專利名稱：用于治療炎癥的脂肪醇和脂肪酸酯的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及抗炎藥，更具體地說，涉及用于治療免疫性炎癥的脂肪醇、其與C1-C6鏈烷酸的酯或脂肪酸和鏈烷二醇或甘油的酯。簡寫AA佐劑關(guān)節(jié)炎；CFA完全弗氏佐劑；EAE實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；GPSCH豚鼠脊髓勻漿；IFA不完全弗氏佐劑；OA油醇；PBS磷酸緩沖鹽溶液；SC皮下。
本發(fā)明背景炎癥通常分為三個階段急性炎癥、免疫反應(yīng)和慢性炎癥。急性炎癥是對組織損傷的最初反應(yīng)，由釋放的組胺、血清素、舒激肽、前列腺素和白三烯介導(dǎo)。當(dāng)免疫活性細(xì)胞在外來生物或急性或慢性炎癥反應(yīng)過程中釋放的抗原物質(zhì)作用下激活時出現(xiàn)免疫反應(yīng)，其通常在急性炎癥階段之后。宿主免疫反應(yīng)的結(jié)果可能是有益的，因?yàn)槠涫谷肭稚锉煌淌苫蛑泻汀５?，如果免疫反?yīng)導(dǎo)致慢性炎癥而沒有終止正在經(jīng)受的損傷過程，如同類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中出現(xiàn)的情況一樣，則結(jié)果就是有害的。
炎癥患者治療擬減輕疼痛以及減緩或終止組織損傷過程，疼痛是炎癥患者的癥狀和持續(xù)主訴。
抗炎藥通常分為甾體類或糖皮質(zhì)激素抗炎藥和非甾體類抗炎藥(NSAID)。糖皮質(zhì)激素是強(qiáng)抗炎藥物，但與慢性皮質(zhì)甾體類治療相關(guān)的高毒性限制了其使用，只是用于治療某些急性炎癥性疾病。因此，非甾體類抗炎藥在慢性病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)治療中起主要作用。
非甾體類抗炎藥包括氨基芳基羧酸、芳基乙酸、芳基丁酸、芳基羧酸、芳基丙酸、吡唑、吡唑酮、水楊酸的衍生物以及一些其它不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的衍生物，包括抗關(guān)節(jié)炎/抗風(fēng)濕的特效藥。
已經(jīng)描述了某些脂肪醇和脂肪酸酯作為溶劑或乳化劑用于藥用組合物。例如，鯨蠟醇可作為乳化劑和硬化劑用于藥用組合物(TheMerck Index，第347-8頁，#2037)、油醇可用做藥物載體(The MerckIndex，第1222頁，#6900)以及油酸烷基酯可用做藥物溶劑(The MerckIndex，第6899頁，#6898)。
主要分離自蜂蠟的高級脂肪族伯醇混合物據(jù)述具有中等抗炎活性。這種混合物的組成沒有公開(Rodriguez等，1998)。
據(jù)述，用富含長鏈n-3多聚不飽和脂肪酸(PUFA)、二十碳五烯酸(205n-3)和二十二碳六烯酸(226n-3)的魚油喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室動物減輕了急性和慢性炎癥反應(yīng)，改善了對內(nèi)毒素和在自身免疫模型中的存活力，以及延長了移植器官的存活力，因此提示補(bǔ)充魚油在臨床上可能對急性和慢性炎癥性疾病和移植后有用(Calder，1998)。WO98/16216和US 6,331,568描述了治療精神分裂癥的包含二十碳五烯酸和/或十八碳四烯酸的藥用制劑。
修飾的多聚不飽和脂肪酸及其衍生物已提出用于藥用用途。WO99/27924和US 6,280,755描述了由亞甲基連接的抗炎脂肪酸，用于局部藥用和化妝用組合物。WO 97/38688和US 6,262,119描述了在?；挛换颚梦痪哂?或2個取代的基團(tuán)(選自氧和硫)的多聚不飽和脂肪酸，用于治療和改善T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。WO 99/58122和US6,365,628描述了其中1個或多個亞甲基被O、S、SO、SO2或Se取代的飽和脂肪酸及其烷基酯，用于治療或預(yù)防糖尿病。US 5,019,383描述了包含肽殘基的合成疫苗，所述肽殘基偶聯(lián)至一個或多個至少12個碳原子的烷基或烯基或其它烴類物質(zhì)，其中所述烷基或烯基可以為偶聯(lián)多功能基團(tuán)的一個或多個功能基團(tuán)的脂肪酸殘基，所述多功能基團(tuán)結(jié)合至所述肽殘基的N-末端氨基和/或C-末端羧基。
文獻(xiàn)中沒有描述分離的脂肪醇或其與鏈烷酸的酯自身可用作藥物，具體地說是沒有描述它們可參與炎癥的免疫調(diào)節(jié)。
本發(fā)明概述現(xiàn)在已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，按照本發(fā)明，某些長鏈脂肪醇、其與C1-C6鏈烷酸的酯、或長鏈脂肪酸和鏈烷二醇或甘油的某些酯可抑制大鼠實(shí)驗(yàn)性佐劑關(guān)節(jié)炎(AA)和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型的炎癥，并可預(yù)防小鼠的移植排斥。
本發(fā)明因此涉及治療炎癥(特別是免疫性炎癥)的藥用組合物，其包含選自以下的作為活性成分的免疫調(diào)節(jié)劑(a)飽和或順式不飽和C10-C20脂肪醇或其與C1-C6鏈烷酸的酯；(b)C2-C8鏈烷二醇或甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的單酯；和(c)甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的二酯。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及選自以下的免疫調(diào)節(jié)劑用于制備治療炎癥(特別是免疫性炎癥)的藥用組合物的用途(a)飽和或順式不飽和C10-C20脂肪醇或其與C1-C6鏈烷酸的酯；(b)C2-C8鏈烷二醇或甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的單酯；和(c)甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的二酯。
在再另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療炎癥性疾病(特別是免疫性炎癥)的方法，該方法包括按個體需要給予其有效量的選自以下的免疫調(diào)節(jié)劑(a)飽和或順式不飽和C10-C20脂肪醇或其與C1-C6鏈烷酸的酯；(b)C2-C8鏈烷二醇或甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的單酯；和(c)甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的二酯。
附圖簡述

圖1顯示了油醇(OA)對佐劑關(guān)節(jié)炎(AA)的劑量效應(yīng)作用。在誘生AA前14天皮下給予大鼠一次不同劑量的OA。
圖2圖示了患實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)并用油醇治療的Lewis大鼠的疾病進(jìn)程。在誘生EAE前14天給予大鼠油醇。對照組用不完全弗氏佐劑(IFA)治療。
圖3圖示了患EAE并用IFA治療的Lewis大鼠的疾病進(jìn)程。在誘生EAE前14天給予大鼠IFA。對照組未進(jìn)行治療。
本發(fā)明詳述本發(fā)明提供選自以下的免疫調(diào)節(jié)劑(a)飽和或順式不飽和C10-C20脂肪醇或其與C1-C6鏈烷酸的酯；(b)C2-C8鏈烷二醇或甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的單酯；和(c)甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的二酯。
按照本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，所述藥用組合物包含長鏈飽和或不飽和C10-C20脂肪醇，優(yōu)選C16-C20脂肪醇，最優(yōu)選C18脂肪醇。
按照本發(fā)明可使用的C10-C20飽和脂肪醇的實(shí)例包括但不限于癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇和優(yōu)選的鯨蠟醇(也稱作棕櫚醇)。
按照本發(fā)明的不飽和脂肪醇優(yōu)選具有一個或多個順式雙鍵和16-18個碳原子，可以為但不限于油醇(順式-9-十八碳烯醇)、亞油醇(順式-9，12-十八碳二烯醇)、γ-亞麻仁醇(順式-6，9，12-十八碳三烯醇)和亞麻仁醇(順式-9，12，15-十八碳三烯醇)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于本發(fā)明組合物的脂肪醇為鯨蠟醇、亞麻仁醇或最優(yōu)選的油醇。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包含以上定義的脂肪醇和C1-C6鏈烷酸(例如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸)的酯。
在再一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包含飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸和醇(選自C2-C8鏈烷二醇或甘油)的酯，所述酯為所述脂肪酸與所述C2-C8鏈烷二醇或甘油的單酯或所述脂肪酸與甘油的二酯。
C10-C20脂肪酸優(yōu)選為C16-C20脂肪酸，最優(yōu)選為C18脂肪酸。在一個實(shí)施方案中，所述C10-C20脂肪酸是飽和脂肪酸，例如但不限于癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸和花生酸。在另一個實(shí)施方案中，所述C10-C20脂肪酸是順式不飽和脂肪酸，例如但不限于棕櫚烯酸(順式-9-十六碳烯酸)、油酸(順式-9-十八碳烯酸)、順式-異油酸(順式-11-十八碳烯酸)、亞油酸(順式-9，12-十八碳二烯酸)、γ-亞麻酸(順式-6，9，12-十八碳三烯酸)、亞麻酸(順式-9，12，15-十八碳三烯酸)和花生四烯酸(順式-5，8，11，14-二十碳四烯酸)。
按照本發(fā)明，鏈烷二醇具有2-8個碳原子，優(yōu)選具有2-4個碳原子，更優(yōu)選具有2個碳原子，其選自但不限于1，3-丙二醇、1，4-丁二醇和優(yōu)選的1，2-乙二醇。這種酯的一個實(shí)例是1，2-乙二醇一油酸酯。
按照本發(fā)明的另一個實(shí)施方案，所述藥用組合物的活性成分為甘油和長鏈脂肪酸的單酯或二酯。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，單酸甘油酯是甘油一油酸酯。雙酸甘油酯包含一個自由羥基而另兩個羥基都可以與2個長鏈脂肪酸分子酯化(例如雙油酸甘油酯)，或者一個羥基與1個長鏈脂肪酸分子酯化，第二個羥基與C1-C6鏈烷酸(例如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸)酯化。
先天和獲得性免疫系統(tǒng)都參與調(diào)節(jié)每種類型的炎癥，而炎癥是傷口愈合、結(jié)締組織重建、血管生成、器官再生、神經(jīng)保護(hù)之類的過程以及在自身免疫、變態(tài)反應(yīng)、移植排斥和感染中觀察到的獲得性免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵因素(參見Cohen，2000；Schwartz and Cohen，2000)。因此，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的抗炎藥(例如上述的那些物質(zhì))對各種病癥都有用。
可用本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑治療的炎癥性疾病包括但不限于免疫性慢性或急性炎癥性疾病(選自自身免疫病、嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)、哮喘、移植排斥)，或者可用本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑治療慢性退行性疾病，如阿耳茨海默氏?。灰约坝糜谥委熒窠?jīng)保護(hù)、器官再生、皮膚慢性潰瘍和精神分裂癥。
可按照本發(fā)明治療的自身免疫病實(shí)例為多發(fā)性硬化癥或人類關(guān)節(jié)炎癥性疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Reiter綜合癥的反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)直性脊椎炎和其它由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。還考慮了其它自身免疫疾病，并按照所涉器官或組織見下文。因此，按照本發(fā)明，免疫性炎癥性疾病可為重癥肌無力、Guillain-Barré綜合癥和神經(jīng)系統(tǒng)其它炎癥性疾?。慌Ｆぐ_、尋常性天皰瘡和其它皮膚??；系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球性腎炎和其它腎臟疾??；動脈硬化和其它血管炎癥；自身免疫性肝炎、炎性腸病(例如Crohn病)、胰腺炎和其它胃腸系統(tǒng)病癥；I型糖尿病(胰島素依賴型糖尿病或IDDM)、自身免疫性甲狀腺炎(橋本氏甲狀腺炎)和其它內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。
一個用于測試本發(fā)明藥物抗炎活性的模型是佐劑關(guān)節(jié)炎(AA)，它是一種用結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的完全弗氏佐劑(CFA)溶液接種某些品系大鼠誘發(fā)的實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)病。這些大鼠出現(xiàn)其特征與人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相似的關(guān)節(jié)炎，因此用作人類關(guān)節(jié)炎癥性疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Reiter綜合癥的反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)直性脊椎炎和其它似乎由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎)的動物模型(Pearson，1964)。佐劑關(guān)節(jié)炎也作為免疫性炎癥(一般包括細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)、移植排斥和變態(tài)反應(yīng))的模型。例如，可抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療包括皮質(zhì)甾體類、環(huán)孢菌素A(Jaffee等，1989；Pollock等，1989)、咪唑硫嘌呤之類的免疫抑制劑和其它廣泛用于治療自身免疫病的免疫抑制劑。因此，一種治療劑抑制佐劑關(guān)節(jié)炎就表明該藥物是潛在有效的廣譜抗炎藥。
本發(fā)明提供的藥用組合物可為固體、半固體或液體形式，另外可包括藥學(xué)上可接受的填充劑、載體或稀釋劑以及其它惰性成分和賦形劑。所述組合物可通過任何合適的途徑給予，例如但不限于口服、局部或胃腸外(例如通過皮下注射、靜脈、肌內(nèi))或任何其它合適的途徑。因?yàn)樵S多化合物是油性的，所以它們優(yōu)選通過胃腸外給藥，更優(yōu)選皮下給藥。如果連續(xù)給藥，則本發(fā)明化合物通常分別以每天1-4次注射給藥，或用例如微型泵連續(xù)皮下輸注給藥。劑量取決于患者情況和病情嚴(yán)重性，按照主治醫(yī)師視為合適的劑量確定。
對于胃腸外給藥，所述化合物每種可以需要的純度、單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液或乳濁液)和藥學(xué)上可接受的載體混合配制，所述藥學(xué)上可接受的載體即是在使用的劑量和濃度對接受者無毒并可與制劑中的其它成分匹配。一般來說，通過使本發(fā)明的每種化合物與液體載體或精細(xì)固體載體或這二者均一而緊密地接觸，配制所述制劑。然后，如果有必要，將產(chǎn)品制作成需要的制劑。所述載體優(yōu)選為胃腸外載體，更優(yōu)選為與接受者血液等滲的溶液。所述載體溶媒的實(shí)例包括水、鹽水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。不揮發(fā)性油脂類的非水性溶媒以及脂質(zhì)體也可使用。這些制劑可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備，例如描述于“Remington藥物科學(xué)，A.R.Gennaro編輯，第17版，1985，Mack Publishing Company，Easton，PA，USA”中的方法。
現(xiàn)在通過以下的非限制性實(shí)施例闡述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1.油醇和其它藥物防佐劑關(guān)節(jié)炎(AA)的抗炎作用如文獻(xiàn)所述(Pearson，1956)用1mg/0.1ml滅活結(jié)核分枝桿菌(Sigma)的IFA(Sigma)溶液在尾根處接種近交8-10周齡Lewis大鼠(Harlan-Olac Limited，Blackthorn，Oxon，UK)，以誘發(fā)AA。觀察到12-14天后肢體出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎，如文獻(xiàn)所述(Holoshitz等，1983)分別對四肢炎癥嚴(yán)重性以0-4評分，求和得0-16的評分。通常在接種后26天左右觀察到關(guān)節(jié)炎發(fā)病高峰。
對照大鼠未治療或注射鹽水處理。通過將在誘發(fā)后第12天開始每隔一天腹腔給予皮質(zhì)甾類藥物地塞米松(200μg)進(jìn)行治療的大鼠組包括在內(nèi)，獲得免疫抑制的陽性對照。
在誘發(fā)AA前第14天或誘發(fā)AA后第12天皮下(SC)給予一次本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑(100μl)油醇、甘油單油酸酯、亞麻仁醇或鯨蠟醇)。如下計(jì)算炎癥最強(qiáng)日檢測的炎癥抑制百分比
發(fā)現(xiàn)全部4種化合物都有效，產(chǎn)生超過60％的炎癥抑制，而油酸沒有作用。結(jié)果概述于表1。
另兩個實(shí)驗(yàn)顯示500μl油醇(100μl相當(dāng)于約90mg油醇)抑制炎癥達(dá)96％和91％。
表1.各種藥物對佐劑關(guān)節(jié)炎炎癥的作用
實(shí)施例2.不同劑量油醇的抗AA作用為研究油醇對AA的劑量效應(yīng)作用，如以上實(shí)施例1所述，在誘發(fā)AA前14天皮下給予Lewis大鼠一次10、50、100或500mg劑量的油醇。
圖1顯示了油醇的劑量效應(yīng)作用。由圖可見，油醇劑量增加抑制關(guān)節(jié)炎。在發(fā)病高峰日第26天，炎癥抑制達(dá)14％(10μl)、61％(50μl)、78％(100μl)和90％(500μl)。
實(shí)施例3.油醇和其它免疫調(diào)節(jié)劑在DA大鼠中的抗炎作用及抗EAE保護(hù)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是用髓鞘堿性蛋白(MBP)或蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)的完全弗氏佐劑(CFA)溶液或用大鼠脊髓的CFA或不完全弗氏佐劑(IFA)乳濁液接種某些大鼠品系誘發(fā)的一種實(shí)驗(yàn)性自身免疫病。DA大鼠的EAE被看作是慢性EAE模型。兩至三周內(nèi)，大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘出現(xiàn)細(xì)胞浸潤，造成脫髓鞘和麻痹。大多數(shù)大鼠死亡，但其它大鼠癥狀不嚴(yán)重，一些大鼠出現(xiàn)慢性形式的EAE，類似于人類中的慢性反復(fù)發(fā)作型多發(fā)性硬化(MS)。因此，這些EAE大鼠用作人MS自身免疫病的模型。接種后大約12天大鼠出現(xiàn)EAE，其特征為由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥而產(chǎn)生不同程度的麻痹。在某些品系如Lewis大鼠中，麻痹可持續(xù)高達(dá)6-7天，大鼠通常痊愈，除非它們在其急性麻痹發(fā)病高峰期死亡。在其它品系如DA大鼠中，麻痹可以是慢性的和反復(fù)的。
為誘導(dǎo)和臨床評價EAE，將得自DA大鼠的脊髓凍融，并在接種前用刮刀徹底切碎。以1次皮下注射(剛好在皮膚下)將200μl乳濁液接種到大鼠的尾根部背側(cè)，所述乳濁液由1∶1的IFA(Difco，Detroit，MI，USA)和抗原(體積/重量，即100μl IFA/100mg全脊髓)制備或由1∶1的CFA(IFA補(bǔ)加4mg/ml的結(jié)核分枝桿菌菌株37RA)和抗原(體積/重量，即100μl CFA/100mg全脊髓)制備。所述乳濁液通過用氣密封玻璃注射器和1.2mm直徑針頭滴定制備。對大鼠定期稱重，并檢查其臨床EAE癥狀。使用4級評分評價臨床嚴(yán)重性0，無麻痹；1，尾無力(懸垂)；2，后肢麻痹；3，后肢和前肢麻痹；4，嚴(yán)重的全身麻痹(Lorentzen等，1995)。
用0.1ml含100mg DA全脊髓勻漿的IFA接種實(shí)驗(yàn)組(每組5或7只DA種屬的雌性大鼠，8-9周齡)大鼠的每個后爪墊，每只大鼠總共200mg。在接種當(dāng)天，通過SC注射油醇或其它本發(fā)明的藥物(100μl)或石蠟油(對照)治療所述大鼠。如上所述按照0-4的嚴(yán)重性評分對所述大鼠的EAE進(jìn)行評分。
實(shí)施例4.油醇在Lewis大鼠中的抗炎作用及抗EAE保護(hù)在Lewis大鼠中誘發(fā)的EAE被看作是腦急性炎癥的模型(與DA大鼠中的慢性病相反)。
為誘導(dǎo)EAE，如下制備3種凍干豚鼠脊髓勻漿(GPSCH)乳濁液(i)將25mg凍干GPSCH(GP2)懸浮在2.5ml無菌PBS(Sigma)中，并于37℃溫育1小時；(ii)將54.1mg結(jié)核分枝桿菌H37Ra(MT，Difco)懸浮在含1mg/ml MT的13.5ml CFA(Sigma)中，以獲得5mg/ml MT；(iii)將2.5ml CFA(5mg/ml MT)加入到裝有含25mg GPSCH的2.5mlPBS的小瓶中，以獲得5mg/ml的GPSCH和2.5mg/ml MT。將混合物轉(zhuǎn)移到玻璃注射器中，該注射器通過Luer鎖梁與第二個玻璃注射器連接。通過在約10分鐘內(nèi)由一個注射器轉(zhuǎn)移到另一個注射器充分混合所述物質(zhì)，直至所述物質(zhì)完全乳化。1mg/大鼠劑量的GPSCH和0.5mg/大鼠劑量的MT的CFA乳濁液在大鼠中誘導(dǎo)出EAE(基于先前的滴定)。
對于所述治療，在誘發(fā)EAE前14天用測試樣品(油醇或IFA)治療兩組各8只9-10周齡的Lewis大鼠(Harlan，Israel)。IFA治療組用作對照組。測試樣品以0.5mg/kg的劑量皮下注射1次。第三組的8只大鼠未進(jìn)行治療，用作非處理對照。
將0.1ml的GPSCH乳濁液的CFA溶液注射到大鼠每條后腿的爪墊中(每只大鼠0.2ml)，注射測試樣品14天后在全部3個組的大鼠中都誘發(fā)出EAE。
觀察EAE臨床癥狀，并在誘發(fā)EAE后第9天開始按照以下的5級臨床嚴(yán)重性評價評分對EAE臨床癥狀進(jìn)行評分，直至實(shí)驗(yàn)終止0，行為正常；1，體重下降；2，尾部無力；3，后腿張力減退和無力；4，后腿麻痹；4，嚴(yán)重全身麻痹；5，呼吸受損和/或痙攣和/或全身麻痹或死亡。具有1或以上評分的所有大鼠都認(rèn)為是患病。
如下進(jìn)行EAE結(jié)果計(jì)算(i)計(jì)算發(fā)病率將每組中病鼠的數(shù)目相加。如下計(jì)算發(fā)病率和有效性％
*＝(根據(jù)患病率)(ii)計(jì)算平均最大評分(MMS)將組別中每只大鼠的最大評分相加。如下計(jì)算所述組的平均最大評分(MMS)和有效性％ *＝(根據(jù)MMS的有效性％)(iii)計(jì)算組平均評分(GMS)將觀察階段的每只大鼠平均評分相加(5分是正向計(jì)數(shù))。如下計(jì)算組平均評分及其有效性％ *＝(根據(jù)GMS的有效性％)(iv)計(jì)算平均發(fā)病時間將組別中每只大鼠的發(fā)病時間(天數(shù))相加。計(jì)算各組的平均發(fā)病時間。那些沒有出現(xiàn)EAE的大鼠的發(fā)病時間定為25天(研究周期)。
(v)計(jì)算平均病程將各組中每只大鼠的病程(天數(shù))相加。計(jì)算各組的平均病程。未出現(xiàn)EAE的大鼠的病程定為0。
表2概述了對EAE臨床表現(xiàn)的評價，即％發(fā)病率、MMS、GMS、平均EAE病程和平均EAE發(fā)病時間。圖2和圖3(分別用油醇和IFA治療)提供了每組的疾病進(jìn)程圖。
如結(jié)果所示，觀察到IFA注射組和非處理對照組之間的發(fā)病率(62.5％-75％發(fā)病率)或平均最大評分(1.75-2.38MMS)基本沒有差異。油醇顯示對測試的全部臨床參數(shù)都有有益作用。相比于非處理對照組，根據(jù)組平均評分(GMS)，油醇表現(xiàn)出77.1％的有效性，根據(jù)平均最大評分(MMS)，油醇具有63％的有效性。油醇治療組的平均發(fā)病時間為18.6天，相比之下非處理對照組為15.5天。油醇治療組病程為2.0天，相比之下非處理對照組為5.13天。測試組EAE臨床癥狀持續(xù)時間在1-7天之間，只有IFA治療組的1只大鼠例外。IFA對大鼠EAE的作用即使有也很微小。測試組沒有觀測到死亡，只有非處理對照組有1只大鼠死亡。
表2EAE臨床評價結(jié)果
OA-油醇；NTC-非處理對照；NA-不適用實(shí)施例5.油醇對皮膚同種異體移植存活力的作用免疫系統(tǒng)強(qiáng)烈阻礙了異基因供體和受體之間器官和組織移植的成功。CD4+和CD8+T細(xì)胞都參與移植排斥。
基本如前(Birk等，1999)所述進(jìn)行皮膚移植。因此，給小鼠剃毛，由處死供體背側(cè)切下1cm2皮膚切片，并周PBS清洗。由麻醉受體(戊巴比妥6mg/ml，0.25ml/小鼠)切下2片各1cm2的背部皮膚，準(zhǔn)備用于異體移植。以每個受體兩塊供體的異體移植物移植到受體的背部移植區(qū)域。將氰丙烯酸丁酯(histoacryl)(B.Braun Melsungen AG，Melsungen，Germany)敷在移植部位周圍。將Nobecutan(ASTR，AstraTech，Glos G15，UK)噴在移植部位上。
在該實(shí)驗(yàn)中，6只8周齡BALB/c雌性小鼠的組別移植1cm2的8周齡C57BL/6雌性小鼠的完整厚度的皮膚移植物。在移植當(dāng)天，用石蠟油處理或用100μl油醇或另一種本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑皮下治療一組受體小鼠。記錄排斥發(fā)生日。免疫調(diào)節(jié)劑治療的小鼠的移植皮膚比非處理對照小鼠的移植皮膚存活時間長。
實(shí)施例6.預(yù)防和治療SLE系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種同時涉及自身抗體和免疫復(fù)合物的自身免疫病。為了測試本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑，可使用實(shí)驗(yàn)性SLE小鼠或自發(fā)出現(xiàn)非常象SLE的自身免疫病的(NZBxNZW)F1小鼠。
為了誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性SLE，用人或鼠抗-DNA單克隆抗體16/6Id(20μg/小鼠)的CFA溶液接種BALB/c小鼠的后爪墊，并在3周后用相同量免疫抗體的PBS溶液加強(qiáng)接種。然后測試所述小鼠的自身抗體產(chǎn)生情況以及實(shí)驗(yàn)性SLE的臨床表現(xiàn)特征。為了防止誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性SLE或治愈患SLE的小鼠，在接種之前或同時或接種后數(shù)周皮下(100μl/小鼠)給予小鼠油醇或另一種本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑。注射次數(shù)是基于測試化合物對疾病誘發(fā)和進(jìn)展的作用。對小鼠定期稱重，并如例如WO 96/30057所述檢查其SLE臨床癥狀。
實(shí)施例7.預(yù)防和治療自身免疫性甲狀腺炎對許多動物都可用甲狀腺球蛋白的CFA溶液接種誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性自身免疫甲狀腺炎(EAT)。體液抗體和TDTH細(xì)胞都對抗甲狀腺球蛋白的出現(xiàn)，導(dǎo)致甲狀腺炎。EAT似乎是最好的模擬性橋本氏甲狀腺炎。
如前所述(Rose等，1971)，通過給每只小鼠皮下注射得自一個甲狀腺的甲狀腺球蛋白提取物誘發(fā)EAT。提取物在IFA(DifcoLaboratories，Detroit，Mich.)中乳化，向其中加入7mg/ml的結(jié)核分枝桿菌H37Ra菌株(Difco Laboratories)。該注射在1周后重復(fù)1次。甲狀腺球蛋白提取物供體是C3H/eB種小鼠。4-5周后，通過取出受體小鼠的甲狀腺、將其在10％甲醛溶液然后在70％乙醇溶液中固定并檢測用蘇木精和曙紅染色的顯微鏡切片，評價EAT。對顯微鏡載玻片編號，并在沒有其身份信息的情況下對其進(jìn)行檢查。通過觀測至少一個由單核細(xì)胞浸潤的明確病灶進(jìn)行EAT診斷。通過在誘發(fā)EAT之前、同時或之后皮下注射油醇或另一種免疫調(diào)節(jié)劑(100μl/小鼠)進(jìn)行治療(對照小鼠注射石蠟油)，定期對小鼠稱重，并通過已知的常規(guī)方法檢查EAT臨床癥狀。
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權(quán)利要求
1.一種用于治療炎癥、特別是免疫性炎癥的藥用組合物，其包含作為活性成分的選自以下的免疫調(diào)節(jié)劑(a)飽和或順式不飽和C10-C20脂肪醇或其與C1-C6鏈烷酸的酯；(b)C2-C8鏈烷二醇或甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的單酯；和(c)甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的二酯。
2.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述活性成分是飽和C10-C20脂肪醇。
3.權(quán)利要求2的藥用組合物，其中所述飽和C10-C20脂肪醇選自癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鯨蠟醇和硬脂醇。
4.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述活性成分是順式不飽和C16-C18脂肪醇。
5.權(quán)利要求4的藥用組合物，其中所述順式不飽和C16-C18脂肪醇選自油醇、亞油醇、γ-亞麻仁醇和亞麻仁醇。
6.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述活性成分是飽和或順式不飽和C10-C20脂肪醇與C1-C6鏈烷酸的酯。
7.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述活性成分是飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸與C2-C8鏈烷二醇的單酯。
8.權(quán)利要求7的藥用組合物，其中所述鏈烷二醇選自1，2-乙二醇、1，3-丙二醇和1，4-丁二醇。
9.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述活性成分是飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸與甘油的單酯。
10.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述活性成分是飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸與甘油的二酯。
11.權(quán)利要求1和7-10任一項(xiàng)的藥用組合物，其中所述脂肪酸為飽和C10-C20脂肪酸。
12.權(quán)利要求11的藥用組合物，其中所述飽和脂肪酸選自癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸和花生酸。
13.權(quán)利要求1和7-10任一項(xiàng)的藥用組合物，其中所述脂肪酸為順式不飽和C10-C20脂肪酸。
14.權(quán)利要求13的藥用組合物，其中所述順式不飽和C10-C20脂肪酸選自棕櫚烯酸、油酸、順式-異油酸、亞油酸、γ-亞麻酸、亞麻酸和花生四烯酸。
15.權(quán)利要求14的藥用組合物，其中所述活性成分是甘油一油酸酯。
16.權(quán)利要求14的藥用組合物，其中所述活性成分是甘油二油酸酯。
17.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的藥用組合物，所述藥用組合物用于治療選自以下的免疫性慢性或急性炎癥性疾病自身免疫病、嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)、哮喘、移植排斥；或用于治療慢性退行性疾病，例如阿耳茨海默氏病以及神經(jīng)保護(hù)、器官再生、皮膚慢性潰瘍和精神分裂癥中的慢性退行性疾病。
18.權(quán)利要求17的藥用組合物，其中所述自身免疫病為多發(fā)性硬化病或人類關(guān)節(jié)病癥。
19.權(quán)利要求18的藥用組合物，其中所述人類關(guān)節(jié)病癥選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Reiter綜合癥的反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)直性脊椎炎和其它由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。
20.權(quán)利要求17的藥用組合物，其中所述免疫性炎癥疾病為重癥肌無力、Guillain-Barré綜合癥和其它神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾?。慌Ｆぐ_、尋常性天皰瘡和其它皮膚??；系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球性腎炎和其它腎臟疾病；動脈硬化和其它血管炎癥；自身免疫性肝炎、炎性腸病、胰腺炎和其它胃腸系統(tǒng)病癥；I型糖尿病、自身免疫性甲狀腺炎和其它內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。
21.免疫調(diào)節(jié)劑在制備用于治療炎癥、特別是免疫性炎癥的藥用組合物中的應(yīng)用，所述免疫調(diào)節(jié)劑選自(a)飽和或順式不飽和C10-C20脂肪醇或其與C1-C6鏈烷酸的酯；(b)C2-C8鏈烷二醇或甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的單酯；和(c)甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的二酯。
22.權(quán)利要求21的用途，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑為飽和C10-C20脂肪醇。
23.權(quán)利要求22的用途，其中所述飽和C10-C20脂肪醇選自癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鯨蠟醇和硬脂醇。
24.權(quán)利要求21的用途，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是順式不飽和C16-C18脂肪醇。
25.權(quán)利要求24的用途，其中所述順式不飽和C16-C18脂肪醇選自油醇、亞油醇、γ-亞麻仁醇和亞麻仁醇。
26.權(quán)利要求21的用途，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是飽和或順式不飽和C10-C20脂肪醇與C1-C6鏈烷酸的酯。
27.權(quán)利要求21的用途，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸與C2-C8鏈烷二醇的單酯。
28.權(quán)利要求27的用途，其中所述鏈烷二醇選自1，2-乙二醇、1，3-丙二醇和1，4-丁二醇。
29.權(quán)利要求21的用途，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的單酯。
30.權(quán)利要求21的用途，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的二酯。
31.權(quán)利要求21和27-30任一項(xiàng)的用途，其中所述脂肪酸為飽和C10-C20脂肪酸。
32.權(quán)利要求31的用途，其中所述飽和C10-C20脂肪酸選自癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸和花生酸。
33.權(quán)利要求21和27-30任一項(xiàng)的用途，其中所述脂肪酸為順式不飽和C10-C20脂肪酸。
34.權(quán)利要求33的用途，其中所述順式不飽和C10-C20脂肪酸選自棕櫚烯酸、油酸、順式異油酸、亞油酸、γ-亞麻酸、亞麻酸和花生四烯酸。
35.權(quán)利要求34的用途，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是甘油一油酸酯。
36.權(quán)利要求34的用途，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是甘油二油酸酯。
37.權(quán)利要求21-36任一項(xiàng)的用途，其中所述藥用組合物用于治療免疫性慢性或急性炎癥性疾病，所述炎癥性疾病選自自身免疫病、嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)、哮喘、移植排斥；或用于治療慢性退行性疾病，例如阿耳茨海默氏病；以及用于治療神經(jīng)保護(hù)、器官再生、皮膚慢性潰瘍和精神分裂癥。
38.權(quán)利要求37的用途，其中所述自身免疫病為多發(fā)性硬化病或人類關(guān)節(jié)病癥。
39.權(quán)利要求38的用途，其中所述人類關(guān)節(jié)病癥選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Reiter綜合癥的反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)直性脊椎炎和其它由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。
40.權(quán)利要求37的用途，其中所述免疫性炎癥性疾病為重癥肌無力、Guillain-Barré綜合癥和其它神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾?。慌Ｆぐ_、尋常性天皰瘡和其它皮膚病；系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球性腎炎和其它腎臟疾病；動脈硬化和其它血管炎癥；自身免疫性肝炎、炎性腸病、胰腺炎和其它胃腸系統(tǒng)病癥；I型糖尿病、甲狀腺炎和其它內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。
41.一種治療炎癥、特別是免疫性炎癥的方法，該方法包括給予其需要患者有效量的免疫調(diào)節(jié)劑，所述免疫調(diào)節(jié)劑選自(a)飽和或順式不飽和C10-C20脂肪醇或其與C1-C6鏈烷酸的酯；(b)C2-C8鏈烷二醇或甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的單酯；和(c)甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的二酯。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑為飽和C10-C12脂肪醇。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述飽和C10-C20脂肪醇選自癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鯨蠟醇和硬脂醇。
44.權(quán)利要求41的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是順式不飽和C16-C18脂肪醇。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述順式不飽和C16-C18脂肪醇選自油醇、亞油醇、γ-亞麻仁醇和亞麻仁醇。
46.權(quán)利要求41的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是飽和或順式不飽和C10-C20脂肪醇與C1-C6鏈烷酸的酯。
47.權(quán)利要求41的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸與C2-C8鏈烷二醇的單酯。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述鏈烷二醇選自1，2-乙二醇、1，3-丙二醇和1，4-丁二醇。
49.權(quán)利要求41的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的單酯。
50.權(quán)利要求41的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是甘油與飽和或順式不飽和C10-C20脂肪酸的二酯。
51.權(quán)利要求41和47-50任一項(xiàng)的方法，其中所述脂肪酸為飽和C10-C20脂肪酸。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述飽和C10-C20脂肪酸選自癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸和花生酸。
53.權(quán)利要求41和47-50任一項(xiàng)的方法，其中所述脂肪酸為順式不飽和C10-C20脂肪酸。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述順式不飽和C10-C20脂肪酸選自棕櫚烯酸、油酸、順式異油酸、亞油酸、γ-亞麻酸、亞麻酸和花生四烯酸。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是甘油一油酸酯。
56.權(quán)利要求54的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是甘油二油酸酯。
57.權(quán)利要求41-56任一項(xiàng)的方法，所述方法用于治療免疫性慢性或急性炎癥性疾病，所述炎癥性疾病選自自身免疫病、嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)、哮喘、移植排斥；或用于治療慢性退行性疾病，例如阿耳茨海默氏?。灰约坝糜谥委熒窠?jīng)保護(hù)、器官再生、皮膚慢性潰瘍和精神分裂癥。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述自身免疫病為多發(fā)性硬化病或人類關(guān)節(jié)病癥。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述人類關(guān)節(jié)病癥選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Reiter綜合癥的反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)直性脊椎炎和其它由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。
60.權(quán)利要求57的方法，其中所述免疫性炎癥性疾病為重癥肌無力、Guillain-Barré綜合癥和其它神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病；牛皮癬、尋常性天皰瘡和其它皮膚?。幌到y(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球性腎炎和其它腎臟疾病；動脈硬化和其它血管炎癥；自身免疫性肝炎、炎性腸病、胰腺炎和其它胃腸系統(tǒng)病癥；I型糖尿病、甲狀腺炎和其它內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。
全文摘要
用于治療炎癥(特別是免疫性炎癥，例如在自身免疫病中發(fā)生的炎癥)的免疫調(diào)節(jié)劑，其選自(a)飽和或順式不飽和C
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公開日2004年7月21日 申請日期2002年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月11日
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