的序列(上排)比較如下；AGATGCCAGTGGAAGAATCG和CTCAAACATTACCACAATCTAGACG是CVB1 VP1擴(kuò)增所用的上下游引物。CVB1 VP1基因共834bp，編碼278個(gè)氮基酸。從上面的序列比較看出本實(shí)驗(yàn)所用CVB1 VP1基因與lizuka所報(bào)道序列存在4處堿基差異，分別為第239bp(A→T，lizuka在前，以下同〕、272bp(T→C)、373bp(G→C)和417bp(A→C)，均影響到氨基酸的編碼，分別為第80氨基酸(Asn→Thr)、第91氨基酸(Val→Ala)、第125氨基酸(Glu→Gln)和第139氨基酸(Gln→His)。另外有一段堿基序列位置差異，即301bp～318bp，lizuka的序列為CTGAGGAGGAAACTAGAG，編碼的氨基酸序列為LRRKLE(LLeu、RArg、KLys、EGlu)；本實(shí)驗(yàn)序列為AGG AGG AAA CTA GAG CTG，編碼的氨基酸序列為RRKLEL。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，又挑選一個(gè)VP1正向插入的3號(hào)菌落測(cè)序，結(jié)果其第272bp與lizuka的一致，其它序列均與4菌落一致。提示4號(hào)菌落第272bp可能是由于PCR擴(kuò)增時(shí)錯(cuò)配或測(cè)序錯(cuò)讀造成的，而本實(shí)臉用CVB1的VP1基因與lizuka所報(bào)道序列的其它差異是確實(shí)存在的。
3.3pCEP4-VP1的構(gòu)建與鑒定3.3.1連接、轉(zhuǎn)化、篩選pCEP4-VP1轉(zhuǎn)化JM109經(jīng)過夜培養(yǎng)后可見約100個(gè)菌落，而pCEP4未切質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM105平板長滿菌落，pCEP4/BamH I+Hind III轉(zhuǎn)化和JM109感受態(tài)菌對(duì)照均無菌落生長，說明轉(zhuǎn)化結(jié)果良好。任意選擇pCEP4-VP1轉(zhuǎn)化菌落5個(gè)粗提質(zhì)粒，電泳觀察重組質(zhì)粒大小約11kb，與理論預(yù)期值一致。進(jìn)一步提純質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定。
3.3.2鑒定pCEP4-VP1被Nhe I酶切成為一條11.23kb的條帶，被NheI+BamH I酶切成為一條10.4kb的條帶和一條0.83kb的條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期理論值一致。對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行PCR，可擴(kuò)增出一條明顯的0.83kb條帶，結(jié)果正確，見圖8。pCEP-VP1的測(cè)序亦由兩端進(jìn)行，結(jié)果如下。AGATGCCAGTGGAAGAATCG和CTCAAACTTACCACAATCTAGA是VP1的擴(kuò)增引物。
是PMD18-T的一部分，其中第50bp的T即為與PCR產(chǎn)物連接的“T″。該結(jié)果VP1序列與來自4號(hào)菌落pMD18-T-VP1的序列完全一致，證明VP1被成功地連接到了pCEP4上。測(cè)序圖譜見圖9。
3.4CVB1VP1基因在HeLa細(xì)胞的表達(dá)3.4.1免疫熒光檢測(cè)pCEP4-VP1、pCEP4轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后經(jīng)含CVB1IgG血清作用，再加熒光標(biāo)記的第二抗體羊抗小鼠IgG作用后，于熒光顯微鏡下觀察?？梢妏CEP4-VP1轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞內(nèi)有熒光標(biāo)記，pCEP4轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)無熒光標(biāo)記(圖10)。
3.4.2Western blot檢測(cè)Western blo結(jié)果顯示pCEP4-VP1轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞電泳后轉(zhuǎn)膜，可于泳道中的33KDa處檢測(cè)到一條明顯的條帶，而pCEP4轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜后在33KD處無明顯條帶。結(jié)果見圖11。
3.5體液免疫檢測(cè)3.5.1CVB1-IgM ELISA試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。第一次免疫前小鼠采血，檢測(cè)不到IgM。第一次免疫后一周、第一次免疫后4周(即加強(qiáng)免疫前)、加強(qiáng)免疫后三周采血進(jìn)行ELISA檢測(cè)，從表1可以看出，第一次免疫后一周，pCEP4-VP1接種組與滅活CVB1接種組的P/N值均大于2.1，其A450值與生理鹽水對(duì)照組比有顯著差異(P＜0.01)。而pCEP4接種組P/N值小于2.1，其A450值與生理鹽水對(duì)照組比無顯著差異(P＞0.05)。結(jié)果說明pCEP4-VP1和滅活的CVB1接種小鼠可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗CVB1的IgM，而單純pCEP4質(zhì)粒接種則不能產(chǎn)生該抗體。第一次免疫后4周、加強(qiáng)免疫后三周各組P/N值均小于2.1，各組A450值間無顯著差異。各組A450值間差異用t檢驗(yàn)，結(jié)果列于表1中。
表1ELISA檢測(cè)小鼠免疫后CVB1IgM水平

*P＜0.01，與pCEP4對(duì)比；ΔP＜0.05，與pCEP4對(duì)比。
3.5.2CVB1-IgG ELISA試驗(yàn)第一次免疫前檢測(cè)不到IgG。第一次免疫后一周、第一次免疫后4周(即加強(qiáng)免疫前)、加強(qiáng)免疫后三周采血進(jìn)行ELISA檢測(cè)，從表2可以看出，pCEP4-VP1接種組僅于加強(qiáng)免疫后三周可檢測(cè)到IgG抗體，而滅活的CVB1接種組在加強(qiáng)免疫前和加強(qiáng)免疫后三周均可檢測(cè)到IgG抗體，且其水平高于pCEP4-VP1接種組。pCEP4接種組在任何時(shí)間點(diǎn)均檢測(cè)不到1gG。各組A450值間差異用t檢驗(yàn)。結(jié)果列于表2中。
表2ELISA檢測(cè)小鼠免疫后CVB1-IgG水平

*P＜0.01，與pCEP4對(duì)比；ΔP＜0.01，與pCEP4-VP1對(duì)比。
3.5細(xì)胞免疫檢測(cè)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)施(CTL)反應(yīng)的檢測(cè)從圖12可見pCEP4-VP1接種小鼠可誘導(dǎo)較強(qiáng)的CTL反應(yīng)，其殺傷率明顯高于對(duì)照組。而pCEP4組、滅活CVB1組幾乎無殺傷效應(yīng)，說明pCEP4-VP1做為DNA疫苗可誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)。
序列表一、pCEP4-CVB1VP1的DNA序列TCTAGAGTCG ACCGGTCATG GCTGCGCCCC GACACCCGCC AACACCCGCT GACGCGCCCT 60GACGGGCTTG TCTGCTCCCG GCATCCGCTT ACAGACAAGC TGTGACCGTC TCCGGGAGCT 120GCATGTGTCA GAGGTTTTCA CCGTCATCAC CGAAACGCGC GAGGCAGCCG GATCATAATC 180AGCCATACCA CATTTGTAGA GGTTTTACTT GCTTTAAAAA ACCTCCCCAC CTCCCCCTGA 240ACCTGAAACA TAAAATGAAT GCAATTGTTG TTGTTAACTT GTTTATTGCA GCTTATAATG 300GTTACAAATA AAGCAATAGC ATCACAAATT TCACAAATAA AGCATTTTTT TCACTGCATT 360CTAGTTGTGG TTTGTCCAAA CTCATCAATG TATCTTATCA TGTCTGGATC CTCTAGAGAT 420TCBTCTAGAT TGTGGTAATG TTTGAGCGCG TTGTGGCGAC TCCTGTTGGG TTGAAATTAA 480CATTCTTTTG CTTCTCATAT TGACATAGCC TCGGCGGTCT GGGCACCCAC GCCTTCACAT 540GTTTGGGTTT AAAATATATT CTAACTGTAC TTTTGATCGG GCCTTGGCCT GCCTCATTTA 600CGTGCCGCAT GTACAGCGTA CCCATGTTGT TCAGGGTATT AATGCCGTAA ACCCCATTCC 660TAGAGAACTG TGTGCATCCA TCATAAAAGC AGCTATAAGC ATTTCCAATA CTGATGAAGG 720GAATAGACAT CCTCGGTGGG GCATTCCCCT CTGTCCAAAA GACGCTGGGG TTTGTGGATG 780TTTGCCAGGC GTAGTCTGTA ACCTTGGTAG GTACCGGCCC GCCTGGAGGC ACATACATTA 840TCTGGTGGGT TTGTACAGGT GCGTCTACAC TGGTAGCGGT ACTGGGCTGC TGGGCACTTG 900TTATCACAAA TGTCAATTCC AGATCGAACC TTAAGTAAGT GAACAGCTCT AGTTTCCTCC 960TCAACTGCGC AACCTGCCTG GTGTTGATAG CCCACTCTGC GTAGCCCTTC TCAGAATTAT1020TAGTGTAGGT GGCGTAATAC ACACAAGCAG ATCGGCACAA GAAATTTTCA ATGGAAGATT1080CCGACCTTGA GTGGTAATTC TTCACGTGTC TAGTTTGCAT GGTGTCACTG GGTACGACTT1140GAGAGGTATG ACCAGTCTCC GCAGCAGTGA GGGCGGGGAT GGATTCTGAA TTCGTAGGCT1200TTGAGCTGAC CGTATCAGCC ACGCGCACCA TGGCGCGTTC CACCGATTCT TCCACTGGCA1260TCTAATCGTC GACCTGCAGG CATGCAAGCT TGCTAGCAGC TGGTACCCAG CTTCTAGAGA1320TCTGACGGTT CACTAAACGA GCTCTGCTTA TATAGACCTC CCACCGTACA CGCCTACCGC1380CCATTTGCGT CAACGGGGCG GGGTTATTAC GACATTTTGG AAAGTCCCGT TGATTTTGGT1440GCCAAAACAA ACTCCCATTG ACGTCAATGG GGTGGAGACT TGGAAATCCC CGTGAGTCAA1500ACCGCTATCC ACGCCCATTG GTGTACTGCC AAAACCGCAT CACCATGGTA ATAGCCATGA1560CTAATACGTA GATGTACTGC CAAGTAGGAA AGTCCCGTAA GGTCATGTAC TGGGCATAAT1620GCCAGGCGGG CCATTTACCG TCATTGACGT CAATAGGGGG CGGACTTGGC ATATGATACA1680CTTGATGTAC TGCCAAGTGG GCAGTTTACC GTAAATACTC CACCCATTGA CGTCAATGGA1740AAGTCCCTAT TGGCGTTACT ATGGGAACAT ACGTCATTAT TGACGTCAAT GGGCGGGGGT1800CGTTGGGCGG TCAGCCAGGC GGGCCATTTA CCGTAAGTTA TGTAACGCGG AACTCCATAT1860ATGGGCTATG AACTAATGAC CCCGTAATTG ATTACTATTA ATAACTAGTC AATAATCAAT1920GTCAACATGG CGGTCATATT GGACATGAGC CAATATAAAT GTACATATTA TGATATAGAT1980ACAACGTATG CAATGGCCAA TAGCCAATAT TGATTTATGC TATATAACCA ATGACTAATA2040TGGCTAATTG CCAATATTTA TTCAATGTAT AGATCTTCCA TACCTACCAG TTCTGCGCCT2100GCAGCAATGC AACAACGTTG CCCGGATCTG CGATGATAAG CTGTCAAACA TGAGAATTGG2160TCGACTAGCT TGGCACGCCA GAAATCCGCG CGGTGGTTTT TGGGGGTCGG GGGTGTTTGG2220
CAGCCACAGA CGCCCGGTGT TCGTGTCGCG CCAGTACATG CGGTCCATGC CCAGGCCATC2280CAAAAACCAT GGGTCTGTCT GCTCAGTCCA GTCGTGGACC AGACCCCACG CAACGCCCAA2340AATAATAACC CCCACGAACC ATAAACCATT CCCCATGGGG GACCCCGTCC CTAACCCACG2400GGGCCAGTGG CTATGGCAGG GCCTGCCGCC CCGACGTTGG CTGCGAGCCC TGGGCCTTCA2460CCCGAACTTG GGGGGTGGGG TGGGGAAAAG GAAGAAACGC GGGCGTATTG GCCCCAATGG2520GGTCTCGGTG GGGTATCGAC AGAGTGCCAG CCCTGGGACC GAACCCCGCG TTTATGAACA2580AACGACCCAA CACCCGTGCG TTTTATTCTG TCTTTTTATT GCCGTCATAG CGCGGGTTCC2640TTCCGGTATT GTCTCCTTCC GTGTTTCAGT TAGCCTCCCC CATCTCCCCT ATTCCTTTGC2700CCTCGGACGA GTGCTGGGGC GTCGGTTTCC ACTATCGGCG AGTACTTCTA CACAGCCATC2760GGTCCAGACG GCCGCGCTTC TGCGGGCGAT TTGTGTACGC CCGACAGTCC CGGCTCCGGA2820TCGGACGATT GCGTCGCATC GACCCTGCGC CCAAGCTGCA TCATCGAAAT TGCCGTCAAC2880CAAGCTCTGA TAGAGTTGGT CAAGACCAAT GCGGAGCATA TACGCCCGGA GCCGCGGCGA2940TCCTGCAAGC TCCGGATGCC TCCGCTCGAA GTAGCGCGTC TGCTGCTCCA TACAAGCCAA3000CCACGGCCTC CAGAAGAAGA TGTTGGCGAC CTCGTATTGG GAATCCCCGA ACATCGCCTC3060GCTCCAGTCA ATGACCGCTG TTATGCGGCC ATTGTCCGTC AGGACATTGT TGGAGCCGAA3120ATCCGCGTGC ACGAGGTGCC GGACTTCGGG GCAGTCCTCG GCCCAAAGCA TCAGCTCATC3180GAGAGCCTGC GCGACGGACG CACTGACGGT GTCGTCCATC ACAGTTTGCC AGTGATACAC3240ATGGGGATCA GCAATCGCGC ATATGAAATC ACGCCATGTA GTGTATTGAC CGATTCCTTG3300CGGTCCGAAT GGGCCGAACC CGCTCGTCTG GCTAAGATCG GCCGCAGCGA TCGCATCCAT3360GGCCTCCGCG ACCGGCTGCA GAACAGCGGG CAGTTCGGTT TCAGGCAGGT CTTGCAACGT3420GACACCCTGT GCACGGCGGG AGATGCAATA GGTCAGGCTC TCGCTGAATT CCCCAATGTC3480AAGCACTTCC GGAATCGGGA GCGCGGCCGA TGCAAAGTGC CGATAAACAT AACGATCTTT3540GTAGAAACCA TCGGCGCAGC TATTTACCCG CAGGACATAT CCACGCCCTC CTACATCGAA3600GCTGAAAGCA CGAGATTCTT CGCCCTCCGA GAGCTGCATC AGGTCGGAGA CGCTGTCGAA3660CTTTTCGATC AGAAACTTCT CGACAGACGT CGCGGTGAGT TCAGGCTTTT TCATATCTCA3720TTCCCCGGGA TCTGCGGCAC GCTGTTGACG CTGTTAAGCG GGTCGCTGCA GGGTCGCTCG3780GTGTTCGAGG CCACACGCGT CACCTTAATA TGCGAAGTGG ACCTGGGACC GCGCCGCCCC3840GACTGCATCT GCGTGTTCGA ATTCGCCAAT GACAAGACGC TGGGCGGGGT TTGTGTCATC3900ATAGAACTAA AGACATGCAA ATATATTTCT TCCGGGGACA CCGCCAGCAA ACGCGAGCAA3960CGGGCCACGG GGATGAAGCA GGGCATGGCG GCCGACGCGC TGGGCTACGT CTTGCTGGCG4020TTCGCGACGC GAGGCTGGAT GGCCTTCCCC ATTATGATTC TTCTCGCTTC CGGCGGCATC4080GGGATGCCCG CGTTGCAGGC CATGCTGTCC AGGCAGGTAG ATGACGACCA TCAGGGACAG4140CTTCAAGGAT CGCTCGCGGC TCTTACCAGC CTAACTTCGA TCACTGGACC GCTGATCGTC4200ACGGCGATTT ATGCCGCCTC GGCGAGCACA TGGAACGGGT TGGCATGGAT TGTAGGCGCC4260GCCCTATACC TTGTCTGCCT CCCCGCGTTG CGTCGCGGTG CATGGAGCCG GGCCACCTCG4320ACCTGAATGG AAGCCGGCGG CACCTCGCTA ACGGATTCAC CACTCCAAGA ATTGGAGCCA4380ATCAATTCTT GCGGAGAACT GTGAATGCGC AAACCAACCC TTGGCAGAAC ATATCCATCG4440CGTCCGCCAT CTCCAGCAGC CGCACGCGGC GCAGCAAAAG GCCAGGAACC GTAAAAAGGC4500CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC GAGCATCACA AAAATCGACG4560
CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG ACTATAAAGA TACCAGGCGT TTCCCCCTGG4620AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC CCTGCCGCTT ACCGGATACC TGTCCGCCTT4680TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG CGCTTTCTCA TAGCTCACGC TGTAGGTATC TCAGTTCGGT4740GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT GCACGAACCC CCCGTTCAGC CCGACCGCTG4800CGCCTTATCC GGTAACTATC GTCTTGAGTC CAACCCGGTA AGACACGACT TATCGCCACT4860GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG AGCGAGGTAT GTAGGCGGTG CTACAGAGTT4920CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC TAGAAGGACA GTATTTGGTA TCTGCGCTCT4980GCTGAAGCCA GTTACCTTCG GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT TGATCCGGCA AACAAACCAC5040CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA GCAGCAGATT ACGCGCAGAA AAAAAGGATC5100TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG GTCTGACGCT CAGTGGAACG AAAACTCACG5160TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA AAGGATCTTC ACCTAGATCC TTTTAAATTA5220AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT ATATGAGTAA ACTTGGTCTG ACAGTTACCA5280ATGCTTAATC AGTGAGGCAC CTATCTCAGC GATCTGTCTA TTTCGTTCAT CCATAGTTGC5340CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC TTACCATCTG GCCCCAGTGC5400TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC GGCTCCAGAT TTATCAGCAA TAAACCAGCC5460AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA GAAGTGGTCC TGCAACTTTA TCCGCCTCCA TCCAGTCTAT5520TAATTGTTGC CGGGAAGCTA GAGTAAGTAG TTCGCCAGTT AATAGTTTGC GCAACGTTGT5580TGCCATTGCT GCAGGCATCG TGGTGTCACG CTCGTCGTTT GGTATGGCTT CATTCAGCTC5640CGGTTCCCAA CGATCAAGGC GAGTTACATG ATCCCCCATG TTGTGCAAAA AAGCGGTTAG5700CTCCTTCGGT CCTCCGATCG TTGTCAGAAG TAAGTTGGCC GCAGTGTTAT CACTCATGGT5760TATGGCAGCA CTGCATAATT CTCTTACTGT CATGCCATCC GTAAGATGCT TTTCTGTGAC5820TGGTGAGTAC TCAACCAAGT CATTCTGAGA ATAGTGTATG CGGCGACCGA GTTGCTCTTG5880CCCGGCGTCA ACACGGGATA ATACCGCGCC ACATAGCAGA ACTTTAAAAG TGCTCATCAT5940TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC AAGGATCTTA CCGCTGTTGA GATCCAGTTC6000GATGTAACCC ACTCGTGCAC CCAACTGATC TTCAGCATCT TTTACTTTCA CCAGCGTTTC6060TGGGTGAGCA AAAACAGGAA GGCAAAATGC CGCAAAAAAG GGAATAAGGG CGACACGGAA6120ATGTTGAATA CTCATACTCT TCCTTTTTCA ATATTATTGA AGCATTTATC AGGGTTATTG6180TCTCATGAGC GGATACATAT TTGAATGTAT TTAGAAAAAT AAACAAATAG GGGTTCCGCG6240CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCTGACGT CTAAGAAACC ATTATTATCA TGACATTAAC6300CTATAAAAAT AGGCGTATCA CGAGGCCCTT TCGTCTTCAA GAATTCTCAT GTTTGACAGC6360TTATCATCGA TAAGCTGATC CTCACAGGCC GCACCCAGCT TTTCTTCCGT TGCCCCAGTA6420GCATCTCTGT CTGGTGACCT TGAAGAGGAA GAGGAGGGGT CCCGAGAATC CCCATCCCTA6480CCGTCCAGCA AAAAGGGGGA CGAGGAATTT GAGGCCTGGC TTGAGGCTCA GGACGCAAAT6540CTTGAGGATG TTCAGCGGGA GTTTTCCGGG CTGCGAGTAA TTGGTGATGA GGACGAGGAT6600GGTTCGGAGG ATGGGGAATT TTCAGACCTG GATCTGTCTG ACAGCGACCA TGAAGGGGAT6660GAGGGTGGGG GGGCTGTTGG AGGGGGCAGG AGTCTGCACT CCCTGTATTC ACTGAGCGTC6720GTCTAATAAA GATGTCTATT GATCTCTTTT AGTGTGAATC ATGTCTGACG AGGGGCCAGG6780TACAGGACCT GGAAATGGCC TAGGAGAGAA GGGAGACACA TCTGGACCAG AAGGCTCCGG6840CGGCAGTGGA CCTCAAAGAA GAGGGGGTGA TAACCATGGA CGAGGACGGG GAAGAGGACG6900
AGGACGAGGA GGCGGAAGAC CAGGAGCCCC GGGCGGCTCA GGATCAGGGC CAAGACATAG6960AGATGGTGTC CGGAGACCCC AAAAACGTCC AAGTTGCATT GGCTGCAAAG GGACCCACGG7020TGGAACAGGA GCAGGAGCAG GAGCGGGAGG GGCAGGAGCA GGAGGGGCAG GAGCAGGAGG7080AGGGGCAGGA GCAGGAGGAG GGGCAGGAGG GGCAGGAGGG GCAGGAGGGG CAGGAGCAGG7140AGGAGGGGCA GGAGCAGGAG GAGGGGCAGG AGGGGCAGGA GGGGCAGGAG CAGGAGGAGG7200GGCAGGAGCA GGAGGAGGGG CAGGAGGGGC AGGAGCAGGA GGAGGGGCAG GAGGGGCAGG7260AGGGGCAGGA GCAGGAGGAG GGGCAGGAGC AGGAGGAGGG GCAGGAGGGG CAGGAGCAGG7320AGGAGGGGCA GGAGGGGCAG GAGGGGCAGG AGCAGGAGGA GGGGCAGGAG CAGGAGGGGC7380AGGAGGGGCA GGAGGGGCAG GAGCAGGAGG GGCAGGAGCA GGAGGAGGGG CAGGAGGGGC7440AGGAGGGGCA GGAGCAGGAG GGGCAGGAGC AGGAGGGGCA GGAGCAGGAG GGGCAGGAGC7500AGGAGGGGCA GGAGGGGCAG GAGCAGGAGG GGCAGGAGGG GCAGGAGCAG GAGGGGCAGG7560AGGGGCAGGA GCAGGAGGAG GGGCAGGAGG GGCAGGAGCA GGAGGAGGGG CAGGAGGGGC7620AGGAGCAGGA GGGGCAGGAG GGGCAGGAGC AGGAGGGGCA GGAGGGGCAG GAGCAGGAGG7680GGCAGGAGGG GCAGGAGCAG GAGGAGGGGC AGGAGCAGGA GGGGCAGGAG CAGGAGGTGG7740AGGCCGGGGT CGAGGAGGCA GTGGAGGCCG GGGTCGAGGA GGTAGTGGAG GCCGGGGTCG7800AGGAGGTAGT GGAGGCCGCC GGGGTAGAGG ACGTGAAAGA GCCAGGGGGG GAAGTCGTGA7860AAGAGCCAGG GGGAGAGGTC GTGGACGTGG AGAAAAGAGG CCCAGGAGTC CCAGTAGTCA7920GTCATCATCA TCCGGGTCTC CACCGCGCAG GCCCCCTCCA GGTAGAAGGC CATTTTTCCA7980CCCTGTAGGG GAAGCCGATT ATTTTGAATA CCACCAAGAA GGTGGCCCAG ATGGTGAGCC8040TGACGTGCCC CCGGGAGCGA TAGAGCAGGG CCCCGCAGAT GACCCAGGAG AAGGCCCAAG8100CACTGGACCC CGGGGTCAGG GTGATGGAGG CAGGCGCAAA AAAGGAGGGT GGTTTGGAAA8160GCATCGTGGT CAAGGAGGTT CCAACCCGAA ATTTGAGAAC ATTGCAGAAG GTTTAAGAGC8220TCTCCTGGCT AGGAGTCACG TAGAAAGGAC TACCGACGAA GGAACTTGGG TCGCCGGTGT8280GTTCGTATAT GGAGGTAGTA AGACCTCCCT TTACAACCTA AGGCGAGGAA CTGCCCTTGC8340TATTCCACAA TGTCGTCTTA CACCATTGAG TCGTCTCCCC TTTGGAATGG CCCCTGGACC8400CGGCCCACAA CCTGGCCCGC TAAGGGAGTC CATTGTCTGT TATTTCATGG TCTTTTTACA8460AACTCATATA TTTGCTGAGG TTTTGAAGGA TGCGATTAAG GACCTTGTTA TGACAAAGCC8520CGCTCCTACC TGCAATATCA GGGTGACTGT GTGCAGCTTT GACGATGGAG TAGATTTGCC8580TCCCTGGTTT CCACCTATGG TGGAAGGGGC TGCCGCGGAG GGTGATGACG GAGATGACGG8640AGATGAAGGA GGTGATGGAG ATGAGGGTGA GGAAGGGCAG GAGTGATGTA ACTTGTTAGG8700AGACGCCCTC AATCGTATTA AAAGCCGTGT ATTCCCCCGC ACTAAAGAAT AAATCCCCAG8760TAGACATCAT GCGTGCTGTT GGTGTATTTC TGGCCATCTG TCTTGTCACC ATTTTCGTCC8820TCCCAACATG GGGCAATTGG GCATACCCAT GTTGTCACGT CACTCAGCTC CGCGCTCAAC8880ACCTTCTCGC GTTGGAAAAC ATTAGCGACA TTTACCTGGT GAGCAATCAG ACATGCGACG8940GCTTTAGCCT GGCCTCCTTA AATTCACCTA AGAATGGGAG CAACCAGCAT GCAGGAAAAG9000GACAAGCAGC GAAAATTCAC GCCCCCTTGG GAGGTGGCGG CATATGCAAA GGATAGCACT9060CCCACTCTAC TACTGGGTAT CATATGCTGA CTGTATATGC ATGAGGATAG CATATGCTAC9120CCGGATACAG ATTAGGATAG CATATACTAC CCAGATATAG ATTAGGATAG CATATGCTAC9180CCAGATATAG ATTAGGATAG CCTATGCTAC CCAGATATAA ATTAGGATAG CATATACTAC9240
CCAGATATAG ATTAGGATAG CATATGCTAC CCAGATATAG ATTAGGATAG CCTATGCTAC 9300CCAGATATAG ATTAGGATAG CATATGCTAC CCAGATATAG ATTAGGATAG CATATGCTAT 9360CCAGATATTT GGGTAGTATA TGCTACCCAG ATATAAATTA GGATAGCATA TACTACCCTA 9420ATCTCTATTA GGATAGCATA TGCTACCCGG ATACAGATTA GGATAGCATA TACTACCCAG 9480ATATAGATTA GGATAGCATA TGCTACCCAG ATATAGATTA GGATAGCCTA TGCTACCCAG 9540ATATAAATTA GGATAGCATA TACTACCCAG ATATAGATTA GGATAGCATA TGCTACCCAG 9600ATATAGATTA GGATAGCCTA TGCTACCCAG ATATAGATTA GGATAGCATA TGCTATCCAG 9660ATATTTGGGT AGTATATGCT ACCCATGGCA ACATTAGCCC ACCGTGCTCT CAGCGACCTC 9720GTGAATATGA GGACCAACAA CCCTGTGCTT GGCGCTCAGG CGCAAGTGTG TGTAATTTGT 9780CCTCCAGATC GCAGCAATCG CGCCCCTATC TTGGCCCGCC CACCTACTTA TGCAGGTATT 9840CCCCGGGGTG CCATTAGTGG TTTTGTGGGC AAGTGGTTTG ACCGCAGTGG TTAGCGGGGT 9900TACAATCAGC CAAGTTATTA CACCCTTATT TTACAGTCCA AAACCGCAGG GCGGCGTGTG 9960GGGGCTGACG CGTGCCCCCA CTCCACAATT TCAAAAAAAA GAGTGGCCAC TTGTCTTTGT 10020TTATGGGCCC CATTGGCGTG GAGCCCCGTT TAATTTTCGG GGGTGTTAGA GACAACCAGT 10080GGAGTCCGCT GCTGTCGGCG TCCACTCTCT TTCCCCTTGT TACAAATAGA GTGTAACAAC 10140ATGGTTCACC TGTCTTGGTC CCTGCCTGGG ACACATCTTA ATAACCCCAG TATCATATTG 10200CACTAGGATT ATGTGTTGCC CATAGCCATA AATTCGTGTG AGATGGACAT CCAGTCTTTA 10260CGGCTTGTCC CCACCCCATG GATTTCTATT GTTAAAGATA TTCAGAATGT TTCATTCCTA 10320CACTAGTATT TATTGCCCAA GGGGTTTGTG AGGGTTATAT TGGTGTCATA GCACAATGCC 10380ACCACTGAAC CCCCCGTCCA AATTTTATTC TGGGGGCGTC ACCTGAAACC TTGTTTTCGA 10440GCACCTCACA TACACCTTAC TGTTCACAAC TCAGCAGTTA TTCTATTAGC TAAACGAAGG 10500AGAATGAAGA AGCAGGCGAA GATTCAGGAG AGTTCACTGC CCGCTCCTTG ATCTTCAGCC 10560ACTGCCCTTG TGACTAAAAT GGTTCACTAC CCTCGTGGAA TCCTGACCCC ATGTAAATAA 10620AACCGTGACA GCTCATGGGG TGGGAGATAT CGCTGTTCCT TAGGACCCTT TTACTAACCC 10680TAATTCGATA GCATATGCTT CCCGTTGGGT AACATATGCT ATTGAATTAG GGTTAGTCTG 10740GATAGTATAT ACTACTACCC GGGAAGCATA TGCTACCCGT TTAGGGTTAA CAAGGCGGCC 10800TTATAAACAC TATTGCTAAT GCCCTCTTGA GGGTCCGCTT ATCGGTAGCT ACACAGGCCC 10860CTCTGATTGA CGTTGGTGTA GCCTCCCGTA GTCTTCCTGG GCCCCTGGGA GGTACATGTC 10920CCCCAGCATT GGTGTAAGAG CTTCAGCCAA GAGTTACACA TAAAGGCAAT GTTGTGTTGC 10980AGTCCACAGC ATGCAAAGTC TGCTCCAGGA TGAAAGCCAC TCAGTGTTGG CAAATGTGCA 11040CATCCATTTA TAAGGATGTC AACTACAGTC AGAGAACCCC TTTGTGTTTG GTCCCCCCCC 11100GTGTCACATG TGGAACAGGG CCCAGTTGGC AAGTTGTACC AACCAACTGA AGGGATTACA 11160TGCACTGCCC CGAATACAAA ACAAAAGCGC TCCTCGTACC AGCGAAGAAG GGGCAGAGAT 11220GCCGTAGTCA GGTTTAGTTC GTCCGGCGGC GGGGC 11255二、pMD18-T-VP1序列(下排)與Genbank中l(wèi)izuka序列(上排)比較Lizuka.N CCTTTTATAA GACAAGACAA TTTTTACCAGLHB1446TAAAACGAC GGCCAGTGCCAAGCTTGCAT GCCTGCAGGT CGACGATTAGHind IIII Pst I
1GGCCCAGTGG AAGAATCGGT GGAACGCGCC ATGGTGCGCG TGGCTGATAC1ATGCCAGTGG AAGAATCGGT GGAACGCGCC ATGGTGCGCG TGGCTGATAC51 GGTCAGCTCA AAGCCTACGA ATTCAGAATC CATCCCCGCC CTCACTGCTG51 GGTCAGCTCA AAGCCTACGA ATTCAGAATC CATCCCCGCC CTCACTGCTG101 CGGAGACTGG TCATACCTCT CAAGTCGTAC CCAGTGACAC CATGCAAACT101 CGGAGACTGG TCATACCTCT CAAGTCGTAC CCAGTGACAC CATGCAAACT151 AGACACGTGA AGAATTACCA CTCAAGGTCG GAATCTTCCA TTGAAAATTT151 AGACACGTGA AGAATTACCA CTCAAGGTCG GAATCTTCCA TTGAAAATTT201 CTTGTGCCGA TCTGCTTGTG TGTATTACGC CACCTACA T AATAATTCTG201 CTTGTGCCGA TCTGCTTGTG TGTATTACGC CACCTACA T AATAATTCTG251 AGAAGGGCTA CGCAGAGTGG GTTATCAACA CCAGGCAGGT TGCGCAGTTG251 AGAAGGGCTA CGCAGAGTGG GCTATCAACA CCAGGCAGGT TGCGCAGTTG301 CTGAGGAGGA AACTAGAGTT CACTTACTTA AGGTTCGATC TGGAATTGAC301 AGGAGGAAAC TAGAGCTGTT CACTTACTTA AGGTTCGATC TGGAATTGAC351 ATTTGTGATA ACAAGTGCCC AG AGCCCAG TACOGCTACC AGTGTAGACG351 ATTTGTGATA ACAAGTGCCC AG AGCCCAG TACCGCTACC AGTGTAGACG401 CACCTGTACA AACCCAACAG ATAATGTATG TGCCTCCAGG CGGGCCGGTA401 CACCTGTACA AACCCA CAG ATAATGTATG TGCCTCCAGG CGGGCCGGTA451 CCTACCAAGG TTACAGACTA CGCCTGGCAA ACATCCACAA ACCCCAGCGT451 CCTACCAAGG TTACAGACTA CGCCTGGCAA ACATCCACAA ACCCCAGCGT501 CTTTTGGACA GAGGGGAATG CCCCACCGAG GATGTCTATT CCCTTCATCA501 CTTTTGGACA GAGGGGAATG CCCCACCGAG GATGTCTATT CCCTTCATCA551 GTATTGGAAA TGCTTATAGC TGCTTTTATG ATGGATGGAC ACAGTTCTCT551 GTATTGGAAA TGCTTATAGC TGCTTTTATG ATGGATGGAC ACAGTTCTCT601 AGGAATGGGG TTTACGGCAT TAATACCCTG AACAACATGG GTACGCTGTA601 AGGAATGGGG TTTACGGCAT TAATACCCTG AACAACATGG GTACGCTGTA651 CATGCGGCAC GTAAATGAGG CAGGCCAAGG CCCGATCAAA AGTACAGTTA651 CATGCGGCAC GTAAATGAGG CAGGCCAAGG CCCGATCAAA AGTACAGTTA701 GAATATATTT TAAACCCAAA CATGTGAAGG CGTGGGTGCC CAGACCGCCG701 GAATATATTT TAAACGCAAA CATGTGAAGG CGTGGGTGCC CAGACCGCOG751 AGGCTATGTC AATATGAGAA GCAAAAGAAT GTTAATTTCA ACCCAACAGG75l AGGCTATGTC AATATGAGAA GCAAAAGAAT GTTAATTTCA ACCCAACAGG801 AGTCACCACA ACGCGCTCAA ACATTACCAC AACC801 AGTCACCACA ACGCGCTCAA ACATTACCAC AATCTAGACG AATCTCTAGAXba I Xba I85l GGATCCCCGG GTACCGAGCT CGAATTCGTA ATCATGGTCA TAGCTBamH I Kpn I三、pCEP4-VP1的DNA序列
KpnINhe Himd III1AAGCTGGGTA CCAGCTGCTA GCAAGGTT 51 AGATGCCAGT GGAAGAATCG GTGGAACGCG CCATGGTGCG CGTGGCTGAT101 ACGGTCAGCT CAAAGCCTAC GAATTCAGAA TCCATCCCCG CCCTCACTGC151 TGCGGAGACT GGTCATACCT CTCAAGTCGT ACCCAGTGAC ACCATGCAAA201 CTAGACACGT GAAGAATTAC CACTCAAGGT CGGAATCTTC CATTGAAAAT251 TTCTTGTGCC GATCTGCTTG TGTGTATTAC GCCACCTACA CTAATAATTC301 TGAGAAGGGC TACGCAGAGT GGGCTATCAA CACCAGGCAG GTTGCGCAGT351 TGAGGAGGAA ACTAGAGCTG TTCACTTACT TAAGGTTCGA TCTGGAATTG401 ACATTTGTGA TAACAAGTGC CCAGCAGCCC AGTACCGCTA CCAGTGTAGA451 CGCACCTGTA CAAACCCACC AGATAATGTA TGTGCCTCCA GGCGGGCCGG501 TACCTACCAA GGTTACAGAC TACGCCTGGC AAACATCCAC AAACCCCAGC551 GTCTTTTGGA CAGAGGGGAA TGCCCCACCG AGGATGTCTA TTCCCTTCAT601 CAGTATTGGA AATGCTTATA GCTGCTTTTA TGATGGATGG ACACAGTTCT651 CTAGGAATGG GGTTTACGGC ATTAATACCC TGAACAACAT GGGTACGCTG701 TACATGCGGC ACGTAAATGA GGCAGGCCAA GGCCCGATCA AAAGTACAGT751 TAGAATATAT TTTAAACCCA AACATGTGAA GGCGTGGGTG CCCAGACCGC801 CGAGGCTATG TCAATATGAG AAGCAAAAGA ATGTTAATTT CAACCCAACA851 GGAGTCGCCA CAACGCGCTC AAACATTACC ACAATCTAGA CGAATCTCTA901 GAGGATCCAG ACAT XbaI XbaIBamH I
權(quán)利要求
1.柯薩奇病毒B組1型基因疫苗，其特征在于它是由CVB1編碼主要中和抗原的VP1基因和作為真核表達(dá)載體的質(zhì)粒pCEP4組成的pCEP4-CVB1VP1質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柯薩奇病毒B組1型基因疫苗，其特征在于pCEP4-CVB1VP1的DNA序列為TCTAGAGTCGACCGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCCGGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCCACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCCTCTAGAGATTCGTCTAGATTGTGGTAATGTTTGAGCGCGTTGTGGCGACTCCTGTTGGGTTGAAATTAACATTCTTTTGCTTCTCATATTGACATAGCCTCGGCGGTCTGGGCACCCACGCCTTCACATGTTTGGGTTTAAAATATATTCTAACTGTACTTTTGATCGGGCCTTGGCCTGCCTCATTTACGTGCCGCATGTACAGCGTACCCATGTTGTTCAGGGTATTAATGCCGTAAACCCCATTCCTAGAGAACTGTGTCCATCCATCATAAAAGCAGCTATAAGCATTTCCAATACTGATGAAGGGAATAGACATCCTCGGTGGGGCATTCCCCTCTGTCCAAAAGACGCTGGGGTTTGTGGATGTTTGCCAGGCGTAGTCTGTAACCTTGGTAGGTACCGGCCCGCCTGGAGGCACATACATTATCTGGTGGGTTTGTACAGGTGCGTCTACACTGGTAGCGGTACTGGGCTGCTGGGCACTTGTTATCACAAATGTCAATTCCAGATCGAACCTTAAGTAAGTGAACAGCTCTAGTTTCCTCCTCAACTGCGCAACCTGCCTGGTGTTGATAGCCCACTCTGCGTAGCCCTTCTCAGAATTATTAGTGTAGGTGGCGTAATACACACAAGCAGATCGGCACAAGAAATTTTCAATGGAAGATTCCGACCTTGAGTGGTAATTCTTCACGTGTCTAGTTTGCATGGTGTCACTGGGTACGACTTGAGAGGTATGACCAGTCTCCGCAGCAGTGAGGGCGGGGATGGATTCTGAATTCGTAGGCTTTGAGCTGACCGTATCAGCCACGCGCACCATGGCGCGTTCCACCGATTCTTCCACTGGCATCTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGCTAGCAGCTGGTACCCAGCTTCTAGAGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCACCGTACACGCCTACCGCCCATTTGCGTCAACGGGGCGGGGTTATTACGACATTTTGGAAAGTCCCGTTGATTTTGGTGCCAAAACAAACTCCCATTGACGTCAATGGGGTGGAGACTTGGAAATCCCCGTGAGTCAAACCGCTATCCACGCCCATTGGTGTACTGCCAAAACCGCATCACCATGGTAATAGCGATGACTAATACGTAGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCGTAAGGTCATGTACTGGGCATAATGCCAGGCGGGCCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGGACTTGGCATATGATACACTTGATGTACTGCCAAGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCCATTGACGTCAATGGAAAGTCCCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTCAATAATCAATGTCAACATGGCGGTCATATTGGACATGAGCCAATATAAATGTACATATTATGATATAGATACAACGTATGCAATGGCCAATAGCCAATATTGATTTATGCTATATAACCAATGACTAATATGGCTAATTGCAACTATTGATTCAATGTATAGATCTTCCATACCTACCAGTTCTGCGCCTGCAGCAATGCAACAACGTTGCCCGGATCTGCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTGGTCGACTAGCTTGGCACGCCAGAAATCCGCGCGGTGGTTTTTGGGGGTCGGGGGTGTTTGGCAGCCACAGACGCCCGGTGTTCGTGTCGCGCCAGTACATGCGGTCCATGCCCAGGCCATCCAAAAACCATGGGTCTGTCTGCTCAGTCCAGTCGTGGACCAGACCCCACGCAACGCCCAAAATAATAACCCCCACGAACCATAAACCATTCCCCATGGGGGACCCCGTCCCTAACCCACGGGGCCAGTGGCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTGGGGGGTGGGGTGGGGAAAAGGAAGAAACGCGGGCGTATTGGCGCCAATGGGGTCTCGGTGGGGTATCGACAGAGTGCCAGCCCTGGGACCGAACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAACACCCGTGCGTTTTATTCTGTCTTTTTATTGCCGTCATAGCGCGGGTTCCTTCCGGTATTGTCTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCCCCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGTCCAGACGGCCGCGCTTCTGCGGGCGATTTGTGTACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGACGATTGCGTCGCATCGACCCTGCGCCCAAGCTGCATCATCGAAATTGCCGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTGGTCAAGACCAATGCGGAGCATATACGCCCGGAGCCGCGGCGATCCTGCAAGCTCCGGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTCCAGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGCACGAGGTGCCGGACTTCGGGGCAGTCCTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCGAGAGCCTGCGCGACGGACGCACTGACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCAGCAATCGCGCATATGAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCCCTCGTCTGGCTAAGATCGGCCGCAGCGATCGCATCCATGGCCTCCGCGACCGGCTGCAGAACAGCGGGCAGTTCGGTTTCAGGCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATGCAATAGGTCAGGCTCTCGCTGAATTCCCCAATGTCAAGCACTTCCGGAATCGGGAGCGCGGCCGATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGCTATTTACCCGCAGGACATATCCACGCCCTCCTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGATTCTTCGCCCTCCGAGAGCTGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAACTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTCATATCTCATTGCCCGGGATCTGCGGCACGCTGTTGACGCTGTTAAGCGGGTCGCTGCAGGGTCGCTCGGTGTTCGAGGCCACACGCGTCACCTTAATATGCGAAGTGGACCTGGGACCGCGCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAAGCAGGGGATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAAC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全文摘要
柯薩奇病毒B組1型基因疫苗，它涉及一種預(yù)防柯薩奇病毒感染的疫苗。針對(duì)現(xiàn)有疫苗存在免疫原性差、安全性差的不足，本發(fā)明提供一種CVB1病毒基因疫苗，它是一種由CVB1編碼主要中和抗原的VP1基因和作為真核表達(dá)載體的質(zhì)粒pCEP4組成的pCEP4－CVB1VP1質(zhì)粒。與傳統(tǒng)疫苗相比，本發(fā)明的基因疫苗有下列優(yōu)點(diǎn)直接DNA接種，避免了傳統(tǒng)疫苗抗原制備純化等繁瑣過程；免疫應(yīng)答完整持久，基因免疫時(shí)抗原多肽的遞呈和自然感染時(shí)相似，以天然構(gòu)象被免疫系統(tǒng)識(shí)別，克服了其它疫苗抗原表位改變的缺點(diǎn)；基因疫苗具有共同的理化特征，可在同一質(zhì)粒嵌合多種目的基因，形成聯(lián)合免疫；基因疫苗制備簡便，成本低，安全穩(wěn)定，便于貯存和運(yùn)輸。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1772305SQ20051001047
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2005年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月25日
發(fā)明者田野, 鐘照華, 趙鐵強(qiáng), 王言, 肖建敏, 孟繁超 申請(qǐng)人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)