專利名稱：一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋pcr快速定量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及油田水系統(tǒng)中常規(guī)污水、含聚污水、地面工藝的水處理過程中硫酸鹽還原菌(SRB)的快速定量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
目前，油田系統(tǒng)內(nèi)SRB菌的計(jì)數(shù)主要執(zhí)行中國(guó)石油天然氣行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，“油田注入水細(xì)菌分析方法——絕跡稀釋法(MPN)”(部頒標(biāo)準(zhǔn))、SY-T0532-93。上述的這種方法存在的問題是檢測(cè)需要14天的時(shí)間，由于檢測(cè)周期較長(zhǎng)，不能有效的和即時(shí)的指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐，在實(shí)際操作過程中有些嚴(yán)格的厭氧SRB菌無法生存，導(dǎo)致SRB菌的記數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確，不能真實(shí)的反映生產(chǎn)實(shí)際情況，同時(shí)檢測(cè)費(fèi)用較高；并且由于現(xiàn)有檢測(cè)方法是以核酸DNA為模板，存在著記數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確的問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有的油田水質(zhì)SRB菌檢測(cè)中存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、不能真實(shí)全面的反應(yīng)水中的SRB菌的數(shù)量、不能即時(shí)的指導(dǎo)生產(chǎn)、檢測(cè)費(fèi)用較高的問題，從而提供一種記數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確、可有效的縮短計(jì)數(shù)時(shí)間、真實(shí)的反映生產(chǎn)實(shí)際情況、降低檢測(cè)費(fèi)用的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測(cè)方法，它是以經(jīng)倍比稀釋的硫酸鹽還原菌的菌體為模板直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。它依次包括以下步驟(1).制備菌體前處理緩沖液；(2).菌體的制備；(3).倍比稀釋；(4).進(jìn)行冰上的PCR操作；(5).PCR在擴(kuò)增儀上的擴(kuò)增；(6).1.0％的瓊脂糖電泳檢測(cè)；(7).結(jié)果觀察，查表記數(shù)；所述“(4).進(jìn)行冰上的PCR操作”過程中的PCR反應(yīng)體系為20μl包括Buffer(10×)2μl、0.3mmol·L-1的d NTP 2μl、濃度為0.1μmol·L-1的正向引物SRBF 1μl、濃度為0.1μmol·L-1的反向引物SRBR 1μl，rTaq酶0.3U，其余加去離子水11.7μl，然后加2μl的樣品。本發(fā)明方法針對(duì)硫酸鹽還原菌特意性引物，采用PCR的擴(kuò)增方法，直接以菌體為模板，具有記數(shù)更加準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)；由于可以精確到一個(gè)菌體，所以有效的縮短了計(jì)數(shù)時(shí)間，整個(gè)發(fā)明從做樣到出結(jié)果只需要四個(gè)小時(shí)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于14天的記數(shù)時(shí)間。由于真實(shí)的表證了水樣的實(shí)際的SRB菌的數(shù)量，準(zhǔn)確的反應(yīng)了當(dāng)時(shí)生產(chǎn)實(shí)際情況，所以可以直接有效的指導(dǎo)生產(chǎn)，降低了檢測(cè)費(fèi)用，利于推廣應(yīng)用。


圖1是應(yīng)用五管平行法計(jì)數(shù)1至4梯度電泳圖譜，圖2是應(yīng)用五管平行法計(jì)數(shù)5至7梯度電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式為一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測(cè)方法，它依次包括以下步驟(1).制備菌體前處理緩沖液；(2).菌體的制備；(3).倍比稀釋；(4).進(jìn)行冰上的PCR操作；(5).PCR在擴(kuò)增儀上的擴(kuò)增；(6).1.0％的瓊脂糖電泳檢測(cè)；(7).結(jié)果觀察，查表記數(shù)；所述“(4).進(jìn)行冰上的PCR操作”過程中的PCR反應(yīng)體系為20μl包括Buffer(10×)2μl、0.3mmol·L-1的d NTP 2μl、濃度為0.1μmol·L-1的正向引物SRBF 1μl、濃度為0.1μmol·L-1的反向引物SRBR 1μl，rTaq酶0.3U，其余加去離子水11.7μl，然后加2μl的樣品。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式的詳細(xì)操作過程依次如下(1).制備菌體前處理緩沖液“菌體前處理緩沖液”的母液成分為70gNaCi、2g Kci、12g Na2HPO4、2g KH2PO4、1‰ SDS；將母液稀釋10倍成為菌體前處理緩沖液；控制工作液的pH為7.5，在121℃條件下滅菌15～30min后即可。
(2).菌體的制備依次包括以下步驟a.菌體的制備在超凈工作臺(tái)下完成，需要先將超凈工作臺(tái)進(jìn)行紫外線滅菌20～40min，然后將用含有高純氮?dú)獾膮捬豕苋』氐挠吞镂鬯乃畼?，或生物反?yīng)器的污泥，取1mL注入到經(jīng)滅菌的1.5mL的離心管中；b.對(duì)油田污水的水樣在震蕩器上充分震蕩3～6min，對(duì)生物反應(yīng)器的污泥在震蕩器上充分震蕩10～5min，13000r/min離心1min；從管中輕輕的棄上清液0.9mL；c.在剩余的0.1mL中加入“菌體前處理緩沖液”0.9mL，對(duì)油田污水的水樣在震蕩器上充分震蕩3～6min，對(duì)生物反應(yīng)器的污泥在震蕩器上充分震蕩10～15min；d.13000r/min離心2min，棄上清液0.98mL，充分震蕩2min。
(3).倍比稀釋倍比稀釋在冰上進(jìn)行，具體操作過程如下吸取2μl(2)步驟得到的菌體加入用于倍比稀釋的管中，加入18μl的去離子水，得稀釋液；然后再?gòu)南♂尮苤腥?μl稀釋液加入另一個(gè)稀釋管中繼續(xù)稀釋，最終水樣被稀釋十倍；重復(fù)上述過程，直至稀釋液中無SRB。
(4).進(jìn)行冰上的PCR操作操作過程采用三管平行法，每個(gè)梯度3個(gè)或5個(gè)樣。PCR反應(yīng)體系為20μl包括Buffer(10×)2μl、0.3mmol·L-1的d NTP 2μl、濃度為0.1μmol·L-1的正向引物SRBF1μl、濃度為0.1μmol·L-1的反向引物SRBR 1μl，rTaq酶0.3U，其余加去離子水11.7μl，然后加2μl的樣品。其中，正向引物SRBF的硫酸鹽還原菌特意性探針的堿基組成為5’-CCTGACGCAGCGACGCCG-3’，共18bp；反向引物SRBR的硫酸鹽還原菌特意性探針的堿基組成為5’-CTACCAGGGTATCTAATCC-3’，共19bp。
(5).PCR在擴(kuò)增儀上的擴(kuò)增操作程序?yàn)?4℃預(yù)熱5min，94℃變性30s，58.8℃復(fù)性45s，72℃延伸90s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。
(6).擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0％的瓊脂糖電泳檢測(cè)；需要一個(gè)半小時(shí)。
(7).結(jié)果觀察，查表記數(shù)。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式用含有高純氮?dú)獾膮捬豕苋』氐挠吞镂鬯鳈z測(cè)樣，采用五管平行法進(jìn)行冰上PCR操作，每個(gè)梯度5個(gè)樣。1.0％的瓊脂糖電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1、圖2所示。進(jìn)行結(jié)果觀察，查表記數(shù)。
具體查表計(jì)算方法是選擇后三個(gè)連續(xù)稀釋梯度(10x、10x+1、10x+2)，將有菌體DNA條帶出現(xiàn)的管數(shù)按稀釋梯度由小到大的順序排列成一個(gè)三位數(shù)稱之為條帶近似值(abc)。其中，第一個(gè)稀釋梯度(10x)是最后一個(gè)5個(gè)試管中都有菌體DNA條帶出現(xiàn)的稀釋梯度，如果第三個(gè)稀釋梯度(10x+2)再往下的梯度稀釋管仍有菌體DNA條帶出現(xiàn)，可將此管數(shù)加到第三個(gè)稀釋梯度(10x+2)上。然后查閱哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社2002年出版的《污染控制微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》32-38頁“每毫升稀釋液的細(xì)菌近似值表”得出對(duì)應(yīng)數(shù)值，計(jì)算出1mL檢測(cè)樣中反硝化細(xì)菌的總數(shù)。計(jì)算公式如下1mL檢測(cè)樣中反硝化細(xì)菌的總數(shù)(個(gè))＝條帶近似值(abc)表中對(duì)應(yīng)數(shù)值×三個(gè)稀釋梯度中第一個(gè)稀釋梯度的稀釋倍數(shù)(10x)×10×102％；本實(shí)施方式選擇104、105、106三個(gè)稀釋梯度，條帶近似值(510)，查閱哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社2002年出版的《污染控制微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》32-38頁“每毫升稀釋液的細(xì)菌近似值表”得出其對(duì)應(yīng)數(shù)值13.5。
從而得出本實(shí)施方式中1mL檢測(cè)樣中反硝化細(xì)菌的總數(shù)(個(gè))＝條帶近似值(510)×104×10×102％＝13.5×104×10×102％＝1.377×106(個(gè))。
三管平行法記錄的結(jié)果無論在檢測(cè)樣濃度低或高的情況下，數(shù)量級(jí)上與五管平行法無差別。本實(shí)施方式結(jié)果表明，采用五管平行法可以精確到一個(gè)菌體，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，置信度大于99％。
試驗(yàn)驗(yàn)證，采用五管平行法記數(shù)的結(jié)果與用硫酸鹽還原菌細(xì)菌檢測(cè)試劑瓶(北京華興化學(xué)試劑廠)14天的記數(shù)結(jié)果相比數(shù)量級(jí)上平均大102，更能反應(yīng)水樣中實(shí)際的SRB菌的數(shù)量。
另外，本發(fā)明操作過程中所采用各成分的具體體積數(shù)值只在于表示相互間的比例關(guān)系，其在實(shí)際應(yīng)用中不限于該數(shù)值的使用，只要符合相互間的比例關(guān)系即可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，所以都應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)；同時(shí)，由于在檢測(cè)過程中有許可誤差的存在，本發(fā)明所提到的數(shù)值也只是具有指導(dǎo)性的意義，所以在實(shí)際應(yīng)用中只要使用了本發(fā)明所述過程的檢測(cè)方法，即應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測(cè)方法，其特征在于它依次包括以下步驟(1).制備菌體前處理緩沖液；(2).菌體的制備；(3).倍比稀釋；(4).進(jìn)行冰上的PCR操作；(5).PCR在擴(kuò)增儀上的擴(kuò)增；(6).1.0％的瓊脂糖電泳檢測(cè)；(7).結(jié)果觀察，查表記數(shù)；所述“(4).進(jìn)行冰上的PCR操作”過程中的PCR反應(yīng)體系為20μl包括Buffer(10×)2μl、0.3mmol·L-1的d NTP 2μl、濃度為0.1μmol·L-1的正向引物SRBF1μl、濃度為0.1μmol·L-1的反向引物SRBR1μl，rTaq酶0.3U，其余加去離子水11.7μl，然后加2μl的樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測(cè)方法，其特征在于正向引物SRBF的硫酸鹽還原菌特意性探針的堿基組成為5’-CCTGACGCAGCGACGCCG-3’，共18bp；反向引物SRBR的硫酸鹽還原菌特意性探針的堿基組成為5’-CTACCAGGGTATCTAATCC-3’，共19bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測(cè)方法，其特征在于“(2).菌體的制備”過程依次包括以下步驟a.將用含有高純氮?dú)獾膮捬豕苋』氐挠吞镂鬯乃畼?，或生物反?yīng)器的污泥，取1mL注入到經(jīng)滅菌的1.5mL的離心管中；b.對(duì)油田污水的水樣在震蕩器上充分震蕩3～6min，對(duì)生物反應(yīng)器的污泥在震蕩器上充分震蕩10～15min，13000r/min離心1min；從管中輕輕的棄上清液0.9mL；c.在剩余的0.1mL中加入“菌體前處理緩沖液”0.9mL，對(duì)油田污水的水樣在震蕩器上充分震蕩3～6min，對(duì)生物反應(yīng)器的污泥在震蕩器上充分震蕩10～15min；d.13000r/min離心2min，棄上清液0.98mL，充分震蕩2min。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測(cè)方法，其特征在于(1).制備“菌體前處理緩沖液”過程中，“菌體前處理緩沖液”的母液成分為70g NaCi、2g Kci、12g Na2HPO4、2g KH2PO4、1‰SDS；將母液稀釋10倍成為菌體前處理緩沖液；控制工作液的pH為7.5，在121℃條件下滅菌15～30min后即可。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測(cè)方法，其特征在于菌體的制備在超凈工作臺(tái)下完成，需要先將超凈工作臺(tái)進(jìn)行紫外線滅菌20～40min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測(cè)方法，其特征在于(5).“PCR在擴(kuò)增儀上的擴(kuò)增”程序?yàn)?4℃預(yù)熱5min，94℃變性30s，58.8℃復(fù)性45s，72℃延伸90s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測(cè)方法，其特征在于(5).“PCR在擴(kuò)增儀上的擴(kuò)增”程序?yàn)?4℃預(yù)熱5min，94℃變性30s，58.8℃復(fù)性45s，72℃延伸90s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測(cè)方法，其特征在于(3).“倍比稀釋”過程要在冰上進(jìn)行且需要達(dá)到稀釋液中無SRB。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測(cè)方法，其特征在于倍比稀釋過程如下吸取2μl(2)步驟得到的菌體加入用于倍比稀釋的管中，加入18μl的去離子水，得稀釋液；然后再?gòu)南♂尮苤腥?μl稀釋液加入另一個(gè)稀釋管中繼續(xù)稀釋，最終水樣被稀釋十倍；重復(fù)上述過程，直至稀釋液中無SRB。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測(cè)方法，其特征在于“(4).進(jìn)行冰上的PCR操作”過程采用三管或五管平行法，每個(gè)梯度3個(gè)或5個(gè)樣。
全文摘要
一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測(cè)方法，涉及水處理過程中硫酸鹽還原菌(SRB)的定量檢測(cè)方法?，F(xiàn)在檢測(cè)方法存在檢測(cè)周期較長(zhǎng)、不能有效的和即時(shí)的指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐和檢測(cè)費(fèi)用較高等缺點(diǎn)。本發(fā)明依次包括以下步驟(1).制備“菌體前處理緩沖液”；(2).菌體的制備；(3).倍比稀釋；(4).進(jìn)行冰上的PCR操作；(5).PCR在擴(kuò)增儀上的擴(kuò)增；(6).擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0％的瓊脂糖電泳檢測(cè)；(7).結(jié)果觀察，查表記數(shù)。本發(fā)明所述方法記數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確、可有效的縮短計(jì)數(shù)時(shí)間、真實(shí)的反映生產(chǎn)實(shí)際情況、降低檢測(cè)費(fèi)用，利于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1769472SQ200510010459
公開日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者馬放, 魏利 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)