專利名稱：治療組合物的制備的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有包含與寡核苷酸共價結(jié)合的多肽的結(jié)構(gòu)并且可用作免疫調(diào)節(jié)劑的新型化合物，所述化合物可用來治療各種病毒感染和免疫系統(tǒng)疾病。
2.相關(guān)技術(shù)的描述由蛋白胨、肽、蛋白質(zhì)和核酸組成的抗病毒劑的概念起源于1934。在經(jīng)過若干年的實(shí)驗(yàn)之后，這樣的抗病毒劑通過應(yīng)用牛血清白蛋白并結(jié)合蛋白胨和核糖核酸而被修飾，產(chǎn)生無毒、無過敏原特性且容易與組織液和血清混合的抗病毒生物環(huán)境因子。所使用的因子被稱為“脂肽-核酸化合物”1，由Chemico Laboratories，Inc.注冊，商標(biāo)為RETICULOSE(Physician Desk Reference，第651頁，1960)。據(jù)報道RETICULOSE可作為抗病毒劑，用來治療各種人類病毒感染，例如流感、皰疹、甲型肝炎和乙型肝炎。于是認(rèn)為RETICULOSE至少通過增加白細(xì)胞生成、抗體合成和增強(qiáng)吞噬作用而作為抗病毒劑發(fā)揮作用。在美國最早于1964允許銷售RETICULOSE。
RETICULOSE的生產(chǎn)方法一直由生產(chǎn)商作為商業(yè)秘密而保密，直到美國專利5,849,196公布為止，所述專利公開了RETICULOSE的生產(chǎn)方法。
正如在美國專利5,849,196中所公開的，用來生產(chǎn)RETICULOSE的原料按重量計(jì)由40-50％酪蛋白、1-10％血白蛋白、15-40％牛肉蛋白胨、10-25％RNA和5-25％氫氧化鈉組成。將這些原料懸浮于水中，得到蛋白質(zhì)(酪蛋白、蛋白胨和血白蛋白)與水的比率按重量計(jì)約等于4.3-100。在所述原料混合物經(jīng)高壓滅菌處理之后，將所得的溶液過濾，調(diào)pH至約8.5，然后至7.8，此后將中和溶液再次過濾。在將溶液稀釋后，將pH進(jìn)一步調(diào)至約7.5。這樣的過程得到肽和核酸的混合物，其分子量在約1-25KDa的范圍內(nèi)。
正如美國專利5,849,196所公開的，RETICULOSE常規(guī)組成中高于15KDa的組分在治療諸如HIV、流感病毒、單純皰疹病毒等的病毒性疾病時更加有效，而約1-15KDa范圍內(nèi)的組分可作為吞噬作用抑制劑發(fā)揮作用。
然而，常規(guī)方法有多個缺點(diǎn)1)所述方法并不保證每次制備產(chǎn)生具有相同比率的終組分，從而產(chǎn)品是不可再現(xiàn)的；2)常規(guī)方法產(chǎn)生各種各樣的終組分，如果可能的話，使得生產(chǎn)的質(zhì)量控制變得極其困難，因?yàn)樘鄥?shù)需要測定；3)高分子量組分例如25KDa組分(從本質(zhì)上講為肽)的存在，增加超敏反應(yīng)或免疫反應(yīng)的危險，使得產(chǎn)品穩(wěn)定性較低。因此，最好具有避開常規(guī)RETICULOSE缺陷而同時保持其治療特性的產(chǎn)品。最好從這樣的產(chǎn)品也能鑒定并分離出有效成分或組分，以便可以進(jìn)一步研究制品R的作用模式，從而可以開發(fā)出新的治療藥。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目的涉及從美國專利申請順序號09/344,095中介紹的組合物—制品R中鑒定并分離的新型化合物。所述新型化合物具有包含與寡核苷酸共價結(jié)合的多肽的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的另一個目的涉及一種表現(xiàn)出治療效應(yīng)的新型肽。
本發(fā)明的再一個目的涉及這些新型核苷酸-肽和/或肽化合物的治療應(yīng)用，可用來治療諸如病毒感染或免疫系統(tǒng)障礙的疾病。
根據(jù)以下詳述并結(jié)合附圖考慮，本發(fā)明的其它目的和特征將變得顯而易見。然而，應(yīng)該知道設(shè)計(jì)的附圖僅僅是為了說明本發(fā)明，而不是用來限制本發(fā)明，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求書的限制。還應(yīng)該知道附圖不一定是按照比例繪制，除非另有說明，它們僅僅用來概念性地說明本文中描述的結(jié)構(gòu)和方法。
附圖簡述在圖中

圖1顯示制品R的代表性紫外吸收分布圖；圖2顯示從反相HPLC分析獲得的制品R的代表性色譜圖；圖3顯示制品R的BioGel P-2分級分離圖；圖4顯示在16％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離的BioGel P-2分級分離圖中級分I的組分；圖5顯示在16％SDS-PAGE上分離的制品R的兩種主要肽組分的相對質(zhì)量(Mr.)；圖6是16％SDS-PAGE，顯示各種各樣的分解代謝酶對制品R的影響；圖7是一幅流式細(xì)胞術(shù)頻率分布圖，顯示制品R對葡聚糖-FITC吞噬作用的影響；圖8是一幅流式細(xì)胞術(shù)頻率分布圖，顯示制品R對葡聚糖-BoDipyFL吞噬作用的影響；圖9是肽-A的質(zhì)子NMR譜；圖10是肽-A的碳/氫HSQC譜；圖11是肽-B的質(zhì)子NMR譜；圖12是肽-B的磷-31 NMR譜；圖13是肽-B的碳/氫HSQC譜；圖14是肽-B的C-13 NMR譜；圖15顯示肽-B的結(jié)構(gòu)；圖16顯示肽-B中絲氨酸18和二核苷酸之間的鍵合性質(zhì)；圖17顯示與二核苷酸連接的肽的通用結(jié)構(gòu)；圖18是肽-B的質(zhì)譜數(shù)據(jù)；
圖19顯示制品R肽組分濃度對U937細(xì)胞分泌IL-8和MCP-1的影響；圖20顯示制品R的分離肽A和肽B對U937細(xì)胞分泌IL-8和MCP-1的影響。
目前優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述制品R的制備一般而言，制品R依照以下方法來制備。
首先，將原料酪蛋白、牛肉蛋白胨、RNA、BSA和氫氧化鈉按比例按重量計(jì)為35-50％(酪蛋白)、15-40％(牛肉蛋白胨)、10-25％(RNA)、1-10％(BSA)和5-25％(氫氧化鈉)懸浮于合適體積的蒸餾水中。所有原料都是可常規(guī)獲得的，或者可以容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員制備。雖然任何RNA都適用于本發(fā)明的計(jì)劃目的，但是優(yōu)選植物RNA，最優(yōu)選酵母RNA?？偟鞍着c蒸餾水量之比一般約1.5-2.5至約100(重量)，優(yōu)選約2.2至約100(重量)。這意味著每次將1.5-2.5克總蛋白懸浮于約100毫升蒸餾水中。
一般而言，所有原料或者是市售的，或者可以容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員制備。
然后將如上制備的懸浮液在以下條件下高壓滅菌在大約5-15lbs.、優(yōu)選8-10lbs.的壓力下，在例如約150-300°F、優(yōu)選約200-230°F范圍的升高溫度下，在約2-10小時的時間內(nèi)、優(yōu)選超過3小時。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，在這樣的條件下，RNA可以完全水解成核苷酸。高壓滅菌后，讓溶液冷卻至室溫，然后讓其在3-8℃的溫度下靜置至少12小時，以沉淀不溶性成分?；蛘?，可以將冷卻溶液在低于8℃的溫度下離心，以除去沉淀。
然后使所得的溶液在諸如氮?dú)饣驓鍤獾亩栊詺怏w、在約1-6psi的壓力下通過2微米和0.45微米濾器過濾。以相似的方式，使溶液通過優(yōu)選0.2微米致熱原保留濾器再次過濾。
在上述過濾后，可以再讓溶液冷卻至3-8℃達(dá)至少約12小時，然后以與如上所述相同的方式再次過濾。
然后采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如Kjeldahl方法，J.G.C.D.Kjeldahl，Z.Anal.Chem.，第22卷，第366頁(1883)及其改進(jìn)方法，分析所得濾液的總氮含量。根據(jù)所述分析，然后將濾液用冷蒸餾水稀釋至具有優(yōu)選總氮含量在165-210mg/ml范圍內(nèi)的合適體積。
然后用HCl將稀釋溶液的pH調(diào)節(jié)至生理上可接受的pH，優(yōu)選至約7.3-7.6，此后，使稀釋溶液在如上所述的惰性氣體下通過0.2微米濾器再次過濾。
如此生產(chǎn)的制品R基本上含有來自RNA完全水解的低分子量核苷酸、核苷和游離核酸堿基及來自蛋白質(zhì)部分水解的小肽。此外蛋白質(zhì)的堿水解產(chǎn)生游離氨基酸也是可能的。
不用說過濾技術(shù)的應(yīng)用可基本上除去細(xì)菌或者其大小與細(xì)菌相似或比細(xì)菌大的其它顆粒。因此，任何濾器無論其生產(chǎn)商或由其制得的材料都適用于計(jì)劃目的。本發(fā)明方法中所使用的所有濾器對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是非常容易獲得的。
然后將終濾液在惰性氣體下灌入合適的管形瓶中，例如2ml或10ml玻璃管形瓶中，然后封口。對于最終滅菌，將裝料管形瓶高壓滅菌，此后待用。
在使用時，如例如美國專利5,807,839、5,807,840和5,902,786中所述方法，將制品R胃腸外或局部給予有需要的患者，所述專利的內(nèi)容通過引用全文結(jié)合到本文中。然而，制品R的應(yīng)用并不限于上述專利中所公開的那些應(yīng)用。
對制品R組成的分析揭示出，制品R含有兩種主要成分，它們在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上表現(xiàn)為具有分子量分別為5.2KDa和4.3KDa的兩個條帶，即肽-A和肽-B。肽-A是一種新的單肽，而肽-B包含一種與寡核苷酸共價結(jié)合的單肽。這兩種組分的量按重量計(jì)基本相等。
對這兩種組分的功能分析表明，它們兩個均能夠誘導(dǎo)U937細(xì)胞產(chǎn)生白介素-8(IL-8)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)，盡管肽-B的活性比肽-A的活性高。這兩種組分的組合活性與制品R相當(dāng)，表明這兩個肽-核苷酸組分可能是負(fù)責(zé)制品R的所有生物活性的關(guān)鍵成分。
制品R的表征紫外吸收光譜圖1是在1cm光程長度石英微量比色杯(100μl容量)中采用Shimadzu Model UV-1201 UV-VIS分光光度計(jì)測量的制品R的代表性紫外吸收光譜。用蒸餾水將制品R稀釋100倍。在220-320nm之間記錄光譜，在260nm顯示最大吸收，而在235nm顯示波谷。260nm的吸光度(A)與280nm的吸光度之比為1.998(±10％)，而260nm的A與230nm的A之比為1.359(±10％)。
HPLC分布圖圖2是采用Hewlett Packard 1100 HpLC系統(tǒng)(Hewlett Packard Co.)從反相HPLC分析獲得的制品R的代表性色譜圖，所述系統(tǒng)包括一個雙泵(G1312A型)、一個二極管陣列檢測器(G1315A型)、一個柱恒溫槽(G 1316A型)、一個恒溫自動進(jìn)樣器(G1329A型)、一個樣品恒溫槽和一個真空脫氣器(G 1322A型)；以及一個不銹鋼YMC-pack ODS-AQ S-5uM柱(YMC，Inc.3223 Burnt MillDr.，Wilmington，NC 28403)，柱的大小為250×10mm ID，孔徑大小為120A。由0.1M乙酸∶三乙胺構(gòu)成的流動相如下制備將6.0ml冰乙酸溶于1000ml HPLC級水中。用三乙胺滴定攪拌的乙酸溶液至pH 4.8。讓該溶液在室溫下平衡過夜，然后通過0.45μM孔徑大小和52mm直徑濾器過濾。必要時，在使用前加入三乙胺，使該溶液的pH再調(diào)節(jié)至pH 4.8。通過HPLC流動系統(tǒng)中安裝的真空脫氣器，使流動相脫氣。對于每次注射，通過自動進(jìn)樣器，將8μl制品R樣品注射到溫度設(shè)定在30℃的柱中。然后，用0.1M乙酸∶三乙胺流動相(pH 4.8)以1ml/分鐘的速率在92-102巴的泵壓力下，從所述柱等度洗脫樣品。每個樣品在160分鐘時記錄色譜圖(260nm的UV吸光度)，通過二極管陣列檢測器收集數(shù)據(jù)，然后運(yùn)用Hewlett-Packard HPLC ChemStation軟件對該數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。產(chǎn)生描記曲線圖，運(yùn)用SigmaPlot程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在這些條件下的反相HPLC產(chǎn)生13個特征性HPLC峰A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L和M，每個峰都具有特征性UV吸收分布圖(數(shù)據(jù)未顯示)。
BioGel P-2凝膠過濾分布圖圖3顯示大小為2.6cm×55cm填充大小的BioGel P-2(Bio-Rad Laboratories Inc.)柱上制品R的分級分離圖。將制品R上樣至所述柱后，用0.1×PBS、優(yōu)選無鈣離子(Ca++)和鎂離子(Mg++)的DULBECCO氏PBS以0.5毫升/分鐘的流速洗脫該柱。1×PBS含有1.47mM KH2PO4、2.67mM KCl、138mM NaCl和8.1mMNa2HPO47H2O。讓洗脫液通過″Uvcord SII″監(jiān)測器，該監(jiān)測器與REC101記錄儀相連并且與254nm濾光片擬合，在″Frac 200″流分收集器中每個流分在12分鐘時收集洗脫液。在這些條件下的凝膠過濾色譜法得到9個流分I、Ia、II、IIa、IIb、III、IIIa、IV和IVa。將每個單獨(dú)的峰與在表I中所示的相應(yīng)流分體積相同或非常接近時洗脫的已知核苷酸、核苷和游離核酸堿基進(jìn)行比較。具有相似值的已知化合物示于注釋欄中。
表I峰實(shí)驗(yàn)值注釋λ最大λ最小A260/A280A260/A230峰I ～275nm ～255nm 0.976 0.300主要為肽和肽綴合物峰Ia～260nm ～240nm 1.636 0.943核蛋白和/肽核酸峰Is～270nm ～245nm 1.258 0.939主要成分為CMP峰IIα ～260nm ～230nm 2.893 3.12 主要成分為AMP、UMP峰IIβ ～250nm ～225nm 1.509 1.988主要成分為GMP峰IIa ～250nm ～230nm 1.257 1.176混合組分峰IIb ～270nm ～250nm 1.142 0.941主要成分為胞苷峰III ～260nm ～230nm 2.695 3.664主要成分為尿苷峰IIIa ～260nm ～225nm 5.15 4.24 主要成分為尿嘧啶、腺苷峰IV～260nm ～225nm 5.406 3.892主要成分為腺嘌呤峰IVa ～245nm ～225nm 1.016 1.285主要成分為鳥嘌呤然后濃縮流分，在16％凝膠上通過SDS-PAGE(參見下文)對其進(jìn)行分析。凝膠的銀染色證明，僅流分I主要顯示表觀分子量為4.3KDa、5.2KDa的兩條主要銀染條帶和次要7.6KDa條帶，如圖4中所示。
相對質(zhì)量(Mr.)圖5顯示在16％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離的并且采用NOVEX的′SilverXpress′染色試劑盒、依照生產(chǎn)商建議的方案通過銀染色染色的制品R的兩種主要肽組分的相對質(zhì)量(分子量)。將制品R解析為表觀分子量為約4.3KDa和約5.2KDa的兩條主要銀染條帶。在過載的SDS-PAGE凝膠上也顯現(xiàn)分子量約為7.6KDa的次要銀染組分，可能有痕量的其它銀染肽，其分子量在約5KDa至約14KDa的范圍內(nèi)。通用蛋白質(zhì)染色—考馬斯藍(lán)對4.3KDa條帶的染色非常弱。這三個條帶-4.3KDa、5.2KDa和7.6KDa構(gòu)成所述肽的約90％以上。因此，制品R基本上由分子量低于8KDa的分子組成。
表II顯示所述5.2KDa和所述4.3KDa組分的氨基酸組成。在具有自動水解的PE Bio-system 420分析儀上，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)苯基異硫氰酸(PTIC)化學(xué)，對所述5.2KDa條帶(樣品A)和所述4.3KDa條帶(樣品B)進(jìn)行氨基酸分析。
表II氨基酸 樣品A 樣品BRes/molRes/molAs(x)1.01 2.03Gl(x)4.98 1.97Ser 0.00 2.02His 0.00 0.00Gly 0.99 3.99Thr 0.00 0.00Ala 2.01 0.99Arg 1.03 1.03Tyr 2.04 2.05Val 4.01 3.02Met 1.02 0.00Trp 0.00 0.00Phe 1.05 1.02Ile 1.03 1.98Leu 3.98 0.00Lys 2.01 0.00Pro 5.97 0.97所述肽的生化特性如下所述，使用各種分解代謝酶，分析制品R的銀染肽組分的某些生化特性用蛋白酶K(ICN Biochemicals)進(jìn)行處理蛋白酶K是一種非特異性廣譜蛋白酶，可切割脂族氨基酸、芳族氨基酸和疏水性氨基酸C末端的肽鍵。它可以以50μg/ml在1小時內(nèi)完全切割所有血清肽。將制品R樣品在具有10mM Tris-HCl，pH 7.6、0.5％SDS、1mM CaCl2、100μg/ml蛋白酶K的反應(yīng)緩沖液中于40℃保溫30分鐘，然后在如上所述的16％凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。在這樣的條件下，制品R的銀染色并未顯示顯著變化。然而，當(dāng)?shù)鞍酌窴的量增加至800μg/ml且保溫時間延長至1小時時，所述5.2KDa條帶消失，但是所述4.3KDa條帶卻無明顯的變化。
用胰蛋白酶(Boehringer Mannheim，USA)進(jìn)行處理胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，在pH 7.5-9.0下可特異性地切割C末端的賴氨酸和精氨酸的肽鍵。將制品R樣品在具有100mM Tris-HCl，pH 8.0、0.1％SDS和250μg/ml測序級胰蛋白酶的反應(yīng)緩沖液中于25℃保溫19小時，然后在16％凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。盡管在這樣的反應(yīng)條件下，血清蛋白質(zhì)將分解為小于4.3KDa的肽，但是制品R的銀染組分均不受胰蛋白酶的影響。
用胰凝乳蛋白酶(Boehringer Mannheim，USA)進(jìn)行處理胰凝乳蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，可特異性地水解C末端的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的肽鍵。它也以相較低的速率切割C末端的亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的肽鍵。將制品R樣品在含有100mMTris-HCl，pH 7.6、10mM CaCl2和250μg/ml測序級胰凝乳蛋白酶的反應(yīng)緩沖液中于25℃保溫19小時，然后在16％凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。胰凝乳蛋白酶處理顯著降低所述5.2KDa和所述7.6KDa條帶的強(qiáng)度，但對所述4.3KDa條帶沒有明顯的影響。
用鏈霉蛋白酶(Boehringer Mannheim，USA)進(jìn)行處理鏈霉蛋白酶是一種非特異性蛋白酶，既作用于天然蛋白質(zhì)又作用于變性蛋白質(zhì)。它實(shí)際上能將所有蛋白質(zhì)分解成它們的單個氨基酸。所述制劑含有各種類型的內(nèi)肽酶如srine和金屬蛋白酶、外肽酶如羧肽酶、中性蛋白酶以及中性和堿性磷酸酶。將制品R樣品在含有100mM Tris-HCl，pH7.4、10mM CaCl2、0.1％SDS和2mg/ml鏈霉蛋白酶(得自S.griseus)的反應(yīng)緩沖液中于40℃保溫75分鐘，然后在16％凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。在這樣的鏈霉蛋白酶處理后，所有的銀染組分都消失了。
用N-糖苷酶F(Boehringer Mannheim，USA)進(jìn)行處理N-糖苷酶F切割所有類型的天冬酰胺結(jié)合的N-聚糖，條件是在肽鍵中存在氨基和羧基，并且寡糖具有最小長度的殼二糖核心單位。將制品R樣品在含有0.4X Dulbecco氏PBS(其中1×PBS含有1.47mM KH2PO4、2.67mMKCl、138mM NaCl和8.1mM Na2PO47H2O)、0.1％SDS、0.5％NP40和50單位/ml重組N-糖苷酶F的反應(yīng)緩沖液中于37℃保溫4小時，然后在16％凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。N-糖苷酶F處理沒有改變16％凝膠上任一制品R條帶的強(qiáng)度。對N-糖苷酶F的抗性表明缺乏天冬酰胺結(jié)合的N-聚糖，其通常在糖蛋白中觀察到。
用核糖核酸酶A(ICN Biochemicals，USA)進(jìn)行處理核糖核酸酶A是一種作用于單鏈RNA的嘧啶特異性內(nèi)切核糖核酸酶。將制品R樣品在含有10mM Tris-HCl，pH 7.4、3mM MgCl2和Img/ml牛胰核糖核酸酶A的反應(yīng)緩沖液中于37℃保溫約1小時，然后在16％凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。核糖核酸酶A沒有改變經(jīng)16％SDS-PAGE凝膠分離的任一制品R條帶的強(qiáng)度。對核糖核酸酶A的抗性排除存在與肽相連的RNA片段的可能性。
用堿性磷酸酶(Life Technologies，USA)進(jìn)行處理小牛胸腺堿性磷酸酶(CIAP)是一種水解DNA、RNA和核苷酸的5′-磷酸基團(tuán)的磷酸單酯酶。將制品R樣品在由所述酶的生產(chǎn)商提供的反應(yīng)緩沖液和200單位/ml CIAP中于37℃保溫約1小時，然后在16％凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。CIAP沒有改變經(jīng)SDS-PAGE分離的任一制品R條帶的強(qiáng)度。
通過分解代謝酶進(jìn)行上述處理的總結(jié)在以下表III中提供，所述處理的結(jié)果示于圖5中，其中″-″表示染色條帶沒有明顯改變，而″+″表示染色條帶明顯改變。
表III制品R中肽組分的酶敏感性(SDS-PAGE)4.3KDa5.2KDa7.6KDa蛋白酶K(100μg/ml) - +/- ？*800μg/ml) - + ？*胰蛋白酶(250μg/ml) - - -胰凝乳蛋白酶(250μg/ml) - + +鏈霉蛋白酶(2mg/ml) + + +N-糖苷酶F(50單位/ml)- - -核糖核酸酶A(1mg/ml) - - -堿性磷酸酶(200單位/ml) - - -*該條帶未明確地鑒定出來，因?yàn)樵谠搮^(qū)域存在所述酶片段。
這些酶消化模式的復(fù)雜性提示，制品R的所述肽組分可以與諸如單核苷酸和/或糖的其它分子綴合，或者在分子內(nèi)/分子間存在交聯(lián)。
RNA凝膠電泳核酸的瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳都不產(chǎn)生任何溴化乙錠染色條帶，表明在制品R中沒有RNA片段。
制品R對吞噬作用的影響圖7和圖8是代表細(xì)胞相關(guān)熒光的流式細(xì)胞術(shù)頻率分布圖，顯示在制品R分別處理24小時和8天后，制品R對葡聚糖-FITC或葡聚糖-BoDipyFL吞噬作用的影響。用人單核細(xì)胞系U937測試制品R對吞噬作用的影響。將U937細(xì)胞在具有5％制品R或作為對照的5％PBS的培養(yǎng)基中在葡聚糖-FITC試驗(yàn)前培養(yǎng)24小時或者在葡聚糖-BoBipyFl試驗(yàn)前培養(yǎng)8天。為了測量吞噬作用，將細(xì)胞如圖5所示用諸如熒光標(biāo)記葡聚糖-FITC的吞噬標(biāo)記于37℃連續(xù)培養(yǎng)5分鐘、15分鐘、30分鐘和45分鐘或者如圖6所示用葡聚糖-BoDipyFL于37℃連續(xù)飼養(yǎng)5分鐘、15分鐘、25分鐘和40分鐘?；旧习凑誗allusto，F(xiàn).等(Sallusto，F(xiàn).等(1995)，J.Exp.Med.，182389-400，所述文獻(xiàn)通過引用全文結(jié)合到本文中)介紹的方法，用流式細(xì)胞術(shù)分析監(jiān)測吞噬攝入后細(xì)胞相關(guān)熒光的數(shù)量。在這些試驗(yàn)中，已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)樣品的數(shù)值中減去本底值，并且用碘化丙錠排除法從所述數(shù)據(jù)中除去死細(xì)胞。
圖7和圖8分別顯示對數(shù)熒光對PBS對照(紫色)、制品R處理(綠色)和與細(xì)胞結(jié)合的本底葡聚糖(黑色)的細(xì)胞數(shù)的覆蓋。在每個時間點(diǎn)紫色曲線(PBS對照)基本上與綠色曲線(制品R)重疊，表明制品R不抑制人單核細(xì)胞的吞噬作用。
制品R的其它生物學(xué)功能制品R的某些其它已知的生物學(xué)功能在以下文獻(xiàn)中有描述美國專利第5,807,840號、第5,807,839號和第5,902,786號；美國專利申請順序號08/838,077、08/838,069、08/835,793、08/835,794、08/833,950、08/837,992、08/837,988、08/838,070、08/834,190、08/835,791、08//838,134、08/839,651、08/835,796、08/964,250、08/964,427、08/923,516、08/923,343、08/922,888、09/189,172、09/007,565、09/316,624、09/316,374、09/257,739和Hirschman等，J.Investig.Med.1996；44347-351公開內(nèi)容。這些專利、專利申請和出版物通過引用全部結(jié)合到本文中。
結(jié)論因此確定按照本發(fā)明所述方法制備的制品R組合物包含分子量不超過14KDa、基本上不超過8KDa的核苷酸和肽。制品R的肽組分不均勻分布并且通常位于分子量為4.3KDa、5.2KDa的兩個主要銀染條帶和7.6KDa的次要條帶。
制品R的UV吸收光譜通常在260nm顯示最大吸收，而在235nm顯示波谷，并且特征性260nm的吸光度與280nm的吸光度之比為1.998，而260nm的吸光度與230nm的吸光度之比為1.359。
制品R的HPLC分布圖包含A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L和M的流分，如圖2所示。
制品R的BioGel P-2凝膠過濾分布圖包含I、Ia、II、IIa、IIb、III、IIIa、IV和IVa的流分，如圖3所示。
比較常規(guī)組成的Reticulose和制品R將按照本發(fā)明公開說明書制備的制品R的組成與常規(guī)組成RETICULOSE的就其分子量(MW)和波長為230nm、260nm和280nm時的紫外(UV)吸光度(A)進(jìn)行比較，如表IV所示。盡管已經(jīng)報道RETICULOSE的分子量低于15KDa的組分可抑制吞噬作用，但是本申請證明制品R不抑制吞噬作用。
表IVMW UV I/PH*A260/280A260/230制品R ＜14KDa 1.998 1.359 不抑制RETICULOSE1-25KDa 2.839 1.198 抑制*分子量低于15KDa的分子抑制吞噬作用因此，制品R與RETICULOSE在其組成和生物學(xué)功能方面顯著不同。
表V是本發(fā)明治療組合物制品R和常規(guī)組合物RETICULOSE制備中所使用的原料相對量的比較。
表V10升中用于起始反應(yīng)的原料 RETICULOSE制品R酪蛋白(克) 250克 140牛肉蛋白胨(克) 150克 68.4血清白蛋白(克) 15克 13RNA(克)80克 88NaOH(克) 75克 66在制品R制備的起始反應(yīng)中使用約221克蛋白質(zhì)，而在RETICULOSE制備的起始反應(yīng)中使用約415克蛋白質(zhì)。因此，RETICULOSE制備的起始蛋白質(zhì)濃度是制品R制備的起始蛋白質(zhì)濃度的兩倍。
為了進(jìn)一步研究制品R組合物的結(jié)構(gòu)和活性，分離并純化所述兩種主要肽組分，即所述5.2KDa肽(下文稱為″肽-A)和所述4.3KDa肽(下文稱為″肽-B″)。開發(fā)一種分離制品R混合物并且純化所述兩種肽中每種的方法。這種方法包括凝膠過濾，然后凍干，離心過濾和透析。這種方法產(chǎn)生適用于測序法和NMR和質(zhì)譜結(jié)構(gòu)研究的肽-A和肽-B樣品。肽-A和肽-B在制品R組合物中以大致相等的量存在，通過Lowry(勞里)蛋白質(zhì)分析測定，這兩種肽的總量約為4.8-5.3mg/ml。
制品R肽的純化將制品R(6ml)凍干，凍干塊溶于1.5mL Nanopure水的總體積中，以形成4倍濃縮液。將BioGel P-b柱(16×51cm)用0.05X無Ca++和Mg++的Dulbecco氏磷酸緩沖鹽溶液(PBS)平衡。將經(jīng)濃縮的制品R加樣至所述柱上。所述柱用0.05×PBS洗脫，收集1ml流分。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)，然后通過對凝膠進(jìn)行銀染色，測試各流分中肽-A和肽-B的存在。
合并含有肽-A的流分，然后凍干。含有肽B的流分并不是完全不含肽A。合并含有＞80％肽-B的流分，然后凍干。將上述步驟重復(fù)若干次，直至獲得供結(jié)構(gòu)研究用的足量的單種肽。
將凍干肽-A的混合物溶于Nanopure水中，濃縮，然后通過Centriplus 3(MWCO-3kDa)過濾裝置(Millipore Corporation，USA)經(jīng)離心進(jìn)一步純化。用BioRad DC蛋白質(zhì)測定試劑盒分析所述濃縮物的蛋白質(zhì)含量。肽-A的純度再次通過SDS-PAGE檢查，將樣品凍干，凍干塊于4℃冷藏待用，以進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究。
將凍干肽-B的混合物溶于少量Nanopure水中，在Spectra/PorDispo透析儀(MWCO-lkDa)(得自Spectrum Microgen，USA)中對10mMTris-HCl，pH 7.4透析。如上關(guān)于肽-A的所述方法，通過使用BioRad DC蛋白質(zhì)測定試劑盒和SDS-PAGE來分析所述透析液中肽-B的蛋白質(zhì)含量和純度。將透析液凍干，肽-B的凍干塊于4℃冷藏待用，以進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究。通過NMR光譜法、Edman法的N末端測序和質(zhì)譜法對肽-A進(jìn)行分析。
在如肽純化小節(jié)中所述的方法透析后，可獲得作為凍干塊的肽-A樣品。對于NMR研究，將所述樣品溶于重水中。對于質(zhì)譜研究，將所述材料溶于PBS緩沖液中。
肽-A的NMR分析將5.2mg肽-A樣品(通過勞里總蛋白質(zhì)測定測定)溶于5mm NMR試管中的0.5mL D20中。將該試管渦旋混合30秒。在Bruker 300MHz儀器上記錄譜線。
D2O中肽-A的質(zhì)子NMR是一種多肽的典型復(fù)雜譜。脂族殘基和芳族殘基均在所述譜中觀察到(圖9)。
對所述樣品未能獲得令人滿意的13C碳NMR譜，因?yàn)榈蜆悠窛饪s所致。然而，可以記錄提供樣品中除叔碳原子(缺乏連接氫原子的基團(tuán)，例如羰基)之外所有碳原子化學(xué)位移的2D-HSQC(異核單量子相干)譜(圖10)。這在Bruker 500MHz儀器上進(jìn)行12小時，以獲得過夜數(shù)據(jù)。二維HSQC實(shí)驗(yàn)使質(zhì)子化學(xué)位移與相應(yīng)的連接所述質(zhì)子的碳原子化學(xué)位移相關(guān)聯(lián)。該實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致闡明了肽A的氨基酸含量。(參見表VI-HSQC譜相關(guān)性-肽A)。HSQC 2D-譜指示作為肽A組分的以下氨基酸的存在芳族氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸、亞氨基酸脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸和谷氨酰胺。未能檢測到色氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、組氨酸或羥脯氨酸。
根據(jù)以下來源的數(shù)據(jù)作出共振化學(xué)位移K.Wuthrich，NMR ofProteins and Nucleic Acids，John Wiley，1986和J.N.S.Evans，Biomolecular NMR Spectroscopy，Oxford University Press，1995)。
對于肽-A樣品也記錄31P譜；12小時的過夜記錄沒有產(chǎn)生磷共振信號。因此，肽-A不是磷酸化肽。
表VI-HSQC譜相關(guān)性-肽-A交叉峰(ppm)質(zhì)子 碳 定位7.28 128.8 CI Tyr7.22 128.4 Cl Tyr7.18 127.8 C2，6 Tyr7.05 130.2 C4 Phe6.75 115.7 C3，5 Tyr4.60 55.2 -H Asp4.52 54.1 -C Met4.32 56.1 -C Glu4.24 50.4 -C Ma4.22 54.4 -C Arg4.18 60.8 -C Val3.87 43.0 -C Gly3.55 48.3 -C Pro2.24 30.3 β-C Pro2.18 31.8 β-C Met2.13 33.5 β-C Gln1.74 36.7 β-C Ile1.72 29.4 β-C Arg1.48 40.0 β-C Leu1.24 16.2 -C Ile0.88 18.5 -C Val0.84 23.2，21.6 -C Leu0.80 10.9 -C Ile肽-A的N末端肽測序通過Edman降解分析對肽-A進(jìn)行N末端肽測序。所得的序列為
KVLPVPQKAVPYPQRDMPIQAFLLYQEPVLG或HZN-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln-Lys-Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-Gln-Arg-Asp-MetPro-Ile-Gln-Ala-Phe-Leu-Leu-Tyr-GIn-Glu-Pro-Val-Leu-Gly-OH用于序列比較的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫BLAST(可通過NCBIINIH在線獲得)的檢查提供與該序列的實(shí)際匹配，該序列對應(yīng)于牛β-酪蛋白中的氨基酸殘基178-208-一條長216個氨基酸的肽(A.F.Stewart，J.Bonsing，C.W.Beattie，F(xiàn).Shah，I.M.Willis和A.G.Mackinlay，completenucleotide sequences of bovine alpha-s2 and beta-casein cDNAsComparisons with related sequence in other species(牛α-s2和β-酪蛋白cDNA的完全核苷酸序列與其它物種中相關(guān)序列的比較)MoI.BioI.Evol.4，231-241 1987)。該序列似乎是肽-A的正確序列，因?yàn)橹破稲來源于牛酪蛋白。此外，在NMR研究和氨基酸分析中，該序列的氨基酸組成同鑒定為肽-A組分的氨基酸一樣。
所述肽結(jié)構(gòu)具有六個間插的脯氨酸殘基和四個堿性谷氨酰胺殘基。由于肽鏈中的脯氨酸殘基可以誘導(dǎo)肽鏈彎曲，因此肽A具有高度折疊的結(jié)構(gòu)是可能的，該結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其高度化學(xué)穩(wěn)定性和其對蛋白酶和肽酶的不應(yīng)特征。
對肽-A的質(zhì)譜研究肽A樣品的許多質(zhì)譜得自Borealis實(shí)驗(yàn)室和CommonwealthBiotechnologies。電噴霧和MALDITOE(Matrix-assisted Laser DesorptionIonization-Time ofFlight)兩種方法均可用來獲得質(zhì)譜。
MALDI-TOF質(zhì)譜法具有使其有效作為測序技術(shù)的補(bǔ)充技術(shù)的若干特征(K.R.Williams，S.M.Samandar，K.L Stone，M.Saylor和J.Rush，MALDI-MS as a complement to internal protein sequencing.，載于TheProtein Protocols Handbook，J.M.Walker編著，1996，Humana Press，Totowa，NJ，第541-555頁)。MALDI-MS具有高靈敏度并且通常解析代表肽結(jié)構(gòu)中連續(xù)肽鍵斷裂的片段，使得可以測序和/或證實(shí)通過Edman N末端測序方法檢測的序列。對質(zhì)譜離子(mass ions)而言，MALDI-MS通常給出的質(zhì)量準(zhǔn)確度為+0.25％，這對于作出定位是令人滿意的。
以下表(表VII)顯示得自肽-A的質(zhì)譜片段，與上述的31個氨基酸肽結(jié)構(gòu)相一致。根據(jù)Edman N末端序列分析，所觀察到的質(zhì)譜片段也證實(shí)先前未確定的、在位置11、15和20定位的氨基酸殘基分別為P、R和Q。
表VII-肽-A的MALDI質(zhì)譜數(shù)據(jù)片段 預(yù)期的質(zhì)譜離子 觀察到的質(zhì)譜離子/MPIQAF 688.87 690.3/VPQKAVPY/ 884.07 884.5884.2/DMPIQAFL-NH3900.09 900.9/AFLLYQEP-28 935.11 935.9KVLPVPQKAV/ 962.06 961.90/PQKAVPYPQ-NH3 993.15 992.8/PQKAVPYPQ/ 1010.191009.3/PIQAFLLYQ 1075.301075.701075.40/LPVPQKAVPY/ 1094.351095.70/YPQRDMPIQ-NH3 1113.281112.11113.0/PQKAVPYPQR-NH3 1149.341150.0/PQKAVPYPQR/ 1166.371166-80/VPQKAVPYPQR-28 1237.501236.5/PQKAVPYPQRD/1281.461280.9/MPIQAFLLYQE-28 1307.601308.201307.1/VPQKAVPYYPQRD/ 1380.601381.021380.05/PIQAFLLYQEPV/ 1400.671399.60/DMPIQAFLLYQE-28 1422.691423.1/KAVPYPQRDMPIQ-281497.811499.9/MPIQAFLLYQEPV/ 1503.421503.851503.42/KAVPYPQRDMPIQ/ 1525.821526.31/VPYPQRDMPIQAF-NH31527.791527.46/MPIQAFLLYQEPV/ 1531.861532.05/PYPQRDMPIQAFL-NH31541.821541.84/VPYPQRDMPIQAF/ 1544.821544.63
KVLPVPQKAVPYPQ/ 1546.901545.32/DMPIQAFLLYQEP/ 1547.821549.47/VPYPQRDMPIQAFL/ 1558.851560.28/VLPVPQKAVPYPQR/ 1574.921575.22/QRDMPIQAFFLY-NH31588.881589.0/LPVPQKAVPYPQRD/ 1590.871590.26/QRDMPIQAFLLYQ/ 1605.911606.05/AVPYPQRDMPIQAF/ 1615.901614.94/DMPIQAFLLYQEPV-NH31629.921630.35/PYPQRDMPIQAFLL-28 1644.001643.31/PYPQRDMPIQAFLL/ 1672.011673.13/PYPQKAVPYPQRDMP/1678.021678.15/PQRDMPIQAFLLYQ-NH31685.991686.95/QKAVPYPQRDMPIQA-28 1697.021698.67/PVPQKAVPYPQRDMP/1706.031706.7/QKAVPYPQRDMPIQA/1725.031725.6/AVPYPQRDMPIQAFL/1729.061730.07/QRDMPIQAFLLYQE/ 1735.021735.57VPYPQRDMPIQAFLL-NH31754.111755.83/DMPIQAFLLYQEPVL/1760.111762.11/VPYQRDMPIQAFLL/ 1771.141770.88/LPVPQKAVPYPQRDMP/ 1790.171789.61/KVLPVPQKVPYPQRDM-NH31801.151799.50/KVLPVPQKAVPYPQRD/ 1818.161772.92(-CO2，-H)/YPQRDMPIQAFLLYQ/1866.201864.68/QKAVPYPQRDMPIQAF/ 1872.211874.98/VLPVPQKAVPYPQRDMP-281890.311890.61/RDMPIQAFLLYQEPVL-NH31899.271897.0/PQRDMPIQAFLLYQEP/ 1929.261929.92/VPYPQRDMPIQAFLLY/ 1934.321936.39/QKAVPYPQRDMPIQAFL/ 1957.361955.81
/PYPQRDMPIQAFLLYQ/1963.321962.80KVLPVPQKAVPYPQRDMPI/ 2159.642207.32(+2Na，+2H)/AVPYPQRDMPIQAFLLYQE/ 2262.692263.52/PVPQKAVPYPQRDMPIQAFLLYQ-28 2664.402664.36/KAVPYPQRDMPIQAFLLYQEPVL/ 2700.232724.23(+Na)KVLPVPQKAVPYPQRDMPIQAFLLYQEPVL/ 3462.183462.67KVLPVPQKAVPYPQRDMPIQAFLLYQEPVLG 3536.243536.843583.48(+2Na)因此，肽-A的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與來源于如上所示的β-酪蛋白的31個氨基酸序列相一致。
因此，肽-A—制品R的一種組分為長31個氨基酸、來源于牛β-酪蛋白、分子量為3536.24Da的肽。它為一種缺乏任何半胱氨酸-半胱氨酸交聯(lián)的直鏈肽。值得注意的是，其結(jié)構(gòu)為整個分子中間插有六個脯氨酸殘基和四個堿性谷氨酰胺殘基。由于脯氨酸殘基可以誘導(dǎo)肽鏈彎曲，因此所述結(jié)構(gòu)可能是一種高度折疊的肽。
肽-B的結(jié)構(gòu)研究通過NMR光譜法、Edman法的N末端測序、C末端測序和質(zhì)譜法對肽-B進(jìn)行分析。
如小節(jié)4.2中所述，純化肽-B樣品可在透析后作為凍干塊而得到。對于NMR研究，將所述樣品溶于重水中。對于質(zhì)譜研究，將所述材料或者溶于Nanopure水中或者溶于0.1×PBS緩沖液中。通過用高碘酸鹽處理并且用DIG-半抗原(Boehringer Mannheim)標(biāo)記，肽B也給出針對糖肽/核肽的陽性反應(yīng)。讓DIG-半抗原結(jié)合的肽-B與抗DIG過氧化物酶反應(yīng)，然后用TETON(4-三亞乙基三氧基-1-萘烷醇)處理，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，表明在糖肽/核肽復(fù)合物中糖部分與肽部分連接。
肽-B的NMR譜分析肽-B的質(zhì)子NMR譜(圖11)顯示肽化合物的特征性信號，但是在任何芳族氨基酸非典型譜的芳族區(qū)中以及在5.7-6.05ppm區(qū)之間的區(qū)域中也具有另外的非典型峰，類似于在二腺苷二核糖核苷酸中芳族質(zhì)子和核糖糖殘基殘基的那些區(qū)域。質(zhì)子共振信號的定位示于表VIII中。所述譜中外非肽峰以1∶1摩爾比與所述肽一起出現(xiàn)，表明在肽和腺苷腺苷二核苷酸之間的1∶1摩爾復(fù)合物。
磷譜(圖12)顯示三種信號，在3.96ppm處指示從典型核苷間磷酸二酯鍵合預(yù)期的那些原子多少有點(diǎn)向低磁場移動的兩個磷酸二酯磷原子的分裂峰和核苷酸間磷酸二酯鍵合特征性的2.46ppm的另一個峰。這表明與非典型核苷酸間鍵合的兩個其它磷酸二酯鍵一起的核糖二核苷酸單位中核糖單位之間的一個傳統(tǒng)3′→5′磷酸二酯鍵合。因此，通過在絲氨酸或酪氨酸殘基上的羥基到二核苷酸的糖部分上的羥基可能存在一個共價磷酸二酯鍵合。
因此，肽-B由與二腺苷核糖二核苷酸連接的肽單位組成，因?yàn)樗@示對應(yīng)于氨基酸和腺嘌呤單位的NMR信號。根據(jù)HSQC譜(圖13，表X)鑒定的氨基酸為4個甘氨酸殘基、3個纈氨酸殘基、3個天冬氨酸殘基、2個異亮氨酸殘基、2個絲氨酸殘基、2個酪氨酸殘基以及丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和谷氨酸各1個。這些數(shù)據(jù)綜合起來表明，長21個氨基酸的肽與腺嘌呤二核糖核苷酸連接有可能通過二磷酸二酯型鍵合來連接。
肽-B的C-13 NMR譜(圖14，表IX)在對應(yīng)于腺嘌呤的芳族區(qū)(118-160ppm)中和在其中核糖環(huán)碳原子產(chǎn)生信號的70-90ppm的區(qū)域中同樣顯示任何氨基酸的非典型峰，這可以歸因于兩個腺苷亞單位。
還認(rèn)為二腺苷二核苷酸可以與肽部分連接成離子型復(fù)合物，而不是共價連接的。為了確定是否存在這種情況，進(jìn)行解離通過與所述肽離子鍵合連接的可能的二核苷酸單位的實(shí)驗(yàn)。肽B樣品通過加入5MNaCl產(chǎn)生2M NaCl離子強(qiáng)度。這種高離子強(qiáng)度溶液應(yīng)該解離離子復(fù)合物。將所述溶液于4℃保溫1小時，然后針對Float-a-Lyzer袋(MW截留值--1kDa)中500mL 1M NaCl的10mM Tris-HCL，pH 7.9溶液透析2小時。然后將透析液于40℃針對500mL 0.5M NaCl的10mM Tris-HCl，pH 7.9溶液再次透析2小時。于4℃針對2.5L 10mM Tris-HCl，pH 7.9最終透析16小時過夜提供可加樣至預(yù)先用10mM Tris-HCl平衡的Macroprep DEAE支持柱上的肽-B溶液。將洗脫液凍干。然后通過質(zhì)子和磷NMR再次分析該產(chǎn)物，得到與未經(jīng)處理的肽-B相同的譜。這表明在所述肽和寡核苷酸部分之間是通過氨基酸殘基上的羥基磷酸二酯鍵連接的共價復(fù)合物，而不是離子型復(fù)合物。
肽-B的N末端序列分析通過Edman降解分析對肽-B進(jìn)行N末端肽測序。將樣品溶于1mLNanopure水中，將50μL經(jīng)溶解的樣品加樣至測序柱上。進(jìn)行30個循環(huán)的測序，導(dǎo)致鑒定出一種長21個氨基酸的序列GEIPDAGGR1VDYYVGFSD(X)(X)該序列C末端的20和21氨基酸不能明確地確定。在NCBI/BLAST數(shù)據(jù)庫中搜索該序列，但是對任何匹配序列沒有命中。因此，肽-B似乎是一種先前未曾描述的化合物。
表VIII-肽B的質(zhì)子NMR峰定位(在H2O溶液中)化學(xué)位移 峰定位0.897 δ-CH3Ile(2個ile殘基)0.9090.9330.947 γ-CH3，Val，γ-CH3Ile(3個Val殘基，2個lIe殘基)0.9490.9460.9641.409 β-H Ala1.4761.490 γ-CH2Ile(2個Ile殘基)1.676 γ-CH2Arg1.866 β-HAsp(3個Asp殘基)1.8851.9202.011 β-H Pro2.071 β-H Glu2.164 β-H Val(3個Val殘基)2.1782.1912.284 β-H Pro2.299 γ-CH2Glu2.961 β-H Tyr3151 β-H Phe3.696 δ-H Pro3.706 核糖5′CH2OH3.878 β-H Ser(2個Ser殘基)3.8853.901 α-H Gly(4 Gly殘基)
3.9123.9233.9314.158 α-H Val(3個Val殘基)4.1784.166 α-H Glu4.3234.359 α-H Arg4.425 α-H Pro5.863 核糖5′5.886 核糖3′5.8945.938 核糖2′5.9486.006 核糖1′6.0216.794 3，5-H Tyr7.0887.144 2，6-H，Tyr7,266 2，6-H，Phe7.282 3，5-H，Phe7.305 4-H，Phe7.740 腺嘌呤環(huán)H-27.7567.791 腺嘌呤環(huán)H87.806
表IX-肽B的C13 NMR峰定位(在D2O中)化學(xué)位移(ppm)峰定位17.7 Ala(β-C)18.5 Val(γ-C)23.2 Pro(γ-C)25.7 Arg(γ-C)28.7 Arg(β-C)28.8 Glu(β-C)30.6 Pro(β-C)38.4 Tyr(β-C)/Phe(β-C)39.8 Asp(β-C)40.8 Asp(β-C)41.7 Arg(δ-C)43.5 Gly(α-C)43.9 Gly(α-C)48.2 Pro(反式，δ-C)51.2 Ala(α-C)53.1 Asp(α-C)53.457.4 Phe(α-C)，Tyr(α-C)57.660.0 Ile(α-C)60.8 Val(α-C)62.0 核糖5′CH2OH62.3 Ser(β-C)62.472.0 腺苷(核糖C2′)74.2 腺苷(核糖C3′)83.7 腺苷(核糖C4′)84.2
90.4 腺苷(核糖Cl′)95.2116.2 Tyr(C3，C5)128.4 Tyr(C1)，Phe(C-4)128.6131.2 Tyr(C2，C6)141.8 腺嘌呤(腺苷環(huán)C8)142.4158.1 腺嘌呤(腺苷環(huán)C4/C2)172-177氨基酸C＝O基團(tuán)182.8 Glu(δ-C)
表X-HSQC譜相關(guān)性-肽-B交叉峰化學(xué)位移(ppm)質(zhì)子 碳定位7.79 158.1 腺苷C/H27.80 159.47.74 141.8 腺苷C/H87.76 142.47.30 128.4 Phe C47.28 128.6 Phe 2，66.79 116.2 Tyr 3，56.01 95.2 腺苷1′5.95 90.4 Adensone 1′4.81 72.0 腺苷2′4.60 74.2 腺苷3′4.38 53.3 α-C Leu4.28 70.1 腺苷2′4.20 83.7 腺苷4′4.16 84.2 腺苷4′4.17 60.8 α-C/H Val3.91 43.5 α-C/H Gly3.89 62.3 β-C/H Ser3.70 62.0 腺苷5′-CH2OH2.96 39.4 β-C/H Tyr2.28 34.1 β-C/H Pro2.17 30.6 β-C/H Val2.07 28.8 β-C/H Glu1.89 25.7 γ-C/H Arg1.41 17.7 β-C/H Ala
0.93 19.3 γ-C/H Val0.92 22.8 γ-C/H Leu0.89 15.7 γ-C/H Ile0.80 11.3 δ-C/H Ile肽-B的C末端序列分析和結(jié)構(gòu)推斷在Commonwealth Biotechnologies，Inc.，采用羧肽酶Y消化，對肽-B進(jìn)行C末端肽序列分析。使用肽-B的量為3.8mg。將樣品與以酶與肽-B的終摩爾比為1∶20加入的羧肽酶Y(Sigma C 3888)一起保溫。將樣品在室溫和時間逐漸增加(0mm 30mm、1hr、2hrs、5hrs和16hrs)的條件下保溫，取出20μL等份樣品，分別進(jìn)行氨基酸分析。將酶自溶樣品作為整個方案的對照。通過加入5μL冰乙酸終止酶消化。將每種樣品干燥(speed-vac)，然后溶于50μL氨基酸加樣緩沖液中，然后進(jìn)行氨基酸分析。
觀察到氨基酸的時間依賴性釋放，在約7皮摩爾時達(dá)到等當(dāng)量。最先釋放和最先達(dá)到等當(dāng)量的殘基是Val，接下來是Ser和Asp。因此，三個C末端殘基可以被鑒定為-DS V-OH。這表明在倒數(shù)第二個、位置20定位的氨基酸(X)是絲氨酸殘基。除這三個C末端氨基酸殘基之外沒有進(jìn)行測序，表明從C末端開始定位的第四個殘基(X)、位置18測序的一種可能的空間位阻。這可以認(rèn)為是由于所述二核苷酸部分與位置18的氨基酸共價連接。
由于根據(jù)磷NMR譜，指示沒有對應(yīng)于典型核苷酸間3′→5′-磷酸二酯鍵合的兩個磷酸二酯信號，因此似乎可能是位置18的氨基酸將具有含羥基的側(cè)鏈；即或者是絲氨酸、蘇氨酸、羥脯氨酸或者是酪氨酸殘基，其被磷酸化為磷酸二酯鍵。由于在肽-B的NMR譜中沒有觀察到蘇氨酸或羥脯氨酸殘基信號并且根據(jù)N末端序列位置在位置13和14上有兩個酪氨酸殘基，因此這將表明位置18必定是絲氨酸殘基。這將表明與位置18的絲氨酸殘基的羥基上的二核苷酸可能共價連接的21個氨基酸肽的可能肽序列是*GEIPDAGGRIVDYYVGFSDSV1 18 21或1 51015*NH2..Gly-Glu-Ile-Pro-Asp-Ala-Gly-Gly-Arg-Ile-Val-Asp-Tyr-Tyr-Val-Gly-Phe-Ser20Asp-Ser-Val-OH該21個氨基酸肽區(qū)段的分子量為2216.4。在質(zhì)譜中，觀察到與該結(jié)構(gòu)相符的片段(參見表XI)。在質(zhì)譜研究中，整個肽-B結(jié)構(gòu)顯示的分子量為2955，表明MW 740結(jié)構(gòu)與所述肽共價連接。
NMR研究表明兩個腺嘌呤單位通過3′→5′-磷酸二酯鍵合相互連接，如在RNA結(jié)構(gòu)中。因?yàn)橛^察到與游離2′羥基相符的2′-核糖碳和氫信號的兩個腺嘌呤單位，所以不包括2′→5′-鍵合。通過3′-5′磷酸二酯鍵連接的二腺苷二核苷酸形成MW 595的片段。這留下的分子量為144，對應(yīng)于兩個額外的非核苷酸間磷酸二酯鍵合。
所述二腺苷二核苷酸單位可以在其3′或5′游離羥基通過二磷酸酯鍵與所述肽絲氨酸羥基連接。因?yàn)橛^察到所述腺嘌呤核糖單位其中一個的游離5′-羥基，所以指示3′-連接(在HSQC譜中于3.7ppm和62.0ppm的交叉峰)。
在腺苷二核苷酸結(jié)構(gòu)中存在游離的5′-羥基由肽-B對小牛胸腺堿性磷酸酶水解的抗性加以進(jìn)一步說明。該酶容易水解DNA、RNA和核苷酸中的5′-磷酸基團(tuán)。
圖15的結(jié)構(gòu)與在所述結(jié)構(gòu)中研究獲得的、如下概述的肽-B的數(shù)據(jù)相符
a.所述結(jié)構(gòu)是一種長21個氨基酸、在位置18的絲氨酸殘基的羥基上與二腺苷二核苷酸單位通過3′-位置上的二磷酸二酯鍵合共價連接的線性肽。
b.質(zhì)譜數(shù)據(jù)與已知結(jié)構(gòu)和N末端和C末端測序數(shù)據(jù)相一致。觀察到與非肽二核苷酸加合物的損失相一致的質(zhì)譜片段以及順序離子片段證實(shí)在所述線性肽部分中的定位氨基酸序列。
c.該結(jié)構(gòu)可以解釋在31P-NMR譜中觀察到的三個磷二酯鍵合，所述結(jié)構(gòu)包括一個常規(guī)的核苷酸間3′-5′磷酸二酯鍵合和兩個由所述肽上的絲氨酸羥基和所述二核苷酸部分上的3′羥基之間的二磷酸二酯鍵合產(chǎn)生的信號。
圖16顯示在絲氨酸18通過二磷酸二酯鍵合與二腺嘌呤二核苷酸單位鍵合的性質(zhì)。
然而，本發(fā)明并不限于上述的核苷酸-肽結(jié)構(gòu)。據(jù)信上述核苷酸-肽結(jié)構(gòu)中的所述肽和所述寡核苷酸之間的二磷酸二酯鍵合對于制品R的活性是關(guān)鍵性的。因此，在不違背本發(fā)明的情況下，本發(fā)明包括根據(jù)上述結(jié)構(gòu)本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠推斷的以上結(jié)構(gòu)的所有其它變異體。圖17顯示上述核苷酸-肽的通用結(jié)構(gòu)，其中B1和B2為嘌呤或嘧啶，例如胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶或5-氟尿嘧啶；R1和R2為氫或羥基；X為羥基化氨基酸殘基，例如絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基或酪氨酸殘基；且Y為與所述二核苷酸連接的肽的其余部分(肽殘基)，不包括羥基化氨基酸殘基。所述肽的長度可以有所變化，但是一般含有不超過50個氨基酸。在這樣的肽中需要至少一個羥基化氨基酸殘基，但是這個殘基的位置可以是在沿所述肽的任何位置上，包括所述肽的N末端和C末端。所述肽中的其它氨基酸殘基可以選自任何已知的氨基酸，而所述二核苷酸可以是核糖二核苷酸或脫氧核糖核苷酸。
對肽-B的質(zhì)譜研究肽-B樣品的質(zhì)譜得自Commonwealth Bioteclinologies，Inc.，、Borealis Laboratories和Louisiana State University。MALDI-TOF和電噴霧這兩種技術(shù)均可用于這些分析。下表(表XI)顯示所觀察的質(zhì)譜片段離子和結(jié)構(gòu)定位。
表XI-肽-B的質(zhì)譜數(shù)據(jù)表XI-肽-B的質(zhì)譜數(shù)據(jù)片段預(yù)期的質(zhì)譜離子觀察到的質(zhì)譜離子/IVDYY/ 654.74 655.7/DAGGRIV/ 669.76 671.8/YYVGFS-28689.79 688.8/IPDAGGRIV/ 880.04 879.82/YYVGFSDS-H2O 901.95 901.97/PDAGGRIVDY/ 1045.14 1044.181044.87/GGRIVDYYVG-281053.21 1053.1GEIPDAGGRIV/ 1066.20 1066.32/EIPDAGGRIVD-28 1096.23 1096.63/VDYYVGFSDS-H2O 1116.18 1118.34/EIPDAGGRIVD/ 1124.24 1123.741123.90/AGGRIVDYYVG/ 1151.58 1150.0/RIVDYYVGFS/ 1201.37 1202.851202.82/GGRIVDYYVGF/ 1228.40 1228.61/IVDYYVGFSDS-H20 1229.34 1229.45/GGRIVDYYVGF-28 1230.41 1230.44/EIPDAGGRIVD/ 1124.24 1123.74GEIPDAGGRIVD/ 1181.30 1181.03/GGRIVDYYVGF/ 1228.46 1229.121228.61/GGRIVDYYVGF-28 1200.39 1198.11/IPDAGGRIVDYY-28 1293.87 1293.87/IPDAGGRIVDYY-NH31304.45 1302.00/PDAGGRIVDYYV/1307.45 1308.42GEIPDAGGRIVDY/1344.46 1342.091342.04142.7
/PDAGGRIVDYYVG-NH31347.47 1346.77/PDAGGRIVDYYG/ 1364.51 1364.021365.0/AGGRIVDYYVGFS/ 1386.56 1386.02/IPDAGGRIVDYYV-28 1392.60 1391.12/GRIVDDYYVGESDS 1460.59 1459.631461.56/GRIVDDYYVGFSDS-H20 1441.68 1440.061440.41/IPDAGGRIVDYYVG/1477.67 1475.01/DAGGRIVDYYVGFS-H2O1483.63 1482.431482.45GEIPDAGGRIVDYY/ 1507.63 1545.32(+K)/EIPDAGGRIVDYV-NH31532.70 1533.93/PDAGGRIVDYYVGF/1511.68 1510.41/PDAGGRIVDYYVGFS-2NH3 1564.72 1565.61566.16/AGGRIVDYYVGFSD-H2O1570.71 1569.89/AGGRIVDYYVGFSDS/ 1588.72 1588.581587.011589.0/GEIPDAGGRIDYYV G-NH3 1589.76 1591.53GEIPDAGGRIVDYYV/1606.76 1608.01/GEIPDAGGRIVDYYVG-281635.80 1635.82GEIPDAGGRIVDYYVG/ 1663.81 1664.61/DAGGRIVDYYVGFSDS-281675.80 1675.951674.56/EIPDAGGRIVDYYVGF/ 1753.96 1751.00GEIPDAGGRIVDYYVGF-NH3-281765.97 1765.6/PDAGGRIVDYYVGFSDS-28 1772.92 1772.92/AGGRIVDVYVGFSDSV-NH31688.84 1688.69GEIPDAGGRIVDYYVGF/ 1810.91 1890.61(+2K)GEIPDAGGRIVDYYVGFS/ 1898.06 1898.61/EIPDAGGRIVDYYVGFSD/1956.13 1957.64GEIPDAGGRIVDYYVGFSDS/ 2100.28 2100.17
GEIPDAGGRIVDYYVGFSDSV/ 2199.352199.682200.172236.71(+K)2245.93/2246.10(+2Na)GEIPDAGGRIVDYYVGFSDSV-NH32182.352183.122183.68GEIPDAGGRIVDYYVGFSDSV.OH(M+)2216.292217.112217.182244.12(+K)2259.48(+2Na)2252.27(+2H2O)2262.24(+2Na)M-腺嘌呤，-H2O 2802.732803.09M-V(C末端) 2857.862859.53M-(NH-V)(C末端) 2842.852842.14M-腺嘌呤2819.742821.70M-2H2O 2918.812918.692940.33(+Na)M 2954.822956.192994.99(+K)3000.63(+2Na)所述質(zhì)譜數(shù)據(jù)支持肽-B的定位結(jié)構(gòu)，此外通過出現(xiàn)在質(zhì)量分別為1664.61、1898.61和2199.68的片段獨(dú)立證實(shí)了所述肽結(jié)構(gòu)中位置16的甘氨酸殘基和位置18和位置20的絲氨酸殘基。
獲得的肽-B的代表性質(zhì)譜示于圖18中。
因此，由長21個氨基酸直鏈肽組成的肽-B通過位置18的絲氨酸殘基的羥基通過二磷酸二酯基團(tuán)與腺苷酰基(3′-5′)腺苷部分的3′-末端共價連接。這使Pcptide-B成為一種肽-核酸綴合物。
總之，將制品R解析成其組分化合物，然后通過一系列結(jié)構(gòu)化學(xué)分析進(jìn)行鑒定。所述方法包括系統(tǒng)性凝膠洗脫法、HPLC分析、SDS-凝膠電泳、酶學(xué)研究、紫外光譜分析、NMR譜分析和質(zhì)譜分析。
根據(jù)這些研究，可以得出以下結(jié)論制品R的有機(jī)組分是衍生自RNA受控水解的13種核苷/核苷酸化合物和兩種肽。
分子量為3536的較長肽(稱為肽-A)是來源于牛β-酪蛋白的3 1個氨基酸片段。它具有6個間插的脯氨酸殘基，所述脯氨酸殘基可能導(dǎo)致所述肽的緊密折疊，導(dǎo)致其化學(xué)穩(wěn)定性和對酶促水解的穩(wěn)定性。它在其結(jié)構(gòu)中也具有4個堿性谷氨酰胺殘基。
較短的肽即一種肽-寡核苷酸綴合物(稱為肽-B)具有在位置18的絲氨酸殘基上與二腺嘌呤(3′-5′)二核糖核苷酸通過3′-位置上的二磷酸二酯鍵合連接的長21個氨基酸的鏈。該核肽綴合物具有與740MW非肽加合物連接的MW 2215肽部分，得到的總MW為2955。迄今為止所述肽-B結(jié)構(gòu)在科學(xué)文獻(xiàn)中尚未描述。
另外，制品R含有在生產(chǎn)工藝中由氫氧化鈉與鹽酸的中和作用產(chǎn)生的無機(jī)成分氯化鈉。
因此，在制品R制劑中存在16種已鑒定的組分化合物-3種核苷、2種核苷二磷酸和8種核苷一磷酸、加上2種肽(其中一種為肽-核酸綴合物)和氯化鈉。
制品R肽-A和肽-B的生物活性U937細(xì)胞—一種得自hystiocytic淋巴瘤、在特定條件下生長的人前單核細(xì)胞系已經(jīng)顯示通過增加其產(chǎn)生白介素-8(IL-8)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)而對Product ft應(yīng)答。
使用市售的定量ELISA測定來檢測對制品R存在作用下培養(yǎng)U937細(xì)胞分泌IL-S和MCP-1的情況。使用在這些測定中的陽性應(yīng)答作為制品R生物活性的指標(biāo)。該試驗(yàn)也可以用來證明制品R中純化肽組分的生物活性。
制品U肽的硫酸銨沉淀將制品U樣品凍干，然后再溶于20％的原始樣品水溶液中(濃縮5倍)。向該溶液中加入硫酸銨結(jié)晶，至達(dá)到60％硫酸銨飽和(390mg/ml溶液)，溫和混合使結(jié)晶溶解。在冰上保溫30mm至1hr后出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀，以16,000xg于40℃離心30分鐘。將沉淀溶于5％的原始樣品水溶液。通過BioGel P-2柱，經(jīng)凝膠過濾色譜使溶液脫鹽。該柱用0.1X磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗脫。合并僅含有蛋白質(zhì)的流分并凍干。
通過凝膠ruhranon色譜法分離制品R的兩種主要肽將BioGelP-10柱(1.6cm×52cm)用0.1X濃度的PBS平衡。將2ml 2X濃縮制品R加樣至該柱上，以25mI/hr的流速用同一緩沖液洗脫。收集4mm.流分。所有含蛋白質(zhì)的流分通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分析。分別合并主要含有肽A和肽B的流分，然后凍干。肽A合并物含極少量其它肽污染物，然而，肽B合并物雖然高度富集，但仍含有作為主要污染物肽A。所述合并物中肽純度的合理估計(jì)為對于肽A而言＞90％，而對于肽B而言＞75％。
U937細(xì)胞培養(yǎng)U937人hystiocytic淋巴瘤細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)。將細(xì)胞解凍，在補(bǔ)充于56℃熱滅活30分鐘的10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1x青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中在對數(shù)生長(5-9×105細(xì)胞/mL)時保持。
制品R或分離肽處理將細(xì)胞(1.0×105/ml)在含有制品R、分離純化肽溶液、混合肽溶液或Dulbecco氏PBS的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。離心后，用趨化因子ELISA試劑盒對培養(yǎng)上清液進(jìn)行分析。培養(yǎng)基中制品R的終濃度為10％(v/v)。將經(jīng)硫酸銨沉淀的肽在培養(yǎng)基中重建，得到10mg/ml溶液。也使用培養(yǎng)基作為稀釋劑來制備兩種2倍稀釋液。在U937細(xì)胞培養(yǎng)中以10％的終濃度使用這些溶液。將單獨(dú)凍干的肽在無內(nèi)毒素的水中重建，得到2mg/ml溶液(這相當(dāng)于制品R中每種肽的近似濃度)。以4mg/ml的終濃度制備兩種肽的等摩爾混合物。在培養(yǎng)基中以10％的終濃度使用這兩種肽，以進(jìn)行所述測定。
分泌的IL-8和MCP-1的測量分別采用人IL-S ELISA試劑盒(Endogen.Inc.)和Quantikine人MCP-1 ELISA試劑盒(R&D Systems，Inc.)，按照生產(chǎn)商的說明(對MCP-1 ELISA稍加修改)，通過ELISA測定培養(yǎng)上清液中IL-8和MCP-1的濃度。在PowerWave 200 Microplate.Scanning Spectrophotometer上測量吸光度。用每個生產(chǎn)商供應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的稀釋液產(chǎn)生四參數(shù)邏輯斯諦擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且通過外推法確定每種上清液中趨化因子的濃度。
結(jié)果和結(jié)論通過硫酸銨沉淀、凍干和在PBS中重建來分離制品R的肽組分。分析它們增加0937細(xì)胞分泌IL-8和MCP-1的能力。用以10mg/ml開始、濃度逐漸降低的肽溶液進(jìn)行兩種不同的測定。兩種測定結(jié)果的平均值示于圖19圖中。對于IL-8和MCP-1兩者分泌，反應(yīng)是劑量依賴性的。對于IL-8測定，10％的10mg/ml肽溶液能夠誘發(fā)與10％完全制品R相似的反應(yīng)。(same lot from which the peptides wereprecipitated)。對于MCP-1，10％的10mg/ml溶液不能誘發(fā)與完全制品R相當(dāng)?shù)目偡磻?yīng)。
為了進(jìn)一步分析制品R的肽組分正調(diào)節(jié)U937細(xì)胞分泌IL-8和MCP-1的能力，通過凝膠過濾色譜制備肽A和肽B的富集制劑。分析單獨(dú)的以及以等摩爾量混合的(4mg/ml溶液)、在培養(yǎng)基中以10％的終濃度的肽A和肽B溶液(2mg/ml)(制劑B更多地被肽A污染，反之亦然)。兩個獨(dú)立測定的結(jié)果示于圖20中。肽B溶液保持制品R正調(diào)節(jié)U937細(xì)胞分泌IL-8的能力的大部分，而肽A溶液僅誘發(fā)較少的反應(yīng)?；旌想娜芤哼_(dá)到與制品R相同的活性。這些結(jié)果表明需要存在這兩種肽，以便獲得制品R的全部活性。就MCP-1而論，肽-A、肽-B和這兩種肽的混合物的每種都不能誘發(fā)制品R對MCP-1正調(diào)節(jié)相同的反應(yīng)，表明對于制品R的全部活性需要某些其它的制品R組分。這兩種肽的混合物分別比每種肽的活性高，并且肽B的活性略高于肽A的活性，再次表明對于制品R的全部活性需要這兩種肽的存在。注意到，在兩種情況下，肽-B比肽-A誘導(dǎo)更高水平的IL-8或MCP-1的分泌。由于肽-B含有與所述肽共價結(jié)合的二核苷酸，因此這樣的結(jié)構(gòu)可以負(fù)責(zé)肽-B的更高水平的生物活性。
以下實(shí)施例僅用來說明制備制品R的方法，不應(yīng)解釋為對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例在合適的容器中，在約2.5升USP注射用水中，于約3-7℃懸浮約35.0g酪蛋白、約17.1g牛肉蛋白胨、約22.0g核酸(酵母RNA)、約3.25g牛血清白蛋白，溫和攪拌，直至所有組分已適度溶解。攪拌下小心加入約16.5g氫氧化鈉(試劑級ACS)，繼續(xù)攪拌直至氫氧化鈉完全溶解。在約9lbs壓力和200-230°F下高壓滅菌一段時間，直至RNA被完全消化，例如約4小時。達(dá)到規(guī)定時間時，停止高壓滅菌，讓反應(yīng)瓶和內(nèi)容物緩慢冷卻至環(huán)境溫度。然后，于約3-8℃冷卻至少6小時。使用諸如氮?dú)饣驓鍤獾亩栊詺怏w，讓所得溶液在低壓(1-6psi)下通過2微米和0.45微米濾器。以相似的方式，讓所述溶液通過0.2微米致熱原保留濾器再次過濾。所得的濾液即為樣品，測定其總氮。然后進(jìn)行計(jì)算，以確定待加入到濾液中的注射用冷卻水的量，得到經(jīng)稀釋的濾液，氮含量介于約165-210mg/100ml，終體積約為5升。然后或者用濃HCl(試劑級ACS)或者用1.0當(dāng)量NaOH調(diào)pH至至約7.3-7.6范圍。然后使經(jīng)稀釋的溶液在低壓惰性氣體下通過0.2微米濾器再次過濾。然后在惰性氣體氛圍下，將終濾液灌入2ml玻璃安瓿中，然后封口。收集安瓿，對于最終滅菌，于240°F和在14-16磅壓力下高壓滅菌約30分鐘。滅菌循環(huán)后，將裝有制品R的安瓿冷卻并洗滌。
所有數(shù)量都正負(fù)15％的pH、體積和分析校正的變化。
盡管制品R作為藥用制劑的部分給予是可行的，但是優(yōu)選將其單獨(dú)給予，但是因?yàn)橐环N或多種其它藥物獨(dú)立給予，因此本發(fā)明藥物可與其它藥物在大致相同的時間給予。如果制品R作為藥用制劑的部分給予，則本發(fā)明的制劑包含至少一種如上限定的給予成分及其一種或多種可接受的載體和任選的其它治療組分。所述載體在與制劑中的其它組分相容的意義上必須是“可接受的”并且對于其接受者是無害的。
因此，盡管已說明和描述并指出本發(fā)明應(yīng)用于其優(yōu)選實(shí)施方案的基本新特征，但是不用說在不偏離本發(fā)明的精神的情況下，本領(lǐng)技術(shù)人員可以對所述裝置的形式和細(xì)節(jié)以及其操作進(jìn)行各種省略和替換和變化。例如，特別是指以大致相同的方式進(jìn)行大致相同的功能以得到相同的結(jié)果的那些成分和/或方法步驟的所有組合都在本發(fā)明范圍內(nèi)。此外，還應(yīng)該認(rèn)識到，結(jié)合本發(fā)明任何公開的形式或?qū)嵤┓桨刚f明和/或描述的結(jié)構(gòu)和/或成分和/或方法步驟可以作為設(shè)計(jì)選擇的通用主題結(jié)合到任何其它公開或描述或建議的形式或?qū)嵤┓桨钢?。因此本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求書范圍的限制。
序列表<110>FRIEDLAND，BERNARDHIRSCHMAN，SHALOM Z.
TARAPOREWALA，IRACH B.
<120>治療組合物的制備<130>4493-2CIP2<140>09/764,017<141>2001-01-17<150>09/344,095<151>1999-06-25<150>08/735,236<151>1996-10-22<160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>1Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp1 5 10 15Met Pro Ile Gln Ala Phe Leu Leu Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly20 25 30<210>2<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>2Gly Glu Ile Pro Asp Ala Gly Gly Arg Ile Val Asp Tyr Tyr Val Gly1 5 10 15Phe Ser Asp Ser Val20<210>3<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<220>
<221>MOD RES<222>(20)..(21)<223>序列中不能明確確定的殘基<400>3Gly Glu Ile Pro Asp Ala Gly Gly Arg Ile Val Asp Tyr Tyr Val Gly1 5 10 15Phe Ser Asp Xaa Xaa20
權(quán)利要求
1.一種SEQ ID NO1肽。
2.權(quán)利要求1的肽，其中所述肽通過包括下述步驟的方法而形成a.形成一種混合物水溶液，該混合物包含一種蛋白質(zhì)組合物、一種植物RNA和一種堿，所述蛋白質(zhì)組合物由酪蛋白、牛肉蛋白胨和牛血清白蛋白組成，其中所述蛋白質(zhì)組合物與所述水之比在約1.5/100至約2.5/100(重量)的范圍內(nèi)；b.在高溫高壓下處理所述混合物，以便形成溶液和不溶性組分；c.除去所述不溶性組分；d.用水稀釋所述溶液；e.在進(jìn)行步驟b、c和d后，調(diào)節(jié)所述溶液的pH至生理上可接受的pH。
3.權(quán)利要求1的肽，其中所述肽用化學(xué)方法合成。
4.一種核苷酸-肽，所述核苷酸-肽包含SEQ ID NO2的肽和與所述肽連接的核苷酸，所述核苷酸-肽由下式表示 其中R1和R2為氫、烷基、芳基烷基、雜芳基(hereroacryl)或芳基；X為氧或硫；Y為氫、羥基或鹵素；B為嘌呤或嘧啶；且n為0-10,000。
5.權(quán)利要求4的核苷酸-肽，其中所述核苷酸-肽通過包括下述步驟的方法而形成a.形成一種混合物水溶液，該混合物包含一種蛋白質(zhì)組合物、一種植物RNA和一種堿，所述蛋白質(zhì)組合物由酪蛋白、牛肉蛋白胨和牛血清白蛋白組成，其中所述蛋白質(zhì)組合物與所述水之比在約1.5/100至約2.5/100(重量)的范圍內(nèi)；b.在高溫高壓下處理所述混合物，以便形成溶液和不溶性組分；c.除去所述不溶性組分；d.用水稀釋所述溶液；e.在進(jìn)行步驟b、c和d后，調(diào)節(jié)所述溶液的pH至生理上可接受的pH。
6.權(quán)利要求4的核苷酸-肽，其中所述核苷酸-肽用化學(xué)方法合成。
7.權(quán)利要求4的核苷酸-肽，其中所述嘌呤選自腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和6-巰基嘌呤，所述嘧啶選自胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴乙烯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2-氟腺嘌呤、5-氟胞嘧啶、尿嘧啶。
8.權(quán)利要求1的核苷酸-肽，其中所述寡核苷酸與所述肽的絲氨酸殘基在所述絲氨酸殘基的羥基上共價連接。
9.權(quán)利要求8的核苷酸-肽，其中所述核苷酸為二核苷酸。
10.權(quán)利要求9的核苷酸-肽，其中所述二核苷酸為二腺苷。
11.權(quán)利要求10的核苷酸-肽，其中所述二腺苷與所述絲氨酸殘基通過二磷酸二酯鍵連接。
12.權(quán)利要求11的核苷酸-肽，其中所述絲氨酸殘基是從所述肽的N末端起的第18號氨基酸殘基。
13.一種核苷酸-肽，所述核苷酸-肽包含具有羥基化氨基酸殘基的肽和具有二磷酸二酯部分的核苷酸，其中所述肽與所述核苷酸在所述羥基化氨基酸殘基的羥基通過所述二磷酸二酯共價連接。
14.權(quán)利要求13的核苷酸-肽，其中所述核苷酸為二核苷酸。
15.權(quán)利要求13的核苷酸-肽，其中所述核苷酸選自腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴乙烯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2-氟腺嘌呤、5-氟胞嘧啶、6-巰基嘌呤。
16.權(quán)利要求13的核苷酸-肽，其中所述羥基化氨基酸選自絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。
17.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含SEQ ID NO1的肽。
18.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含一種核苷酸-肽，所述核苷酸-肽包含具有絲氨酸殘基的肽和具有二磷酸二酯部分的核苷酸，其中所述肽與所述核苷酸在所述絲氨酸殘基的羥基通過所述二磷酸二酯共價連接。
19.權(quán)利要求18的藥用組合物，所述藥用組合物還包含SEQ IDNO1的肽。
20.一種藥用組合物，所述藥用組合物包括一種核苷酸-肽，所述核苷酸-肽包含SEQ ID NO2的肽和與所述肽連接的核苷酸，所述核苷酸-肽由下式表示 其中R1和R2為氫、烷基、芳基烷基、雜芳基或芳基；X為氧或硫；Y為氫、羥基或鹵素；B為嘌呤或嘧啶；且n為0-10,000。
21.權(quán)利要求20的核苷酸-肽，其中所述嘌呤選自腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和6-巰基嘌呤，所述嘧啶選自胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴乙烯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2-氟腺嘌呤、5-氟胞嘧啶、尿嘧啶。
22.權(quán)利要求21的核苷酸-肽，其中所述核苷酸與所述肽的絲氨酸殘基在所述絲氨酸殘基的羥基上共價連接。
23.權(quán)利要求22的核苷酸-肽，其中所述核苷酸為二核苷酸。
24.權(quán)利要求23的核苷酸-肽，其中所述二核苷酸為二腺苷。
25.權(quán)利要求24的核苷酸-肽，其中所述二腺苷與所述絲氨酸殘基通過二磷酸二酯鍵連接。
26.權(quán)利要求10的核苷酸-肽，其中所述絲氨酸殘基是從所述肽的N末端起的第18號氨基酸殘基。
27.權(quán)利要求20的藥用組合物，所述藥用組合物還包含SEQ IDNO1的肽。
28.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含具有約31個氨基酸并且能夠刺激培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生白介素-8的肽。
29.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含具有絲氨酸殘基和二核苷酸部分的核苷酸-肽，所述核苷酸-肽殘基能夠刺激培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生白介素-8。
30.權(quán)利要求29的藥用組合物，所述藥用組合物還包含權(quán)利要求28的肽。
31.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含具有約31個氨基酸并且能夠刺激培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生單核細(xì)胞趨化蛋白1的肽。
32.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含具有絲氨酸殘基和二核苷酸部分的核苷酸-肽，所述核苷酸-肽殘基能夠刺激培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生白介素-8。
33.權(quán)利要求32的藥用組合物，所述藥用組合物還包含權(quán)利要求31的肽。
34.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含一種肽核酸制劑，所述肽核酸制劑吸收波長230nm、260nm和280nm的光，使260nm/280nm吸收比約為1.998，而260nm/230nm吸收比約為1.359，所述藥用組合物包含植物RNA形成的核苷酸分子以及由酪蛋白、牛肉蛋白胨和牛血清白蛋白混合物形成的肽分子，所述分子的分子量分布不均勻。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中所述核苷酸包含單核苷酸。
36.權(quán)利要求34的組合物，其中通過銀染色，所述分子分子量在零至基本上不超過14KDa的范圍內(nèi)不均勻分布。
37.權(quán)利要求34的組合物，其中通過銀染色，所述分子分子量在零至基本上不超過8KDa的范圍內(nèi)不均勻分布。
38.權(quán)利要求34的組合物，其中通過銀染色，所述分子分子量集中為約5.2KDa和4.3KDa。
全文摘要
制品R－一種可用來治病毒感染并且刺激免疫系統(tǒng)的新治療組合物包含一種具有31個氨基酸的獨(dú)特肽和另一種具有21個氨基酸的獨(dú)特肽，并且與寡核苷酸通過二磷酸二酯或二硫代二磷酸酯鍵合連接。所述組合物具有一種于260nm/280nm典型吸收比為1.998而于260nm/230nm典型吸收比為1.359的光吸收譜。
文檔編號A61K38/01GK1516591SQ02806362
公開日2004年7月28日 申請日期2002年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月17日
發(fā)明者B·弗里蘭德, B 弗里蘭德, S·Z·希爾施曼, 希爾施曼, I·B·塔拉波雷瓦拉, 塔拉波雷瓦拉 申請人:先進(jìn)病毒研究公司